CN115867808A

CN115867808A - 用于治疗蛋白的中和抗体测定

Info

Publication number: CN115867808A
Application number: CN202180029176.8A
Authority: CN
Inventors: M·帕特里奇; S·艾尔文; M·拉杰德西亚斯科沙; A·赫曼
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2020-05-01
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2023-03-28
Also published as: MX2022013738A; IL297783A; WO2021222711A1; US20210341487A1; EP4143573A1; KR20230005936A; BR112022021039A2; CA3180569A1; AU2021263487A1; US20220260577A1; JP2023524062A

Abstract

本发明总体上涉及测试针对治疗蛋白的中和抗体(NAb)的存在的方法。具体地，本发明涉及针对干扰性竞争性药物的减轻剂在用于检测针对治疗蛋白的中和抗体的配体结合测定或基于细胞的测定中的用途。

Description

用于治疗蛋白的中和抗体测定

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年5月1日提交的美国临时专利申请第63/018,821号、于2020年6月19日提交的美国临时专利申请第63/041,768号以及于2021年4月8日提交的美国临时专利申请第63/172,488号的优先权和权益，所述美国临时专利申请各自通过引用并入本文。

技术领域

本申请涉及用于进行用于检测针对治疗蛋白的中和抗体的诊断测定的测定方法、模块和试剂盒。

背景技术

向患者施用生物治疗剂可能在患者体内诱导不期望的免疫原性应答，所述免疫原性应答可能导致抗药物抗体(ADA)的产生(Mire-Sluis,A.R.等人,《免疫学方法杂志(JImmunol Methods)》,289(1):1-16(2004))。中和抗体(NAb)是ADA的子集，其抑制药物与其靶标的结合，从而使得药物在生物学上无活性。根据定义，NAb中和药物的作用，从而潜在地降低临床活性。另外，在药物是内源性蛋白质的生物模拟物的情况下，NAb可以与药物的内源性类似物交叉反应，这可能会对药物安全性产生严重后果(Finco,D.等人,《药学和生物医学分析杂志(J Pharm Biomed Anal)》,54(2):351-358(2011)；Hu,J.等人,《免疫学方法杂志》,419:1-8(2015))。

免疫原性应答的检测涉及分级方法，在所述分级方法中，首先通常使用桥接免疫测定测试样品中的ADA的存在(Mire-Sluis,A.R.等人,《免疫学方法杂志》,289(1):1-16(2004))。ADA应答的进一步表征可以包含用于确定ADA的相对量的滴度测定，以及确定抗体应答是否是中和的测定(Wu,B.等人,《美国药学科学家协会杂志(AAPS Journal)》18(6):1335-1350(2016)；Shankar,G等人,《药学和生物医学分析杂志》48(5):1267-1281(2008)；Gupta,S.等人,《药学和生物医学分析杂志》,55(5):878-888(2011))。

NAb测定可以经受干扰，所述干扰阻止针对治疗蛋白的中和的准确定量。例如，如果内源性药物靶标是可溶的，则其可以存在于受试者样品中并且与治疗剂竞争性结合，从而产生假阳性NAb信号。在受试者样品中还可能存在来自先前施用治疗剂的残留药物，所述残留药物可以与NAb竞争性结合并且产生假阴性NAb信号。已经开发了不同的技术来处理这些干扰源，以获得对NAb的准确定量(Xu,W.等人,《免疫学方法杂志》,462:34-41(2018)；Xu,W.等人,《免疫学方法杂志》,416:94-104(2015)；Xiang,Y.等人,《美国药学科学家协会杂志》,21(1):4(2019)；Sloan,J.H.等人,《生物分析(Bioanalysis)》,8(20):2157-2168(2016))。

尚未被表征的潜在干扰的另外的来源是不同于所测试的治疗蛋白的残留药物的干扰，所述残留药物和与治疗剂相同的药物靶标竞争性结合，这将产生假阳性NAb信号。因此，到目前为止，还没有开发出减轻这种类型的干扰的策略。

因此，应当理解，需要用于在用于检测针对治疗蛋白的中和抗体的配体结合测定或基于细胞的测定中识别和减轻来自竞争性药物的干扰的方法。

发明内容

本公开提供了一种用于检测样品中针对治疗蛋白的中和剂的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)使具有所述中和剂和竞争性药物的所述样品与(i)所述治疗蛋白、(ii)所述治疗蛋白的靶标以及(iii)减轻剂接触；(b)测量所述治疗蛋白与所述靶标的结合；以及(c)将(b)的结果与对照测量进行比较以检测所述中和剂。

在一方面，所述对照测量是通过在不存在中和剂的情况下测量所述治疗蛋白与所述靶标的结合来获得的。在另一方面，所述中和剂是中和抗体。

在一方面，所述治疗蛋白是抗体、可溶性受体、抗体-药物缀合物或酶。在具体方面，所述治疗蛋白是单克隆抗体。在又另一具体方面，所述单克隆抗体是抗PD-1抗体、抗TNF抗体、抗PD-L1抗体、抗EGFR抗体、抗CD20抗体、抗CD38抗体或抗LAG3抗体。

在一方面，所述治疗蛋白是双特异性抗体。在具体方面，所述双特异性抗体是CD20xCD3抗体、BCMAxCD3抗体、EGFRxCD28抗体或CD38xCD28抗体。

在一方面，所述治疗蛋白固定到固相载体上。在另一方面，所述治疗蛋白经过标记以便进行检测。在具体方面，所述标记可通过荧光、化学发光、电化学发光、放射性或亲和纯化来检测。在又另一具体方面，所述标记包括钌。

在一方面，所述靶标是抗原、受体、配体或酶底物。在另一方面，所述靶标是细胞表面蛋白。在又另一方面，所述靶标是重组蛋白。在又另一方面，所述靶标由细胞表达。在具体方面，所述细胞是HEK293细胞、MOLP-8细胞、Jurkat细胞或其经修饰形式。

在一方面，所述靶标固定到固相载体上。在另一方面，所述靶标经过标记以便进行检测。在具体方面，所述标记可通过荧光、化学发光、电化学发光、放射性或亲和纯化来检测。在另一方面，所述靶标是酶底物。在又另一方面，所述靶标是CD20、CD3、BCMA、PD-1、EGFR、CD28、CD38、TNF、PD-L1或LAG3。在又另一方面，所述方法另外包括第二靶标。

在一方面，所述竞争性药物是单克隆抗体。在具体方面，所述竞争性药物是利妥昔单抗(rituximab)、派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫单抗(tositumomab)、乌妥昔单抗(ublituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达雷木单抗(daratumumab)或阿达木单抗(adalimumab)在另一方面，所述竞争性药物是双特异性抗体。

在一方面，所述减轻剂是单克隆抗体。在另一方面，所述方法包括使用两种、三种、四种或更多种减轻剂。

在一方面，所述治疗蛋白与所述靶标的结合是通过测量以下来测量的：受体磷酸化、信号转导途径中下游蛋白质的磷酸化、细胞因子释放、细胞增殖、细胞死亡或次级蛋白的产生。在另一方面，所述治疗蛋白与所述靶标的结合是通过报告基因的表达来测量的。在具体方面，所述报告基因是荧光素酶。

在一方面，所述方法进一步包括在使所述样品与所述治疗蛋白或所述靶标接触之前使所述样品与所述减轻剂接触的预处理步骤。

本公开还提供了一种用于执行本发明的方法的试剂盒。在一些示例性实施例中，所述试剂盒包括治疗蛋白、所述治疗蛋白的靶标、针对所述治疗蛋白的中和剂、竞争性药物和减轻剂。

在一方面，所述试剂盒进一步包括表达所述靶标的细胞。在具体方面，所述试剂盒进一步包括响应于所述治疗蛋白与所述靶标的结合而产生可测量活性或信号的细胞。在另一具体方面，所述活性是荧光素酶的表达。

在一方面，所述靶标固定到固相载体上。在另一方面，所述试剂盒进一步包括附连到所述治疗蛋白的标记。在具体方面，所述标记包括钌。

当结合以下描述和附图考虑时，将更好地认识和理解本发明的这些方面和其它方面。以下描述虽然表明各个实施例及其众多具体细节，但是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内可以进行许多替换、修改、添加或重新排列。

附图说明

图1A示出了根据一示例性实施例的基于细胞的中和抗体(NAb)测定的图。图1B示出了根据一示例性实施例的荧光素酶活性随着双特异性CD20xCD3药物抗体的浓度的增加而增加，而阴性对照抗体不诱导荧光素酶信号。图1C示出了根据一示例性实施例的荧光素酶活性随着两种双特异性BCMAxCD3药物抗体的浓度的增加而增加。

图2A示出了根据一示例性实施例的在添加针对治疗抗体的每个臂的中和抗体的情况下基于细胞的NAb测定的图。图2B示出了根据一示例性实施例的荧光素酶活性随着针对双特异性CD20xCD3药物抗体的CD20臂或CD3臂的替代中和抗体的浓度的增加而降低。

图2C示出了根据一示例性实施例的荧光素酶活性随着针对双特异性BCMAxCD3药物抗体的BCMA臂的替代中和抗体的浓度的增加而降低。图2D示出了根据一示例性实施例的荧光素酶活性随着针对双特异性BCMAxCD3药物抗体的CD3臂的替代中和抗体的浓度的增加而降低。图2E示出了根据一示例性实施例的荧光素酶活性随着向双特异性BCMAxCD3药物抗体的NAb测定中添加同型对照抗体而未发生变化。

图2F示出了根据一示例性实施例的荧光素酶活性随着针对第二双特异性BCMAxCD3药物抗体的BCMA臂的替代中和抗体的浓度的增加而降低。图2G示出了根据一示例性实施例的荧光素酶活性随着针对第二双特异性BCMAxCD3药物抗体的CD3臂的替代中和抗体的浓度的增加而降低。图2H示出了根据一示例性实施例的荧光素酶活性随着向第二双特异性BCMAxCD3药物抗体的NAb测定中添加同型对照抗体而未发生变化。

图3A示出了根据一示例性实施例的在添加针对药物靶标CD20的竞争性抗体的情况下在针对双特异性CD20xCD3药物抗体的NAb测定中荧光素酶活性的降低。图3B示出了根据一示例性实施例的在添加针对药物靶标CD3的竞争性抗体的情况下在针对双特异性CD20xCD3药物抗体的NAb测定中荧光素酶活性的降低。图3C和图3D示出了根据一示例性实施例的在添加针对药物靶标BCMA或CD3的竞争性抗体的情况下在针对双特异性BCMAxCD3药物抗体的NAb测定中荧光素酶活性的降低。图3E和图3F示出了根据一示例性实施例的在添加针对药物靶标BCMA或CD3的竞争性抗体的情况下在针对第二双特异性BCMAxCD3药物抗体的NAb测定中荧光素酶活性的降低。

图4A示出了根据一示例性实施例的NAb测定中荧光素酶活性随着治疗抗体的浓度的增加而增加。添加未处理的人血清对荧光素酶活性没有影响。图4B示出了根据一示例性实施例的通过将在存在药物对照的情况下的荧光素酶活性与在存在实验样品的情况下的荧光素酶活性进行比较来定量NAb测定信号。

图5示出了根据一示例性实施例的来自60个未经药物处理的临床样品的基于细胞的NAb测定结果。

图6示出了根据一示例性实施例的临床样品中利妥昔单抗的浓度与NAb测定信号之间的相关性。

图7A示出了根据一示例性实施例的在添加利妥昔单抗的情况下基于细胞的NAb测定的图。图7B示出了根据一示例性实施例的在添加利妥昔单抗和针对利妥昔单抗的减轻抗体的情况下NAb测定的图。图7C示出了根据一示例性实施例的在添加针对利妥昔单抗的减轻抗体的情况下NAb测定中荧光素酶活性的恢复。

图8示出了根据一示例性实施例的在添加针对利妥昔单抗的减轻抗体的情况下未经药物处理的临床样品中假阳性NAb测定信号的减少。

图9A示出了根据一示例性实施例的靶标-捕获配体结合NAb测定的图。图9B示出了根据一示例性实施例的在添加针对治疗蛋白的一个臂的NAb的情况下靶标-捕获配体结合NAb测定的图。图9C示出了根据一示例性实施例的药物捕获配体结合NAb测定的图。

图10A示出了根据一示例性实施例的在添加竞争性药物的情况下配体结合NAb测定的图。图10B示出了根据一示例性实施例的配体结合NAb测定中假阳性信号抑制随着竞争性药物的浓度的增加而增加。

图11A示出了根据一示例性实施例的在添加竞争性药物和针对竞争性药物的减轻抗体的情况下配体结合NAb测定的图。图11B示出了根据一示例性实施例的在添加针对竞争性药物的减轻抗体的情况下假阳性NAb测定信号的消除。

具体实施方式

治疗蛋白是用于治疗各种人类疾病的一类重要的药物。然而，治疗蛋白可以在给药接受者中引发免疫应答，从而产生抗药物抗体(ADA)。中和抗体(NAb)是可以潜在地影响患者安全性并且通过阻断治疗蛋白的生物活性介导药物功效损失的ADA的亚群。因此，表征和监测NAb是免疫原性评估的重要方面，需要反映治疗作用机制的灵敏且可靠的方法(Wu,B.等人,《美国药学科学家协会杂志》,18(6):1335-1350(2016))。

预期NAb测定以足够的灵敏度、特异性、选择性和精确度可靠地检测NAb。基于细胞的测定和非基于细胞的测定两者都是NAb评估的选择。通常，NAb测定提供了治疗蛋白的靶标以及作为对治疗蛋白与其靶标结合的应答的信号输出的机制，从而允许定量结合。如果NAb存在于经过共温育的样品中，则NAb将抑制治疗蛋白与靶标的结合，从而降低信号输出并且允许定量样品中的NAb。

样品基质可以包含干扰剂，所述干扰剂例如通过直接与NAb、治疗蛋白或靶标相互作用来阻止对NAb的准确定量。可以通过与NAb相互作用并占据NAb而干扰的基质组分包含例如来自先前施用治疗蛋白的残留药物。可以通过与治疗蛋白相互作用并占据治疗蛋白而干扰的另一种组分包含例如可溶性药物靶标。这些干扰剂已经在现有技术中进行表征，并且已经开发了多种技术来处理这些干扰源，以获得对NAb的准确定量(Xu,W.等人,《免疫学方法杂志》,462:34-41(2018)；Xu,W.等人,《免疫学方法杂志》,416:94-104(2015)；Xiang,Y.等人,《美国药学科学家协会杂志》,21(1):4(2019)；Sloan,J.H.等人,《生物分析》,8(20):2157-2168(2016))。

然而，尚未被表征或解决的另一种可能的干扰剂是受试者样品中不同于所测试的治疗蛋白的残留竞争性药物，所述残留竞争性药物可以与治疗蛋白的靶标相互作用并占据治疗蛋白的靶标，从而导致NAb的假阳性定量。

为了应对准确测量针对治疗蛋白的中和抗体的挑战，本文描述了用于使用针对竞争性药物的减轻剂来防止中和抗体测定中的干扰的方法和试剂盒。本文还公开了检测来自与治疗蛋白的靶标竞争性结合的药物的NAb测定中的干扰。这种干扰可能导致NAb测定中的治疗蛋白结合信号或活性以及假阳性NAb测定信号的降低。为了克服这种干扰，可以使用降低竞争性药物与靶标的结合的减轻剂，从而允许治疗蛋白与其靶标结合并恢复准确的NAb测定信号。

来自残余竞争性药物的干扰是在测试用于临床使用的治疗蛋白的同时准确评估NAb的严峻挑战，如例如在实例5和6中所示。可以在已经向患者施用可以与同一靶标竞争性地相互作用的一线疗法之后测试新型治疗剂。在这些情况下，必须识别和减轻来自竞争性药物的干扰。例如，表1中列出了具有B细胞成熟抗原(BCMA)或CD3的共享靶标的许多候选药物。可能存在许多竞争性药物的其它治疗性靶标包含例如：表皮生长因子受体(EGFR)，其可以被如西妥昔单抗等药物或候选药物靶向；CD28；CD38，其可以被如达雷木单抗等药物或候选药物靶向；淋巴细胞激活基因3(LAG3)；程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，其可以被如西米普利单抗(cemiplimab)、派姆单抗或纳武单抗等药物或候选药物靶向；程序性死亡配体1(PD-L1)；肿瘤坏死因子(TNF)，其可以被如阿达木单抗等药物或候选药物靶向；或CD20，其可以被如利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、奥妥珠单抗、奥法木单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗或乌妥昔单抗等药物或候选药物靶向。本文的公开内容教导了一种方法，所述方法适于减轻来自这些和其它药物和候选药物的NAb测定干扰。

表1：具有共享靶标的候选药物的实例

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除非另外描述，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管类似或等效于本文所述的任何方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试，但现在对特定方法和材料进行描述。

术语“一个(a)”应理解为意指“至少一个”，并且术语“约”和“大约”应理解为允许标准变化，如本领域普通技术人员将理解的，并且在提供范围的情况下，包含端点。如本文所使用的，术语“包含(include)”、“包含(includes)”和“包含(including)”意指是非限制性的，并且被理解为分别意指“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”。

如本文所使用的，术语“蛋白质”或“所关注蛋白”可以包含具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包括一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体以及通过肽键连接的其合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。“合成肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成肽或多肽可以例如使用自动化多肽合成仪合成。各种固相肽合成方法是本领域的技术人员已知的。蛋白质可以包括一种或多种多肽以形成单一功能性生物分子。蛋白质可以包含抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。所关注蛋白可以包含以下中的任一种：生物治疗蛋白、用于研究或疗法的重组蛋白、trap蛋白和其它嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体。蛋白质可以使用基于重组细胞的生产系统来生产，如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如，毕赤酵母(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如，CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。对于最近讨论生物治疗蛋白及其生产的综述，参见Ghaderi等人,“用于生物治疗性糖蛋白的生产平台-非人类唾液酸化的发生、影响和挑战(Production platforms for biotherapeutic glycoproteins.Occurrence,impact,andchallenges of non-human sialylation)”(Darius Ghaderi等人,用于生物治疗性糖蛋白的生产平台-非人类唾液酸化的发生、影响和挑战),28《生物技术和基因工程综述(BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING REVIEWS)》147-176(2012)，所述文献的全部教导内容并入本文)。蛋白质可以根据组成和溶解度来分类，并且因此可以包含简单蛋白，如球状蛋白和纤维状蛋白；缀合蛋白，如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及衍生蛋白，如初级衍生的蛋白和次级衍生的蛋白。

在一些示例性实施例中，所关注蛋白可以是重组蛋白、抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白、scFv和其组合。

如本文所使用的，术语“重组蛋白”是指由于在已经引入到合适的宿主细胞中的重组表达载体上携带的基因的转录和翻译而产生的蛋白质。在某些示例性实施例中，重组蛋白可以是抗体，例如，嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。在某些示例性实施例中，重组蛋白可以是选自由以下组成的组的同型的抗体：IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。在某些示例性实施例中，抗体分子是全长抗体(例如，IgG1或IgG4免疫球蛋白)，或者可替代地抗体可以是片段(例如，Fc片段或Fab片段)。

如本文所使用的术语“抗体”包含包括四个多肽链、通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链以及其多聚体(例如，IgM)的免疫球蛋白分子。每个重链包括重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的高变区，所述高变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本发明的不同实施例中，抗大ET-1抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同或可以是天然的或经人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并列分析来定义氨基酸共有序列。如本文所使用，术语“抗体”还包含完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的多肽或糖蛋白，其与抗原特异性结合以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术衍生自完整抗体分子，所述标准技术如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变结构域以及任选地恒定结构域的DNA的重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包含例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以合成。可以通过化学方法或通过分子生物学技术对DNA进行测序和操纵，例如，将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型、或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。

如本文所使用的，“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包含但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双功能抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域以及三功能抗体、四功能抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段是免疫球蛋白重链和轻链的可变区的组合，并且ScFv蛋白是重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽连接子连接。在一些示例性实施例中，抗体片段包括亲本抗体的足够的氨基酸序列，所述氨基酸序列是所述亲本抗体的片段，使得其如亲本抗体那样与同一抗原结合；在一些示例性实施例中，片段与具有与亲本抗体的亲和力相当的亲和力的抗原结合和/或与亲本抗体竞争以与抗原结合。抗体片段可以通过任何方式产生。例如，抗体片段可以通过完整抗体的片段化酶促地或化学地产生和/或抗体片段可以由编码部分抗体序列的基因重组地产生。可替代地或另外地，抗体片段可以完全地或部分地合成产生。抗体片段可以任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外地，抗体片段可以包括例如通过二硫键连接在一起的多个链。抗体片段可以任选地包括多分子复合物。功能性抗体片段通常包括至少约50个氨基酸，并且更通常包括至少约200个氨基酸。

术语“双特异性抗体”包含能够与两个或多个表位选择性结合的抗体。双特异性抗体通常包括两个不同的重链，其中每个重链与两个不同分子(例如，抗原)上或同一分子上(例如，同一抗原上)的不同表位特异性结合。如果双特异性抗体能够与两个不同的表位(第一表位和第二表位)选择性结合，则第一重链对第一表位的亲和力通常比第一重链对第二表位的亲和力低至少一至两个或三个或四个数量级，反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可以位于相同或不同的靶标上(例如，位于相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可以例如通过组合识别同一抗原的不同表位的重链来制备。例如，编码识别同一抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且此类序列可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。

典型的双特异性抗体具有两个重链，所述两个重链各自具有三个重链CDR，随后是CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域以及免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性但可以与每个重链缔合，或者可以与每个重链缔合且可以与由重链抗原结合区结合的表位中的一个或多个表位结合，或者可以与每个重链缔合且使得所述重链中的一个或两个重链能够与一个或两个表位结合。BsAb可以分成两个主要类别：一类是带有Fc区(IgG样)；以及另一类是缺乏Fc区，后者通常小于包括Fc的IgG和IgG样双特异性分子。IgG样bsAb可以具有不同形式，如但不限于三功能抗体、杵臼IgG(kih IgG)、crossMab、orth-Fab IgG、双可变结构域Ig(DVD-Ig)、二合一或双功能Fab(DAF)、IgG-单链Fv(IgG-scFv)或κλ体。非IgG样不同形式包含串联scFv、双功能抗体形式、单链双功能抗体、串联双功能抗体(TandAb)、双亲和力再靶向分子(DART)、DART-Fc、纳米抗体或通过对接锁定(dock-and-lock，DNL)方法产生的抗体(Gaowei Fan、Zujian Wang和Mingju Hao,双特异性抗体及其应用(Bispecific antibodies and their applications),8《血液学与肿瘤学杂志(JOURNAL OF HEMATOLOGY&ONCOLOGY)》130；Dafne Müller和Roland E.Kontermann,双特异性抗体(Bispecific Antibodies),《治疗抗体手册(HANDBOOK OF THERAPEUTICANTIBODIES)》265-310(2014)，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文)。

如本文所使用的，“多特异性抗体”是指对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。虽然这些分子通常将仅与两种抗原(即，双特异性抗体，bsAb)结合，但具有另外特异性的抗体，如三特异性抗体和KIH三特异性抗体也可以通过本文所公开的系统和方法来解决。

如本文所使用的，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可以通过本领域的任何可获得或已知的方式源自单个克隆，包含任何真核、原核或噬菌体克隆。可以使用本领域已知的各种技术来制备可用于本公开的单克隆抗体，包含使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。

在一些示例性实施例中，所关注蛋白可以从哺乳动物细胞中产生。哺乳动物细胞可以是人来源的或非人来源的，并且可以包含原代上皮细胞(例如，角质形成细胞、宫颈上皮细胞、支气管上皮细胞、气管上皮细胞、肾脏上皮细胞和视网膜上皮细胞)、已建立的细胞系及其菌株(例如，293胚肾细胞、BHK细胞、HeLa宫颈上皮细胞和PER-C6视网膜细胞、MDBK(NBL-1)细胞、911细胞、CRFK细胞、MDCK细胞、CHO细胞、BeWo细胞、Chang细胞、Detroit 562细胞、HeLa 229细胞、HeLa S3细胞、Hep-2细胞、KB细胞、LSI80细胞、LS174T细胞、NCI-H-548细胞、RPMI2650细胞、SW-13细胞、T24细胞、WI-28VA13、2RA细胞、WISH细胞、BS-C-I细胞、LLC-MK2细胞、克隆M-3细胞、1-10细胞、RAG细胞、TCMK-1细胞、Y-l细胞、LLC-PKi细胞、PK(15)细胞、GHi细胞、GH3细胞、L2细胞、LLC-RC 256细胞、MHiCi细胞、XC细胞、MDOK细胞、VSW细胞和TH-I、B1细胞、BSC-1细胞、RAf细胞、RK细胞、PK-15细胞或其衍生物)、来自任何组织或器官的成纤维细胞(包含但不限于心脏、肝脏、肾脏、结肠、肠、食道、胃、神经组织(脑、脊髓)、肺、血管组织(动脉、静脉、毛细管)、淋巴组织(淋巴腺、腺样、扁桃体、骨髓和血液)、脾脏以及成纤维细胞和成纤维细胞样细胞系(例如，CHO细胞、TRG-2细胞、IMR-33细胞、Don细胞、GHK-21细胞、瓜氨酸血症细胞(citrullinemia cell)、邓普斯细胞(Dempsey cell)、Detroit 551细胞、Detroit510细胞、Detroit 525细胞、Detroit 529细胞、Detroit 532细胞、Detroit 539细胞、Detroit548细胞、Detroit 573细胞、HEL 299细胞、IMR-90细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WI-26细胞、Midi细胞、CHO细胞、CV-1细胞、COS-1细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、Vero细胞、DBS-FrhL-2细胞、BALB/3T3细胞、F9细胞、SV-T2细胞、M-MSV-BALB/3T3细胞、K-BALB细胞、BLO-11细胞、NOR-10细胞、C3H/IOTI/2细胞、HSDMiC3细胞、KLN205细胞、McCoy细胞、小鼠L细胞、菌株2071(小鼠L)细胞、L-M菌株(小鼠L)细胞、L-MTK'(小鼠L)细胞、NCTC克隆2472和2555、SCC-PSA1细胞、Swiss/3T3细胞、印度麂细胞(Indian muntjaccell)、SIRC细胞、Cn细胞和詹森细胞(Jensen cell)、Sp2/0、NS0、NS1细胞或其衍生物)。

如本文所使用的，术语“治疗蛋白”是指可以施用于受试者用于治疗疾病或病症的任何蛋白质。在一些示例性实施例中，治疗蛋白可以针对治疗癌症。治疗蛋白可以是具有药理学作用的任何蛋白质，例如抗体、可溶性受体、抗体-药物缀合物或酶。在一些示例性实施例中，治疗蛋白可以是双特异性CD20xCD3抗体。在一些示例性实施例中，治疗蛋白可以是双特异性BCMAxCD3抗体。在一些示例性实施例中，治疗蛋白可以是针对程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的单克隆抗体，如西米普利单抗。在其它实施例中，治疗蛋白可以是双特异性EGFRxCD28抗体、双特异性CD38xCD28抗体、单克隆抗TNF抗体、单克隆抗PD-L1抗体、单克隆抗EGFR抗体、单克隆抗CD20抗体、单克隆抗CD38抗体或单克隆抗LAG3抗体。

如本文所使用的，术语“靶标”是指可以与治疗蛋白特异性相互作用以实现药理学作用的任何分子。例如，抗体的靶标可以是所述抗体所针对的抗原；配体的靶标可以是所述配体优先结合的受体，并且反之亦然；酶的靶标可以是所述酶优先结合的底物等。单一治疗蛋白可以具有多于一个靶标。根据具体应用，多种靶标适合用于本发明的方法中。靶标可以例如存在于细胞表面上，可以是可溶的，可以是胞质的，或者可以固定在固体表面上。靶标可以是重组蛋白。在一些示例性实施例中，靶标可以是CD20、CD3、BCMA、PD-1、EGFR、CD28、CD38、TNF、PD-L1或LAG3。

如本文所使用的，术语“抗药物抗体”或“ADA”是指由受试者的免疫系统产生的靶向治疗蛋白上的表位的抗体。ADA的子集是“中和抗体”或“NAb”，其可以以抑制或中和其药理学活性的方式与治疗蛋白结合。NAb可能影响治疗蛋白的临床功效，并且因此在向受试者施用治疗蛋白时必须对其进行监测。

如本文所使用的，术语“中和剂”是指可以以抑制或中和其药理学活性的方式与治疗蛋白相互作用的分子。中和剂可以是例如，寡核苷酸，如适配体，或蛋白质，如抗体。中和剂可以来源于多种来源，例如，通过化学合成、通过重组产生，或来源于受试者的免疫系统。为了简单起见，由受试者的免疫系统产生的中和抗体(NAb)是本文所讨论的初级中和剂，但应当理解，本发明的方法可以应用于任何中和剂的检测。

可以使用各种测定来对NAb进行监测。NAb测定可以宽泛地分为基于细胞的测定或非基于细胞的测定。基于细胞的测定对非基于细胞的测定的选择取决于所讨论的治疗蛋白、靶标和应用，并且本领域技术人员将能够根据他们的需要选择测定。

基于细胞的测定包括至少一种类型的细胞。治疗蛋白可以与靶标结合，使得细胞事件受到影响，然后可以测量所述细胞事件作为治疗蛋白结合的输出。产生可测量信号或活性的有用细胞事件可以包含例如，受体磷酸化、信号转导途径中下游蛋白质的磷酸化、细胞因子释放、细胞增殖、细胞死亡、次级蛋白的产生或任何其它细胞活性。另外地或可替代地，可以使用响应于由与靶标结合的治疗蛋白引起的细胞事件而表达的报告基因，例如，荧光蛋白，如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)或其任何变体。

对由与靶标结合的治疗蛋白产生的信号的测量和对NAb对所述信号的抑制的测量可以称为“直接”基于细胞的测定。相反，在“间接”基于细胞的测定中，治疗蛋白与靶标的结合抑制可测量信号，并且所述信号的恢复用于检测NAb。为了简单起见，讨论将限于直接基于细胞的测定，虽然本文所描述的方法同样可以应用于间接基于细胞的测定。

本文公开了基于细胞的NAb测定，所述基于细胞的NAb测定包括两种类型的细胞，所述两种类型的细胞在被治疗性双特异性抗体桥接时产生可测量的细胞事件。每种类型的细胞可以在其细胞表面上存在靶标，所述靶标是被双特异性抗体的一个臂识别的抗原。两个靶标的同时结合桥接两个细胞并且产生下游细胞事件，所述下游细胞事件可以作为治疗蛋白结合的指示来测量。用于基于细胞的NAb测定的细胞的实例包含表达人CD20的HEK293/hCD20细胞、内源性表达BCMA的MOLP-8细胞以及Jurkat/NFAT-Luc细胞。Jurkat/NFAT-Luc细胞在其细胞表面上表达CD3和T细胞受体(TCR)。当双特异性抗体，例如双特异性CD20xCD3抗体或双特异性BCMAxCD3抗体，将此细胞与第二细胞桥接时，TCR启动信号转导途径，引起荧光素酶报告基因的表达，从而产生可测量信号。如在实例中进一步描述的，此信号可以通过在测定中存在NAb或通过竞争性药物来降低。

应当理解，根据所测试的治疗蛋白和靶标，许多类型的细胞可以用于本发明的基于细胞的测定，条件是细胞表达或可以被修饰以表达靶标，和/或可以通过产生可测量信号或活性来响应于治疗蛋白与靶标的结合。可以用于本发明的方法的细胞的非限制性实例包含HEK293细胞、HEK293/hCD20细胞、HEK293/MfBCMA细胞、HEK293/hBCMA细胞、NCI-H929细胞、MOLP-8细胞、Jurkat细胞、Jurkat/NFAT-Luc细胞、Jurkat/NFAT-Luc/MfCD3细胞及其经修饰形式。

非基于细胞的测定可以在不存在细胞的情况下检测NAb的存在。一种类型的非基于细胞的测定被称为竞争性配体结合(CLB)测定。CLB测定或如在本文中提及的配体结合测定测量治疗蛋白与靶标的结合，所述靶标可以是例如经纯化的重组蛋白或与所制备的细胞膜相关的天然靶标。靶标可以固定在固相载体如微孔板或珠粒上，从而允许捕获经标记的治疗蛋白，并且所述标记的检测可以用于测量结合。样品中的NAb将阻断治疗蛋白与靶标的结合，从而降低信号。可替代地，可以将治疗蛋白固定到固体表面上，同时标记可溶性靶标，在其它情况下应用相同的原理。标记可以通过例如荧光、化学发光、电化学发光、放射性或亲和纯化来检测和/或产生信号或活性。

由与靶标结合的治疗蛋白产生的信号的测量和对NAb对所述信号的抑制的测量可以称为直接结合测定。相反，在间接结合测定中，治疗蛋白与靶标的结合抑制可测量信号，并且所述信号的恢复用于检测NAb。为了简单起见，讨论将限于直接结合测定，虽然本文所描述的方法同样可以应用于间接结合测定。

本文公开了配体结合NAb测定，所述配体结合NAb测定包括生物素化靶标(例如，PD-1)，所述生物素化靶标固定到亲和素包被的微孔板上并且与钌化治疗蛋白(例如，西米普利单抗)共温育。经标记的西米普利单抗与固定化PD-1的结合允许检测可以用于测量这种结合的信号。如在实例中进一步所讨论的，测定中NAb或竞争性药物的存在可以降低此信号。

第二种类型的非基于细胞的测定被称为基于酶活性的测定。基于酶活性的测定通过将合适的底物转化成产物来测量酶药物产物催化与其作用机制在生物学上相关的反应的能力。酶活性可以通过直接测量酶与其底物的结合或通过测量所产生的产物的量来测量。测定中的NAb或竞争性药物的存在可以通过结合降低或产物产生降低来指示。因此，本文所公开的方法也适用于基于酶活性的测定中的NAb的准确定量。

为了检测样品中NAb的存在，NAb测定应当包含实验条件和对照条件。实验条件包含测试样品中NAb的存在。对照条件可以是例如已知不包含NAb的阴性对照条件。在NAb测定中产生信号或活性作为治疗蛋白与靶标结合的量度，并且与对照条件相比，在实验条件下所述信号的降低是治疗蛋白的中和的量度，并且因此在实验条件下存在NAb，如例如图4B所示。

相反，阳性对照条件可以已知包含NAb或另一种中和剂，并且可以用于例如验证NAb测定或校准其信号。

实验条件与对照条件之间的信号变化也可能是由干扰剂的干扰引起的。本文公开了一种降低所述干扰的方法，使得可以精确地检测样品中NAb的存在。

如本文所使用的，术语“干扰剂”是指NAb测定或样品基质中存在的可能干扰NAb的准确测量的任何分子。干扰可能是由与NAb、治疗蛋白、治疗蛋白靶标或NAb测定的任何组分的缔合引起的。干扰剂的实例可以包含治疗蛋白的可溶性靶标、具有与治疗蛋白类似序列的蛋白质，所述治疗蛋白因此被同一NAb靶向，或来自先前施用治疗蛋白的残留药物。

特定类别的干扰剂可以是存在于样品基质中的“竞争性药物”，所述竞争性药物不是治疗蛋白，但能够与NAb测定的组分竞争性结合，如与治疗蛋白靶标结合。竞争性药物可以是先前施用于受试者的残留药物。在一些示例性实施例中，竞争性药物可以与治疗靶标竞争性结合，所述治疗靶标包含例如，CD20、CD3、BCMA、PD-1、EGFR、CD28、CD38、TNF、PD-L1或LAG3。在一些示例性实施例中，竞争性药物可以是表1中列出的药物或候选药物中的任何药物或候选药物。在一些示例性实施例中，竞争性药物可以是利妥昔单抗、派姆单抗、纳武单抗、奥瑞珠单抗、奥妥珠单抗、奥法木单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、乌妥昔单抗、西妥昔单抗、达雷木单抗或阿达木单抗。

如本文所使用的，术语“减轻剂”是指可以与干扰剂结合以降低或防止NAb测定中的干扰并允许准确检测样品中NAb的任何分子。可以与干扰剂特异性相互作用并防止其干扰NAb、治疗蛋白、靶标或NAb测定的其它组分的任何分子都可以是合适的减轻剂。减轻剂可以是例如，寡核苷酸，如适配体，或蛋白质，如抗体。在一些示例性实施例中，减轻剂可以是针对竞争性药物的阻断抗体，如抗利妥昔单抗阻断抗体、抗派姆单抗阻断抗体或抗纳武单抗阻断抗体。

本文还公开了用于执行本发明的方法的试剂盒。本发明的试剂盒允许用户通过减轻来自竞争性药物的干扰来准确地检测样品中NAb的存在。本发明的试剂盒可以包含例如，治疗蛋白、所述治疗蛋白的靶标、减轻剂、产生信号或活性作为所述治疗蛋白与所述靶标之间的结合的量度的手段，以及试剂盒的使用说明书。所述试剂盒还可以包含可以用作阳性对照的中和剂。所述试剂盒可以另外包含可以用作阳性对照的竞争性药物。

试剂盒可以针对基于细胞的NAb测定或非基于细胞的NAb测定或两者。针对基于细胞的NAb测定的试剂盒可以包括适于表达靶标并产生信号或活性作为治疗蛋白与所述靶标结合的量度的细胞，例如，HEK293/hCD20细胞、Jurkat/NFAT-Luc细胞、MOLP-8细胞或能够表达靶标和/或能够通过产生可测量信号或活性来响应于治疗蛋白与靶标的结合的任何其它细胞。针对基于细胞的NAb测定的试剂盒中的合适的靶标可以是例如，CD20、CD3、BCMA、EGFR、CD28、CD38或其组合。合适的治疗蛋白可以是例如，双特异性CD20xCD3抗体、双特异性BCMAxCD3抗体、双特异性EGFRxCD28抗体或双特异性CD38xCD28抗体。

针对非基于细胞的NAb测定的试剂盒可以包括例如通过用亲和素包被而与靶标和/或治疗蛋白结合的固相载体，例如微孔板或珠粒。所述试剂盒可以另外包括能够例如通过与生物素缀合而与所述固相载体结合的靶标和/或治疗蛋白。所述试剂盒可以进一步包括经标记的靶标和/或治疗蛋白，例如用钌标记的靶标和/或治疗蛋白。针对非基于细胞的NAb测定的试剂盒中的合适的靶标可以是例如，PD-1、TNF、PD-L1、EGFR、CD20、CD38或LAG3。合适的治疗蛋白可以是例如，西米普利单抗或针对上述靶标中的任何靶标的单克隆抗体。

应当理解，本发明不限于以下中的任一种：上述治疗蛋白、靶标、中和剂、基于细胞的测定、细胞类型、非基于细胞的测定、报告基因、标记、干扰剂、竞争性药物或减轻剂，并且可以通过任何合适的手段选择任何治疗蛋白、靶标、中和剂、基于细胞的测定、细胞类型、非基于细胞的测定、报告基因、标记、干扰剂、竞争性药物或减轻剂。

通过参考以下实例，将更充分地理解本发明。然而，以下实例不应被解释为限制本发明的范围。

实例

材料和方法：当由本领域的技术人员实践时，本发明可以利用药物化学、免疫学、分子生物学、细胞生物学、重组DNA技术以及测定技术领域中的常规技术，如在以下文献中描述的技术：例如，Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第3版,2001；Ausubel等人,《精编分子生物学实验指南(ShortProtocols in Molecular Biology)》,第5版,1995；《酶学方法(Methods inEnzymology)》,学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)；MacPherson,Hames和Taylor(编辑),《PCR2：实用方法(PCR 2:A practical approach)》,1995；Harlow和Lane(编辑),《抗体：实验室手册(Antibodies,a Laboratory Manual)》1988；Freshney(编辑),《动物细胞培养(Culture of Animal Cells)》,第4版,2000；《分子生物学方法(Methods inMolecular Biology)》,第149卷(John Crowther,《ELISA指南(The ELISA Guidebook)》),胡马纳出版社(Humana Press)2001，以及这些论文的后期版本(例如，Michael Green,《分子克隆(Molecular Cloning)》(第4版,2012)以及Freshney,《动物细胞培养》(第7版,2015)，以及当前的电子版本。

用于执行本发明的方法的试剂以及本发明的试剂盒的各方面包含生物素化PD-1(靶标)；抗利妥昔单抗抗体α-利妥昔单抗Ab1、α-利妥昔单抗Ab2和α-利妥昔单抗Ab3、抗派姆单抗抗体以及抗纳武单抗抗体(减轻剂)；抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗BCMA抗体、抗PD-1抗体、利妥昔单抗、派姆单抗和纳武单抗(竞争性药物)；以及双特异性抗体CD20xCD3、双特异性抗体BCMAxCD3和西米普利单抗(治疗蛋白)；参见例如，美国专利第9,657,102号和第10,550,193号，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文。阴性对照抗体(例如，hIgG1、hIgG4)可从若干商业来源获得。

适用于执行本发明的方法的细胞以及本发明的试剂盒的各方面包含HEK293/hCD20、MOLP-8、Jurkat/NFAT-Luc和Jurkat/NFAT-Luc/MfCD3细胞，所有这些都可从若干商业来源获得。

荧光素酶测定是根据制造商的指南进行的，参见例如，普洛麦格公司(Promega)和赛默飞世尔公司(ThermoFisher)。

实例1：用于检测针对治疗蛋白的中和抗体(NAb)的基于细胞的测定设计

本实例示出了用于评估治疗蛋白候选物的本发明的基于细胞的中和抗体(NAb)测定的实验设计。简而言之，制备工程化以表达细胞表面人抗原CD20的人永生化B细胞(命名为HEK293/hCD20)。这些细胞表示模拟表达CD20的人癌细胞的测定的“靶细胞”。另外，制备表达T细胞受体(TCR)和细胞表面抗原CD3的人永生化T细胞，并且将其工程化以在TCR/CD3诱导型启动子(激活的T细胞的核因子(NFAT))的控制下表达报告基因(荧光素酶)。这些Jurkat/NFAT-Luc细胞表示模拟患者的免疫细胞的测定的“报告细胞”，当与药物抗体(如双特异性CD20xCD3抗体)桥接时，所述报告细胞能够通过细胞介导的细胞毒性应答来接合并潜在地消除表达CD20的癌细胞，如图1A所示。

添加与CD20和CD3结合的介导T细胞受体(TCR)在报告细胞上的簇聚的抗体(双特异性CD20xCD3药物抗体)引起荧光素酶报告基因的表达并提供稳健的剂量依赖性荧光素酶信号，如图1B所示。添加hIgG4同型对照抗体不产生荧光素酶活性，如由图1B中的空心方形所指示的。

使用Jurkat/NFAT-Luc细胞作为如上所述的报告细胞与MOLP-8细胞作为靶细胞的组合来设计另一种基于细胞的NAb测定。MOLP-8是内源性表达细胞表面蛋白B细胞成熟抗原(BCMA)的多发性骨髓瘤细胞系。双特异性BCMAxCD3抗体可以桥接报告细胞和靶细胞，从而介导TCR在报告细胞上的簇聚，由此引起荧光素酶报告基因的表达并且产生剂量依赖性荧光素酶信号，如图1C所示。测试两种BCMAxCD3抗体，其中虚线指示在后续测定中使用的浓度。

这些结果表明，本发明的基于细胞的测定提供了稳健的剂量应答曲线，并且可预测地响应阳性对照和阴性对照。

实例2：使用基于细胞的NAb测定检测针对治疗蛋白的NAb

本实例示出了本发明的NAb测定的实验设计的概念的进一步证明。在基于细胞的NAb测定中，针对治疗蛋白的NAb抑制治疗蛋白与其靶标和/或报告细胞的结合，并且由此消除报告信号。NAb测定中报告信号或活性的降低是样品中NAb存在的量度。

例如，图2A展示了NAb针对双特异性CD20xCD3药物抗体的作用，其中NAb与双特异性抗体的抗CD20臂或抗CD3臂的结合分别中断与CD20或CD3的结合，从而消除荧光素酶活性。为了进一步验证此基于细胞的NAb测定，将替代NAb添加到NAb测定中，靶向双特异性CD20xCD3药物抗体的抗CD20臂或抗CD3臂。NAb的添加以剂量依赖性方式引起荧光素酶活性的降低，如图2B所示。

进一步验证了这种基于细胞的NAb测定与两种双特异性BCMAxCD3药物抗体一起使用的有效性。将替代NAb添加到NAb测定中，靶向两种双特异性BCMAxCD3药物抗体的抗BCMA臂或抗CD3臂。NAb的添加以剂量依赖性方式引起荧光素酶活性的降低，如图2C、2D、2F和2G所示。添加同型对照对荧光素酶活性没有影响，如图2E和2H所示。

这些结果表明，本发明的测定以剂量依赖性方式可靠地测量针对治疗蛋白的中和抗体的存在。

实例3：竞争性药物对基于细胞的NAb测定的干扰

NAb测定可能由于来自基质组分的干扰而容易出现假阳性或假阴性结果。一个潜在的干扰来源是与所测试的治疗蛋白的靶标竞争性结合的第二药物。作为这种类型的干扰的概念证明，在添加针对CD20或CD3的竞争性抗体的情况下进行双特异性CD20xCD3药物抗体的NAb测定，如图3A和图3B所示。添加竞争性药物引起荧光素酶活性的剂量依赖性降低，从而模拟由替代NAb引起的荧光素酶活性的降低并且因此产生假阳性结果。

在两种双特异性BCMAxCD3药物抗体的NAb测定中还观察到来自竞争性药物的干扰。添加针对BCMA或CD3的二价亲本抗体引起两种测定中荧光素酶信号的降低，如图3C和3E所示。添加针对BCMA的各种临床候选抗体还引起两种测定中荧光素酶信号的降低，如图3D和3F所示。

这些结果表明，竞争性第二药物的存在可以在基于细胞的NAb测定中产生假阳性结果的概念的证明。

实例4：将人血清添加到基于细胞的NAb测定

如上文所讨论的，NAb测定可能容易出现来自基质组分的干扰。为了测试本发明的NAb测定对潜在干扰的恢复力，在添加未经药物处理的人血清的情况下进行双特异性CD20xCD3药物抗体的NAb测定，如图4A所示。荧光素酶活性不受添加人血清的影响，从而证明本发明的NAb测定对来自人血清组分的干扰的恢复力并且因此适合于临床应用。

图4B表明“NAb测定信号”的简单表示。通过用药物对照诱导的荧光素酶活性除以实验样品中诱导的荧光素酶活性来对样品中NAb的相对存在进行定量。在存在NAb的情况下，荧光素酶活性以剂量依赖性方式降低，从而引起更高的NAb测定信号。

实例5：临床样品中基于细胞的NAb测定干扰

使用本发明的NAb测定来测试来自临床试验的60个未经药物处理的人类样品中针对双特异性CD20xCD3药物抗体的NAb的存在，如图5所示。尽管所测试患者未暴露于药物抗体，但许多样品示出了NAb的假阳性结果。

如实例3中所讨论的，NAb测定中假阳性信号的一个可能来源是竞争性第二药物。在本临床试验中的许多患者具有先前抗CD20疗法的病史。为了评估竞争性抗CD20药物是否可能负责NAb测定的假阳性结果，使用可商购获得的ELISA测试17个人类样品的子集中的利妥昔单抗(一种抗CD20抗体)的存在。利妥昔单抗的存在与假阳性NAb测定信号相关，如图6所示。

这些结果表明，来自残留竞争性药物的干扰可能在临床应用中导致NAb测定中的假阳性结果，并且必须得到解决以便准确地检测针对治疗蛋白的NAb。

实例6：竞争性药物对基于细胞的NAb测定干扰的减轻

如上文所描述的，竞争性药物的存在可能干扰NAb测定中治疗蛋白与其靶标的结合，从而导致报告基因活性降低和假阳性NAb测定信号。在图7A中展示了这一点，使用双特异性CD20xCD3药物抗体的实例作为治疗蛋白并且使用利妥昔单抗(一种抗CD20抗体)作为竞争性药物。为了在存在竞争性药物的情况下准确地检测针对治疗蛋白的NAb，必须减轻竞争性药物与相互靶标的结合。在图7B中展示了这一点，即，使用抗利妥昔单抗抗体的实例作为防止来自竞争性药物的干扰并且允许针对治疗蛋白的NAb的准确检测的减轻剂。

测试针对利妥昔单抗的阻断抗体在本发明的NAb测定中减轻干扰的能力。将抗利妥昔单抗抗体在掺有利妥昔单抗的血清中共温育并且添加到NAb测定，如图7C所示。添加抗利妥昔单抗抗体恢复了荧光素酶活性，从而消除由利妥昔单抗引起的假阳性NAb测定信号。

这些结果表明，使用针对竞争性药物的减轻剂可以消除假阳性NAb测定信号并允许针对治疗蛋白的NAb的准确检测。

实例7：临床样品中竞争性药物对基于细胞的NAb测定干扰的减轻

如实例5所示，当针对双特异性CD20xCD3药物抗体测试NAb时，来自临床试验的许多未经药物处理的人类样品产生假阳性NAb测定信号，这潜在地由于存在竞争性药物，抗CD20抗体利妥昔单抗所致。为了减轻来自利妥昔单抗的干扰，使用添加抗利妥昔单抗阻断抗体的临床样品进行NAb测定，如图8所示。样品#1是具有低NAb测定信号的对照样品。样品#2和#3示出了高假阳性NAb测定信号。添加抗利妥昔单抗抗体消除假阳性NAb测定信号。

这些结果证实，临床样品中残留的竞争性药物，在这种情况下利妥昔单抗，可以干扰NAb测定并使得NAb测定结果不准确。这些结果进一步表明，针对竞争性药物的减轻剂可以消除临床应用中的假阳性NAb测定信号。针对竞争性药物的减轻剂的使用允许针对所测试的治疗蛋白的NAb的准确检测。

实例8：用于检测针对治疗蛋白的NAb的配体结合测定设计

本实例示出了用于评估治疗蛋白候选物的本发明的配体结合NAb测定的实验设计。本发明的示例性实施例包括靶标-捕获配体结合NAb测定。简而言之，将样品与生物素化靶标一起温育，并且将所述样品转移到亲和素包被的微孔板上。在随后的步骤中，将钌化药物添加到微孔板中。在不存在NAb的情况下，钌标记的药物与固定化生物素靶标结合，从而在测定中产生信号，如图9A所示。在存在NAb的情况下，钌标记的药物不能与生物素靶标结合，从而引起对测定信号的抑制，如图9B所示。

另外的配体结合NAb测定可以适用于评估针对治疗蛋白的NAb。例如，代替靶标捕获设计，配体结合测定可以被设计成用于药物-捕获：所关注的治疗蛋白被固定，并且靶标经过标记以便产生测定信号。图9C展示了配体结合测定设计，其中生物素化药物固定在亲和素包被的微孔板上，钌化靶标产生测定信号，并且针对固定化药物的NAb阻断与靶标的结合并且由此抑制测定信号。

实例9：竞争性药物对配体结合NAb测定的干扰

与上述基于细胞的NAb测定一样，配体结合NAb测定可能由于来自基质组分的干扰而容易出现假阳性或假阴性结果。一个潜在的干扰来源是与所测试的治疗蛋白的靶标竞争性结合的第二药物，如图10A所示。例如，药物抗体西米普利单抗、派姆单抗和纳武单抗共享同一药物靶标PD-1。如果通过使用钌化西米普利单抗与生物素化PD-1的结合来产生信号，从而测试临床样品中针对抗西米普利单抗的NAb，则临床样品中任何残留的派姆单抗、纳武单抗或未经标记的西米普利单抗将与靶标竞争性结合，从而抑制测定信号并且引起NAb存在的假阳性结果。

作为概念证明，将渐增浓度的西米普利单抗、派姆单抗或纳武单抗添加到针对西米普利单抗的NAb的靶标-捕获NAb测定中，如图10B所示。浓度高于125ng/mL的西米普利单抗、派姆单抗或纳武单抗抑制来自钌化西米普利单抗的信号，从而产生假阳性NAb测定信号。

这些结果表明，竞争性药物的存在可能导致假阳性配体结合NAb测定信号，并且必须得到解决以便准确地检测针对治疗蛋白的NAb。

实例10：竞争性药物对配体结合NAb测定干扰的减轻

如以上所描述的，竞争性药物的存在可能干扰配体结合NAb测定中治疗蛋白与其靶标的结合，从而导致信号降低和假阳性NAb测定信号。为了在存在竞争性药物的情况下准确地检测针对治疗蛋白的NAb，必须减轻竞争性药物与相互靶标的结合。在图11A中展示了这一点，使用抗派姆单抗或抗纳武单抗抗体的实例作为防止来自竞争性药物的干扰并且允许针对治疗蛋白的NAb的准确检测的减轻剂。

测试针对派姆单抗和纳武单抗的阻断抗体在本发明的NAb测定中减轻干扰的能力。将抗派姆单抗或抗纳武单抗抗体在分别掺有派姆单抗或纳武单抗的样品中共温育并且添加到配体结合NAb测定，如图11B所示。添加针对竞争性药物的减轻剂消除由与靶标竞争性结合引起的假阳性NAb测定信号。

这些结果表明，使用针对竞争性药物的减轻剂可以消除配体结合测定中的假阳性NAb测定信号，并且允许针对治疗蛋白的NAb的准确检测。

Claims

1.一种用于检测样品中针对治疗蛋白的中和剂的方法，所述方法包括：

(a)使具有所述中和剂和竞争性药物的所述样品与所述治疗蛋白、所述治疗蛋白的靶标和减轻剂接触；

(b)测量所述治疗蛋白与所述靶标的结合；以及

(c)将(b)的结果与对照测量进行比较以检测所述中和剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照测量包含在不存在中和剂的情况下测量所述治疗蛋白与所述靶标的结合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述中和剂是中和抗体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗蛋白选自由以下组成的组：抗体、可溶性受体、抗体-药物缀合物和酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗蛋白是单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述单克隆抗体选自由以下组成的组：抗PD-1抗体、抗TNF抗体、抗PD-L1抗体、抗EGFR抗体、抗CD20抗体、抗CD38抗体和抗LAG3抗体。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗蛋白是双特异性抗体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述双特异性抗体选自由以下组成的组：CD20xCD3抗体、BCMAxCD3抗体、EGFRxCD28抗体和CD38xCD28抗体。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗蛋白固定到固相载体上。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗蛋白经过标记以便进行检测。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述标记能够通过荧光、化学发光、电化学发光、放射性或亲和纯化来检测。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述标记包括钌。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标是抗原、受体、配体或酶底物。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标是细胞表面蛋白。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标是重组蛋白。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标由细胞表达。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是HEK293细胞、MOLP-8细胞、Jurkat细胞或其经修饰形式。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标固定到固相载体上。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标经过标记以便进行检测。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述标记能够通过荧光、化学发光、电化学发光、放射性或亲和纯化来检测。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标是酶底物。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标是CD20、CD3、BCMA、PD-1、EGFR、CD28、CD38、TNF、PD-L1或LAG3。

23.根据权利要求1所述的方法，其另外包括第二靶标。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述竞争性药物是单克隆抗体。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述竞争性药物是利妥昔单抗(rituximab)、派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫单抗(tositumomab)、乌妥昔单抗(ublituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达雷木单抗(daratumumab)或阿达木单抗(adalimumab)。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述竞争性药物是双特异性抗体。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述减轻剂是单克隆抗体。

28.根据权利要求1所述的方法，其包括使用两种、三种、四种或更多种减轻剂。

29.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗蛋白与所述靶标的结合是通过测量以下来测量的：受体磷酸化、信号转导途径中下游蛋白质的磷酸化、细胞因子释放、细胞增殖、细胞死亡或次级蛋白的产生。

30.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗蛋白与所述靶标的结合是通过报告基因的表达来测量的。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述报告基因是荧光素酶。

32.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在使所述样品与所述治疗蛋白或所述靶标接触之前使所述样品与所述减轻剂接触的预处理步骤。

33.一种试剂盒，其包括：

(a)治疗蛋白；

(b)所述治疗蛋白的靶标；

(c)针对所述治疗蛋白的中和剂；

(d)竞争性药物；以及

(e)减轻剂。

34.根据权利要求33所述的试剂盒，其进一步包括表达所述靶标的细胞。

35.根据权利要求34所述的试剂盒，其进一步包括响应于所述治疗蛋白与所述靶标的结合而产生可测量活性或信号的细胞。

36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述活性是荧光素酶的表达。

37.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述靶标固定到固相载体上。

38.根据权利要求33所述的试剂盒，其进一步包括附连到所述治疗蛋白的标记。

39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述标记包括钌。