DE69619405T2 - Verbindungen und verfahren zum nachweis und zur vorbeugung von t.cruzi infektionen - Google Patents
Verbindungen und verfahren zum nachweis und zur vorbeugung von t.cruzi infektionenInfo
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen die Diagnose von T. cruzi-Infektion. Die Erfindung betrifft genauer die Verwendung von einem oder mehreren T. cruzi antigenen Peptiden oder Antikörper dagegen in Verfahren und diagnostischen Kits, um Individuen und Blutvorräte auf T. cruzi-Infektion zu screenen. Die Erfindung ist ebenfalls auf Zusammensetzungen gerichtet, um Chagas-Erkrankung zu verhindern.
- Protozooen-Parasiten sind eine ernste Gesundheitsbedrohung in vielen Bereichen der Welt. Trypanosoma cruzi (T. cruzi) ist ein solcher Parasit, der Millionen von Individuen, primär in Zentral- und Südamerika, infiziert. Infektionen mit diesem Parasiten können Chagas'- Erkrankung verursachen, die zu chronischer Herzerkrankung und einer Vielzahl von Immunsystemabweichungen führen kann. Es wird geschätzt, daß 18 Millionen Menschen in Lateinamerika mit T. cruzi infiziert sind, es gibt jedoch keine verläßliche Behandlung für die klinischen Manifestationen der Infektion. Kein Impfstoff zur Verbeugung von Chagas-Erkrankung ist augenblicklich erhältlich.
- Die am meisten signifikante Route der Übertragung in Regionen, wo die Erkrankung endemisch ist, findet über Kontakt mit einer infizierten Raubwanze statt. In anderen Regionen sind jedoch Bluttransfusionen die vorherrschenden Mittel der Übertragung. Um die Übertragung von T. cruzi in solchen Regionen zu inhibieren, ist es erforderlich, genaue Verfahren zur Diagnose von T. cruzi-Infektion in Individuen und zum Sreening von Blutvorräten zu entwickeln. Blutbank-Screening ist besonders wichtig in Südamerika, wo 0,1%-62% der Proben infiziert sein können und wo der Parasit häufig durch Bluttransfusionen übertragen wird. Es bestehen auch zunehmende Bedenken, daß der Blutvorrat in bestimmten US-Städten mit T. cruzi- Parasiten kontaminiert sein könnte.
- Die Diagnose von T. cruzi-Infektion war problematisch, da genaue Verfahren zum Nachweis des Parasiten, die für den Routinegebrauch geeignet sind, nicht erhältlich waren. Während der akuten Phase der Infektion, die über Jahrzehnte dauern kann, kann die Infektion ruhend verbleiben und der Wirt asymptomatisch sein. Im Ergebnis sind serologische Tests auf T. cruzi- Infektion die am verläßlichsten und die am meisten verbreitet Verwendeten.
- Solche Diagnosen sind jedoch durch den komplexen Lebenszyklus des Parasiten und die verschiedene Immunantworten des Wirts verkompliziert. Der Parasit passiert durch eine epimastigotische Phase in dem Insektenvektor und zwei Hauptphasen in Säugerwirt. Eine Wirtsphase findet im Blut statt (die trypomastigotische Phase) und eine zweite Phase ist intrazellulär (die amastigote Phase). Die multiplen Phasen führen zu einer Diversität von Antigenen, die durch den Parasiten während der Infektion präsentiert werden. Zusätzlich sind Immunantworten gegenüber Protozooen Infektion komplex, und schließen sowohl humorale und Zellvermittelte Antworten gegenüber dem Sortiment von Parasitenantigenen ein.
- Während der Nachweis von Antikörpern gegenüber Parasitenantigenen das am meisten verbreitete und verläßliche Verfahren der Diagnose von klinischen und subklinischen Infektionen ist, sind augenblickliche Tests teuer und schwierig. Die meisten serologischen Tests verwenden Gesamt- oder lysierte T. cruzi und erfordern positive Ergebnisse bei zwei von drei Tests, einschließlich Komplementfixation, indirekter Immunfluoreszenz, passiver Agglutinierung oder ELISA, um T. cruzi-Infektion genau nachzuweisen. Die Kosten und Schwierigkeiten von solchen Tests haben das Screening von Blut oder Seren in vielen endemischen Bereichen verhindert.
- Demzufolge besteht ein Bedarf in der Technik für spezifischere und sensitivere Verfahren zum Nachweis von T. cruzi-Infektionen in Blutvorräten und Individuen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und stellt weiterhin andere zusammenhängende Vorteile zur Verfügung.
- Kurz gesagt, stellt diese Erfindung Verbindungen und Verfahren zum Nachweis und Schutz gegenüber T. cruzi-Infektion in Individuen und Blutvorräten zur Verfügung, und für das Screening auf T. cruzi-Infektion in biologischen Proben. In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweis von T. cruzi-Infektion in einer biologischen Probe zur Verfügung, umfassend (a) in Kontakt bringen der biologischen Probe mit einem Polypeptid, umfassend ein Epitop eines T. cruzi-Antigens, das eine Aminosequenz aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22 angegebene Nukleotidsequenz kodiert wird, oder eine Variante eines solchen Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet; und (b) Nach weisen die Anwesenheit von Antikörpern, die an das Polypeptid binden in der biologischen Probe, wodurch T. cruzi-Infektion in der biologischen Probe nachgewiesen wird.
- In einem anderen Aspekt dieser Erfindung werden Polypeptide zur Verfügung gestellt, die ein Epitop eines T. cruzi-Antigens umfassen, das eine Aminosequenz aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 21 angegebenen Nukleotidsequenz kodiert wird, oder eine Variante eines solchen Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet.
- Innerhalb verwandter Aspekte werden DNA-Sequenzen, die für die oben genannten Polypeptide kodieren, Expressionsvektoren, die diese DNA-Sequenzen umfassen und mit solchen Expressionsvektoren transformierte oder transfizierte Wirtszellen ebenfalls zur Verfügung gestellt.
- In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung diagnostische Kits zum Nachweis von T. cruzi-Infektion in einer biologischen Probe zur Verfügung, umfassend (a) ein Polypeptid, das ein Epitop eines T. cruzi-Antigens umfaßt, das eine Aminosequenz aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22 angegebene Nukleotidsequenz kodiert wird, oder eine Variante solch eines Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet; und (b) ein Nachweisreagenz.
- In noch einem anderen Aspekt der Erfindung werden Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von T. cruzi-Infektionen in einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, umfassend (a) in Kontakt bringen einer biologischen Probe mit einem monoklonalen Antikörper, der an ein Epitop eines T. cruzi-Antigens bindet, die eine Aminosequenz aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22 angegebene Nukleotidsequenz kodiert wird, oder eine Variante von solch einem Antigen, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet; und (b) Nachweisen der Anwesenheit von 71 cruzi-Parasiten in der biologischen Probe, die an den monoklonalen Antikörper binden.
- Innerhalb verwandter Aspekte werden pharmazeutische Zusammensetzungen, die die oben genannten Polypeptide und einen physiologisch akzeptablen Träger umfassen und Zusammensetzungen, die die oben genannten Polypeptide in Kombination mit einem Adjuvants umfassen, ebenfalls zu Verfügung gestellt.
- Die vorliegende Erfindung stellt innerhalb anderer Aspekte auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Induktion von protektiver Immunität gegen Chagas'-Erkrankungen in einem Patienten zur Verfügung. Dies kann ein Verabreichen einer wie oben beschriebenen Zusammensetzung oder pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten umfassen.
- Innerhalb anderer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweis von T. cruzi-Infektion in einer biologischen Probe zur Verfügung, umfassend (a) in Kontakt bringen der biologischen Probe mit einem ersten Polypeptid, umfassend ein Epitop eines T. cruzi- Antigens, das eine Aminosequenz aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22 angegebene Nukleotidsequenz kodiert wird, oder eine Variante des Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet, (b) in Kontakt bringen der biologischen Probe mit einem oder mehreren weiteren Polypeptiden, die ein oder mehrere Epitope von anderen T. cruzi-Antigenen umfaßt, oder eine Variante davon, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet; und (c) Nachweisen der Anwesenheit von Antikörpern in der biologischen Probe, die an eines oder mehrere der Polypeptide binden, wodurch T. cruzi-Infektion in der biologischen Probe nachgewiesen wird. In einer Ausführungsform umfaßt das zusätzliche Polypeptide ein Epitop von TcD oder eine Variante davon, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet. In einer anderen Ausführungsform umfassen die zusätzlichen Polypeptide ein Epitop von TcD (oder eine Variante davon die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet) und ein Epitop von TcE (oder eine Variante davon, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet). In noch einer anderen Ausführungsform umfassen die zusätzlichen Polypeptide ein Epitop von TcD (oder eine Variante davon, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet) und PEP-2 (oder eine Variante davon, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet).
- In noch weiteren Aspekten stellt die vorliegende Erfindung Kombinationspolypeptide zur Verfügung, die zwei oder mehr Polypeptide umfassen, wobei jedes Polypeptid ein Epitop eines T. cruzi-Antigens umfaßt, das eine Aminosequenz aufweist, die durch eine der in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22 angegebenen Nukleotidsequenzen kodiert wird oder eine Variante davon, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet. Kombinationspolypeptide, die mindestens ein Epitop eines T. cruzi-Antigens, das eine Aminosequenz aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22 angegebene Nukleotidsequenz kodiert werden, oder eine Variante davon, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet und mindestens ein Epitop, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TcD-Epitopen, TcE-Epitopen, PEP-2-Epitopen und Varianten davon, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheiden umfassen, werden ebenfalls zur Verfügung gestellt.
- In verwandten Aspekten werden Verfahren zum Nachweis von T. cruzi-Infektion in einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, umfassend (a) in Kontakt bringen der biologischen Probe mit mindestens einem der oben genannten Kombinationspolypeptide und (b) Nachweisen der Anwesenheit von Antikörpern in der biologischen Probe, die an das Kombinationspolypeptid binden.
- Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nach Berücksichtigung der folgenden genauen Beschreibung und der beigefügten Zeichnungen ersichtlich werden. Alle hier beschriebenen Referenzen sind hierdurch durch Bezug in ihrer Gesamtheit aufgenommen, als ob jedes hier einzeln aufgenommen wäre.
- Fig. 1 zeigt einen Graphen, der die Reaktivität von T. cruzi-Lysat und einen repräsentativen Polypeptid der vorliegenden Erfindung (rTcc6) in einem ELISA-Test vergleicht, der unter der Verwendung von Seren von T. cruzi-infizierten (Pos) und nicht infizierten (Neg) Individuen durchgeführt wurde. Die Balken stellen ±1 Standardabweichung dar.
- Fig. 2 ist ein Graph, der ein Vergleich der Reaktivität von repräsentativen Polypeptiden der vorliegenden Erfindung in einem ELISA-Test zeigt, der unter Verwendung von Seren von T. cruzi-infizierten (Pos) und nicht infizierten (Neg) Individuen durchgeführt wurde. Experiment 1 zeigt einen Vergleich von rTcc22 und den Peptiden Tcc22-1 und Tcc22-1+; Experiment 2 zeigt einen Vergleich von rTcc22, rTcHi12 und den Peptiden Tcc22-1, Tcc22-1+ und Tcc22- 2.1. Die Balken stellen ±1 Standardabweichung dar.
- Fig. 3 ist ein Graph, der einen Vergleich der Reaktivität von T. cruzi-Lysat und einem repräsentativen Polypeptid (Tcc38) in einem ELISA-Test darstellt, der unter der Verwendung von Seren von. T. cruzi-infizierten (Pos) und nicht infizierten (Neg) Individuen durchgeführt wurde, sowie unter der Verwendung von Seren von Individuen mit viszeraler Leishmaniasis (VL), kutaner Leishmaniasis (CL), Tuberkulose (TB) und Malaria. Die Balken stellen ±1 Standardabweichung dar.
- Fig. 4 zeigt einen Graphen, der einen Vergleich der Reaktivität von T. cruzi-Lysat und verschiedenen Polypeptiden der vorliegenden Erfindung darstellt, die verschiedene Leserahmen der TcLO1- und TcHi10-Antigene darstellen, in einem ELISA-Test, der unter der Verwendung von Seren von T. cruzi-infizierten (Pos) und nicht infizierten (Neg) Individuen durchgeführt wurde. Die Balken zeigen + 1 Standardabweichung.
- Fig. 5 ist ein Graph, der die Reaktivität von T. cruzi-Lysat und einem repräsentativen Polypeptid (TccLo1.2) in einem ELISA-Test vergleicht, der unter der Verwendung von Seren von T. cruzi-infizierten (Pos) und nicht infizierten (Neg) Individuen durchgeführt wurde, sowie mit Seren von Individuen mit viszeraler Leishmaniasis (VL), kutaner Leishmaniasis (CL), Malaria und Tuberkulose (TB).
- Fig. 6 zeigt einen Graphen, der die ELISA-Reaktivität einer Serie von Polypeptidkombinationen mit T. cruzi positiven und negativen Seren zeigt.
- Fig. 7 zeigt einen Graphen, der die ELISA-Reaktivität einer Serie von TcE-Polypeptid- Varianten mit T. cruzi positiven und negativen Seren darstellt.
- Fig. 8 zeigt einen Graphen, der die ELISA-Reaktivität von zwei Dipeptiden, einem Tripeptid und einem Tetrapeptid der vorliegenden Erfindung mit T. cruzi positiven und negativen Seren vergleicht.
- Fig. 9 ist ein Graph, der die ELISA-Reaktivität eines repräsentativen Polypeptids der vorliegenden Erfindung (TcHi29) und von TcE mit Seren von normalen Individuen, T. cruzi- Patienten und Patienten mit anderen Erkrankungen darstellt.
- Fig. 10 ist ein Graph, der die ELISA-Reaktivität von zwei repräsentativen Dipeptidgemischen mit T. cruzi positiven und negativen Seren vergleicht, wobei ein Gemisch ein TcE- Epitop einschließt und das andere ein TcHi29-Epitop der vorliegenden Erfindung einschließt.
- Wie oben angegeben, ist die vorliegende Erfindung allgemein auf Verbindungen und Verfahren zum Nachweis und dem Schutz gegen T. cruzi-Infektion in Individuen und Blutvorräten gerichtet. Die Verbindungen dieser Erfindung umfassen im allgemeinen ein oder mehrere Epitope von T. cruzi-Antigenen. Insbesondere sind Polypeptide, die ein Epitop eines T. cruzi- Antigens umfassen, das eine Aminosequenz aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22 angegebene, Nukleotidsequenz kodiert wird, bevorzugt. Wie hier verwendet, umfaßt der Begriff "Polypeptid" Aminosäureketten von jeder Länge, einschließlich Vollängen (d. h. nativen) Antigenen. Daher kann ein Polypeptid, das ein Epitop, umfaßt vollständig aus dem Epitop bestehen oder zusätzliche Sequenzen enthalten. Diese zusätzlichen Sequenzen können von dem nativen Antigen abstammen oder heterolog sein, und solche Sequenzen können (müssen jedoch nicht) antigenisch sein. Ein Protein, das eine bestimmte Aminosäuresequenz "aufweist" ist ein Protein, das innerhalb seiner Gesamtlängensequenz die angegebene Sequenz enthält. Solch ein Protein kann oder kann nicht eine zusätzlich Aminosäuresequenz enthalten. Die Verwendung von einem oder mehreren Epitopen von zusätzlichen T. cruzi-Proteinen, vorher oder in Kombination mit einem oder mehreren Epitopen von Sequenzen hier angegebener, um die Sensitivität und Spezifität der Diagnose zu verstärken, wird ebenfalls vorgesehen.
- Ein "Epitop", wie hier verwendet, ist ein Teil eines T. cruzi-Antigens, der mit Seren von T. cruzi-infizierten Individuen reagiert (d. h. ein Epitop wird spezifisch durch einen oder mehrere Antikörper innerhalb solcher Seren gebunden). Epitope der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Antigene können im allgemeinen unter der Verwendung von dem Fachmann in der Technik bekannten Verfahren identifiziert werden, wie zum Beispiel denjenigen, die in Paul, Fundamental Immunology, 3rd Ed., 243-247 (Raven Press, 1993) und darin zitierten Referenzen zusammengefaßt sind. Zum Beispiel kann ein von einem nativen T. cruzi-Antigen abgeleitetes Polypeptid auf die Fähigkeit hin gescreent werden, mit gepoolten Seren zu reagieren, die von T. cruzi-infizierten Patienten erhalten wurden. Geeignete Tests zur Evaluierung der Reaktivität mit T. cruzi-infizierten Seren, wie zum Beispiel ein Enzym-markierter Immunosorbent-Test (ELISA), sind genauer unten beschrieben und in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Ein Epitop eines Polypeptids ist ein Teil, der mit solchen Antiseren zu einem solchen Ausmaß reagiert, das im wesentlichen ähnlich zu der Reaktivität des Vollängenpolypeptids ist. In anderen Worten kann ein Epitop mindestens ungefähr 80% und bevorzugterweise mindestens ungefähr 100% der Antwort erzeugen, die durch das Vollängenpolypeptid in einen Antikörperbindungstest (z. B. einem ELISA) erzeugt wird.
- Die Verbindungen und Verfahren dieser Erfindung schließen auch Varianten der oben genannten Polypeptide ein. Wie hier verwendet, ist eine "Variante" ein Polypeptid, das sich von den angegebenen Polypeptid nur in konservativen Substitutionen oder Modifikationen unterscheidet, so daß es die antigenen Eigenschaften des angegebenen Polypeptids beibehält. Eine "konservative Substitution" ist eine, in der eine Aminosäure für eine andere Aminosäure, die ähnliche Eigenschaften aufweist substituiert wird, so daß ein Fachmann der Peptidchemie erwarten würde, daß die Sekundärstruktur und die hydropathische Natur des Polypeptids im wesentlichen unverändert bleibt. Im allgemeinen stellen die folgenden Gruppen von Aminosäuren konservative Veränderungen dar: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; und (5) phe, tyr, trp, his. Varianten können auch, oder alternativ, andere konservative Modifikationen enthalten, einschließlich der Deletion oder Hinzufügung von Aminosäuren, die einen minimalen Einfluß auf die antigenen Eigenschaften, die Sekundärstruktur und die hydropathische Natur des Polypeptids aufweisen. Zum Beispiel kann das Polypeptid an einen Linker oder andere Sequenz konjugiert werden, um die Synthese zu erleichtern oder die Bindung des Polypeptids an einen festen Träger zu verstärken.
- In einen verwandten Aspekt werden Kombinationspolypeptide offenbart, die Epitope von vielen T. cruzi-Antigenen enthalten. Ein "Kombinationspolypeptid" ist ein Polypeptid, in dem Epitope von verschiedenen T. cruzi-Antigenen oder Varianten davon zusammengefügt sind, zum Beispiel durch eine Peptidbindung oder eine einzelne Aminosäurekette. Die so gebildete Aminosäurekette kann entweder linear oder verzweigt sein. Die Epitope können direkt verbunden sein (d. h. mit keinen dazwischenliegenden Aminosäuren) oder können durch eine Linkersequenz (z. B. Gly-Cys-Gly) verbunden sein, die die antigenen Eigenschaften der Epitope nicht signifikant verändert. Die Peptidepitope können auch durch nicht- Peptidverbindungen verbunden sein, wie zum Beispiel hetero- oder homo-bifunktionelle Mittel, die chemisch oder photochemisch zwischen spezifischen funktionellen Gruppen auf den Peptidepitopen kuppeln, wie zum Beispiel durch Amino-, Carboxyl- oder Sulfhydryl- Gruppen. Bifunktionelle Mittel, die bei den Kombinationspolypeptiden der vorliegenden Erfindung brauchbar angewendet werden können, sind dem Fachmann gut bekannt. Die Epitope können ebenfalls mittels komplementärer Liganden/anti-Liganden-Paare, wie zum Beispiel Avidin/Biotin verbunden werden, wobei ein oder mehrere Epitope an ein erstes Mitglied eines Liganden/anti-Liganden-Paars gebunden werden und dann an das komplementäre Mitglied des Liganden/anti-Liganden-Paars gebunden werden, entweder in Lösung oder in fester Phase. Ein Kombinationspolypeptid kann viele Epitope von hier beschriebenen Polypeptiden enthalten und/oder kann Epitope von einem oder mehreren anderen T. cruzi-Antigenen enthalten, wie zum Beispiel TcD, TcE oder PEP-2, verbunden an ein hier beschriebenes Epitop.
- Im allgemeinen können T. cruzi-Antigene und DNA-Sequenzen, die für solche Antigene kodieren, unter der Verwendung jeder einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine T. cruzi cDNA oder genomische DNA Expressionsbibliothek mit Pools von Seren von T. cruzi-infizierten Individuen gescreent werden. Solche Screens können im allgemeinen unter der Verwendung von Techniken durchgeführt werden, die den Fachmann gut bekannt sind, wie zum Beispiel denjenigen, beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Kurz kann die Bakteriophagen-Bibliothek plattiert werden und auf Filter transferiert werden. Die Filter können dann mit Serum und einem Nachweisreagenz inkubiert werden. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung ist ein "Nachweisreagenz" jede Verbindung, die in der Lage ist, an den Antikörper-Antigen-Komplex zu binden, die dann durch jedes einer Vielzahl von dem Fachmann bekannten Mitteln nachgewiesen werden kann. Typische Nachweisreagenzien für Screening-Zwecke enthalten ein "Bindungsmittel" wie zum Beispiel Protein A, Protein G, IgG oder ein Lectin, gekuppelt an eine Reportergruppe. Bevorzugte Reportergruppen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Enzyme, Substrate, Co-Faktoren, Inhibitoren, Farbstoffe, Radionuklide, lumineszente Gruppen, fluoreszente Gruppen und Biotin. Weiter bevorzugt ist die Reportergruppe Rettichperoxidase, die durch Inkubation mit einem Substrat, wie zum Beispiel Tetramethylbenzidin oder 2,2'-Azino-di-3- ethylbenzthiazolinsulfonsäure nachgewiesen werden kann. Plaques, die cDNAs enthalten, die ein Protein exprimieren, das an einen Antikörper in dem Serum bindet, können durch dem Fachmann bekannte Techniken isoliert werden und gereinigt werden. Geeignete Verfahren können z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 gefunden werden.
- DNA-Moleküle, die die in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 18 angegebenen Nukleotidsequenzen aufweisen, können durch Screenen einer T. cruzi genomischen Expressionsbank mit Pools von Seren von T. cruzi-infizierten Individuen, wie oben beschrieben, isoliert werden. Genauer gesagt können DNA-Moleküle, die die in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 16 angegebenen Nukleotid-Sequenzen aufweisen, durch Screenen der Bibliothek mit einem Pool von Seren isoliert werden, die serologische Reaktivität (in einem ELISA oder Western-Test) mit Parasitenlysat und/oder beiden der T. cruzi-Antigene TcD und TcE zeigen, beschrieben in U.S.- Patent Nr. 5,304,371 und U.S. Serial No. 08/403,379, angemeldet 14 März 1995. Ein nachfolgender Screen wird dann mit Patientenseren durchgeführt, denen nachweisbarer anti-TcD Antikörper fehlt. Ein DNA-Molekül, das die in SEQ ID NO: 17 (5'-Ende) und SEQ ID NO: 18 (3'-Ende) angegebenen Nukleotid-Sequenzen aufweist, kann durch Screenen der genomischen Expressionsbibliothek mit einem Pool von Seren isoliert werden, die eine geringere serologische Reaktivität (d. h. weist ein Signal von weniger als 3 Standardabweichungen über die Hintergrundreaktivität in einem ELISA oder Western-Test nach) mit Lysat, TcD und TcE zeigen, gefolgt von einem nachfolgenden Screen mit Patientenseren, denen nachweisbarer anti-TcD-Antikörper fehlt.
- DNA-Moleküle, die die in SEQ ID NO: 19-SEQ ID NO: 22 angegebenen Sequenzen aufwiesen, können durch Screenen einer nichtamplifizierten T. cruzi cDNA Expressionsbank mit Seren (sowohl höherer und niedrigerer serologischer Reaktivität) von T. cruzi-infizierten Individuen, wie oben beschrieben erhalten, werden.
- Alternativ können DNA-Moleküle, die die in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22 angegebenen Sequenzen aufweisen aus T. cruzi genomischer DNA oder cDNA über Polymerase- Kettenreaktion amplifiziert werden. Für diesen Ansatz können Sequenz-spezifische Primer auf Basis der in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22 zur Verfügung gestellten Sequenzen entworfen werden und gekauft oder synthetisiert werden. Ein amplifizierter Teil der DNA- Sequenzen kann dann dazu verwendet werden, um die Vollängen oder genomischen cDNA- Klone unter der Verwendung von gut bekannten Techniken, wie z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben, zu isolieren.
- Epitope von Antigenen, die durch die oben angegebenen DNA-Sequenzen kodierte Aminosäuresequenzen aufweisen, können im allgemeinen durch Erzeugen von Polypeptiden, die Teile des nativen Antigens enthalten, und Evaluieren der Reaktivität dieser Polypeptide mit Seren von T. cruzi-infizierten Individuen identifiziert werden, wie oben beschrieben. In vielen Fällen enthalten Peptide, die eine oder mehrere in dem nativen Antigen gefundene repetitive Sequenzen umfassen, ein Epitop. Solche repetitiven Sequenzen können basierend auf der Inspektion der oben genannten Nukleotid-Sequenzen identifiziert werden. Repräsentative repetitive Sequenzen für Antigene, die durch die oben angegebenen DNA-Sequenzen kodiert werden, werden in SEQ ID NO: 23-SEQ ID NO: 36 und SEQ ID NO: 47-SEQ ID NO: 49 zur Verfügung gestellt. Weiter spezifisch werden repetitive Sequenzen für die in SEQ ID NO: 3 angegebene Sequenz in SEQ ID NO: 23 (Leserahmen 1), SEQ ID NO: 24 (Leserahmen 2) und SEQ ID NO: 25 (Leserahmen 3) zur Verfügung gestellt. Repetitive Sequenzen für die in SEQ ID NO: 4 angegebene Sequenz sind in SEQ ID NO: 26 (Leserahmen 1) und SEQ ID NO: 27 (Leserahmen 3) zur Verfügung gestellt und repetitive Sequenzen für SEQ ID NO: 9 sind in SEQ ID NO: 47 (Leserahmen 1), SEQ ID NO: 48 (Leserahmen 2) und SEQ ID NO: 49 (Leserahmen 3) zur Verfügung gestellt. Für SEQ ID NO: 12 sind repetitive Sequenzen in SEQ ID NO: 28 (Leserahmen 1), SEQ ID NO: 29 (Leserahmen 2) und SEQ ID NO: 30 (Leserahmen 3) zur Verfügung gestellt. SEQ ID NO: 31 gibt eine repetitive Sequenz für SEQ ID NO: 15 an. Für SEQ ID NO: 16 werden repetitive Sequenzen in SEQ ID NO: 32 (Leserahmen 2) und SEQ ID NO: 33 (Leserahmen 3) zur Verfügung gestellt. Zuletzt werden repetitive Sequenzen für SEQ ID NO: 18 in SEQ ID NO: 34 (Leserahmen 1), SEQ ID NO: 35 (Leserahmen 2) und SEQ ID NO: 36 (Leserahmen 3) zur Verfügung gestellt.
- Die hier beschriebenen Polypeptide können unter Verwendung von dem Durchschnittsfachmann gut bekannten Techniken erzeugt werden. Polypeptide, die weniger als ungefähr 100 Aminosäuren und im allgemeinen weniger als ungefähr 50 Aminosäuren aufweisen, können z. B. unter der Verwendung der Merrifield Festphasen Syntheseverfahren synthetisiert werden, wobei Aminosäuren nacheinander zu einer wachsenden Aminosäurekette hinzugefügt werden können. Siehe Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1983. Ausrüstung für die automatisierte Synthese von Polypeptiden ist von Herstellern, wie z. B. Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, käuflich erhältlich. Daher können z. B. Polypeptide, die die oben genannten repetitiven Sequenzen oder Teilen davon umfassen, durch dieses Verfahren synthetisiert werden. Ähnlich können Epitope von anderen nativen Antigenen oder Varianten davon unter der Verwendung eines automatisierten Synthesizers hergestellt werden.
- Alternativ können die Polypeptide dieser Erfindung durch Expression von rekombinanter DNA, die für das Polypeptid kodiert, in kultivierten Wirtszellen hergestellt werden. Bevorzugterweise sind die Wirtszellen E. coli, Hefe, eine Insekten-Zellinie (wie z. B. Spodoptera oder Trichoplusia) oder eine Säuger-Zellinie, einschließlich (jedoch nicht begrenzt auf) CHO, COS und NS-1. Die auf diese Weise exprimierten DNA-Sequenzen können für natürlich vorkommende Proteine, wie z. B. Vollängen-Antigene kodieren, welche die durch die DNA- Sequenz der SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22 kodierten Aminosäure-Sequenzen aufweisen, Teile von natürlich auftretenden Proteinen oder Varianten von solchen Proteinen. Repräsentative Polypeptide, die durch solche DNA-Sequenzen kodiert werden, werden in SEQ ID NO: 37-SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52 und SEQ ID NO: 65 zur Verfügung gestellt.
- Exprimierte Polypeptide dieser Erfindung werden im allgemeinen in im wesentlichen reiner Form isoliert. Bevorzugterweise werden die Polypeptide in einer Reinheit von mindestens 80 Gew.-%, weiter bevorzugt in einer Reinheit von mindestens 95 Gew.-% und am meisten bevorzugt in einer Reinheit von mindestens 99 Gew.-% isoliert. Im allgemeinen kann eine solche Reinigung unter der Verwendung von, z. B., den Standardtechniken der Ammoniumsulfat- Fraktionierung, SDS-PAGE-Elektrophorese und Affinitätschromatographie erreicht werden.
- In einem anderen Aspekt dieser Erfindung werden Verfahren zum Nachweis von T. cruzi- Infektionen Individuen und Blutvorräten beschrieben. In einer Ausführungsform kann die T. cruzi-Infektion in jeder biologischen Probe nachgewiesen werden, die Antikörper enthält. Bevorzugterweise ist die Probe Blut, Serum, Plasma, Speichel, cerebrospinale Flüssigkeit oder Urin. Weiter bevorzugt ist die Probe eine Blut- oder Serumprobe, die von einem Patienten oder einem Blutvorrat erhalten wurde. Kurz gesagt, kann die T. cruzi-Infektion unter der Verwendung von einem oder mehrerer der oben beschriebenen Polypeptide oder Varianten davon nachgewiesen werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern gegen das Polypeptid oder Polypeptide in der Probe relativ zu einem vorbestimmten cut-off-Wert zu bestimmen.
- Es gibt eine Vielzahl von Testformaten, die dem Fachmann bekannt sind, zur Verwendung von gereinigtem Antigen, um Antikörper in einer Probe nachzuweisen. Siehe, z. B. Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt der Test die Verwendung von auf einem festen Träger immobilisierten Polypeptid ein, um an den Antikörper zu binden und ihn aus der Probe zu entfernen. Der gebundene Antikörper kann dann unter der Vewendung eines Nachweisreagenz nachgewiesen werden, das an den Antikörper-Peptid-Komplex bindet und eine nachweisbare Reportergruppe enthält. Geeignete Nachweisreagenzien schließen Antikörper, die an den Antikörper/Polypeptidkomplex binden und freie Polypeptide, die mit einer Reportergruppe markiert sind, ein (z. B. in einem semi-kompetitiven Test). Alternativ kann ein kompetitiver Test verwendet werden, in dem ein Antikörper, der an das Polypeptid bindet, mit einer Reportergruppe markiert ist und es ihm ermöglicht wird, an das immobilisierte Antigen nach Inkubation des Antigens mit der Probe zu binden. Das Ausmaß, in dem die Komponenten der Probe die Bindung des markierten Antikörpers an das Polypeptid inhibieren, zeigt die Reaktivität der Probe mit dem immobilisierten Polypeptid an.
- Der feste Träger kann jedes feste Material sein, das dem Fachmann bekannt ist, an das das Antigen angebracht werden kann. Zum Beispiel kann der feste Träger ein Testtüpfel in einer Mikrotiterplatte oder eine Nitrozellulose- oder eine andere geeignete Membran sein. Alternativ kann der Träger eine Perle oder Scheibe, wie z. B. Glas, Fiberglas, Latex oder ein Plastikmaterial, wie z. B. Polystyrol oder Polyvinylchlorid sein. Der Träger kann auch ein magnetischer Partikel oder ein faseroptischer Sensor sein, wie z. B. diejenigen die z. B. in U.S.-Patent Nr. 5,359,681 beschrieben sind.
- Das Polypeptid kann an den festen Träger unter der Verwendung einer Vielzahl von dem Durchschnittsfachmann bekannten Techniken gebunden werden, die in der Patent- und wissenschaftlichen Literatur reichlich beschrieben sind. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck "gebunden" sowohl nichtkovalente Assoziierung, wie z. B. Adsorption und kovalente Anbringung (die eine direkte Verbindung zwischen dem Antigen und funktionellen Gruppen auf dem Träger oder eine Verbindung mittels eines kreuzvernetzenden Mittels sein kann). Die Bindung durch Adsorption an einen Tüpfel einer Mikrotiterplatte oder an eine Membran ist bevorzugt. In solchen Fällen kann die Adsorption durch in Kontakt bringen des Polypeptids in einem geeigneten Puffer mit dem festen Träger für eine ausreichende Zeitdauer erreicht werden. Die Kontaktzeit variiert mit der Temperatur, beträgt jedoch typischerweise zwischen einer Stunde und einem Tag. Im allgemeinen ist ein In- Kontakt-Bringen eines Tüpfels an einer Plastikmikrotiterplatte (wie z. B. Polystyrol oder Polyvinylchlorid) mit einer Menge von Polypeptid, die von ungefähr 10 ng bis 1 ug reicht und bevorzugterweise ungefähr 100 ng, ausreichend, um eine adäquate Menge von Antigenen zu binden. Nitrozellulose wird ungefähr 100 ug Protein pro cm³ binden.
- Die kovalente Anbringung von Polypeptid an einen festen Träger kann im allgemeinen durch zunächst Reagieren des Trägers mit einem bifunktionellen Reagenz erreicht werden, das mit sowohl dem Träger und einer funktionellen Gruppe auf dem Polypeptid reagieren wird, wie z. B. eine Hydroxyl- oder Aminogruppe. Zum Beispiel kann das Polypeptid an Träger gebunden werden, die eine geeignete Polymerbeschichtung aufweisen, unter Verwendung von Benzochinon oder durch Kondensierung einer Aldehydgruppe auf dem Träger mit einem Amin und einem aktiven Wasserstoff auf dem Polypeptid (siehe z. B. Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook (1991) at A12-A13).
- In bestimmten Ausführungsformen ist der Test ein Enzym gekoppelter Immunsorbent-Test (ELISA). Dieser Test kann durch zuerst in Kontakt bringen eines Polypeptid-Antigens, das auf einem festen Träger immobilisiert wurde, im allgemeinen der Tüpfel einer Mikrotiterplatte, mit der Probe durchgeführt werden, so daß es Antikörpern gegen das Polypeptid innerhalb der Probe ermöglicht wird, an das immobilisierte Polypeptid zu binden. Nicht gebundene Probe wird dann von dem immobilisierten Polypeptid entfernt und ein Nachweisreagenz wird hinzugefügt, das in der Lage ist, an den immobilisierten Antikörper-Polypeptid-Komplex zu binden. Die Menge von Nachweisreagenz, die an den festen Träger gebunden bleibt, wird dann unter der Verwendung eines für das spezifische Nachweisreagenz geeigneten Verfahrens bestimmt.
- Sobald das Polypeptid auf dem Träger immobilisiert ist, werden die verbleibenden Protein- Bindungsstellen auf dem Träger typischerweise blockiert. Jedes geeignete Blockierungsmittel, das dem Fachmann bekannt ist, wie z. B. Rinderserumalbumin oder Tween 20TM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Das immobilisierte Polypeptid wird dann mit der Probe inkubiert und Antikörper (wenn in der Probe vorhanden) wird es ermöglicht, an das Antigen zu binden. Die Probe kann dann vor der Inkubation mit einem geeigneten Verdünnungsmittel verdünnt werden, wie z. B. Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Im allgemeinen ist eine geeignete Kontaktzeit (d. h. Inkubationszeit) die Zeitdauer, die ausreichend ist, um den Nachweis der Anwesenheit von T. cruzi-Antikörper innerhalb einer T. cruzi-infizierten Probe zu erlauben. Bevorzugterweise ist die Kontaktzeit ausreichend, um einen Bindungsspiegel zu erhalten, der mindestens 95% von demjenigen ist, der bei Äquilibrium zwischen gebundenem und nicht gebundenem Antikörper erhalten wird. Ein Fachmann wird erkennen, daß die Zeitdauer, die erforderlich ist, um Äquilibrium zu erreichen, leicht durch Messen des Bindungsspiegels bestimmt werden kann, der über eine Zeitdauer hinweg auftritt. Bei Raumtemperatur ist eine Inkubationszeit von ungefähr 30 Minuten im allgemeinen ausreichend.
- Nichtgebundene Probe kann dann durch Waschen des festen Trägers mit einem geeigneten Puffer, wie z. B. PBS, die 0,1% Tween 20TM enthält, entfernt werden. Dann kann Nachweisreagenz zum festen Träger hinzugefügt werden. Ein geeignetes Nachweisreagenz ist jede Verbindung, die an den immobilisierten Antikörper-Polypeptidkomplex bindet und die durch jedes einer Vielzahl von dem Fachmann bekannten Mitteln nachgewiesen werden kann. Bevorzugterweise enthält das Nachweisreagenz ein Bindungsmittel (wie z. B. Protein A, Protein G, Immunglobulin, Lectin oder freies Antigen), konjugiert an eine Reportergruppe. Bevorzugte Reportergruppen schließen Enzyme (wie z. B. Rettichperoxidase), Substrate, Kofaktoren, Inhibitoren, Farbstoffe, Radionuklide, lumineszente Gruppen, fluoreszente Gruppen und Biotin ein. Die Konjugation von Bindungsmittel an die Reportergruppe kann unter der Verwendung von dem Fachmann bekannten Standardverfahren erreicht werden. Verbreitete Bindungsmittel können ebenfalls, an eine Vielzahl von Reportergruppen konjugiert, von vielen Quellen erworben werden (z. B. Zymed Laboratories, Sam Francisco, CA und Pierce, Rockford, IL).
- Das Nachweisreagenz wird dann mit dem immobilisierten Antikörper-Polypeptid-Komplex für eine Zeitdauer inkubiert, die ausreichend ist, um den gebundenen Antikörper nachzuweisen. Eine geeignete Zeitdauer kann im allgemeinen von den Hersteller-Informationen bestimmt werden oder durch Testen des Ausmaßes von Bindung, die über eine Zeitdauer hinweg auftritt. Nicht gebundenes Nachweisreagenz wird dann entfernt und gebundenes Nachweisreagenz wird unter der Verwendung der Reportergruppe nachgewiesen. Das zum Nachweis der Reportergruppe verwendete Verfahren hängt von der Natur der Reportergruppe an. Für radioaktive Gruppen sind im allgemeinen Szintillationszählung oder autoradiographische Verfahren geeignet. Spektroskopische Verfahren können dazu verwendet werden, um Farbstoffe, lumineszente Gruppen und fluoreszente Gruppen nachzuweisen. Biotin kann unter der Verwendung von Avidin, das an eine verschiedene Reportergruppe (im allgemeinen eine radioaktive oder fluoreszente Gruppe oder ein Enzym) gekoppelt ist, nachgewiesen werden. Enzymreportergruppen können im allgemeinen durch die Zugabe von Substrat (im allgemeinen für eine spezifische Zeitdauer), gefolgt von spektroskopischer oder anderer Analyse der Reaktionsprodukte, nachgewiesen werden.
- Um die Anwesenheit oder Abwesenheit von T. cruzi-Antikörpern in der Probe zu bestimmen, wird im allgemeinen das von der Reportergruppe nachgewiesene Signal, das an den festen Träger gebunden verbleibt mit einem Signal verglichen, das einem vorbestimmten cut-off Wert entspricht. Dieser cut-off Wert ist bevorzugterweise das durchschnittliche mittlere Signal, das erhalten wird, wenn das immobilisierte Antigen mit Proben von einem nicht infizierten Patienten inkubiert wird. Im allgemeinen wird eine Probe, die ein Signal erzeugt, das 3 Standardabweichungen oberhalb des Mittels liegt, als positiv für T. cruzi-Antikörper und T. cruzi-Infektion angesehen. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform wird der cut- off Wert unter der Verwendung einer Receiver Operator Kurve nach dem Verfahren von Sakkett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Seiten 106-7 (Little Brown and Co., 1985) bestimmt. Kurz gesagt, kann in dieser Ausführungsform der cut-off Wert, von einem Plot von Paaren von echt positiven Raten (d. h. Sensitivität) und falsch positiven Raten (100%-Spezifität) bestimmt werden, der jedem möglichen cut-off Wert des diagnostischen Testergebnisses entspricht. Der cut-off Wert des Plots, der am dichtesten zur oberen linksseitigen Ecke liegt (d. h. der Wert, der die größte Fläche umfaßt), ist der genaueste cut-off Wert und eine Probe, die ein Signal erzeugt, das höher ist als der durch dieses Verfahren bestimmte cut-off Wert, kann als positiv angesehen werden. Alternativ kann der cut-off Wert auf die linke Seite entlang des Plots verschoben werden, um die falsch positive Rate zu minimieren oder zur rechten, um die falsch negative Rate zu minimieren. Im allgemeinen wird eine Probe, die ein Signal erzeugt, das höher als der durch dieses Verfahren bestimmte cut-off Wert ist, als für T. cruzi-Infektion positiv angesehen.
- In einer ähnlichen Ausführungsform wird der Test in einem Durchfluß- oder Streifentestformat durchgeführt, wobei das Antigen auf einer Membran, wie z. B. Nitrozellulose, immobilisiert ist. In dem Durchflußtest binden Antikörper innerhalb der Probe an das immobilisierte Polypeptid, während die Probe durch die Membran hindurch passiert. Ein Nachweisreagenz (z. B. Protein A-kolloidales Gold) bindet dann an den Antikörper-Polypeptid-Komplex, während die Lösung, die das Nachweisreagenz enthält, durch die Membran hindurch fließt. Der Nachweis von gebundenem Nachweisreagenz kann dann, wie oben beschrieben, durchgeführt werden. In dem Streifentestformat wird ein Ende der Membran, an die Polypeptid gebunden ist, in eine Lösung getaucht, welche die Probe enthält. Die Probe wandert entlang der Membran durch eine Region, die Nachweisreagenz enthält und zu dem Bereich von immobilisiertem Polypeptid. Die Konzentration von Nachweisreagenz an dem Polypeptid zeigt die Anwesenheit von T. cruzi-Antikörpern in der Probe an. Solche Tests können typischerweise mit einer sehr kleinen Menge (z. B. einem Tropfen) vom Patientenserum oder Blut durchgeführt werden.
- Der oben diskutierte Test kann unter der Verwendung von einem oder mehreren der hier beschriebenen Polypeptide durchgeführt werden. Alternativ kann die Sensitivität durch Verwendung von Epitopen von einem oder mehreren T. cruzi-Antigenen in Kombination mit den oben angegebenen Polypeptid(en) verbessert werden. Insbesondere können Epitope von TcD (beschrieben z. B. in U.S.-Patent Nr. 5,304,371), PEP-2 und/oder TcE (die beide z. B. in U.S. Serial No. 08/403,379, angemeldet 14. März 1995 beschrieben sind), in Verbindung mit den/dem oben genannten Polypeptid(en), verwendet werden. Das PEP-2 antigene Epitop wird auch in Peralta et al., J. Clin. Microbiol. 32: 971-74, 1994 diskutiert. Die Sequenz von TcD wird in SEQ ID NO: 50 zur Verfügung gestellt, die Sequenz von TcE wird in SEQ ID NO: 51 zur Verfügung gestellt. Das TcD antigene Epitop weist bevorzugterweise die Aminosäuresequenz Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser (SEQ ID NO: 53) oder die Aminosäuresequenz Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro (SEQ ID NO: 54) auf. Das TcE Epitop weist bevorzugterweise die Aminosäuresequenz Lys Ala Ala Ile Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Thr Ala Pro Ala (SEQ ID NO: 55) oder die Aminosäuresequenz Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala (SEQ ID NO: 56) auf, und das PEP2-Epitop weist bevorzugterweise die Aminosäuresequenz Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala (SEQ ID NO: 57) auf
- Weitere Epitope können innerhalb desselben Polypeptids vorhanden sein (d. h. in einem Kombinationspolypeptid), oder können in separaten Polypeptiden enthalten sein. Bevorzugterweise werden die Polypeptide durch Adsorption an einen festen Träger, wie zum Beispiel einen Tüpfel einer Mikrotiterplatte oder eine Membran immobilisiert, wie oben beschrieben, so daß eine ungefähr gleiche Menge von jedem Polypeptid mit dem Träger in Kontakt kommt und so daß die Gesamtmenge von Polypeptid in Kontakt mit dem Träger von ungefähr 1 ng bis ungefähr 10 ug reicht. Der Rest der Schritte kann im allgemeinen wie oben beschrieben durchgeführt werden.
- Die oben beschriebenen Polypeptide können ebenfalls im Anschluß an die Diagnose unter der Verwendung von einem oder mehreren der Epitope von TcD, TcE und/oder PEP2 verwendet werden. In dieser Ausführungsform werden die Polypeptide der vorliegenden Erfindung dazu verwendet, um eine Diagnose von T. cruzi-Infektion basierend auf einem Screen mit TcD, TcE und/oder PEP2 zu bestätigen. Die Diagnose von T. cruzi-Infektion unter der Verwendung von Epitopen von TcD, TcE und/oder PEP2 wird in U.S. Serial Nr. 08/4013,379, angemeldet am 14. März 1995, beschrieben.
- In noch einem anderen Aspekt dieser Erfindung werden Verfahren zum Nachweis von T. cruzi in einer biologischen Probe unter der Verwendung von monospezifischen Antikörpern (die polyklonal oder monoklonal sein können) gegen eines oder mehrere Epitope wie oben beschrieben, zur Verfügung gestellt. Antikörper, gegen gereinigte oder synthetisierte Polypeptide können durch eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Techniken hergestellt werden. Siehe, z. B., Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. In einer solchen Technik wird ein Immunogen, das das antigene Polypeptid umfaßt, anfänglich in jedes einer großen Auswahl von Säugern (z. B. Mäusen, Ratten, Kaninchen, Schafe und Ziegen) injiziert. Bei diesem Schritt können die Polypeptide dieser Erfindung ohne Modifikation als das Immunogen dienen. Alternativ, insbesondere für relativ kurze Polypeptide, kann eine stärkere Immunantwort hervorgerufen werden, wenn das Polypeptid an ein Trägerprotein angebracht ist, wie zum Beispiel Rinderserumalbumin oder Megathura Crenulata-Hämocyanin. Das Immunogen wird in den Tierwirt injiziert, bevorzugterweise gemäß einem vorgewählten Plan, der einen oder mehrere Booster-Immunisierungen einschließt, und den Tieren wird regelmäßig Blut entnommen. Polyklonale Antikörper, spezifisch für das Polypeptid, können dann von solchen Antiseren durch, zum Beispiel, Affinitätschromatographie unter der Verwendung des Polypeptids, gekuppelt an einen geeigneten festen Träger, gereinigt werden.
- Monoklonale Antikörper, die spezifisch für das antigenische Polypeptid von Interesse sind, können zum Beispiel, unter der Verwendung von Kohler und Milstein. Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976 und Verbesserungen davon hergestellt werden. Kurz gesagt, schließen diese Verfahren die Herstellung von immortalen Zellinien ein, die in der Lage sind Antikörper zu produzieren, die die gewünschte Spezifität aufweisen (d. h. Reaktivität mit dem Polypeptid von Interesse). Solche Zellinien können zum Beispiel aus Milzzellen hergestellt werden, die von einem Tier erhalten wurden, da wie oben immunisiert wurde. Die Milzzellen werden dann durch zum Beispiel Fusion mit einem Myelom-Zellfusionspartner immortalisiert, bevorzugterweise einem, der syngenisch mit dem immunisierten Tier ist. Eine Vielzahl von Fusionstechniken können angewendet werden. Zum Beispiel können die Milzzellen und Myeloma- Zellen mit einem nicht-ionischen Detergens für ein paar Minuten zusammengefügt werden und dann bei geringer Dichte auf einem selektiven Medium ausplattiert werden, das das Wachstum von Hybrid-Zellen unterstützt, jedoch nicht von Myeloma-Zellen. Eine bevorzugte Selektionstechnik verwendet die HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin)-Selektion. Nach einer ausreichenden Zeit, gewöhnlicherweise ungefähr 1 bis 2 Wochen, werden Kolonien von Hybriden beobachtet. Einzelne Kolonien werden selektiert und auf die Bindungsaktivität gegen das Polypeptid getestet. Hybridome, die eine hohe Reaktivität und Spezifität aufweisen, sind bevorzugt.
- Monoklonale Antikörper können von den Überständen von wachsenden Hybridomakolonien isoliert werden. Zusätzlich können verschiedene Techniken verwendet werden, um die Ausbeute zu verbessern, wie zum Beispiel Injektion der Hybridoma-Zellinie in die Peritonealhöhle eines geeigneten Wirbeltierwirts, wie zum Beispiel einer Maus. Monoklonale Antikörper können dann von der Bauchwasserflüssigkeit oder dem Blut geerntet werden. Kontaminanten können durch herkömmliche Techniken von den Antikörpern entfernt werden, wie zum Beispiel Chromatographie, Gelfiltration, Präzipitation und Extraktion.
- Monospezifische Antikörper gegen Epitope von einem oder mehrerer der Polypeptide, die hier beschrieben werden, können dazu verwendet werden, um T. cruzi-Infektion in einer biologischen Probe nachzuweisen, unter der Verwendung jeder einer Vielzahl von Immuntests, die direkt oder kompetitiv sein können. Geeignete biologische Proben zur Verwendung in diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung sind wie oben beschrieben. Kurz, wird in einem direkten Testformat ein monospezifischer Antikörper auf einem festen Träger (wie oben beschrieben) immobilisiert und mit der Probe in Kontakt gebracht, die getestet werden soll. Nach Entfernung der nicht gebundenen Probe kann ein zweiter monospezifischer Antikörper, der mit einer Reportergruppe markiert wurde, hinzugefügt werden und dazu verwendet werden, um gebundenes Antigen nachzuweisen. In einem beispielhaften kompetitiven Test kann die Probe mit dem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper kombiniert werden, der mit einer geeigneten Reportergruppe markiert wurde. Das Gemisch von Probe und Antikörper kann dann mit auf einem geeigneten festen Träger immobilisiertem Polypeptidantigen kombiniert werden. Dem Antikörper, der nicht an ein Antigen in der Probe gebunden hat, wird es ermöglicht, an das immobilisierte Antigen zu binden und der Rest der Probe und Antikörper wird entfernt. Der Spiegel von an dem festen Träger gebundenen Antikörper hängt invers zusammen mit dem Spiegel von Antigen in der Probe. Daher zeigt ein niedrigerer Spiegel von an dem festen Träger gebundenen Antikörper die Anwesenheit von T. cruzi in der Probe an. Um die Anwesenheit oder Abwesenheit von T. cruzi-Infektion nachzuweisen, wird das Signal, das von der Reportergruppe nachgewiesen wird, die an den festen Träger gebunden bleibt, im allgemeinen mit einem Signal verglichen, das einem vorgewählten cut-off-Wert entspricht. Solche cut-off-Werte können im allgemeinen wie oben beschrieben bestimmt werden. Jede der oben im Kontext von ELISAs diskutierten Reportergruppen kann verwendet werden, um die monospezifischen Antikörper zu markieren, und die Bindung kann durch jede einer Vielzahl von Techniken nachgewiesen werden, die für die verwendete Reportergruppe geeignet sind. Andere Formate zur Verwendung von monospezifischen Antikörpern um T. cruzi in einer Probe nachzuweisen, werden dem Fachmann ersichtlich sein und die oben genannten Formate werden lediglich zu Beispielszwecken zur Verfügung gestellt.
- Ebenfalls beschrieben werden Impfstoffe und pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Vorbeugung von T. cruzi-Infektion und Komplikationen dadurch in einem Säuger zur Verfügung gestellt werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen im allgemeinen eines oder mehrere Polypeptide, die ein oder mehrere Epitope von T. cruzi-Proteinen enthalten und einen physiologisch akzeptablen Träger. Die Impfstoffe umfassen eines oder mehrere der oben genannten Polypeptide und Adjuvans zur Verstärkung der Immunantwort.
- Routen und Frequenzen der Verabreichung und Polypeptiddosierungen werden von Individuum zu Individuum variieren und können parallel zu denen liegen, die augenblicklich bei der Immunisierung gegen andere Protozooen-Infektionen verwendet werden. Im allgemeinen können die Zusammensetzungen und Impfstoffe durch Injektion verabreicht werden (z. B. intramuskular, intravenös oder subkutan), intranasal (z. B. Aspiration) oder oral. Zwischen einer und vier Dosen können über eine 2-6 Wochenperiode verabreicht werden. Bevorzugterweise werden zwei Dosen verabreicht, wobei die zweite Dosis 2-4 Wochen später als die erste verabreicht wird. Eine geeignete Dosis ist die Menge von Polypeptid, die effektiv ist, um Antikörper in einem behandelten Säuger hervorzurufen, die ausreichend sind, um den Säuger für eine Zeitdauer vor T. cruzi-Infektion zu schützen. Im allgemeinen reicht die Menge von in einer Dosis vorhandenem Polypeptid von ungefähr 1 pg bis ungefähr 100 mg pro kg von Wirt, typischerweise bis ungefähr 10 pg bis ungefähr 1 mg und bevorzugterweise von ungefähr 100 pg zu ungefähr 1 ug. Geeignete Dosisgrößen werden mit der Größe des Tiers variieren, werden jedoch typischerweise von ungefähr 0,01 ml bis ungefähr 5 ml für ein 10-60 kg Tier reichen.
- Während andere Träger, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, in den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden können, wird der Typ von Träger in Abhängigkeit von dem Verabreichungsmodus variieren. Zur parenteralen Verabreichung, wie zum Beispiel subkutaner Injektion, umfaßt der Träger bevorzugterweise Wasser, Kochsalz, Alkohol, ein Fett, ein Wachs oder einen Puffer. Für orale Verabreichung kann jeder der oben genannten Träger oder ein fester Träger, wie zum Beispiel Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talcum, Zellulose, Glucose, Saccharose und Magnesiumcarbonat verwendet werden. Bioabbaubare Mikrosphären (z. B. Polylactidgalactid) können ebenfalls als Träger für die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden.
- Jedes einer Vielzahl von Adjuvantien können in den hier offenbarten Impfstoffen verwendet werden, um die Immunantwort nicht spezifisch zu verstärken. Die meisten Adjuvantien enthalten eine Substanz, die dazu aufgebaut ist, um das Antigen vor schnellem Katabolismus zu schützen, wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid oder Mineralöl, und einen nicht spezifischen Stimulator der Immunantwort, wie zum Beispiel Lipid A, Bordetella pertussis oder Mycobacterium tuberculosis. Solche Adjuvantien sind zum Beispiel als Freunds unvollständiges Adjuvans oder vollständiges Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI) und Merck Adjuvans 65 (Merck und Company, Inc., Rahway, NJ) käuflich erhältlich.
- Die folgenden Beispiele werden zur Verdeutlichung und nicht zur Begrenzung angeboten.
- Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung von genomischen und cDNA-Molekülen, die für T. cruzi-Antigene kodieren.
- Eine genomische Expressionsbibliothek wurde von zufällig gescherter T. cruzi genomischer DNA (Tulahuen C2 Stamm) unter der Verwendung des Lambda ZAP- Expressionssystems (Stratagene, La Jolla, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers konstruiert. In einem Screen wurde die Bibliothek mit einem Pool von Seren von 5 Patienten gescreent, die eine hohe Reaktivität mit Parasitenlysat und/oder einem oder beiden der T. cruzi-Antigene TcD und TcE, beschrieben in U.S. Patent Nr. 5,304,371 und U.S. Serial Nr. 08/403,379, angemeldet am 14. März 1995, zeigten. Jedes der 5 Patientenseren wurde als reaktiv bestimmt, basierend auf Western- und ELISA-Tests mit Gesamtlysat und/oder TcD oder TcE. Anti-E. coli-Reaktivität wurde aus dem Serum vor dem Screening durch Adsorption entfernt. 50.000 pfu der nicht amplifizierten Bibliothek wurden mit dem Serumpool gescreent und Plaques, die Proteine exprimierten die mit dem Serum reagierten, wurden unter der Verwendung von Protein-A-Meerrettichperoxidase (mit dem ABTS-Substrat) nachgewiesen. Ein nachfolgender Screen wurde dann mit einem Pool von Seren von 3 Patienten durchgeführt, denen nachweisbarer anti-TcD-Antikörper in Western- und ELISA-Tests unter der Verwendung von rekombinatem TcD fehlte.
- Ein ähnlicher Screen wurde unter der Verwendung eines Pools von Seren durchgeführt, die eine niedrigere Reaktivität mit Lysat, TcD und TcE zeigten (d. h. ein Signal von weniger als 3 Standardabweichungen über die Hintergrundreaktivität in einem ELISA- oder Western-Test nachwiesen) gefolgt von einem nachfolgenden Screen mit Patientenseren, denen nachweisebarer anti-TcD-Antikörper fehlte, wie oben beschrieben.
- 28 Klone, die Proteine exprimierten, die mit beide Pools von Seren in mindestens einem der oben genannten Screens reagierten, wurden dann isoliert. Die Exzision des pBSK (-) Phagemids (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Überlappende Klone wurden durch Exonuklease III-Verdau erzeugt und einzelsträngige Template wurden nach Infektion mit VCSM 13 Helferphage isoliert. Die DNA wurde durch die Didesoxyketten-Terminationsmethode oder durch das Taq di-Terminatorsystem unter der Verwendung eines Applied Biosystem automatischen Sequenzierers, Modell 373A, sequenziert.
- Von den 28 Klonen waren 5 vorher beschrieben, 2 waren identisch und 8 enthielten identische Peptidsequenzen, die durch einen degenerierten 42-Basenpaare-Repeat repräsentiert wurden. SEQ ID NO: 16 zeigt den Prototypklon, der die 42-Basenpaar- Repeatsequenz enthält. Demzufolge wurden 14 neue DNA-Sequenzen, die für T. cruzi-Antigene kodierten, unter der Verwendung des oben genannten Screens mit dem reaktiven Pool von Seren hergestellt (gezeigt in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 16, wobei SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 jeweils das 5'- und 3'-Ende eines einzelnen Klons darstellen, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 stellen jeweils die 5'- und 3'-Enden eines einzelnen Klons dar. Eine neue Sequenz wurde durch den Screen unter der Verwendung der Seren mit niedrigerer Aktivität erhalten (gezeigt in SEQ ID NO: 17 (5'- Ende) und SEQ ID NO: 18 (3'-Ende)).
- Poly A+ RNA wurde von der intrazellulären amastigoten Phase von T. cruzi (Tulahuen C2 Stamm) gereinigt. Die RNA wurde revers transkribiert und bei der Konstruktion einer unidirektionalen cDNA-Expressionsbibliothek in dem Lambda UniZAP- Expressionsvektor (Stratagenen, La Jolla, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet. 50.000 pfu der nicht amplifizierten Bibliothek wurden in einem Serumpool gescreent der Patientenseren enthielt, die sowohl eine hohe und niedrige serologische Reaktivität zeigten, gefolgt von einem anschließenden Screen mit Patientenseren, denen nachweisbarer anti-TcD-Antikörper fehlte, wie oben beschrieben. Eine Gesamtzahl von 32 Klonen wurde aus diesem Screen isoliert. 25 dieser Klone waren Proteine des Translationsapparats, die vorher als hoch immunogen identifiziert wurden und alle waren von denjenigen Klonen, die durch Screening der genomischen Expressionsbank identifiziert wurden, verschieden. Die verbleibenden sieben sind durch die in SEQ ID NO: 19-SEQ ID NO: 20 zur Verfügung gestellten Sequenzen dargestellt. Die in SEQ ID NO: 22 angegebene Sequenz ist diejenige von T. cruzi- Ubiquitin.
- Dieses Beispiel zeigt die Synthese von Polypeptiden, die von hier beschriebenen T. cruzi- Antigenen abgeleitete Sequenzen aufweisen.
- Polypeptide können auf einem Millipore 9050 Peptidsynthesizer unter Verwendung von FMOC-Chemie mit HBTU (O-Benztriazol-N,N,N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat) Aktivierung synthetisiert werden. Eine gly-cys-gly-Sequenz kann an den Amino- oder Carboxyl-Terminus des Peptids angefügt werden, um ein Verfahren zur Konjugation oder Markierung des Peptids zur Verfügung zu stellen. Die Abspaltung der Peptide von dem festen Träger kann unter der Verwendung des folgenden Abspaltungsgemischs durchgeführt werden: Trifluoressigsäure : Ethandiol : Thioanisol : Wasser : Phenol (40 : 1 : 2 : 2 : 3). Nach Spaltung für 2 Stunden können die Peptide in kaltem Methyl-t-butylether gefällt werden. Die Peptidpellets können dann in Wasser gelöst werden, das 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) enthält und vor der Reinigung durch D 18 reverse HPLC lyophilisiert werden. Ein Gradient von 0%-60% Acetonitril (enthaltend 0,1% TFA) in Wasser (enthaltend 0,1% TFA) kann dazu verwendet werden um die Peptide zu eluieren. Im Anschluß an die Lyophilisierung der reinen Fraktionen werden die Peptide unter der Verwendung von Elektrospray-Massenspektrometrie und durch Aminosäure-Analyse charakterisiert.
- Dieses Verfahren wurde verwendet, um Peptide wie zum Beispiel Tcc22-1, Tcc22-1+, Tcc22- 2.1 (enthalten in SEQ ID NR: 41), TcLo 1.1, 1.2 und 1.3 (enthalten in SEQ ID NRn 34, 35 und 36) und TcHi10.1 und 10.3 (SEQ ID NRn 26 und 27) zu synthetisieren, die die folgenden Sequenzen aufweisen:
- Dieses Beispiel zeigt die diagnostischen Eigenschaften von verschiedenen rekombinanten Antigenen, die als serologisch aktiv gefunden wurde. Dies schließt Studien der Reaktivität mit T. cruzi positiven und negativen Seren, sowie Kreuzreaktivitäts-Studien mit Seren von Patienten mit anderen Erkrankungen ein.
- Die Tests wurden in 96 Tüpfelplatten (Coming Easiwash, Corning, New York) durchgeführt. Die Tüpfel wurden in 50 ul von Carbonat-Beschichtungspuffer, pH 9,6 beschichtet. Für T. cruzi-Lysat wurden 100 ng/Tüpfel verwendet und für jedes der rekombinanten Antigene wurden 200 ng/Tüpfel verwendet. Die Tüpfel wurden über Nacht bei 4ºC beschichtet (oder 2 Stunden bei 37ºC). Die Platteninhalte wurden dann entfernt und die Tüpfel wurden für 2 Stunden mit 200 ul PBS/1% BSA blockiert. Nach dem Blockierungsschritt wurden die Tüpfel fünfmal mit PBS/0,1% Tween 20TM gewaschen, 50 ul von Seren (entweder positiv oder negativ auf T. cruzi-Infektion), verdünnt 1 : 50 in PBS/0,1% Tween 20/0,1% BSA wurden dann zu jedem Tüpfel hinzugefügt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann nochmals fünfmal mit PBS/0,1% Tween 20TM gewaschen.
- Das Enzymkonjugat (Meerrettichperoxidase-Protein A, Zymed, San Franzisko, CA) wurde dann 1 : 20.000 in PBS/0,1% Tween 20TM/0,1%BSA verdünnt und 50 ul des verdünnten Konjugats wurden zu jedem Tüpfel hinzugefügt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Tüpfel noch fünf mal mit PB S/0,1% Tween 20TM gewaschen. 100 ul des Peroxidasesubstrats, Tetramethylbenzidin (Kirkegaard und Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) wurden unverdünnt zu jedem der Tüpfel hinzugefügt und für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 ul 1 N H&sub2;SO&sub4; zu jedem Tüpfel gestoppt und die Platten wurden bei 450 nm abgelesen.
- Fig. 1 zeigt die Reaktivität des rekombinanten rTcc6 (SEQ ID NO: 39), verglichen mit zu der von T. cruzi-Lysat. Basierend auf einem cut-off des Mittels des Negativwerts plus 3 Standardabweichungen, waren 49 von 50 Serumproben mit Lysat positiv und 34 von 50 waren mit rTcc6 positiv. In einer ähnlichen Studie (gezeigt in Fig. 2) wurde von rekombinantem rTcc22 (SEQ ID NO: 41) gefunden, daß er eine Sensitivität von 79,2% (38 von 48 Serumproben waren positiv) aufweist. Vergleichende Untersuchungen des rekombinanten rTcc38 (SEQ ID NO: 38) mit T. cruzi-Lysat, unter der Verwendung von ähnlichen Kriterien, zeigte, daß 24/39 positiv waren, verglichen mit 39/39 für Lysat (Fig. 3). Tcc38, wenn mit potentiell kreuzreagierenden Seren getestet, zeigte eine verbesserte Spezifität über T. cruzi-Lysat.
- Das rekombinante TcHi12 (SEQ ID NO: 37) wurde ebenfalls als immunreaktiv (Fig. 2) gefunden, und wies ein Sensitivität von 62,5% (15/24) auf.
- Dieses Beispiel verdeutlicht die diagnostischen Eigenschaften von verschiedenen der in Beispiel 2 beschriebenen Peptide. Diese Peptide wurden auf die Reaktivität mit T. cruzi positiven und negativen Seren getestet und in einigen Fällen auf die Kreuzreaktivität mit Seren von Patienten mit anderen, potentiell kreuzreaktiven, Erkrankungen.
- Die erste Gruppe von Peptiden schloß verschiedene Leserahmen ein, um die am meisten reaktive Repeat-Sequenz zu bestimmen. Die getesteten Peptide waren TcLo1.1 (enthalten innerhalb von SEQ ID NO: 34), TcLo1.2 (enthalten innerhalb von SEQ ID NO: 35) und TcLo1.3 (enthalten innerhalb von SEQ ID NO: 36), die Leserahmen 1, 2 und 3 von der in SEQ ID NO: 18 zur Verfügung gestellten DNA-Sequenz darstellen und TcHi10.1 (SEQ ID NO: 26) und TcHi10.3 (SEQ ID NO: 27), die zwei der Leserahmen für die TcHi10-Sequenz (gezeigt in SEQ ID NO: 5) darstellen. Die Daten sind in Fig. 4 gezeigt. Im Fall der TcLo-Rahmen waren sowohl die TcLo1.1- und 1.2-Peptide stark reaktiv, jedoch war das TcLo1.2 im Signal gegenüber Rauschen überlegen, wenn an Seren von T. cruzi positiven und negativen Individuen getestet. TcLo1.3 wies ein niedrigeres Signal auf, jedoch auch niedrigen Hintergrund. In dieser Studie wies das Lysat 24/24 Positive nach, TcLo1.1 wies 21/24 nach, TcLo1.2 wies 23/24 nach und TcLo1.3 wies 15/24 nach. In derselben Studie wiesen die zwei Rahmen TcHi10.1 und 10.3 jeweils 19/24 und 14/24 Positive nach, jedoch mit niedrigerem Signal, als für TcLo1. Die Kreuzreaktivitätsstudien mit diesen verschiedenen Leserahmen zeigen, daß TcLo1.2 eine minimale Kreuzreaktivtät mit den getesteten Seren aufweist (Fig. 5), wenn mit T. cruzi-Lysat verglichen.
- Wie in Beispiel 2 diskutiert wurden überlappende Peptide ebenfalls für rTcc22 synthetisiert, um das aktive Epitop zu bestimmen. Die Peptide Tcc22-1, 1+ und 2 wurden mit T. cruzi positiven und negativen Seren getestet. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Die Tcc22-1+ und Tcc22-2.1-Peptide waren reaktiver, als das Tcc22-1-Peptid. Im ersten Experiment wiesen Tcc22-1 und Tcc22-1+ 29/48 und 36/48 Positive im Vergleich zum rekombinanten Tcc22 nach, das 38/48 Positive nachwies. In einem anschließenden Experiment wurde von Tcc22- 2.1 gezeigt, daß es reaktiv ist, jedoch bei demselben Plattenbeschichtungsspiegel mit weniger Signal als Tcc22-1+.
- Ein Polypeptid, das die TcHi15-Rahmen 3 Repeat-Sequenz aufwies (SEQ ID NO: 49) wurde ebenfalls synthetisiert und in einem ELISA-Test unter der Verwendung eines Beschichtungsspiegels von 200 ng/Tüpfel getestet. Eine Gesamtzahl von 48 T. cruzi positven Seren und 26 negativen Seren wurde getestet, um die Reaktivität dieser Peptidsequenz zu bestimmen. In dieser Studie wies das Peptid eine Sensitivität von 68,75% (wobei es 33 von 48 Positiven nachwies) und eine Spezifität von 92,3% (24 von 36 Negativen) auf, was anzeigte, daß dieses Polypeptid eine potentielle Signifikanz beim Nachweis von T. cruzi-Infektionen aufweist. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 1 unten dargestellt. Tabelle 1 Reaktivität von TcHi15-Rahmen 3 Polypeptid mit T. cruzi positiven und -negativen Seren
- Dieses Beispiel verdeutlicht die diagnostischen Eigenschaften von verschiedenen Peptidkombinationen.
- Das TcLo1.2-Peptid (enthalten innerhalb von SEQ ID NO: 35) wurde in Kombination mit dem synthetischen Peptid TcD und auch den dualen Epitop-Peptiden D/2 (das die TcD- und PEP2- Sequenzen enthält) und D/E (das die TcD- und TcE-Sequenzen enthält) getestet. Diese Kombinationen wurden mit den einzelnen Peptiden sowie den Tripeptid 2/D/E, das TcD, TcE und PEP2 enthält, verglichen. Die verwendete TcD-Sequenz war Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser (SEQ ID NO: 53), die TcE-Sequenz war Lys Ala Ala Ile Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Thr Ala Pro Ala (SEQ ID NO: 55) und die PEP2-Sequenz war Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala (SEQ ID NO: 57).
- Die Daten sind in Fig. 6 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß TcLo1.2 die Reaktivität von TcD, D/2 und D/E verstärken kann, wie in Tabelle 2 zusammengefaßt.
- TcD 62/67
- TcE 50/67
- PEP-2 66/67
- TcLo1.2 61/67
- TcD+TcLo1.2 66/67
- D/2+TcLo1.2 67/67
- D/E+TcLo1.2 67/67
- 2/D/E 67/67
- Diese Ergebnisse zeigen die Verwendung von T. cruzi-Antigenen, wie hier beschrieben, um die serodiagnostischen Eigenschaften von anderen Antigenen zu verstärken.
- Dieses Beispiel verdeutlicht die diagnostischen Eigenschaften von verschiedenen TcE- Repeat-Sequenzen.
- Die Repeat-Sequenz-Region des rekombinanten TcE enthält verschiedene Degenerationen, die zu Resten führen, worin ein A (Alanin), T (Threonin) oder I (Isoleucin) in der Repeat- Sequenz vorhanden sein kann. Um alle Degenerationen darzustellen, wurde die Originalsequenz für das synthetische TcE-Peptid mit einem A, T und I in einem einzelnen Peptid hergestellt, das 3 Repeats enthielt (siehe Beispiel 5). Um die Repeat-Region weiterhin Epitop- zu kartieren und die Zahl von für serologische Aktivität erforderlichen Repeats zu bestimmen, wurden die folgenden Peptide, wie beschrieben in Beispiel 2, hergestellt:
- Original TcE KAAIAPAKAAAAPAKAATAPA (SEQ ID NO: 55)
- TcE(3A) KAAAAPAKAAAAPAKAAAAPA (SEQ ID NO: 58)
- TcE(3T) KAATAPKAATAPAKAATAPA (SEQ ID NO: 59)
- TcE(31) KAAIAP/LKAAIAPAKAAIAPA (SEQ ID NO: 60)
- TcE(2A) KAAAAPAKAAAAPA (SEQ ID NO: 61)
- TcE(AT) KAAAAPAKAATAPA (SEQ ID NO: 62)
- Die serologische Reaktivität dieser Peptide wurde dann verglichen. Eine Gesamtzahl von 24 positiven und 21 negativen Seren wurde mit jeder der TcE-Varianten als der festen Phase in einem wie in Beispiel 3 beschriebenen ELISA-Test getestet, unter der Verwendung von 25 ng/Tüpfel von Peptid. Die Reaktivität der verschiedenen Peptide ist in Fig. 7 gezeigt. Die höchste Reaktivität wurde mit dem 3-Repeat-Peptid gefunden, in dem jeder Repeat ein A an dem degenerierten Rest (TcE(3A)) enthielt. Dieses Peptid zeigte sogar höhere Reaktivität als die Original-TcE-Sequenzen, die einen A, T und I-Rest in den drei Repeats enthielten. Die 31- und 3T-Varianten waren im Gegensatz dazu im wesentlichen negativ mit den getesteten T. cruzi positiven Proben. Die Sequenz, die zwei Repeats mit A (TcE(2A)) enthielt, war klar weniger reaktiv als die 3A-Sequenz und die zwei Repeat-Sequenz mit einem A und einem T (TcE(AT)) war negativ. Basierend auf einen cut-off des Mittels der Negativprobe plus drei Standardabweichungen wies das Original-TcE (A,T,I) 17 von 24 Positiven nach und die 3A- Variante wies 19 von 24 Positiven nach. Es scheint auch so, daß, um eine maximale serologische Aktivität zu erhalten, mindestens drei Repeats erforderlich sind.
- Dieses Beispiel verdeutlicht die diagnostischen Eigenschaften von verschiedenen Multi- Epitop-Peptidkombinationen.
- Zwei Dipeptide, PEP-2/TcLo1.2, das die PEP-2 (SEQ ID NO: 57) und TcLo1.2 (SEQ ID NO: 35) Sequenzen enthielt, und TcD/TcE, das die TcD (SEQ ID NO: 53) und TcE (SEQ ID NO: 55) Sequenzen enthielt, wurden wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert. Die Reaktivität dieser zwei Dipeptide mit T. cruzi-Antikörperpositiven Seren wurde mit der des Tripeptids 2/D/E verglichen. ELISAs wurden wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, unter der Verwendung von PEP-2/TcLo1.2 bei 250 ng/Tüpfel und TcD/TcE bei 50 ng/Tüpfel. Die Ergebnisse dieser Studie sind in Fig. 8 gezeigt. Ein T. cruzi positives Serum, von dem gefunden wurde, daß es nicht mit dem Tripeptid 2/D/E reagiert, wurde beim Screening auf das TcLo1.2-Epitop verwendet. Dieses Serum wurde durch das TcLo1.2-Epitop nachgewiesen und auch wie erwartet durch das Dipeptidgemisch (PEP-2/TcLo1.2 zusammen mit TcD/TcE).
- Ein Tetrapeptid, das die vier immunreaktiven T. cruzi-Epitope PEP-2, TcD, TcE und TcLo1.2 in einer linearen Sequenz enthielt, im folgenden als 2/Lo/2E/D (SEQ ID NO: 63) bezeichnet, wurde wie in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert. Dieses Tetrapeptid wurde bei 100 ng/Tüpfel beschichtet und seine Reaktivität mit T. cruzi positiven und negativen Seren wurde wie in Beispiel 3 beschrieben getestet. Die Reaktivität des Tetrapeptids 2/Lo/2E/D ist in Fig. 8 gezeigt. Das eine T. cruzi positive Serum, das als nicht mit dem Tripeptid 2/D/E reagierend gefunden wurde, wurde, wie erwartet, durch das Tetrapeptid nachgewiesen.
- Die vier immunreaktiven T. cruzi-Epitope PEP-2, TcD, TcE und TcLo1.2 können auch zu einem Reagenz durch die Verwendung eines "verzweigten" Peptids verbunden werden, ausgehend von einer Lysin-Kerngruppe. Der orthogonale Schutz des Lysins, zum Beispiel unter der Verwendung von 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) an der α-Aminogruppe und 1-(4,4- Dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-yliden)ethyl (Dde) an der ε-Aminogruppe wird dazu verwendet, um die selektive Entschützung von einer Aminogruppe in Anwesenheit der anderen zu erlauben, wodurch die Synthese der ersten Peptidkette von entweder der α- oder ε-Gruppe an dem Lysin ermöglicht wird. Diese erste Peptidkette wird mit einer Schutzgruppe terminiert, die nicht während des Verlaufs der Synthese der zweiten Peptidkette entfernt wird. Zum Beispiel könnte eine tert-Butoxycarbonyl (Boc) Aminosäure mit der Dde- und Fmoc- Kombination verwendet werden. Die verbleibende Lysin-Aminoschutzgruppe wird dann entfernt, bevor eine zweite Aminosäurekette von der zweiten Aminogruppe synthetisiert wird. Zum Beispiel wird ε-Dde mit 20% Hydrazin entfernt. Die Abspaltung des verzweigten Peptids von einem festen Träger und die Entfernung der N-α-Boc-Gruppe wird unter der Verwendung von Trifluoressigsäure durchgeführt, wobei Standardprotokolle befolgt werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes können zwei unabhängige Aminosäuresequenzen von einem "Kern"-Lysinrest aufgebaut werden, wie unten gezeigt, was es so verschiedene Kombinationen von TcD, TcE, PEP2, TcLo1.2 und anderen Epitopen erlaubt, an den Kernrest angekuppelt zu werden. Die Reinigung des sich ergebenden Peptids wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.
- Von dem Antigen TcHi29 (SEQ ID NO: 52) wurde gezeigt, daß es ein Polymorph der TcE- Repeat-Sequenz ist. Ein TcHi29-Peptid wurde synthetisiert, das die folgende Sequenz im Vergleich zu TcE aufwies.
- TcE KAAIAPAKAAAAPAKAATAPA (SEQ ID NO: 55).
- TcHi29 KTAAPPAKTAAPPAKTAAPPA (SEQ ID NO: 64)
- Fig. 9 zeigt einen Vergleich der Reaktivität von diesen zwei miteinander verwandten Sequenzen mit Seren von T. cruzi positiven Patienten, sowie von anderen Erkrankungskategorien, wie durch ELISA nachgewiesen, unter der Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens. Die Daten zeigen wenig oder keine Kreuzreaktivität mit den anderen getesteten Erkrankungsgruppen, jedoch überlappte die Verteilung der Reaktivität unter den T. cruzi positiven Seren teilweise für die zwei Peptide. Von den 53 Consensus positiv getesteten Proben, wies TcE 31/53 und TcHi29 36/53 nach. Innerhalb dieser Gruppe wiesen sowohl TcE und TcHi29 24 der selben Seren nach. TcE wies 7 positive Seren nach, die nicht durch TcHi29 nachgewiesen wurden, das im Gegenzug 12 positive Seren nachwies, die durch TcE ausgelassen wurden. Ein Dipeptid, TcD/TcHi29 wurde auch synthetisiert und in Kombination mit den PEP-2/TcLo1.2-Dipeptid im ELISA verwendet (100 ng/Tüpfel TcD/TcHi29, 250 ng/Tüpfel PEP-2/TcLo1.2) und mit der TcD/TcE plus PEP-2/TcLo1.2 Dipeptidkombination verglichen. Wie in Fig. 10 gezeigt, zeigen die Daten an, daß die Gesamtaktivität der zwei Gemische, die untersucht wurden, ähnlich für beide der T. cruzi positiven und negativen Populationen ist und vermuten läßt, daß in solchen Peptidkombinationen TcHi29 als eine Alternative zu TcE betrachtet werden kann.
- Aus dem Vorangegangenen wird es ersichtlich sein, daß, obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindung hier zum Zweck der Verdeutlichung beschrieben wurden, verschiedene Modifikationen gemacht werden können, ohne sich von dem Geist und Bereich der Erfindung zu entfernen.
- (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
- (i) ANMELDER: Corixa Corporation
- (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verbindungen und Verfahren zum Nachweis und zur Vorbereitung von T. cruzi-Infektionen
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 65
- (iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
- (A) EMPFÄNGER: SEED und BERRY LLP
- (B) STRASSE: 6300 Columbia Center, 701 Fifth Avenue
- (C) ORT: Seattle
- (D) STAAT: Washington
- (E) LAND: USA
- (F) POSTLEITZAHL: 98104-7092
- (v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
- (A) DATENTRÄGER: Diskette
- (B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE: Patent In Release 1.0, Version 1.30
- (vi) DATEN DER VORANMELDUNG:
- (A) ANMELDENUMMER:
- (B) ANMELDETAG: 14/11/1995
- (C) KLASSIFIZIERUNG:
- (viii) INFORMATION ZUM ANWALT:
- (A) NAME: Maki, David J.
- (B) REGISTRIERNUMMER: 31,392
- (C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 210121.422PC
- (ix) INFORMATION ZUR TELEKOMMUNIKATION:
- (A) TELEFON: (206) 622-4900
- (B) TELEFAX: (206) 682-6031
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1
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- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NO: 42:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 186 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 106 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 141 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 27 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 117 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 47:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 48:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 117 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 48:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 117 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 49:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 50:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 207 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 51:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 263 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 51:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 52:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 442 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 52:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 53:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 53:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 54:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 54:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 55:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 55:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 56:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 56:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 57:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN: ·
- (A) LÄNGE: 22 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 57:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 58:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 58:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 59:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 59:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 60:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 60:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 61:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 61:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 62:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 62:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 63:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 83 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 63:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 64:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 64:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 65:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 618 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM:
- (D) TOPOLOGIE. linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 65:
Claims (29)
1. Verfahren zum Nachweis einer T. cruzi-Infektion in einer biologischen Probe,
umfassend:
a) In Kontakt bringen der biologischen Probe mit einem Polypeptid, umfassend
ein Epitop eines T. cruzi-Antigens, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die
durch eine in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22 angegebe Nukleotidsequenz
kodiert wird, oder eine Variante des Antigens, die sich nur in konservativen
Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet; und
b) Nachweisen der Anwesenheit von Antikörpern in der biologischen Probe, die
an das Polypeptid binden, und dadurch Nachweisen einer T. cruzi-Infektion in
der biologischen Probe.
2. Ein diagnostischer Kit zum Nachweisen einer T. cruzi-Infektion in einer biologischen
Probe, umfassend:
a) Ein Polypeptid, umfassend ein Epitop eines T. cruzi-Antigens, das eine
Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22
angegebe Nukleotidsequenz kodiert wird, oder eine Variante des Antigens, die
sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen
unterscheidet; und
b) ein Nachweisreagenz.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologische Probe ausgewählt ist aus der
Gruppe bestehend aus Blut, Serum, Plasma, Speichel, cerebrospinaler Flüssigkeit und Urin.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Kit nach Anspruch 2, wobei das Polypeptid an einen
feste Halterung gebunden ist.
5. Verfahren oder Kit nach Anspruch 4, wobei die feste Halterung Nitrocellulose, Latex
oder ein Plastikmaterial umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Schritt des Nachweisens umfaßt:
a) Entfernen nicht gebundener Probe von der festen Halterung;
b) Zugabe eines Nachweisreagenz zu der festen Halterung und
c) Bestimmen des Level an Nachweisreagenz, das an die feste Halterung
gebunden ist, relativ zu einem vorbestimmten Ausschlußwert, und dadurch Nachweis
einer T. cruzi-Infektion in der biologischen Probe.
7. Verfahren nach Anspruch 6 oder Kit nach Anspruch 2, wobei das Nachweisreagenz
eine Reportergruppe umfaßt, die an ein Bindemittel konjugiert ist.
8. Verfahren oder Kit nach Anspruch 7, wobei das Bindemittel ausgewählt ist aus der
Gruppe bestehend aus anti-Immunglobulin, Protein G, Protein A und Lektinen.
9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Reportergruppe aus der Gruppe bestehend aus
Radioisotopen, fluoreszenten Gruppen, lumineszenten Gruppen, Enzymen, Biotin und
Farbstoffpartikeln ausgewählt ist.
10. Polypeptid, umfassend ein Epitop eines T. cruzi-Antigens, das eine
Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 21 angegebene
Nukleotidsequenz kodiert wird, oder eine Variante des Antigens, die sich nur in
konservativen Substitutionen oder Modifikationen unterscheidet.
11. Eine isolierte DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid nach Anspruch 10 kodiert.
12. Ein rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz nach Anspruch
11.
13. Eine Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 12 transformiert oder
transfiziert ist.
14. Wirtszelle nach Anspruch 13, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe
bestehend aus E. coli, Hefe, Insektenzellinien und Säugerzellinien.
15. Verfahren zum Nachweis einer T. cruzi-Infektion in einer biologischen Probe,
umfassend:
a) In Kontakt bringen einer biologischen Probe mit einem monoklonalem
Antikörper, der an ein Epitop eines T. cruzi-Antigens bindet, das eine
Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22
angegebene Nukleotidsequenz kodiert wird, oder eine Variante des Antigens, die sich
nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet;
b) Nachweisen der Anwesenheit von T. cruzi-Parasiten in der biologischen Probe
die an den monoklonalen Antikörper binden, und dadurch Nachweisen einer T.
cruzi-Infektion in der biologischen Probe.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der monoklonale Antikörper an eine feste
Halterung gebunden ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Schritt des Nachweisens umfaßt:
a) Entfernen nicht gebundener Probe von der festen Halterung;
b) Zugabe eines Nachweisreagenz zu der festen Halterung; und
c) Bestimmen des Level von an die feste Halterung gebundenen
Nachweisreagenz, relativ zu einem vorbestimmten Ausschlußwert, und dadurch
Nachweisen einer T. cruzi-Infektion in der biologischen Probe.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Nachweisreagenz eine Reportergruppe
umfaßt, die an einen Antikörper gekoppelt ist.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend:
a) Ein Polypeptid, wobei das Polypeptid ein Epitop eines T. cruzi-Antigens
umfaßt, das eine Aminosäuresequnz aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1-
SEQ ID NO: 22 angegebene Nukleotidsequenz kodiert wird, oder eine Variante
des Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder
Modifikationen unterscheidet; und
b) einen physiologisch akzeptablen Träger.
20. Zusammensetzung zur Stimulierung der Produktion von Antikörpern, die an T. cruzi
binden, umfassend:
a) Ein Polypeptid, wobei das Polypeptid ein Epitop eines T. cruzi-Antigens
umfaßt, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1 -
SEQ ID NO: 22 angegebene Nukleotidsequenz kodiert wird, oder eine Variante
des Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder
Modifikationen unterscheidet; und
b) ein Adjuvans.
21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19 zur Induktion der protektiven
Immunität gegen Chagas'-Erkrankung in einem Patienten.
22. Zusammensetzung nach Anspruch 20 zur Induktion der protektiven Immunität gegen
Chagas'-Erkrankung in einem Patienten.
23. Verfahren zum Nachweis einer T. cruzi-Infektion in einer biologischen Probe,
umfassend:
a) In Kontakt bringen der biologischen Probe mit einem ersten Polypeptid, das ein
Epitop eines T. cruzi-Antigens umfaßt, das eine Aminosäuresequenz aufweist,
die durch eine in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22 angegebene Nukleotidsequenz
kodiert wird, oder eine Variante des Antigens, die sich nur in
konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet;
b) In Kontakt bringen der biologischen Probe mit einem zweiten Polypeptid,
umfassend ein Epitop von TcD oder TcE oder eine Variante davon, die sich nur in
konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet; und
c) Nachweisen der Anwesenheit von Antikörpern in der biologischen Probe, die
an eine oder mehre der Polypeptide binden, und dadurch Nachweisen einer T.
cruzi-Infektion in der biologischen Probe.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das zweite Polypeptid die Aminosäuresequenz
Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro
Ala (SEQ ID NO: 56) umfaßt.
25. Verfahren zum Nachweis einer T. cruzi-Infektion in einer biologischen Probe,
umfassend:
a) In Kontakt bringen der biologischen Probe mit einem ersten Polypeptid,
umfassend ein Epitop eines T. cruzi-Antigens, das eine Aminosäuresequenz
aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 22 angegebene
Nukleotidsequenz kodiert wird, oder eine Variante des Antigens, die sich nur in
konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet;
b) In Kontakt bringen der biologischen Probe mit einem zweiten Polypeptid, das
ein Epitop von TcD umfaßt, oder eine Variante davon, die sich nur in
konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet.
c) In Kontakt bringen der biologischen Probe mit einem dritten Polypeptid, das
ein Epitop von TcE oder PEP-2 umfaßt, oder eine Variante davon, die sich nur
in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet; und
d) Nachweisen der Anwesenheit von Antikörpern in der biologischen Probe, die
an eines oder mehrere der Polypeptide binden, und dadurch Nachweisen einer
77 cruzi-Infektion in der biologischen Probe.
26. Ein Kombinationspolypeptid, umfassend zwei oder mehrere Polypeptide nach
Anspruch 10.
27. Ein Kombinationspolypeptid, umfassend mindestens ein Epitop eines T. cruzi-
Antigens, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine in SEQ ID NO: 1-
SEQ ID NO: 22 angegebene Nukleotidsequenz kodiert wird, oder eine Variante des
Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen
unterscheidet, und mindestens ein Epitop ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Epitopen von TcD, Epitopen von TcE, Epitopen von PEP-2 und Varianten davon, die sich
nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheiden.
28. Kombinationspolypeptid nach Anspruch 27, wobei das Epitop ausgewählt ist aus der
Gruppe bestehend aus TcD, Epitopen von TcE, Epitopen von PEP-2 und Varianten
davon, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen
unterscheiden, und das eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 55-56, SEQ
ID NO: 53-54 oder SEQ ID NO: 57 angegeben ist.
29. Verfahren zum Nachweis einer T. cruzi-Infektion in einer biologischen Probe,
umfassend:
a) In Kontakt bringen der biologischen Probe mit einem Kombinationspolypeptid
nach einem der Ansprüche 26-28; und
b) Nachweisen der Anwesenheit von Antikörpern in der biologischen Probe, die
an das Kombinationspolypeptid binden, und dadurch Nachweisen einer T.
cruzi-Infektion in der biologischen Probe.
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