DE69925911T2

DE69925911T2 - Immunodiagnostischer wirkstoff zum nachweiss von maedi-visna virus und caev infektionen

Info

Publication number: DE69925911T2
Application number: DE69925911T
Authority: DE
Inventors: Lorenzo Gonzalez; Francesco Tolari; Neil Watt; Gordon Harkiss; Beatriz Amorena; Eric Saman; Geertrui Van Eynde; Juan Jose Badiola Diez; Belen Extramiana; Enrico Bollo; A. Ramon JUSTE
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-26
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2019-04-27
Also published as: ATE298347T1; DK1073676T3; EP1073676B1; PT1073676E; AU3823399A; WO1999057141A1; EP1073676A1; DE69925911D1; EP0953574A1; ES2245100T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Infektion mit Maedi-Visna-Virus (MVV) in Säugern, insbesondere in Schafen, sowie den Nachweis davon. Die Erfindung betrifft spezifische, bei der Immundiagnose der MVV-Infektion geeignete Peptide sowie diese Peptide verwendende Verfahren und Kits. Ebenso betrifft die Erfindung Peptide, Verfahren und Kits zum Nachweis einer Infektion mit CAEV in Ziegen.
STAND DER TECHNIK
Bei dem Maedi-Visna-Virus (MVV) (oder ovinen Lentivirus) handelt es sich um ein nichtonkogenes, exogenes Retrovirus der Lentiviridae-Unterfamilie (Cutlip und Laird, 1976), das mit dem menschlichen Immunschwächevirus (HIV) verwandt ist. MVV verursacht eine Erkrankung in Schafen, die durch einen relativ langen asymptomatischen Zeitraum gekennzeichnet ist, in dem das Virus in Gegenwart einer starken humoralen und zellulären Antwort überdauert. Nach einer unterschiedlich langen Inkubationszeit (2–10 Jahre) verursacht das Virus eine chronische, progressive und tödliche degenerative und entzündliche Erkrankung der Lungen, Gelenke, Brustdrüsen sowie des zentralen Nervensystems von Schafen (Bulgin, 1990). Dabei sind infizierte Schafe auch immunkompromittiert und für Sekundärinfektionen anfällig (Myer et al., 1988).
Die meisten Schafe reagieren auf eine MVV-Infektion mit der Produktion nichtschützender, doch nachweisbarer Serumantikörper gegen Virusproteine, vor allem Strukturproteine der Virushülle und des Viruscapsids. Zum Nachweis dieser Antikörper wurden mehrere serologische diagnostische Tests entwickelt, doch lediglich zwei Verfahren, der Agargel-Immundiffusionstest (AGIDT) und der WV (Whole Virus)-ELISA, sind praktikabel und werden routinemäßig verwendet (Cutlip et al., 1977; Houwers et al., 1982; Houwers und Schaake, 1987; Hoff-Jorgensen, 1990; Simard und Briscoe, 1990). Weitgehend aufgrund des Fehlens eines angemessenen „Gold-Standard"-MVV-Diagnoseverfahrens gibt es keine guten Schätzungen für die Empfindlichkeit und Spezifität des AGIDT und des WV-ELISA (Campbell et al., 1994). Zusätzlich zur schlecht definierten Empfindlichkeit und Spezifität besteht ein Hauptproblem für sowohl den AGIDT als auch den WV-ELISA in der allgemein geringen Qualität (d.h. niedrigen Reinheit und heterogenen Zusammensetzung) sowie den hohen Kosten der eingesetzten viralen Testantigene. Virale Antigene für herkömmliche Tests werden von von einer zeitaufwendigen, teueren und mühsamen MVV-Vermehrung in Zellkultursystemen hergestellten Lysaten mit ganzen Virionen produziert. Die spezifische Ausbeute an Virusprotein ist gering, während die Reinigung schwierig ist und häufig zur Mitreinigung undefinierter Wirtszellproteine führt. Somit können aufgrund von Kreuzreaktionen mit Säugerzellproteinen falsch-positive (nichtspezifische) Reaktionen auftreten, und die Abwesenheit oder unzureichende Menge spezifischer immunogener Virusproteine in der Testantigenpräparation kann zu falsch-negativen Reaktionen führen. Darüber hinaus eignen sich der AGIDT und der WV-ELISA nicht für reproduzierbares automatisiertes Testen im Großmaßstab, wodurch ein ökonomischer und effizienter Durchsatz von Proben in großer Zahl, eine Voraussetzung für eine wirksame Kontrolle der Herde, ausgeschlossen ist.
Das CAEV (Caprine Arthritis-Encephalitis Virus) ist genetisch und antigenisch eng mit MVV verwandt. Infektion mit CAEV ist in Ziegen weit verbreitet und kann bedeutende wirtschaftliche Verluste hervorrufen. Die hauptsächlichen klinischen Symptome sind Arthritis, chronische subklinische Mastitis sowie interstitielle Lungenentzündung. Enzephalitis ist ein seltenes Merkmal einer CAEV-Infektion in jungen Ziegen. Ähnlich wie bei der MVV-Infektion in Schafen beruht die Labordiagnose einer CAEV-Infektion auf dem Nachweis antiviraler Antikörper in Agargel-Immundiffusionstests oder ELISA-Tests (Enzyme Linked Immunosorbent Assays). MVV-Antigene werden häufig für die Diagnose einer MVV-Infektion in Schafen als auch für die Diagnose einer CAEV-Infektion in Ziegen verwendet (Coackley und Smith, 1984; Houwers und Schaake, 1987; Zwahlen et al., 1983).
In jüngerer Zeit wurden rekombinante Virusproteine verbreitet für den Nachweis antiviraler Antikörper, vor allem in der Human- und Veterinär-Lentivirologie verwendet. Mit rekombinanten DNA-Techniken lassen sich in effizienter Weise große Menge hochgereinigter Virusproteine erzielen. Zu den für den Nachweis von Anti-MVV-Antikörper verwendeten rekombinanten Antigenen zählen solche, die sich von den Core (gag)-Proteinen (speziell p25), dem Transmembran-Glykoprotein (TM) und dem Glykoprotein der äußeren Hülle ableiten (Kwang und Cutlip, 1992a, b; Kwang et. al., 1995; Power et. al., 1995; Keen et. al., 1995, FR 2 586 427 ). Von Boshoff et al. (1997) wurde kürzlich die Verwendung eines GST-TM-p25-Fusionsproteins zum Nachweis von Antikörpern gegen MVV berichtet. Obwohl die dargestellten Ergebnisse vielversprechend sind, sollten sie im Hinblick auf die begrenzte Anzahl von getesteten Schafen als vorläufig angesehen werden. Zudem wird von den Autoren eine mögliche Reaktivität des (nicht abgespaltenen) GST-Teils im Fusionsprotein mit Schafsseren erwähnt, was möglicherweise zu Spezifitätsproblemen führt.
Von Kwang und Torres (1994) wird ein Immunoassay auf Oligopeptidbasis zum Nachweis von Antikörpern gegen MVV in Schafen beschrieben. Nach Computer-Vorhersagemodellen wurden von ihnen drei antigene Stellen im N-terminalen Segment des MVV-Proteins TM (gp46) identifiziert, auf deren Grundlage drei Peptide synthetisiert wurden. Die synthetischen Peptide zeigten eine sehr hohe Spezifität (keine falsch-positiven Reaktionen) beim Testen mit einer Sammlung von bekannten seropositiven und seronegativen Schafsseren. Die Reaktionsempfindlichkeit war jedoch geringer als das entsprechende rekombinante TM-Protein, selbst bei Verwendung einer Kombination aus den drei Peptiden. Von den Autoren wird die Schlußfolgerung gezogen, daß rekombinante Proteine die bevorzugten Reagentien für die Entwicklung von MVV-Immundiagnostika darstellen.
Nach dem oben gesagten scheint weiterhin ein Bedarf an besseren immundiagnostischen Verfahren zum Nachweis von MVV in Schafen zu bestehen, und zwar Verfahren, die bessere Spezifitäts-, Empfindlichkeits- und Reproduzierbarkeitseigenschaften zeigen. Darüber hinaus besteht ein Bedarf an Tests, die sich leichter herstellen ließen und sich zur Automatisierung eignen würden.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von zur Immundiagnose einer MVV-Infektion sowie der naheverwandten CAEV-Infektion geeigneten Peptiden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Kombination aus rekombinanten Proteinen und Peptiden zur Verwendung bei der Immundiagnose einer MVV-Infektion sowie der naheverwandten CAEV-Infektion.
Die vorliegende Erfindung richtet sich ebenso auf neue Verfahren und Kits zur Immundiagnose einer MVV-Infektion sowie der naheverwandten CAEV-Infektion.
Diese Ziele wurden allesamt von den nachfolgend aufgeführten Ausführungsformen erfüllt.
Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren) vor:
Die durch SEQ ID NO 1 dargestellte Aminosäuresequenz ist Teil des MVV-Transmembran-Hüllgylcoproteins (gp46), das nachfolgend als TM-Antigen bezeichnet wird. Das Peptid befindet sich in der Gesamtsequenz des gp46-Proteins, wie sie in 1 dargestellt ist, bei Aminosäurerest 85 bis 102 und umfaßt die konservierte Cys-Cys-Loop-Struktur, wie sie bei verwandten Lentiviren beschrieben ist. Die Sequenz des MVV-Proteins gp46, wie sie in 1 dargestellt ist, stammt von der veröffentlichten Sequenz des MVV-Stamms E1 (Sargan et al., 1991). Es versteht sich, daß die TM-Sequenz je nach dem Virusstamm, aus dem sie isoliert wurde, leicht variieren kann. Vor allem können konservative Aminosäureaustausche, wie sie in Tabelle 1 unten dargestellt sind, häufig auftreten.
TABELLE 1: Übersicht über konservative Aminosäureaustausche.
In Tabelle 2 unten sind einige Variationen in der Aminosäuresequenz des Peptids gezeigt, die nachgewiesenermaßen unter unterschiedlichen natürlichen Isolaten von MVV- und CAEV-Stämmen auftreten können.
Tabelle 2: Natürliche Sequenzvariationen des den konservierten Cys-Cys-Loop umfaßten Bereichs im TM-Protein, wie sie in unterschiedlichen MVV- und CAEV-Isolaten auftreten.
Aus der obigen vergleichenden Anordnung ist ersichtlich, daß vor allem an Positionen 1, 9, 10, 13, 17 und 18 des Peptids konservative Austausche stattfinden können. Eine allgemeinere Formel des Peptids ist daher nachfolgend angegeben:
X₁ELDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TSTX₁₇X₁₈ (SEQ ID NO 12)
wobei

– X₁ für Q oder einen konservativen Austausch von Q, vorzugsweise H,
– X₉ für Q oder einen konservativen Austausch von Q, vorzugsweise H,
– X₁₀ für H oder einen konservativen Austausch von H, vorzugsweise Q,
– X₁₃ für V oder einen konservativen Austausch von V, vorzugsweise I,
– X₁₇ für K oder einen konservativen Austausch von K, vorzugsweise R,
– X₁₈ für S oder einen konservativen Austausch von S, vorzugsweise T oder A, steht.

Es sei angemerkt, daß bei der Mehrzahl der MVV-Sequenzen X₉ für Q und X₁₀ für H steht, während es bei der Mehrzahl der CAEV-Sequenzen umgekehrt ist (X₉ steht für H und X₁₀ für Q).
In mehreren Untersuchungen an mit MVV verwandten Lentiviren, wie z.B. HIV (Human Immunodeficiency Virus), SIV (Simian Immunodeficiency Virus) [= Affen-Immunschwächevirus] und CAEV, konnte gezeigt werden, daß der konservierte Cys-Cys-Loop-Bereich im TM-Protein einen immundominanten Bereich darstellt (im Übersichtsartikel von Pancino et al., 1994) beschrieben. Insbesondere wurde beschrieben, daß ein CAEV-Peptid mit einer zu der durch SEQ ID NO 1 dargestellten Sequenz homologen Sequenz mit Seren aus mit CAEV infizierten Ziegen reaktiv ist (Bertoni et al., 1994, WO 96/00784, FR 2721618 ).
Wie weiter im Beispielteil gezeigt, demonstriert die vorliegende Erfindung, daß das als SEQ ID NO 1 dargestellte Peptid ziemlich unerwartet nicht immunreaktiv ist, wenn es als solches auf der Festphase eines Immunoassays gebunden ist. Nur wenn das Peptid biotinyliert ist und die Bindung an die Festphase über die Wechselwirkung der Biotingruppierung mit Streptavidin oder Avidin stattfindet, wird festgestellt, daß das Peptid mit Seren aus mit MVV infizierten Schafen immunreaktiv ist.
Die Erfindung sieht somit insbesondere ein biotinyliertes Peptid vor, das durch die folgende Formel dargestellt wird:
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TSTX₁₇X₁₈-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 13)
wobei

– X₁ für Q oder einen konservativen Austausch von Q, vorzugsweise H,
– X₉ für Q oder einen konservativen Austausch von Q, vorzugsweise H,
– X₁₀ für H oder einen konservativen Austausch von H, vorzugsweise Q,
– X₁₃ für V oder einen konservativen Austausch von V, vorzugsweise I,
– X₁₇ für K oder einen konservativen Austausch von K, vorzugsweise R,
– X₁₈ für S oder einen konservativen Austausch von S, vorzugsweise T oder A,
– B für eine Biotinylgruppierung,
– L für eine Amidbindung oder eine Aminosäure-Linkersequenz mit 1 bis 5 Aminosäureresten steht, und wobei [B₁-L₁] oder/und [L₂-B₂] vorhanden sind.

Linkersequenzen führen zu einer räumlich ausgedehnteren Präsentation des Peptidepitops auf der Festphase und infolgedessen zu einer effizienteren Erkennung des Peptids durch Antikörper. Häufig verwendete Aminosäuren zur Konstruktion von Linkersequenzen sind unter anderem Glycin, Alanin, beta-Alanin, Lysin, epsilon-Lysin, Aminocapronsäure, Ornithin, Aminobuttersäure. Es versteht sich, daß die Biotinylgruppierung über ihre Carboxylgruppe an eine Aminogruppe der Aminosäuren der Linkersequenz oder des Peptids gebunden ist. Diese Aminogruppe kann in der Alpha-Stellung vorliegen und in der Seitenkette der jeweiligen Aminosäure lokalisiert sein (z.B. epsilon-Lysin). Die im Beispielteil der vorliegenden Erfindung dargestellte Linkersequenz besteht aus einer Reihe von Glycinresten, vorzugsweise 2 Glycinen. Es sollte jedoch ersichtlich sein, daß andere zur Zeit auf dem Gebiet der Peptidchemie verwendete Linkersequenzen ebenso effizient sein können.
Die die Immunreaktivität der oben beschriebenen Peptide bestimmende Kernsequenz wird von den beiden Cysteinresten umschlossen. Dabei können die folgenden verkürzten Peptide als Äquivalente der Peptide betrachtet werden:
[B₁-L₁]-ELDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TSTX₁₇X₁₈-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 14)
[B₁-L₁]-LDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TSTX₁₇X₁₈-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 15)
[B₁-L₁]-DCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TSTX₁₇X₁₈-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 16)
[B₁-L₁]-CWHYX₉X₁₀YCX₁₃TSTX₁₇X₁₈-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 17)
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TSTX₁₇-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 18)
[B₁-L₁]-ELDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TSTX₁₇-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 19)
[B₁-L₁]-LDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TSTX₁₇-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 20)
[B₁-L₁]-DCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TSTX₁₇-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 21)
[B₁-L₁]-CWHYX₉X₁₀YCX₁₃TSTX₁₇-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 22)
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TST-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 23)
[B₁-L₁]-ELDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TST-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 24)
[B₁-L₁]-LDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TST-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 25)
[B₁-L₁]-DCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TST-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 26)
[B₁-L₁]-CWHYX₉X₁₀YCX₁₃TST-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 27)
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TS-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 28)
[B₁-L₁]-ELDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TS-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 29)
[B₁-L₁]-LDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TS-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 30)
[B₁-L₁]-DCWHYX₉X₁₀YCX₁₃TS-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 31)
[B₁-L₁]-CWHYX₉X₁₀YCX₁₃TS-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 32)
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃T-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 33)
[B₁-L₁]-ELDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃T-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 34)
[B₁-L₁]-LDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃T-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 35)
[B₁-L₁]-DCWHYX₉X₁₀YCX₁₃T-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 36)
[B₁-L₁]-CWHYX₉X₁₀YCX₁₃T-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 37)
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 38)
[B₁-L₁]-ELDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 39)
[B₁-L₁]-LDCWHYX₉X₁₀YCX₁₃-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 40)
[B₁-L₁]-DCWHYX₉R₁₀YCX₁₃-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 41)
[B₁-L₁]-CWHYX₉X₁₀YCX₁₃-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 42)
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYX₉X₁₀YC-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 43)
[B₁-L₁]-ELDCWHYX₉X₁₀YC-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 44)
[B₁-L₁]-LDCWHYX₉X₁₀YC-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 45)
[B₁-L₁]-DCWHYX₉X₁₀YC-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 46)
[B₁-L₁]-CWHYX₉X₁₀YC-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 47)
wobei

Weiter unten im Beispielteil wird gezeigt, daß sich die MVV-Peptide der vorliegenden Erfindung neben ihrer demonstrierten Eignung als Reagentien zum Nachweis einer MVV-Infektion in Schafen perfekt zum Nachweis einer CAEV-Infektion in Ziegen einsetzen lassen.
Die Begriffe „von MVV abgeleitete" und „von CAEV abgeleitete" Peptide bedeuten, daß die Sequenzen der jeweiligen Peptide jeweils Teil einer aus einem MVV- bzw. CAEV-Stamm isolierten Proteinsequenz sind. Wie oben angegeben können von MVV abgeleitete und von CAEV abgeleitete Peptide starke Kreuzreaktivität zeigen, wenn es um den Nachweis einer MVV-Infektion in Schafen bzw. einer CAEV-Infektion in Ziegen geht.
Spezifische, von MVV abgeleitete Peptide sind durch die folgende Familie von Sequenzen repräsentiert:
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYQHYCVTSTX₁₇X₁₈-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 48)
[B₁-L₁]-ELDCWHYQHYCVTSTX₁₇X₁₈-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 49)
[B₁-L₁]-LDCWHYQHYCVTSTX₁₇X₁₈-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 50)
[B₁-L₁]-DCWHYQHYCVTSTX₁₇X₁₈-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 51)
[B₁-L₁]-CWHYQHYCVTSTX₁₇X₁₈-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 52)
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYQHYCVTSTX₁₇-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 53)
[B₁-L₁]-ELDCWHYQHYCVTSTX₁₇-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 54)
[B₁-L₁]-LDCWHYQHYCVTSTX₁₇-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 55)
[B₁-L₁]-DCWHYQHYCVTSTX₁₇-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 56)
[B₁-L₁]-CWHYQHYCVTSTX₁₇-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 57)
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYQHYCVTST-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 58)
[B₁-L₁]-ELDCWHYQHYCVTST-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 59)
[B₁-L₁]-LDCWHYQHYCVTST-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 60)
[B₁-L₁]-DCWHYQHYCVTST-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 61)
[B₁-L₁]-CWHYQHYCVTST-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 62)
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYQHYCVTS-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 63)
[B₁-L₁]-ELDCWHYQHYCVTS-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 64)
[B₁-L₁]-LDCWHYQHYCVTS-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 65)
[B₁-L₁]-DCWHYQHYCVTS-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 66)
[B₁-L₁]-CWHYQHYCVTS-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 67)
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYQHYCVT-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 68)
[B₁-L₁]-ELDCWHYQHYCVT-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 69)
[B₁-L₁]-LDCWHYQHYCVT-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 70)
[B₁-L₁]-DCWHYQHYCVT-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 71)
[B₁-L₁]-CWHYQHYCVT-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 72)
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYQHYCV-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 73)
[B₁-L₁]-ELDCWHYQHYCV-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 74)
[B₁-L₁]-LDCWHYQHYCV-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 75)
[B₁-L₁]-DCWHYQHYCV-[L₂-B₂] ( SEQ ID NO 76)
[B₁-L₁]-CWHYQHYCV-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 77)
[B₁-L₁]-X₁ELDCWHYQHYC-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 78)
[B₁-L₁]-ELDCWHYQHYC-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 79)
[B₁-L₁]-LDCWHYQHYC-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 80)
[B₁-L₁]-DCWHYQHYC-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 81)
[B₁-L₁]-CWHYQHYC-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 82)
wobei

– X₁ für Q oder einen konservativen Austausch von Q, vorzugsweise H,
– X₁₇ für K oder einen konservativen Austausch von K, vorzugsweise R,
– X₁₈ für S oder einen konservativen Austausch von S, vorzugsweise T oder A,
– B für eine Biotinylgruppierung,
– L für eine Amidbindung oder eine Aminosäure-Linkersequenz mit 1 bis 5 Aminosäureresten steht, und wobei [B₁-L₁] oder/und [L₂-B₂] vorhanden sind.

Die gesamte Gruppe erfindungsgemäßer biotinylierter Peptide stammt aus dem gleichen immundominanten Bereich im TM-Protein (im weiteren „TM-Peptide" genannt).
Die Erfindung sieht somit beim Nachweis einer Infektion mit MVV bzw. CAEV geeignete biotinylierte TM-Peptide vor, die durch die folgende Formel dargestellt sind:
[B₁-L₁]-(a)-CWHYX₉X₁₀YC-(b)-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 83),
wobei B für eine Biotinylgruppierung und L für eine Amidbindung oder eine Aminosäure-Linkersequenz mit 1 bis 5 Aminosäureresten steht, wobei [B₁-L₁] oder/und [L₂-B₂] vorhanden ist, und wobei (a) für keine oder die Maximalanzahl an aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die zwischen Position 1 bis Position 4 in der als SEQ ID NO 12 dargestellten Sequenz lokalisiert sind, und wobei (b) für keine bis zur Maximalanzahl an aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die zwischen Position 13 bis Position 18 in der als SEQ ID NO 12 dargestellten Sequenz lokalisiert sind, steht.
Die Gruppe von MVV abgeleiteter biotinylierter TM-Peptide, die sich zum Nachweis einer Infektion mit MVV bzw. CAEV eignen, wird durch die folgende Formel dargestellt:
[B₁-L₁]-(a)-CWHYQHYC-(b)-[L₂-B₂] (SEQ ID NO 84),
wobei B für eine Biotinylgruppierung und L für eine Amidbindung oder eine Aminosäure-Linkersequenz mit 1 bis 5 Aminosäureresten steht, wobei entweder [B₁-L₁] oder [L₂-B₂] oder beide gleichzeitig vorhanden sind, und wobei (a) für keine oder die Maximalanzahl an aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die zwischen Position 1 bis Position 4 in der als SEQ ID NO 12 dargestellten Sequenz lokalisiert sind, und wobei (b) für keine bis zur Maximalanzahl an aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die zwischen Position 13 bis Position 18 in der als SEQ ID NO 12 dargestellten Sequenz lokalisiert sind, steht.
Das erfindungsgemäße TM-Peptid wird durch die folgende Sequenz dargestellt:
B-GGQELDCWHYQHYCVTSTKS (SEQ ID NO 85)
Wie im Beispielteil gezeigt wird, zeigt das oben beschriebene Peptid (SEQ ID NO 85) eine äußerst gute Immunreaktivität mit Seren aus mit MVV infizierten Schafen, wenn es über eine Streptavidin- oder Avidinwechselwirkung auf einem festen Träger präsentiert wird. Tatsächlich beträgt die Nachweisempfindlichkeit von auf diesem Peptid allein als Nachweismittel beruhenden Immunoassays mindestens 90%, in vielen Fällen 95% und in einigen Fällen sogar an die 100%.
Der Begriff „Empfindlichkeit", wie er in der gesamten vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet den Prozentanteil an Seren aus mit MVV infizierten Individuen, die eine positive (= über dem Hintergrundniveau liegende) Immunreaktivität mit dem (den) erfindungsgemäßen Peptid(en) zeigen.
Der Begriff „Spezifität", wie er in der gesamten vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet (Gesamtanzahl gesunder (= aus nicht mit MVV infizierten Individuen stammender) Seren minus Anzahl gesunder Seren, die eine falsch-positive Immunreaktivität mit dem (den) erfindungsgemäßen Peptid(en) zeigen, geteilt durch die Gesamtzahl an gesunden Seren) × 100.
Verkürzte biotinylierte TM-Peptide, die zur oben beschriebenen Familie von Sequenzen der SEQ ID NO 14 bis 82 gehören, zeigen mit Seren aus mit MVV infizierten Schafen eine ähnliche Immunreaktivität wie das durch SEQ ID NO 85 dargestellte bevorzugte TM-Peptid. Die Spezifität von auf diesen Peptiden beruhenden Immunoassays ist in etwa gleich, die Empfindlichkeit kann im Vergleich mit der Reaktivität der gleichen Seren mit dem durch SEQ ID NO 85 dargestellten Peptid gleich oder etwas geringer (von 50% bis 100%) sein.
Die Synthese von Oligopeptiden kann nach einem auf dem Gebiet der Peptidchemie bekannten Verfahren, wie beispielsweise in Bodanszky (1993) beschrieben, durchgeführt werden. Wie weiter im Beispielteil beschrieben wird, wurden die Peptide der vorliegenden Erfindung mittels Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung von Fmoc-Chemie (Fmoc = 9-Fluormethyloxycarbonyl) synthetisiert. Zur Zeit stehen eine Reihe von Vorrichtungen zur Verfügung, die eine schnelle und vollautomatische Peptidsynthese ermöglichen, wie beispielsweise das Peptidsynthesegerät Symphony/Multiplex von der Firma Rainin Instruments Co. Inc.
Der Biotinylierungsvorgang läßt sich nach auf dem Gebiet der Peptidchemie allgemein bekannten Verfahren durchführen (siehe z.B. WO 93/18054). Dabei kann die Anbindung der Biotinylgruppierung während oder nach der Peptidsynthese erfolgen. Die Biotinylgruppierung kann N-terminal, C-terminal oder intern gebunden werden.
Die Erfindung sieht ferner ein wie oben beschriebenes biotinyliertes TM-Peptid, insbesondere ein biotinyliertes TM-Peptid, wie es durch eine der SEQ ID NO 13–85 dargestellt ist, vor, wodurch die beiden in der Aminosäuresequenz vorhandenen Cystein(C)-Reste unter Bildung einer intramolekularen Cystinbrücke kovalent verknüpft sind. Durch dieses chemisch cyclisierte Peptid wird die Loop-Struktur, von der man annimmt, daß sie im nativen TM-Protein existiert, nachgeahmt.
Die Bildung der Cystinbindung kann nach auf dem Fachgebiet der Proteinchemie bekannten Verfahren erfolgen. Es gibt eine Reihe von oxidierenden Verbindungen oder Bedingungen, die spezifisch die Bildung von Disulfidbrücken induzieren, wie z.B. Oxidation an der Luft, I₂, K₃Fe(CN)₆ (McCurdy, 1989; Pohl et al., 1993).
Durch die vorliegende Erfindung wird ebenso ein wie oben beschriebenes biotinyliertes TM-Peptid bereitgestellt, wodurch die Biotingruppierung bereits mit einem Streptavidin- oder Avidinmolekül komplexiert ist.
Durch die vorliegende Erfindung wird zudem ein wie oben beschriebenes biotinyliertes TM-Peptid bereitgestellt, das mit einem Streptavidin- oder Avidinmolekül komplexiert ist, wodurch der Komplex bereits auf einem festen Träger immobilisiert ist.
Ebenso wird durch die Erfindung eine ein wie oben beschriebenes biotinyliertes Peptid in Kombination mit einem weiteren MVV-Peptid oder rekombinanten Protein umfassende Peptidzusammensetzung bereitgestellt.
Eine bevorzugte Peptidzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt ein wie oben beschriebenes biotinyliertes TM-Peptid sowie ein rekombinantes MVV-gag (p25)-Polypeptid oder ein Fragment davon.
Die Verwendung von rekombinantem MVV-gag-Protein in der Serodiagnostik einer MVV-Infektion in Schafen und einer CAEV-Infektion in Ziegen wurde bereits zuvor beschrieben (siehe z.B. Zanoni et al., 1991). Allerdings waren die mit diesem rekombinanten Antigen erzielte Empfindlichkeit und Spezifität nicht zufriedenstellend. Zudem enthielt das wie von Zanoni et al. (1991) beschriebene rekombinante MVV-gag-Protein einen GST (Glutathion-S-Transferase)-Teil, an den Schafseren unspezifisch binden können.
Durch die vorliegende Erfindung wird eine ein wie oben beschriebenes biotinyliertes TM-Peptid sowie ein wie in 2 (SEQ ID NO 88) dargestelltes rekombinantes MVV-p25-Protein umfassende Peptidzusammensetzung bereitgestellt.
Die Aminosäuresequenz des rekombinanten p25-Proteins, wie es in 2 gezeigt ist, enthält zusätzlich zur p25-Proteinsequenz selbst ein aus 6 Histidinresten bestehendes „His-Tag", das die Reinigung des rekombinanten Proteins mittels IMAC (Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie) gestattet, sowie eine Enterokinasestelle, die die Spaltung des His-Tags nach der Reinigung ermöglicht.
Es versteht sich, daß das wie in 2 dargestellte rekombinante p25-Protein nur als Beispiel dient und andere rekombinante MVV-p25-Proteine mit einer ähnlichen Immunreaktivität nicht ausschließt. Die Sequenz des das MVV-p25-Protein codierenden Gens ist im Stand der Technik ausgiebig beschrieben worden (beispielsweise für den MVV-E1-Stamm von Sargan et al., 1991). Mit bekannten Techniken zur Klonierung und rekombinanten Expression, beispielsweise in einem Bakterienwirt wie z.B. E. coli, ist es relativ einfach, das rekombinant produzierte p25-Protein oder ein Fragment davon zu gewinnen.
Wie weiter im Beispielteil gezeigt führt die Kombination eines wie oben beschriebenen biotinylierten TM-Peptids mit dem rekombinanten MVV-p25-Protein zu einem immundiagnostischen Reagens, mit dem mit MVV infizierte Schafe mit sowohl einer Empfindlichkeit als auch einer Spezifität an die 100 nachgewiesen werden. Die gleiche Peptidzusammensetzung kann zur Serodiagnostik einer CAEV-Infektion in Ziegen verwendet werden.
Die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Peptide kann ebenso in eine zweite Aminosäuresequenz eingefügt oder daran angefügt werden, was zu einem Fusionsprotein führt. Die zweite Aminosäuresequenz kann entweder aus einem überhaupt nicht verwandten (= heterologen) Protein stammen, dessen Funktion wie die eines „Träger"-Proteins des erfindungsgemäßen Peptids wäre, oder sie kann aus MVV stammen. Im letzten Fall kann die zweite Aminosäuresequenz zusätzliche für den Nachweis einer MVV-Infektion geeignete immunogene Bereiche (Epitope) enthalten, was zu einer erhöhten Empfindlichkeit des Fusionsproteins im Vergleich mit dem Peptid allein führt. Die zweite Aminosäuresequenz des Fusionsproteins entspricht vorzugsweise der MVV-gag-Sequenz oder einem Teil davon. Die Präsentation des Epitops des MVV-TM-Peptids über ein Fusionsprotein kann der Präsentation des TM-Peptids über Biotin/Streptavidin-Wechselwirkung ähneln. Darüber hinaus kann die heterologe Sequenz im Fusionsprotein zu einem beliebigen gewünschten Nebeneffekt auf das gebildete Fusionsprotein führen; beispielsweise kann sie die Expression, die Reinigung, die Immobilisierung auf eine Oberfläche usw. optimieren.
Die Konstruktion und Expression von Fusionsproteinen können nach allgemein bekannten Techniken auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie durchgeführt werden (wie beispielsweise von Maniatis et al. (1982) veranschaulicht). Die die unterschiedlichen Teile des Fusionsproteins codierenden DNA-Fragmente werden so miteinander verknüpft, daß sich das Leseraster nicht verschiebt. Das Hybrid-DNA-Molekül wird dann mit einer Expressionskassette operativ verknüpft, was die Expression des Fusionsproteins in einer Wirtszelle gestattet. Mögliche Wirtszellen zur Expression rekombinanter MVV-Proteine sind Bakterien (wie z.B. E. coli) oder eukaryontische Zellen (Hefen oder Säugerzellinien).
Der Ausdruck „operativ verknüpft" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, bei der die Komponenten so konfiguriert sind, daß sie ihre normale Funktion ausüben. Somit sind mit einer codierenden Sequenz operativ verknüpfte Kontrollsequenzen dazu in der Lage, die Expression des codierenden Gens zu beeinflussen.
Der Begriff „Expressionskassette" umfaßt eine Kassette aus Elementen, die die korrekte Transkription und Translation der codierten Sequenzen durch den Wirtszellapparat ermöglichen: d.h. eine Promotersequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und möglicherweise auch Regulationssequenzen oder Sekretionssignale.
Die oben beschriebenen MVV-TM-Peptide oder rekombinanten Proteine können auf einen festen Träger durch kovalente oder nicht kovalente Verknüpfung immobilisiert werden. Ein bevorzugter Weg zur Immobilisierung besteht für die biotinylierten TM-Peptide der vorliegenden Erfindung in der Beschichtung über ihre Biotingruppierung an eine mit Streptavidin oder Avidin beschichtete Oberfläche. Die Komplexierung des biotinylierten Peptids an Streptavidin (oder Avidin) kann auch vor der Bindung stattfinden, d.h. in Lösung, mit anschließender Beschichtung der Festphase mit dem Komplex, wie weiter unten im Beispielteil beschrieben.
Durch die Erfindung wird somit ebenso ein fester Träger bereitgestellt, auf dem das bzw. die obenerwähnte biotinylierte TM-Peptid oder Peptidzusammensetzung immobilisiert wurde.
Der feste Träger, der mit den erfindungsgemäßen Peptiden oder rekombinanten Proteinen beschichtet wird, kann unter den üblicherweise auf dem Gebiet der Immundiagnostik verwendeten Trägern gewählt werden. Je nach Art des Tests kann es sich bei dem festen Träger um einen Polystyrolträger (Mikrotiterplatte (z.B. ELISA) oder Kügelchen [= Beads] (z.B. Microbeads-Assay)), eine Nylonmembran (LIA), Latexkügelchen (Koagulierungstests) usw. handeln.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird durch die Erfindung ein Verfahren zum immunologischen Nachweis einer MVV- oder CAEV-Infektion in Säugern bereitgestellt, bei dem man:

– eine biologische Probe aus dem Säuger mit einem wie oben beschriebenen biotinylierten TM-Peptid oder einer wie oben beschriebenen Peptidzusammensetzung unter Bedingungen, die die Bildung eines immunologischen Komplexes gestatten, in Kontakt bringt und
– das Vorhandensein eines zwischen dem biotinylierten TM-Peptid oder der Peptidzusammensetzung und den gegebenenfalls in der Probe vorhandenen Anti-MVV- bzw. Anti-CAEV-Antikörpern ausgebildeten immunologischen Komplexes nachweist.

Es versteht sich, daß das Vorhandensein von Anti-MVV- bzw. Anti-CAEV-Antikörpern in einer biologischen Probe die Existenz einer MVV-Infektion (bzw. CAEV-Infektion) in dem Säuger, aus dem die Probe entnommen wurde, anzeigt.
Der Begriff „Säuger" kann sich auf ein menschliches Individuum oder ein beliebiges Säugetier beziehen. vorzugsweise bezieht sich der Begriff Säuger auf Schafe, den natürlichen Wirt für MVV, oder Ziegen, den natürlichen Wirt für CAEV. Zwar konnte bislang noch nicht gezeigt werden, daß MVV beim Menschen auftritt, doch ist nicht ausgeschlossen, daß dies passieren kann, wie kürzlich für CAEV (Caprine Arthritis Encephalitis Virus) gezeigt werden konnte (siehe WO 97/33615).
Der Begriff „biologische Probe" bezieht sich auf eine Probe aus Blut, Serum, Plasma, Milch, Urin, Liquor oder einer beliebigen anderen Körperflüssigkeit, die Antikörper gegen MVV enthalten kann. Vorzugsweise handelt es sich bei der biologischen Probe um eine Serumprobe.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird durch die Erfindung ein Verfahren zum immunologischen Nachweis einer MVV- oder CREV-Infektion in Säugern bereitgestellt, bei dem man:

– eine biologische Probe aus dem Säuger mit einem wie oben beschriebenen biotinylierten TM-Peptid oder einer wie oben beschriebenen Peptidzusammensetzung oder einem wie oben beschriebenen Fusionsprotein unter Bedingungen, die die Bildung eines immunologischen Komplexes gestatten, in Kontakt bringt und
– das Vorhandensein eines zwischen dem biotinylierten TM-Peptid oder der Peptidzusammensetzung oder dem Fusionsprotein und den gegebenenfalls in der Probe vorhandenen Anti-MVV- bzw. Anti-CAEV-Antikörpern ausgebildeten immunologischen Komplexes nachweist.

Die Ausbildung und der Nachweis eines immunologischen Antikörper-Antigen-Komplexes, wodurch das Vorhandensein von Anti-MVV- bzw. Anti-CAEV-Antikörpern in der Probe angezeigt wird, können nach im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Die Gestaltung von zum Nachweis von Antikörpern in einer Probe geeigneten immunologischen Tests kann starke Unterschiede aufweisen, wobei im Fachgebiet viele Formate bekannt sind. Bei den meisten Tests werden ein markierter Antikörper und/oder ein markiertes Peptid verwendet. Bei den Markierungen kann es sich beispielsweise um enzymatische (wie etwa Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase), fluoreszierende, chemolumineszierende, radioaktive oder Farbstoffmoleküle handeln. Bei einem ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) ist die Markierung enzymatisch und das Nachweissignal normalerweise colorimetrisch (optische Dichte).
Zum Nachweis von Antikörpern in einer Probe können sich unterschiedliche Arten von ELISA eignen. Bei einem indirekten ELISA werden die erfindungsgemäßen Peptide auf eine feste Oberfläche (Mikrotiterplatten) als Schicht aufgebracht, wo sie die möglicherweise in der Probe vorhandenen Antikörper einfangen. Die gebundenen Antikörper aus der Probe werden anschließend mit einem markierten zweiten Antikörper (Konjugat) nachgewiesen. Das durch den letzteren erzeugte Signal wird quantifiziert. In einem Antigen-Sandwich-ELISA werden die erfindungsgemäßen Peptide zweimal verwendet, zunächst als Einfangmittel (gebunden an die Oberfläche beispielsweise einer Mikrotiterplatte) und zweitens als Nachweismittel (mit den gebundenen Antikörpern aus der Probe reagierendes markiertes Peptid). Die Antikörper aus der Probe befinden sich in einem „Sandwich" zwischen den beiden Peptidschichten (dies wird durch die beiden Antigenbindungsstellen, die sich auf jedem Antikörper befinden, ermöglicht).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird durch die Erfindung ein wie oben beschriebenes immunologisches Nachweisverfahren oder immunologischer Nachweistest bereitgestellt, wobei es sich bei dem Verfahren bzw. Test um einen ELISA handelt.
Weiterhin wird durch die Erfindung ein immundiagnostischer Kit zum Nachweis einer MVV-Infektion oder einer CAEV-Infektion in Säugern bereitgestellt, wobei der Kit ein wie oben beschriebenes biotinyliertes TM-Peptid oder eine wie oben beschriebene Peptidzusammensetzung umfaßt.
Darüber hinaus wird durch die Erfindung ein immundiagnostischer Kit zum Nachweis einer MVV-Infektion oder CAEV-Infektion in Säugern bereitgestellt, wobei der Kit ein wie oben beschriebenes biotinyliertes TM-Peptid oder eine wie oben beschriebene Peptidzusammensetzung oder ein wie oben beschriebenes Fusionsprotein umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der immundiagnostische Kit einen festen Träger, auf dem bereits ein erfindungsgemäßes biotinyliertes TM-Peptid, vorzugsweise über Biotin/Streptavidin-Wechselwirkung, immobilisiert wurde.
Als Alternative umfaßt ein bevorzugter erfindungsgemäßer immundiagnostischer Kit als Reagens ein erfindungsgemäßes biotinyliertes TM-Peptid im Format eines Biotin/Streptavidin-Komplexes.
Die erfindungsgemäßen immundiagnostischen Kits umfassen neben den biotinylierten TM-Peptiden die notwendigen Puffer und Reagentien zur Durchführung des Tests.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der erfindungsgemäße immundiagnostische Kit ein wie oben beschriebenes biotinyliertes TM-Peptid in Kombination mit einem rekombinanten p25-Protein. Als Alternative umfaßt der immundiagnostische Kit der vorliegenden Erfindung ein wie oben beschriebenes Fusionsprotein.
FIGURENBESCHREIBUNG
1: Das TM-Protein des MVV-EV1-Isolats (wie von Sargan et al. 1991, beschrieben) darstellende Aminosäuresequenz. Die Sequenz in Fettdruck entspricht dem erfindungsgemäßen TM1-Peptid.
2: Aminosäuresequenz des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen rekombinanten p25-Proteins (SEQ ID NO 88).
Unterstrichen und in Fettdruck: His-Tag
Unterstrichen: Enterokinase (EK)-Stelle
3: Physikalische Karte des Expressionskonstrukts pIGRHISAMVVp25. Relevante Restriktionsstellen sind bezeichnet.
4: Induktionsexperiment zur Produktion von HisMVVp25-Protein.
Proben wurden in unterschiedlichen Zeitabständen entnommen (Spuren 1, 2 bzw. 3: nicht induziert, 1,5 h bzw. 3 h Induktion) und auf SDS-PAGE analysiert.
Nachweis der Proteine mit Coomassie-Färbung. Die Verteilung zwischen unlöslicher (Spur 4), Einschlußkörperchen- (Spur 5) und löslicher (Spur 6) Fraktion ist ebenso gezeigt. Der Pfeil bezeichnet das MVV-Fusionsprotein.
5: Analyse des gereinigten HisMVVp25-Proteins.
Teil A: Analyse von gereinigtem Protein aus der löslichen Fraktion (Spuren 3 und 4) und aus der Einschlußkörperchenfraktion (Spuren 1 und 2). Nachweis mit Coomassie-Färbung.
Teil B: Western-Blot-Analyse mit einem mit MVV infizierten Schafserum (links) oder einem Anti-Coli-Serum (rechts). Spuren 1 und 3, lösliche Fraktion; Spuren 2 und 4, Einschlußkörperchen.

6: Indirekter ELISA mit biotinyliertem MVV-TM1-Peptid (SEQ ID NO 85) als Nachweisreagens. OD-Werte entsprechen den in Tabelle 4 angegebenen Werten. OD-Werte mit auf der Mikrotiterplatte als Schicht aufgetragenem TM1-Peptid (direkt aufgetragen oder über Streptavidin) sind durch schwarze Balken dargestellt. Kontrollwerte ohne aufgetragenes TM1-Peptid sind als weiße Balken dargestellt. Die horizontale Linie stellt das Cutoff-Niveau (C.O.) dar.
Teil 6A: Direkte Beschichtung mit dem biotinylierten TM1-Peptid
Teil 6B: Beschichtung mit dem mit Biotin/Streptavidin komplexierten TM1-Peptid Verwendete Seren werden gemäß ihrer Reaktivität im AGIDT klassifiziert:

gp135+:	deutlich positiv in AGIDT mit Anti-gp135-Referenzantikörper
gp135+/–:	schwach positiv im AGIDT mit Anti-gp135-Referenzantikörper
p25+:	deutlich positiv im AGIDT mit Anti-p25-Referenzantikörper

Zweifelhaft: unbestimmte Reaktivität im AGIDT
Negative Seren (mit * markiert): stammen aus isländischen Herden, die als MVV-frei erklärt sind.

7: Vergleichender ELISA mit den Peptiden TM1, TM2 und TM3 (bzw. SEQ ID NO 85, 86, 87). Die biotinylierten Peptide werden mit Streptavidin komplexiert und anschließend als Schicht auf die Mikrotiterplatten aufgetragen. Es werden die gleichen Seren und Reaktionsbedingungen wie in 6 verwendet. Die senkrechte Achse zeigt die S/N-Werte (Werte > 1 werden als positiv betrachtet).
8: ELISA mit rekombinantem p25 (SEQ ID NO 88) als Nachweisreagens.
Es werden die gleichen Seren und Reaktionsbedingungen wie in 6 verwendet. S/N-Werte oberhalb von 1 werden als positiv betrachtet.
9: „Combi-ELISA" mit einer Kombination aus über Streptavidin-Wechselwirkung als Schicht aufgetra genem biotinyliertem TM1-Peptid (SEQ ID NO 85) und rekombinantem p25-Protein (SEQ ID NO 88) als Nachweisreagens. Gleiche Seren und gleiche Reaktionsbedingungen wie in 6. Serum N1–17 wurde in dieser Reihe nicht getestet.
BEISPIELE
Beispiel 1 : Expression von rekombinantem MVV-p25-Protein in E. coli
Klonierung des das MVV-p25-Protein codierenden Gens mittels PCR
Das p25-Protein von MVV wird durch das gag-Vorläufer(Group Associated Antigens)-Gen codiert. Dies ergibt ein nicht glykosyliertes Protein von 55 kD, das enzymatisch gespalten und zu p25 (dem Kernprotein), p16 (Matrixprotein) und p14 (dem Nukleoprotein) prozessiert wird. Es stellte sich heraus, daß von allen viralen gag-Proteinen das Kernprotein am stärksten immunogen ist. Es ist ebenso das am stärksten konservierte gag-Protein unter allen bis heute sequenzierten MVV-Isolaten.
Das das p25-Protein codierende Virusgen wurde mittels PCR kloniert, wobei von nicht integrierter proviraler DNA ausgegangen wurde, die aus in vitro kultivierten infizierten Schafsfibroblasten nach dem modifizierten Hirt-Verfahren extrahiert wurde.
Für die Amplifikation des p25-Gens wurde der folgende Primersatz verwendet:

(a) 5'-TCCCGGGATCCATAGAAGGTAGAATTGTAAATCTGCAAGCAGG-3' (Sens) (SEQ ID NO 89)
(b) 5'-ACACCCGGGATCCCTTCTGATCCTACATCTC-3' (Antisens) (SEQ ID NO 90)

Das durch PCR erhaltene Fragment wurde in den Vektor pTZ (Pharmacia) kloniert und sequenziert. Es wurde dann als BamHI-Fragment in pBluescript SK (Stratagene) übertragen und anschließend als ein SmaI/XbaI-Fragment in den Expressionsvektor pIGRHISA kloniert.
Expression des p25-Antigens in E. coli Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Expressionsvektor pIGRHISA ist in 3 dargestellt. Die Transkription des heterologen Gens wird durch den linken Promoter des Bakteriophagen Lambda gesteuert. Dieser Promoter wird durch einen temperaturempfindlichen Repressor (Ci^ts), der von einem in der gleichen Zelle vorhandenen kompatiblen Plasmid bereitgestellt wird, kontrolliert. Dieses System ist streng kontrolliert und gestattet den Zellen das Wachstum unter reprimierten Bedingungen (28°C), unter denen keine (oder sehr begrenzte) Mengen an heterologem Protein produziert werden. Nach Induktion bei höherer Temperatur (37°C oder 42°C) wird das interessierende Protein über einen begrenzten Zeitraum produziert, der je nach den spezifischen Anforderungen für jedes zu produzierende Protein optimiert werden kann. Dieses System gestattet die Produktion von Proteinen, die für den Wirtsorganismus toxisch sind und deren konstitutive Expression für den Wirt tödlich wäre.
Im Vektor pIGRHISA folgt auf das Startcodon ein Codon für Alanin, dem unmittelbar sechs Histidincodons sowie eine von Enterokinase erkannte Spaltstelle folgen. In diesem Fall trägt das produzierte Protein an seinem N-terminalen Ende die Sequenz M-A-H-H-H-H-H-H-V-D-D-D-K. Die Enterokinase-Spaltstelle gestattet die Abtrennung der Hexahistidinsequenz vom gereinigten Protein, falls dies notwendig sein sollte.
Das mit PCR erhaltene, das p25-Protein codierende Gen wurde als SmaI/XbaI-Verdau in den Vektor pIGRHISA kloniert. Der Vektor wurde mit NsiI geöffnet, mit Klenow-Polymerase stumpfendig gemacht und mit XbaI geschnitten. Durch die auf diese Weise erzeugte SmaI/NsiI-Fusion wird das Leseraster zwischen dem His6-Bereich aus dem Vektor und dem MVV-Gen wieder hergestellt. Dieses Plasmid wurde mit pIGRHISAp25 bezeichnet (3). Die Sequenz des von diesem Konstrukt erhaltenen rekombinanten p25-Proteins ist in 2 dargestellt (SEQ ID NO 88). Dieses rekombinante Protein wird als HisMVVp25-Protein bezeichnet.
Induktion der heterologen Expression
Expressionsexperimente werden in E. coli-Stämmen durchgeführt, die ein eine temperaturempfindliche Mutante des CI-Repressorgens codierendes kompatibles Plasmid tragen. Zur Induktion der Expression der unter der Kontrolle des Lambda-Promoters klonierten Gene wird eine Kultur durch Animpfen mit einer gesättigten Übernachtkultur bei einer Verdünnung von 1:100 gestartet. Die Kultur wird dann bei 28°C bis zu einer OD von etwa 0,2 (bei 600 nm) wachsen gelassen und die Temperatur dann auf 42°C gebracht. Die Kultur wird mehrere Stunden lang weiter inkubiert, wobei der genaue Induktionszeitraum von dem einzelnen Protein abhängt. Für die Produktion rekombinanter Proteine im Großmaßstab wurde ein 15 l-Fermentor verwendet. Die Induktionsbedingungen waren im wesentlichen die gleichen wie oben beschrieben. Während der Fermentation wurden der pH-Wert, der Sauerstoffdruck und die Temperatur überwacht und eingestellt. Die Wachstumskurve wird ebenso aufgenommen. Nach Beendigung der Fermentation werden die Zellen durch Mikrofiltration und Zentrifugation konzentriert, und das Zellpellet wird bis zur weiteren Verarbeitung bei –70°C gelagert.
Zur Beurteilung des Expressionsniveaus der rekombinanten Proteine wurden Induktionen im kleinen Maßstab durchgeführt und die Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Induktion geerntet. Die Zellen wurden durch Kochen in SDS/Mercaptoethanol lysiert, und das Lysat wurde mittels SDS/PAGE analysiert und mit Coomassie-Blau angefärbt. Das Expressionsniveau wurde in drei unterschiedlichen E. coli-Stämmen (SG4044, MC1061 und UT5600) analysiert. Das höchste Expressionsniveau wurde in SG4044 erhalten, und dieser Stamm wurde für die Fermentation im Großmaßstab verwendet. Eine Analyse eines Fermentationslaufs in Abhängigkeit von der Zeit ist in 4 gezeigt. Zudem wird in 4 auch die Verteilung des Proteins zwischen löslicher und unlöslicher Fraktion (einschließlich der Membranfraktion und Einschlußkörperchen) nach Lyse der Zellen mit einer French-Press gezeigt. Das rekombinante MVV-p25-Protein ist in der löslichen ebenso wie in der unlöslichen Fraktion vorhanden. Beide Fraktionen wurden aufgereinigt und in der Serologie verwendet.
Reinigung des rekombinanten p25-Proteins
Das nach der Fermentation erhaltene Zellpellet wurde in Lysepuffer (10 mM Tris pH 6,08, mit 150 mM KCl und 5 mM EDTA) resuspendiert (5 ml pro Gramm feuchte Zellen) und durch zweimaliges Durchleiten durch die French-Press lysiert. Vor der Lyse wurde zur Proteasehemmung die Suspension mit PMSF (1 mM) und Epsilon-Aminocapronsäure (25 mM) supplementiert. Die Suspension wurde durch Zentrifugation geklärt, und da das MVV-p25-Protein in Einschlußkörperchen ebenso wie in der löslichen Fraktion vorhanden ist, wurden sowohl der geklärte Überstand als auch das Pellet für die weitere Aufarbeitung verwendet.
Die nach der Lyse mit der French-Press erhaltene Pelletfraktion wurde in Puffer mit 6M Guanidiniumchlorid (50 mM Phosphat, 0,05% Triton-X-100, pH 7,2) solubilisiert. Die nach Zentrifugation bei 30 000 erhaltene geklärte Lösung wurde dann auf eine voraktivierte und mit dem gleichen Puffer mit 6 m Guanidiniumchlorid und 20 mM Imidazol äquilibrierte Ni-IDA-Säule (Pharmacia) aufgetragen. Eine 12-ml-IDA-Säule wurde mit dem Äquivalent von 4 Liter Fermentationsbrühe beladen. Die Säule wurde dann mit dem Guanidiniumpuffer mit 0,05 Triton-X-100 gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm das Grundniveau erreichte. Die Säule wurde mit dem Ladepuffer mit 35 mM Imidazol und anschließend 50 mM Imidazol gewaschen. Das gebundene Protein wurde dann mit 200 mM Imidazol eluiert. Die Fraktionen wurden über SDS/PAGE und Western-Blotting zur Beurteilung der Reinheit und der Ausbeute der Reinigung analysiert.
Zur Aufreinigung der löslichen Fraktion wurde der nach dem Klären des French-Press-Lysats erhaltene Überstand mit festem Guanidiniumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 6 M versetzt. Die weitere Aufarbeitung erfolgte wie oben beschrieben.
Die von der IMAC-Säule bei 200 mM Imidazol eluierten Proteinfraktionen wurden vereinigt und auf SDS/PAGE mit anschließendem Immunoblotting analysiert (5). Die Reinheit der Präparation wurde durch Sondieren des Blots mit gegen E. coli-Gesamtprotein produziertem Serum beurteilt. Nach dieser Analyse wurde die Reinheit beider Proteinpräparationen auf höher als 95% geschätzt. Dies wurde ebenso durch Silberfärbung bestätigt. Die Gesamtausbeute an gereinigtem Protein betrug etwa 10 mg HisMVVp25-Protein pro Liter Fermentationsbrühe.
Die Menge an gereinigtem rekombinantem Protein wurde mit dem Micro-BCA-Verfahren (Pierce) geschätzt, wobei Rinderserumalbumin als Standard verwendet wurde.
Das rekombinante HisMVVp25-Protein enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und vor ihrer Verwendung für die serologische Analyse gegen einen Puffer mit 6 M Harnstoff (50 mM Phosphat pH 7,2, 150 mM NaCl) dialysiert, um das Guanidiniumchlorid und das Imidazol, die nachgewiesenermaßen einen hohen Hintergrund mit Schafseren ergeben (Ergebnisse nicht gezeigt), zu entfernen.
Beispiel 2: Synthese, Biotinylierung und Cyclisierung von MVV-TM-Peptiden
Die Peptide wurden auf einem Tentagel S-Harz (Rapp Polymere GmbH, Deutschland) unter Verwendung eines Rainin-Symphony/Multiplex-Synthesegeräts mit Standard Fmoc-Chemie und HOBt/TBTU (TBTU:2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat; HOBt:N-Hydroxybenzotriazol)-in situ-Aktivierung synthetisiert. Es wurden Standard-Doppelkopplungen mit einem 4fachen Überschuß an Aminosäuren in Gegenwart äquimolarer Mengen von HOBt und TBTU über einen Zeitraum von 2 × 20 Minuten durchgeführt. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde durch milde Basenbehandlung mit 2% Piperidin/2% DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en) in DMF (Dimethylformamid) entfernt.
Die Biotinylierung wurde durchgeführt, indem Biotin in 30% Dimethylsulfoxid/70% Dimethylformamid mit in-situ-Aktivierung gelöst wurde. Nach Vervollständigung des Peptid-Harz-Komplexes wird das Peptid durch 2,5stündige Inkubation mit 90% Trifluoressigsäure/5% Thioanisol/3% Ethandithiol/2% Anisol vom Harz abgespalten. Das Peptid wird aus dem Abspaltungsgemisch mit t-Butylmethylether ausgefällt. Nach Zentrifugation wird das Pellet 3mal mit t-Butylmethylether gewaschen und über Nacht im Vakuum getrocknet. Die Reinheit des Rohpeptids wird auf RP-HPLC überprüft.
Die folgenden TM-Peptide wurden synthetisiert:

TM1: B-GGQELDCWHYQHYCVTSTKS (SEQ ID NO 85)
TM2: B-GGRYRDNCTWQQWEEEIE (SEQ ID NO 86)
TM3: B-GGQRDAQRIPDVWTALQG (SEQ ID NO 87)

Die Oxidation (Cyclisierung) des TM1-Peptids wurde gemäß der folgenden Vorgehensweise durchgeführt: 48,4 mg TM1 wurden in 242 ml 20% ACN (Acetonitril)/0,1% TFA gelöst (Ultraschallbehandlung). Als Referenz-Ausgangsmaterial im analytischen Maßstab wurden 20-μl-Proben entnommen. Danach wurde mit K₃[Fe(CN)₆] in einer Endkonzentration von 0,24 mM versetzt. Der pH-Wert wurde mit 3 M NaOH auf pH 11 erhöht und die Lösung 150 min. bei Raumtemperatur und lichtgeschützt gerührt. Schließlich wurde der pH-Wert wieder auf pH 1,5 mit TFA abgesenkt. Lagerung bei –20°C.
Nach der Oxidation des TM1-Peptids wurde das oxidierte cyclische Peptid (TM1c) mittels HPLC-Chromatographie von der verbliebenen nichtoxidierten Fraktion getrennt. In Kürze: Die Probe wurde auf die HPLC-Säule (Nucleosil 10 μ (C18)-Säule, Vertrieb durch Alltech) in 0,1% TFA geladen. Die Elution wurde durchgeführt, indem ACN nach und nach erhöht wurde, wobei eine Lösung von 80% ACN in 0,1% TFA verwendet wurde. Das TM1c-Peptid eluierte bei 28–30% ACN, während das lineare TM1-Peptid als separates Maximum (Peak) bei 31–32% ACN eluierte.
Beispiel 3. Serologische Beurteilung der MVV-TM-Peptide und des p25-Antigens
Serumproben
Die erfindungsgemäßen MVV-Peptide und -proteine wurden gegen eine Sammlung von Seren aus mit MVV infizierten und nichtinfizierten Schafen getestet, um ihre Eignung als immundiagnostische Reagenzien zu beurteilen. Bei den Schafen handelte es sich hauptsächlich um die „Rasa meat"-Zucht. Alle Tiere waren mindestens 6 Monate alt.
Die Seren von infizierten Tieren wurden mittels klassischem AGIDT (Agar Gel Immuno Diffusion Test) unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Maeditec-1000, Central Veterinary Laboratory, U.K.) charakterisiert. Bei diesem Kit dienen komplette MVV-Viruspartikel als Antigene, wobei als Antikörper kontrolle ein Referenzserum gegen gp 135 und p25 bereitgestellt wird. Die Interpretation der Ergebnisse wurde gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Seren wurden als positiv für gp 135 (gp 135 +), schwach positiv für gp 135 (gp 135 +/–), positiv für p25, zweifelhaft (unbestimmt) und negativ klassifiziert. Als erklärte Serumnegativkontrollen wurden Seren aus isländischen Schafen, die frei von MVV waren, verwendet. Alle Seren wurden bei –20°C gelagert.
ELISA-Verfahren
Rekombinantes p25-Antigen sowie die TM-Peptide wurden im ELISA auf ihre Empfindlichkeit und Spezifität für den Nachweis von Seren aus mit MVV infizierten Schafen beurteilt.
Die Beschichtungsbedingungen (pH-Wert des Beschichtungspuffers, optimale Antigenkonzentration ...) wurden bestimmt und optimiert, um das günstigste Signal/Rausch (S/N)-Verhältnis zu erhalten. Die Antigene werden von einer Stammlösung in dem Beschichtungspuffer verdünnt, so daß die gewünschte Antigenkonzentration erhalten wird. Die Verdünnungsrate beträgt mindestens 1:100, um eine mögliche Störung durch in der Proteinstammlösung vorhandenen Harnstoff zu minimieren. Die biotinylierten Peptide wurden als Schicht entweder direkt (d.h. ohne Streptavidin-Komplexierung) oder nach Komplexbildung mit Streptavidin aufgetragen. Es versteht sich, daß man annehmen darf, daß die direkte Beschichtung mit biotinylierten Peptiden einen äquivalenten Effekt wie die Beschichtung mit nichtbiotinylierten Peptiden hat. Die Komplexbildung mit Streptavidin kann entweder in Lösung (d.h. vor der Beschichtung) oder auf Platten, die zuvor mit Streptavidin (3 μg/ml in Carbonatpuffer) beschichtet ("sensibilisiert") wurden, stattfinden. In den folgenden Beispielen findet die Komplexierung der TM-Peptide mit Streptavidin vor der Beschichtung statt (= Komplex-Beschichtung).
Die verwendeten Beschichtungsbedingungen (außer wenn anders angegeben) sind nachfolgend in Tabelle 3 aufgeführt:
Tabelle 3: ELISA-Beschichtungsbedingungen für MVV-Antigene (Peptide; Proteine)
*: Komplex:

9 μl Streptavidin (5 mg/ml)
12 μl TM-Peptid (1 mg/ml)
129 μl Carbonatpuffer
Mix 1 h bei 37°C inkubieren

Nach der Beschichtung werden die Platten mit einer Kaseinlösung (0,1% Kasein in PBS) plus 0,25 M Glycin ("Blockierungspuffer") abgesättigt. Die Löcher wurden mit 250 μl Blockierungspuffer 1 h bei 37°C inkubiert, wonach sie 3 Mal mit einer Lösung von PBS-Tween 20 ("Waschpuffer") gewaschen wurden. Die in „Probenverdünnungsmittel" (Blockierungspuffer + 2,86 g/l Triton X-705) 1/500 verdünnten Serumproben wurden bei 100 μl/Loch 1 h bei 37°C inkubiert. Nach ausgiebigem (5×) Waschen mit Waschpuffer wurde der Nachweis der gebundenen Schafsantikörper mit einem Peroxidase-konjugierten Kaninchen-Anti-Schafimmunoglobulin (Prosan), 1/10.000 verdünnt in Blockierungspuffer, das man 1 h bei 37°C in den Löchern bewies, durchgeführt. Nach einer weiteren ausgiebigen Waschrunde (5×) wurden die Löcher mit 100 μl des Chromogens TMB (Tetramethylbenzidin) versetzt (1:100-Verdünnung in Substratpuffer (0,06 M Na₂HPO₄·2H₂O; 0,04 M Zitronensäure; 0,006% H₂O₂). Nach 15–30 min. wurde die Farbentwicklung durch Zugabe von 100 μl 1 N H₂SO₄ gestoppt und durch Messen der Werte der optischen Dichte (OD) bei 450 nm–595 nm quantifiziert. Die ELISA-Ergebnisse können als OD-Werte oder als S/N-Verhältnis (Signal/Noise), wobei N in jedem einzelnen Experiment jeweils mit einem Satz von 15 erklärt negativen isländischen Seren bestimmt wurde (N = 2× (Mittelwert der negativen OD-Werte + 3SD)), ausgedrückt werden. Die ELISA-Ergebnisse werden als positiv betrachtet, wenn das S/N-Verhältnis oberhalb 1 liegt.
Einfluß der Streptavidin-Komplexbildung auf die Seroreaktivität von TM1
Das biotinylierte TM1-Peptid (SEQ ID NO 85) wurde als Schicht entweder direkt auf die Mikrotiterplatten oder nach Komplexbildung mit Streptavidin, wie oben beschrieben, aufgetragen. Wie in 6 und Tabelle 4 veranschaulicht, erfolgte nach Präsentation des Peptids über die Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung ein drastischer Anstieg der OD-Werte. Da die direkte Beschichtung mit dem biotinylierten TM1-Peptid als Äquivalent zu der direkten Beschichtung mit nichtbiotinyliertem TM1-Peptid angesehen werden kann, läßt sich sagen, daß auf die Biotinylierung des TM1-Peptids und die nachfolgende Präsentation des Peptids auf einer Festphase über Streptavidin-Wechselwirkung nicht verzichtet werden kann, um eine gute Reaktivität des Peptids mit den Schafsseren zu erhalten. Direkter gesagt: Wenn die Oberfläche einer Immunoessay-Festphase mit dem durch SEQ ID NO 1 dargestellten Peptid als solchem beschichtet wird, so ist dieses vollkommen unbrauchbar (siehe 6a). Nach der Biotinylierung des Peptids (wie z.B. SEQ ID NO 85) und anschließender Präsentation des Peptids über die Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung, wird es gegenüber Seren aus mit MVV infizierten Schafen hoch reaktiv (siehe 6b). Obwohl bekannt ist, daß die Präsentation des Peptids über einen Streptavidin/Biotin-Komplex einen positiven Effekt auf die Seroreaktivität und/oder die Bindungseffizienz einiger Peptide hat, kann der Unterschied in der Reaktivität, wie er zwischen 6a und 6b beobachtet wird, als hochüberraschend angesehen werden. Wie in Tabelle 4 gezeigt erreichte der beobachtete Reaktivitätsanstieg häufig einen Faktor von 100 oder ging sogar darüber hinaus.
Tabelle 4: Dem in Figur 6 dargestellten ELISA entsprechende OD-Werte. Anstiegsfaktor = Faktor des Reaktivitätsanstiegs, wenn die Beschichtung mit biotinyliertem TM-Peptid über Streptavidin erfolgt anstatt einer direkten Beschichtung der Mikrotiterplatte.
Vergleichende Seroreaktivität der Peptide TM1, TM2 und TM3 im ELISA
Die drei biotinylierten TM-Peptide TM1, TM2 und TM3 (SEQ ID NO 85, 86 bzw. 87) wurden mit Streptavidin komplexiert und anschließend für serologische Tests als Schicht auf Mikrotiterplatten aufgetragen. Dabei wurde der gleiche Satz von Seren wie in 6 dargestellt verwendet. 7 zeigt die deutlich bessere Reaktivität des TM1-Peptids verglichen mit TM2 und TM3, die kaum reaktiv mit AGIDT-positiven MVV-Seren waren. Gegenüber der gesamten Gruppe von getesteten Seren in 7 beträgt die mit TM1 als Nachweisreagenz erhaltene Gesamtempfindlichkeit 84%, während ein auf TM2 bzw. TM3 beruhender ELISA nur ein Empfindlichkeitsniveau von 19% bzw. 42% erreicht.
Seroreaktivität des p25-Antigens
Der gleiche Satz von Seren wurde zur Bewertung der serologischen Reaktivität des rekombinanten p25-Antigens unter den wie oben beschriebenen Bedingungen verwendet. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Einige Seren, die mit dem Peptid TM1 nicht erfaßt wurden, werden nun mit dem p25-Antigen nachgewiesen (wie z.B. Serum-Nr. N1/8, N-3/21). Andererseits ist die Gesamtempfindlichkeit des p25-Antigens niedriger (58%) als die mit dem Peptid TM1 allein erhaltene Empfindlichkeit (84%). Zudem lagen die mit dem p25-Antigen erhaltenen S/N-Werte im allgemeinen unterhalb der mit TM1-Peptid als Antigen erhaltenen Werte.
Abschließend kann die mit dem Peptid TM1 erhaltene hohe Empfindlichkeit, die besser als die mit dem rekombinanten p25 erhaltene Empfindlichkeit ist, als ziemlich außergewöhnlich angesehen werden und beweist den tatsächlich immunodominanten Charakter des durch TM1 repräsentierten Epitops. Eine begrenzte Anzahl von Seren scheint gegenüber dem Peptid nicht reaktiv zu sein, reagiert jedoch mit dem rekombinanten p25. Daher wurde ein kombinierter ELISA, bei dem beide Antigene zusammen auf der Festphase verwendet werden, entworfen.
ELISA auf Basis einer Kombination des TM1-Peptids mit p25: "Combi-ELISA"
Eine Kombination aus dem p25-Antigen mit dem biotinylierten TM1-Peptid, komplexiert mit Streptavidin, wurde wiederum mit dem gleichen Satz von Seren wie zuvor getestet. Dabei mußten zunächst die Beschichtungsbedingungen optimiert werden. Wurden beide Antigene, p25 und [strept/TM 11]-Komplex, in den Konzentrationen, wie sie für die getrennte Beschichtung verwendet wurden, aufgetragen, so wurde mit mehreren Seren ein beträchtlich geringeres Signal erhalten als bei der getrennten Verwendung der Antigene. Dies war insbesondere der Fall für Seren, die mit dem TM1-Peptid allein hohe Signale ergaben, mit p25 jedoch negativ waren. Diese Beobachtung deutete darauf hin, daß das rekombinante p25 einen negativen Effekt auf die TM1-Reaktion hatte. Daher wurde ein anderes Verhältnis von p25 und TM1-Peptid für die Beschichtung getestet, und die Ergebnisse zeigten, daß die Erniedrigung der Beschichtungskonzentration des p25 von 5 μg/ml auf 1 μg/ml die Ergebnisse bei einer gemeinsamen Beschichtung mit beiden Antigenen beträchtlich verbesserte. Daher sind die letztendlich akzeptierten Bedingungen für die kombinierte Beschichtung 1 μg/ml p25 und 3 μg/ml Komplex [strept/TM1], wie in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 5 zeigt, daß bei Verwendung dieser Kombination von Antigenen eine außergewöhnlich hohe Empfindlichkeit von (> 98%) erhalten wurde.
Eine Reihe zusätzlicher Serumproben unterschiedlichen Ursprungs (Schottland, Spanien, Italien) wurden im Combi-ELISA getestet. Die Gesamtbewertung ist in Tabelle 5 unten zusammengefaßt.
Tabelle 5. Zusammenfassung der mit dem Combi-ELISA im Vergleich zum AGIDT erhaltenen serologischen Ergebnisse (Gesamtanzahl der getesteten Seren: 2336)
Die Gesamtübereinstimmung zwischen AGIDT und ELISA ist gut, so weit es um die Empfindlichkeit geht (98,4%). Dies durfte erwartet werden, da bekannt ist, daß der ELISA empfindlicher als der AGIDT ist. Andererseits besteht eine Folge dieser höheren Empfindlichkeit darin, daß sich mehr im AGIDT unbestimmte oder negative Proben im ELISA als positiv herausstellen. Die relative Unempfindlichkeit des AGIDT-Tests führt dazu, daß er als Gold-Standard nicht geeignet ist, womit der geringere Spezifitätswert (96,9%) des ELISA gegenüber dem AGIDT mit Vorsicht betrachtet werden muß. Zu widersprüchlichen Ergebnissen führende Proben wurden weiter mit alternativen serologischen Ansätzen (wie z.B. LIA oder Western-Blotting mit Viruslysat als Antigen) analysiert. Die Werte aus Tabelle 5 werden unter Berücksichtigung der Ergebnisse der alternativen Serologie angepaßt, wie in der Tabelle 6 gezeigt (wobei die unbestimmten Proben weggelassen werden). Diese Tabelle veranschaulicht, daß die Berücksichtigung der Ergebnisse der alternativen serologischen Tests eine beträchtliche Auswirkung auf den Spezifitätswert des Tests hat.
Tabelle 6. Zusammenfassung der mit dem Combi-ELISA erhaltenen serologischen Ergebnisse unter Berücksichtigung der alternativen serologischen Tests
Einfluß der Cyclisierung des TM1-Peptids
Während der serologischen Bewertung des TM1-Peptids wurde festgestellt, daß die Reaktivität von frisch gelöstem TM1 suboptimal war und sich bei Aufbewahrung der Lösung verbesserte (siehe Tabelle 7). Dieses Phänomen könnte darauf hindeuten, daß während der Aufbewahrung eine Ausbildung von Disulfidbrücken erfolgt.
Tabelle 7: Mit einem Combi-ELISA erhaltenes S/N-Verhältnis, wobei entweder einen neue (= frisch gelöste) (N) oder alte (= aufbewahrte) (O) Lösung von TM1 als Beschichtungsantigen in Kombination mit p25 verwendet wird. Die Seren 6 bis 118 stammen aus Schottland (AGIDT + Seren). Die anderen Seren (N) stammen aus Saragossa (Spanien).
Die chemische Oxidation des TM1-Peptids zur Bildung intramolekularer Disulfidgruppen wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Durch diese Behandlung wurde ein Peptid (TM1c) mit guter Anfangsreaktivität und Stabilität in Lösung erhalten. Dieses wurde daher gegenüber TM1 als bevorzugtes Reagens für die Entwicklung serologischer Tests verwendet.
Alternative serologische Tests
Als alternatives System wurden die Antigene auch auf LIA-(Line Immuno Assay)-Streifen aufgetragen. Bei diesem System wurden die gereinigten Antigene oder Peptidkomplexe in parallelen Reihen auf Nylonmembranen aufgetragen, die dann senkrecht zu den Antigenreihen geschnitten wurden, so daß kleine Streifen (3–5 mm breit) erhalten wurden. Die Peptide wurden als Komplexe mit Streptavidin aufgetragen. Diese Streifen wurden mit dem verdünnten Serum inkubiert und ähnlich wie ein Western-Blot weiterentwickelt. Die Reaktivität des Antigens oder Peptids mit dem Serum zeigt sich als gefärbte Linie auf den jeweiligen Positionen.
Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, daß LIA für das weitere Austesten problematischer (zweifelhafter) Seren geeignet sein kann. Tatsächlich waren in einigen Fällen ELISA-negative Proben, die AGIDT-positiv sind, gegenüber dem p25-Protein auf LIA reaktiv. Dies deutet darauf hin, daß sich der LIA für Bestätigungszwecke in zweideutigen Fällen eignen könnte.
Testen von Ziegenseren
Eine begrenzte Anzahl von Ziegenseren (212) wurde mit dem Combi-ELISA unter identischen Bedingungen, wie sie für die Schafsseren beschrieben wurden, getestet. Der Nachweisantikörper (Peroxidase-konjugiertes Kaninchen-Anti-Schaf-Immunglobulin (Prosan)) zeigt ausreichende Kreuzreaktivität mit Ziege-Antikörpern, um als Nachweismittel im Combi-ELISA für den Nachweis von CAEV in Ziegen verwendet zu werden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 8 unten gezeigt. Es ist klar ersichtlich, daß der wie oben beschriebene Combi-ELISA auf Basis des MVV-TM1-Peptids (SEQ ID NO 85) und des rekombinanten MVV-p25-Proteins sich auch für den Nachweis von Anti-CAEV-Antikörpern in Ziegen perfekt eignet, zusätzlich zu seiner bereits demonstrierten Eignung zum Nachweis einer MVV-Infektion in Schafen.
Tabelle 8. Zusammenfassung der mit dem Combi-ELISA im Vergleich mit dem AGIDT für Ziegenseren erhaltenen serologischen Ergebnisse (Gesamtzahl der getesteten Seren: 212)
LITERATURANGABEN

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Claims

Biotinyliertes Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz: B-GGQELDCWHYQHYCVTSTKS (SEQ ID NO 85)
Biotinyliertes Peptid nach Anspruch 1, wobei die beiden in der Aminosäuresequenz vorhandenen Cysteinreste (C) unter Bildung einer intramolekularen Cysteinbrücke kovalent verknüpft sind.
Biotinyliertes Peptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Biotinylgruppierung in einem Komplex mit einem Streptavidin- oder Avidinmolekül vorliegt.
Peptidzusammensetzung, umfassend ein biotinyliertes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, kombiniert mit einem beliebigen anderen MVV-Peptid oder rekombinanten Protein.
Peptidzusammensetzung nach Anspruch 4, umfassend ein biotinyliertes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, kombiniert mit einem rekombinanten MVV-gag(p25)-Polypeptid oder einem Fragment davon, insbesondere kombiniert mit dem rekombinanten Protein MVV-p25, wie es durch SEQ ID NO 88 (2) dargestellt ist.
Verwendung eines biotinylierten Peptids oder von biotinylierten Peptidzusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bzw. Ansprüchen 4 und 5 zum immunologischen Nachweis einer Infektion mit MVV oder CAEV.
Verwendung eines biotinylierten Peptids oder von biotinylierten Peptidzusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in einem Kit zum immunologischen Nachweis einer Infektion mit MVV oder CAEV.
Fester Träger, an dem ein biotinyliertes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine Peptidzusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5 immobilisiert ist.
Verfahren zum immunologischen Nachweis einer MVV- oder CAEV-Infektion in Säugern, bei dem man: – eine biologische Probe aus dem Säuger mit einem biotinylierten Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer Peptidzusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5 unter Bedingungen, die die Bildung eines immunologischen Komplexes gestatten, in Kontakt bringt und – das Vorhandensein eines zwischen dem biotinylierten Peptid oder der Peptidzusammensetzung und den gegebenenfalls in der Probe vorhandenen Anti-MVV- bzw. Anti-CAEV-Antikörpern ausgebildeten immunologischen Komplexes nachweist.
Immundiagnostischer Kit zum Nachweis einer MVV- oder CAEV-Infektion in Säugern, wobei der Kit ein biotinyliertes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine Peptidzusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5 umfaßt.