DE69433690T2

DE69433690T2 - Chimere proteine, welche borrelia polypeptide beinhalten, verwendungen dafür

Info

Publication number: DE69433690T2
Application number: DE69433690T
Authority: DE
Inventors: J. John DUNN; J. Benjamin LUFT
Original assignee: Research Foundation of State University of New York; Brookhaven Science Associates LLC
Current assignee: Research Foundation of State University of New York; Brookhaven Science Associates LLC
Priority date: 1993-11-01
Filing date: 1994-10-27
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2014-10-28
Also published as: IL111479A0; EP0726955A1; ES2219657T3; WO1995012676A1; CA2175567C; EP0726955B1; AU8127494A; ATE263836T1; CA2175567A1; PT726955E; DK0726955T3; DE69433690D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Lyme Borreliose ist die Häufigste von Zecken übertragene Infektionserkrankung in Nordamerika, Europa und Nordasien. Das diese Erkrankung auslösende Bakterium, Borrelia burgdorferi, wurde zuerst 1982 isoliert und kultiviert (Burgdorferi, W.A. et al., Science 216: 1317–1319 (1982); Steere, A.R. et al., N. Engl. J. Med. 308: 733–740 (1983)). Aufgrund dieser Entdeckung konnte eine große Anzahl klinischer Syndrome, die sowohl in der europäischen als auch in der amerikanischen Literatur seit dem frühen 20. Jahrhundert beschrieben wurden, einer Infektion durch B. burgdorferi zugeschrieben werden (Afzelius, A., Acta Derm. Venereol. 2: 120–125 (1921); Bannwarth, A., Arch. Psychiatr. Nervenkrankh. 117: 161–185 (1944); Garin, C. und A. Bujadouz, J. Med. Lyon 71: 765–767 (1922); Herxheimer, K. und K. Hartmann, Arch. Dermatol. Syphilol. 61: 57–76, 255–300 (1902)).
Die Immunantwort gegen B. burgdorferi wird durch eine frühe, prominente und persistente humorale Antwort gegen das Ende des Geißelproteins p41 (fla) und gegen einen Proteinbestandteil des protoplasmatischen Zylinders, p93 (Szczepanski, A., und J.L. Benach, Microbiol. Rev. 55: 21 (1991)) charakterisiert. Das p41 Geißelantigen ist ein immundominantes Protein; es besitzt jedoch signifikante Homologie mit Flagellinen anderer Mikroorganismen und ist deswegen stark kreuzreaktiv. Das p93 Antigen ist das größte immundominante Antigen von B. burgdorferi. Sowohl das p41 als auch das p93 Protein sind physisch verborgene Antigene, die vor dem Immunsystem durch eine äußere Membran geschützt sind, deren Hauptproteinbestandteile die äußeren Membranproteine A und B (OspA und OspB) sind. OspA ist ein basisches Lipoprotein von etwa 31 kd, welches zusammen mit OspB, einem basischem Lipoprotein von etwa 34 kd, auf einem großen linearen Plasmid kodiert ist (Szczepanski, A., und J.L. Benach, Microbiol. Rev. 55: 21 (1991)). Die Analyse von aus Nordamerika und Europa stammenden Isolaten von B. burgdorferi haben gezeigt, dass OspA antigene Variabilität aufweist, und das verschiedene distinkte Gruppen serologisch und genotypisch definiert werden können (Wilske, B. et al., World J. Microbiol. 7: 130 (1991). Andere Borrelia-Proteine zeigen eine ähnliche antigenische Variabilität. Überraschenderweise tendiert die Immunantwort gegen diese Proteine der äußeren Oberfläche dazu falls überhaupt spät im Krankheitsverlauf aufzutreten (Craft, J. E. et al., J. Clin Invest. 78: 934–939 (1986); Dattwyler, R.J. und B.J. Luft, Rheum. Clin. North Am. 15: 727–734 (1989)). Außerdem reagieren Patienten die akut oder chronisch mit B. burgdorferi infiziert sind, unterschiedlich auf die verschiedenen Antigene einschließlich OspA, OspB, OspC, OspD, p39, p41 und p93.
Die Herstellung von Vakzinen gegen die Lyme Borreliose wurden bereits versucht. Mäuse, die mit einer rekombinanten Form von OspA immunisiert wurden, sind gegenüber einer Infektion mit dem selben Stamm von B. burgdorferi, von welchem das Protein erhalten wurde, geschützt (Fikrig, E. et al., Science 250: 553–556 (1990)). Weiterhin wurde gezeigt, dass passiv transferierte monoklonale Anti-OspA Antikörper (Mabs) in Mäusen protektiv wirken, und das die Impfung mit einem rekombinanten Protein einer protektiven Immunität gegen nachfolgende Infektion mit dem homologen Stamm von B. burgdorferi injizierte (Simon, M. M. et al., J. Infect. Dis. 164: 123 (1991)). Unglücklicher Weise bedingt jedoch die Immunisierung mit einem Protein von einem Stamm nicht notwendigerweise die Resistenz gegenüber einem heterologen Stamm (Fikrig, E. et al., J. Immunol. 7: 2256–1160 (1992)), sondern ist im Gegenteil eher auf die homologe „Arten" begrenzt, aus welchen das Protein erhalten wurde. Weiterhin wird eine Immunisierung mit einem einzelnen Protein eines ausgewählten Stammes von Borrelia nicht notwendigerweise in allen Individuen eine Resistenz hervorrufen. Sowohl OspA und OspB als auch p93 zeigen eine deutliche Variation auch innerhalb der Regionen, die für die Antigenizität verantwortlich sind. Daher hängen sowohl das Ausmaß als auch die Häufigkeit des Auftretens eines Schutzes, welcher von einer Impfung mit einem Protein aus einem einzelnen Stamm ausgeht, von der Antwort des Immunsystems auf die entsprechende Variante und auch von der Häufigkeit der genetischen Abweichung in B. burgdorferi ab. Daher besteht zur Zeit ein Bedarf an einem Vakzin, welches Immunität über die Artgrenzen hinweg, gegenüber mehreren Epitopen innerhalb einer Spezies und gegen mehr als ein Protein verleiht.
Rosa et al. (Molec. Biol. 6: 3031–3040 (1992)) beschreiben die Isolierung von klonalen B. burgdorferi Stämmen, bei denen innerhalb des OspA/OspB Operons Rekombinationen aufgetreten sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft chimäre Borrelia-Proteine, welche zwei oder mehr antigene Borrelia-Polypeptide umfassen, welche natürlicherweise (in der Natur) in dem selben Protein in Borrelia nicht auftreten, sowie die Nukleinsäuren, die solche chimäre Proteine kodieren. Die in die chimären Proteine eingebauten antigenen Polypeptide stammen aus jedweden Borrelia-Protein aus jedweden Borrelia Stamm, und umfassen die Proteine der äußeren Oberfläche OspA, OspB, OspC, OspD, p12, p39, p41, p66 und p93. Die Proteine, aus denen die antigenen Polypeptide erhalten werden, können aus dem gleichen Stamm von Borrelia, aus unterschiedlichen Stämmen oder aus Kombinationen von Proteinen aus dem gleichen und unterschiedlichen Stämmen stammen. Falls die Proteine, aus denen die antigenen Polypeptide stammen, OspA oder OspB sind, kann das erhaltene antigene Polypeptid entweder aus dem Anteil des OspA oder OspB Proteins erhalten werden, welcher zwischen dem Aminoende und dem konservierten Tryptophan des Proteins (im weiteren proximaler Anteil genannt) vorhanden ist, oder aus dem Anteil des OspA oder OspB Proteins, welcher zwischen dem konservierten Tryptophan des Proteins und dem Carboxyterminus (im weiteren distaler Anteil) vorhanden ist. Ausgewählte chimäre Proteine und die für sie kodierende Nukleinsäuresequenzen sind in den 23–37 und 43–46 dargestellt.
Die chimären Proteine der vorliegenden Erfindung stellen antigene Polypeptide aus unterschiedlichen Borrelia-Stämmen und/oder Proteinen innerhalb eines einzelnen Proteins zur Verfügung. Diese Proteine sind besonders nützlich, um die Gegenwart von Antikörpern gegen native Borrelia in möglicher Weise infizierten Individuen in immundiagnostischen Tests zu untersuchen, und um die T-Zell Reaktivität zu messen, und können daher als immundiagnostische Mittel verwendet werden. Außerdem sind die chimären Proteine der vorliegenden Erfindung zusätzlich als Impfstoffe bei einer Borrelia-Infektion geeignet. Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung zusammen mit anderen und weiteren Gegenständen, wird auf die folgende Beschreibung zusammen mit den begleitenden Zeichnungen Bezug genommen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 fasst Peptide und antigene Domänen zusammen, die durch proteolytische und chemische Fragmentierung von OspA lokalisiert wurden.
2 zeigt einen Vergleich der in 1 dargestellten antigenen Domänen von OspA in neun Stämmen von B. burgdorferi.
3 zeigt einen Graph, wobei ein gewichteter Polymorphismus gegenüber der Aminosäureposition in Form eines Plots bei 14 OspA Varianten zeigt. Die markierten Spitzen sind: a) Aminosäuren 132–145; b) Aminosäuren 163–177; c) Aminosäuren 208–221. Die untere gepunktete Linie bei dem Polymorphismuswert 1.395 markiert statistisch signifikante Polymorphismusüberschüsse bei p = 0.05. Die obere gepunktete Linie bei 1.520 besitzt die gleiche Bedeutung wobei allerdings die ersten 29 Aminosäuren aus dem monomorphen N-Terminus aus der Originalanalyse entfernt wurden.
In 4 ist das Aminosäurealignment der Reste 200 bis 220 der OspAs aus den Stellen B31 und K48 sowie für die gerichteten Mutanten 613, 625, 640, 613/625 und 613/640 dargestellt. Der Pfeil zeigt das Trp216 an. Aminosäureaustausche sind unterstrichen.
5 zeigt eine „helical wheel" Darstellung der Reste 204–217 aus B31 OspA. Großbuchstaben zeigen hydrophobe Reste an, Kleinbuchstaben zeigen hydrophile Reste an, +/– zeigt positiv bzw. negativ geladene Reste an. Die gepunktete Linie zeigt eine Teilung der Alpha-Helix in eine hydrophobe Schleife (oberhalb der Linie) und eine polare Schleife (unterhalb der Linie) an. Übernommen aus France et al. (Biochem. Biophys. Acta 1120: 59 (1992)).
6 stellt einen phylogenetischen Stammbaum für die Borrelia Stämme dar, die in Tabelle 1 beschrieben sind. Die Stämme sind folgendermaßen bezeichnet: 1 = B31; 2 = PKa1; 3 = ZS7; 4 = N40; 5 = 25015; 6 = K48; 7 = DK29; 8 = PHei; 9 = Ip90; 10 = PTrob; 11 = ACAl; 12 = PGau; 13 = Ip3; 14 = PBo; 15 = PKo.
7 zeigt die Nukleinsäuresequenz von OspA-B31 (SEQ ID No. 6) und die kodierte Proteinsequenz (SEQ ID No. 7).
8 zeigt die Nukleinsäuresequenz von OspA-K48 (SEQ ID No. 8) und die kodierte Proteinsequenz (SEQ ID No. 9).
9 zeigt die Nukleinsäuresequenz von OspA-PGau (SEQ ID No. 10) und die kodierte Proteinsequenz (SEQ ID No. 11).
10 zeigt die Nukleinsäuresequenz von OspA-25015 (SEQ ID No. 12) und die kodierte Proteinsequenz (SEQ ID No. 13).
11 zeigt die Nukleinsäuresequenz von OspB-B31 (SEQ ID No. 21) und die kodierte Proteinsequenz (SEQ ID No. 22).
12 zeigt die Nukleinsäuresequenz von OspC-831 (SEQ ID No. 29) und die kodierte Proteinsequenz (SEQ ID No. 30).
13 zeigt die Nukleinsäuresequenz von OspC-K48 (SEQ ID No. 31) und die kodierte Proteinsequenz (SEQ ID No. 32).
14 zeigt die Nukleinsäuresequenz von OspC-PKo (SEQ ID No. 33) und die kodierte Proteinsequenz (SEQ ID No. 34).
15 zeigt die Nukleinsäuresequenz von OspC-PTrob (SEQ ID No. 35) und die kodierte Proteinsequenz (SEQ ID No. 36).
16 zeigt die Nukleinsäuresequenz von p93-B31 (SEQ ID No. 65) und die kodiere Proteinsequenz (SEQ ID No. 66).
17 zeigt die Nukleinsäuresequenz von p93-K48 (SEQ ID No. 67).
18 zeigt die Nukleinsäuresequenz von p93-PBo (SEQ ID No. 69).
19 zeigt die Nukleinsäuresequenz von p93-PTrob (SEQ ID No. 71).
20 zeigt die Nukleinsäuresequenz von p93-PGau (SEQ ID No. 73).
21 zeigt die Nukleinsäuresequenz von p93-25015 (SEQ ID No. 75).
22 zeigt die Nukleinsäuresequenz von p93-PKo (SEQ ID No. 77).
23 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspA-K48/OspA-PGau Chimären (SEQ ID No. 85) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 86).
24 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspA-B31/OspA-PGau Chimären (SEQ ID No. 88) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 89).
25 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspA-B31/OspA-K48 Chimären (SEQ ID No. 91) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 92).
26 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspA-B31/OspA-25015 Chimären (SEQ ID No. 94) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 95).
27 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspA-K48/OspA-B31/OspA-K48 Chimären (SEQ ID No. 97) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 98).
28 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspA-B31/OspA-K48/OspA-B31/OspA-K48 Chimären (SEQ ID No. 100) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 101).
29 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspA-B31/OspB-B31 Chimären (SEQ ID No. 103) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 104).
30 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspA-B31/OspB-B31/OspC-B31 Chimären (SEQ ID No. 106) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 107).
31 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspC-B31/OspA-B31/OspB-B31 Chimären (SEQ ID No. 109) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 110).
32 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspA-B31/p93-B31 Chimären (SEQ ID No. 111) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 112).
33 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspB-B31/p41-B31 Chimären (122-234) (SEQ ID No. 113) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No., 114).
34 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspB-B31/p41-B31 Chimären (122-295) (SEQ ID No. 115) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 116).
35 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspB-B31/p41-B31 Chimären (140-234) (SEQ ID No. 117) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 118).
36 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspB-B31/p41-B31 Chimären (140-295) (SEQ ID No. 119) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 120).
37 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspB-B31/p41-B31 Chimären (122-234)/OspC-B31 (SEQ ID No. 121) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 122).
38 zeigt ein Alignment der Nukleinsäuresequenz OspC-B31 (SEQ ID No. 29), OspC-PKo (SEQ ID No. 33), OspC-PTrob (SEQ ID No. 35) und OspC-K48 (SEQ ID No. 31). Nukleinsäuren welche mit der führenden Nukleinsäuresequenz (hier OspC-B31) identisch sind, sind durch einen Punkt (.) dargestellt; unterschiedliche Nukleinsäuren sind in Kleinbuchstaben gezeigt.
39 zeigt ein Alignment der Nukleinsäuresequenz OspD-pBO (SEQ ID No. 123), OspD-PGau (SEQ ID No. 124), OspD-DK29 (SEQ ID No. 125) und OspD-K48 (SEQ ID No. 126). Nukleinsäuren welche mit der führenden Nukleinsäuresequenz (hier OspD-PBO) identisch sind, sind durch einen Punkt (.) dargestellt; unterschiedliche Nukleinsäuren sind in Kleinbuchstaben gezeigt.
40 zeigt die Nukleinsäuresequenz p41-B31 (SEQ ID No. 127) und die kodierte Proteinsequenz (SEQ ID No. 128).
41 zeigt ein Alignment der Nukleinsäuresequenz p41-B31 (SEQ ID No. 127), p41-pKa1 (SEQ ID No. 129), p41-PGau (SEQ ID No. 51), p41-PBo (SEQ ID No. 130), p41-DK29 (SEQ ID No. 53), und p41-PKo (SEQ ID No. 131). Nukleinsäuren, die mit denen der führenden Nukleinsäuresequenz (hier p41-B31) identisch sind, sind durch einen Punkt (.) dargestellt; unterschiedliche Nukleinsäuren sind in Kleinbuchstaben gezeigt.
42 zeigt ein Alignment der Nukleinsäuresequenz OspA-B31 (SEQ ID No. 6), OspA-pKa1 (SEQ ID No. 132), OspA-N40 (SEQ ID No. 133), OspA-ZS7 (SEQ ID No. 134), OspA-25015 (SEQ ID No. 12), OspA-PTrob (SEQ ID No. 135), OspA-K48 (SEQ ID No. 8), OspA-Hei (SEQ ID No. 136), OspA-DK29 (SEQ ID No. 49), OspA-Ip90 (SEQ ID No. 50), OspA-PBo (SEQ ID No. 55), OspA-Ip3 (SEQ ID No. 56), OspA-PKo (SEQ ID No. 57), OspA-ACAl (SEQ ID No. 58) und OspA-PGau (SEQ ID No. 10). Nukleinsäuren, die mit denen der führenden Nukleinsäuresequenz (hier OspA-B31) identisch sind, sind durch einen Punkt (.) dargestellt; unterschiedliche Nukleinsäuren sind in Kleinbuchstaben gezeigt.
43 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspA-Tro/OspA-Bo Chimären (SEQ ID No. 137) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 138).
44 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspA-PGau/OspA-Bo Chimären (SEQ ID No. 139) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 140).
45 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspA-B31/OspA-PGau/OspA-B31/OspA-K48 Chimären (SEQ ID No. 141) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 142).
46 zeigt die Nukleinsäuresequenz des OspA-PGau/OspA-B31/OspA-K48 Chimären (SEQ ID No. 143) und die kodierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID No. 144).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft chimäre Proteine, die antigene Borrelia-Polypeptide umfassen, die in der Natur nicht in demselben Borrelia-Protein auftreten. Die chimären Proteine stellen eine Kombination aus zwei oder mehr antigenen Polypeptiden dar, welche aus Borrelia-Proteinen stammen. Die antigenen Polypeptide können aus unterschiedlichen Proteinen aus derselben Borrelia-Art, aus unterschiedlichen Proteinen aus unterschiedlichen Borrelia-Arten oder auch aus korrespondierenden Proteinen aus unterschiedlichen Arten stammen. Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff „chimäres Protein" ein Protein, welches zwei oder mehr Polypeptide umfasst, die von einem korrespondierenden und/oder nicht-korrespondierenden nativen Borrelia-Protein stammen. Ein Polypeptid „stammend aus" einem nativen Borrelia-Protein ist ein Polypeptid, welches entweder die gleiche Aminosäuresequenz aufweist wie die Aminosäuresequenz eines in Borrelia vorhandenen Proteins, oder welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die äquivalent ist zu der Aminosäuresequenz des natürlicherweise auftreten Borrelia-Proteins, oder welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen gleich ist zu der Aminosäuresequenz eines natürlicherweise auftretenden Borrelia-Proteins (z.B. nur in wenigen Aminosäuren sich unterscheidend), wie es der Fall ist, wenn eine für ein Protein kodierende Nukleinsäure einer gerichteten Mutagenese unterworfen wird. „Korrespondierende" Proteine sind äquivalente Proteine aus unterschiedlichen Arten oder Stämmen von Borrelia, wie beispielsweise das Oberflächenprotein A (OspA) aus Stamm B31 und OspA aus Stamm K48. Die Erfindung betrifft zusätzlich die Nukleinsäuren, die diese chimären Proteine kodieren.
Wie weiter unten beschrieben wird, haben die Anmelder zwei getrennte antigene Domänen von OspA und OspB identifiziert, welche das einzige in OspA und OspB vorhandene konservierte Tryptophan flankieren. Diese Domänen zeigen bei verschiedenen Genospecies von Borrelia eine Kreuzreaktivität. Die genauen für die antigene Variabilität verantwortlichen Aminosäuren wurden durch gerichtete Mutagenese bestimmt, so dass für die Entwicklung von chimären Proteinen Proteine mit spezifischen Aminosäureaustauschen verfügbar sind. Außerdem haben die Anmelder wie in Beispiel 2 beschrieben immunologisch wichtige hypervariable Domänen in OspA Proteinen identifiziert. Die erste wichtige hypervariable Domäne für chimäre Proteine, Domäne A, umfasst die Aminosäurereste 120–140 von OspA, die zweite hypervariable Domäne, Domäne B, umfasst die Reste 150–180 und die dritte hypervariable Domäne, Domäne C, umfasst die Reste 200–216 oder 217 (abhängig von der Position des einzigen konservierten Tryptophanrests im OspA der ausgewählten Borrelia-Art) (siehe 3). Zusätzlich haben die Anmelder die Gene verschiedener Borrelia-Proteine sequenziert.
Diese Entdeckungen haben die Entwicklung von neuartigen rekombinanten Borrelia-Proteinen ermöglicht, welche zwei oder mehr Aminosäureregionen oder –sequenzen umfassen, die in dem gleichen Borrelia-Protein natürlicherweise nicht vorkommen. Die rekombinanten Proteine umfassen Polypeptide aus einer Vielzahl von Borrelia-Proteinen, umfassend, aber nicht begrenzt auf, OspA, OspB, OspC, OspD, p12, p39, p41, p66 und p93. Antigenisch relevante Polypeptide aus jedem einer Anzahl von Proteinen werden zu einem einzelnen chimären Protein vereinigt.
Unter einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung sind nun Chimären verfügbar, welche antigene Polypeptide umfassen, die einen Tryptophanrest flankieren. Die antigenen Polypeptide stammen entweder von dem proximal zu dem Tryptophan gelegenen Anteil (dem Anteil des OspA oder OspB Proteins, welches zwischen dem Aminoterminus und dem konservierten Tryptophan des Proteins liegt), oder von dem distal zu dem Tryptophan gelegenen Anteil (dem Anteil des OspA oder OspB Proteins, welches zwischen dem konservierten Tryptophan des Proteins und dem Carboxyterminus liegt) in OspA und/oder OspB. Die sich ergebenden Chimären können OspA-OspA Chimären (d.h. Chimären, die Polypeptide vereinigen, die aus OspA aus unterschiedlichen Stämmen von Borrelia stammen), OspA-OspB Chimären, oder OspB-OspB Chimären sein, und sind so aufgebaut, dass Aminosäurereste, die aminoproximal zu dem invarianten Tryptophan liegen, von einem Protein stammen, und Reste, die carboxyproximal zu dem invarianten Tryptophan liegen, von dem anderen Protein stammen. Beispielsweise besteht ein verfügbares Chimäres aus einem Polypeptid, welches aus der aminoproximalen Region des OspA aus Stamm B31 stammt, welches gefolgt wird von dem Tryptophanrest, welcher wiederum von einem Polypeptid gefolgt wird, welches aus der carboxyproximalen Region von OspA aus Stamm K48 (SEQ ID No. 92) stammt. Ein anderes verfügbares Chimär umfasst ein Polypeptid, welches aus der aminoproximalen Region von OspA aus Stamm B31 stammt, sowie ein Polypeptid, welches aus der carboxyproximalen Region von OspB aus Stamm B31 (SEQ ID No. 104) stammt. Falls das proximal zu dem Tryptophan liegende Polypeptid dieser chimären Proteine aus OspA stammt, kann das proximale Polypeptid weiter unterteilt sein in die drei hypervariablen Domänen (Domäne A, B und C), von denen wiederum jede von einem OspA aus einem unterschiedlichen Stamm von Borrelia stammen kann. Diese chimären Proteine können weiterhin zusätzlich zu den antigenen Polypeptiden, die den Tryptophanrest flankieren, antigene Polypeptide aus einem anderen Protein, umfassen.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung sind chimäre Proteine verfügbar, welche antigene Domänen aus zwei oder mehr Borrelia- Proteinen wie beispielsweise Osp Proteinen (OspA, B, C und/oder D) und beispielsweise p12, p39, p41, p66 und/oder p93 vereinigen.
Die vorliegend beschriebenen Chimären können so hergestellt werden, dass sie hoch löslich sind, in E. coli überproduziert werden und nicht lipidiert sind. Zusätzlich können die Chimären Proteine so ausgestaltet sein, dass sie in einem Affinitätsschwanz (His-tag) enden, um die Aufreinigung zu erleichtern. Die vorliegend beschriebenen rekombinanten Proteine wurden konstruiert, um einen hohen Spiegel an Antigenizität zu gewährleisten. Zusätzlich sind nun rekombinante Proteine verfügbar, die für die die Lyme-Erkrankung bewirkenden unterschiedlichen Genospecies von Borrelia spezifisch sind, da die Gene aus jeder der Hauptgenospecies sequenziert wurden; die Sequenzen sind weiter unten dargestellt. Diese rekombinanten Proteine mit ihren neuen biophysikalischen und antigenen Eigenschaften werden wichtige Kandidaten für diagnostische Mittel und Vakzine sein.
Die chimäre Proteine der vorliegenden Erfindung sind vorteilhaft, da sie eine spezifische Reaktivität gegen monoklonale und polyklonale Antikörper gegen Wild-Typ Borrelia-Proteine aufweisen, immunogen sind, und das Wachstum oder die Lyse von Borrelia in-vitro inhibieren induzieren. Weiterhin stellen die Proteine bei manchen Ausführungsbeispielen die antigenen Domänen von zwei oder mehr Borrelia Stämmen und/oder Proteinen innerhalb eines einzelnen Proteins zur Verfügung. Solche Proteine sind insbesondere für immundiagnostische Tests verwendbar. Beispielsweise können die Proteine der vorliegenden Erfindung als Reagenzien in Tests verwendet werden, um die Gegenwart von Antikörpern gegen native Borrelia-Protein in möglicherweise infizierten Individuen nachzuweisen. Diese Proteine können auch als immundiagnostische Reagenzien beispielsweise in Dotblots, Westernblots, ELISA (enzyme linked immunosorbed assays) oder Agglutinationstests verwendet werden. Die chimären Proteine der vorliegenden Erfindung können mittels bekannter Techniken, wie rekombinanter Methoden, der Polymerase Kettenreaktion oder der Mutagenese hergestellt werden.
Außerdem sind die Proteine der vorliegenden Erfindung als Vakzine gegen eine Borrelia Infektion verwendbar. Da gezeigt werden konnte, dass Borrelia klonal vorkommt, wird ein Protein, dass antigene Polypeptide aus einer Vielzahl von Borrelia-Proteinen und/oder Arten umfasst, für eine erhebliche Zeit Immunschutz verleihen, wenn es in einem Vakzine verwendet wird. Das Fehlen einer signifikanten intragenen Rekombination, einem Prozess, welcher schnell neue Epitope mit veränderten antigenen Eigenschaften hervorrufen könnte, stellt sicher, dass Borrelia den antigenen Typus nur über akkumulierende Mutationsänderungen ändern kann, welches verglichen mit der Rekombination für die Ausbildung unterschiedlicher antigener Typen langsam vonstatten geht. Das chimäre Protein kann mit einem physiologisch annehmbaren Träger vereinigt und einem Wirbeltier durch Standardverfahren (z.B. intravenös oder intramuskulär) verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung wird beispielhaft durch die folgenden Beispiele dargestellt, welche jedoch nicht auf irgend eine Art und Weise als begrenzend verstanden werden sollten.
Beispiel 1. Reinigung des Borrelia burgdorferi Oberflächenproteins A und Analyse der Antikörper-bindenden Domänen
Das vorliegende Beispiel beschreibt ein Verfahren für die Reinigung von großen Mengen des nativen Oberflächenproteins A (OspA) bis zur Homogenität, und beschreibt das Zuordnen der antigenischen Spezifitäten einiger anti-OspA Mabs. OspA wurde unter Ausnutzung seiner Resistenz gegen den Trypsinabbau bis zur Homogenität gereinigt. Ein intrinsisches Markieren mit ¹⁴C-Palmitinsäure bestätigte, dass OspA lipdiert ist, und ein partieller Abbau zeigte, dass die Lipidierung an dem aminoterminalen Cystein des Moleküls vorliegt.
Die Reaktivität von sieben murinen monoklonalen Anti-OspA Antikörpern gegenüber neun unterschiedlichen Borrelia Isolaten wurde durch Westernblot-Analyse festgestellt. Gereinigtes OspA wurde durch enzymatische oder chemische Spaltung fragmentiert und die monoklonalen Antikörper waren in der Lage, vier distinkte immunogene Domänen zu definieren (siehe 1). Domäne 3, die die Reste 190–220 von OspA umfasst, reagiert mit protektiven Antikörpern, von denen bekannt war, dass sie in-vitro den Organismus agglutinieren, und sie umfasst distinkte Spezifitäten, von denen manche nicht auf einen Genotyp von B. burgdorferi beschränkt waren.
A. Reinigung von nativem OspA
Die Detergens-Solubilisierung von B. burgdorferi löst die Oberflächenproteine ab, und führt zu teil-gereinigten Präparationen, die sowohl OspA als auch das Oberflächenprotein B (OspB) enthalten (Barbour, A. G. et al., Infect. Immun. 52 (5): 549–554 (1986); Coleman, J. L. und J. L. Benach, J. Infect. Dis. 155 (4): 756-765 (1987); Cunningham, T. M. et al., Ann. NY Acad. Sci. 539: 376–378 (1988); Brandt, M. E. et al., Infect. Immun. 58: 983–991 (1990); Sambri, V. und R. Cevenini, Microbiol. 14: 307–314 (1991)). Obwohl sowohl OspA als auch OspB gegenüber einem Proteinase K-Verdau sensitiv sind, ist OspB im Gegensatz zu OspA gegenüber einer Trypsinspaltung resistent. (Dunn, J. et al., Prot. Exp. Purif. 1: 159–168 (1990); Barbour, A. G. et al., Infect. Immun. 45: 94–100 (1984)). Die relative Unempfindlichkeit gegenüber Trypsin ist angesichts der Tatsache, dass OspA einen hohen Lysingehalt aufweist (16% bei B31) überraschend, und könnte durch die relative Konfiguration von OspA und B in der Oberflächenmembran bedingt sein.
Intrinsische Radiomarkierung von Borrelia
Die Markierung der Lipoproteine wurde wie von Brandt et al. beschrieben durchgeführt (Infect. Immun. 58: 983–991 (1990). ¹⁴C-Palmitinsäure (ICN, Irvine, Kalifornien) wurde zu dem BSK II Medium in einer Endkonzentration von 0.5 μCi pro Milliliter (ml) hinzugefügt. Die Organismen wurden in diesem Medium bei 34°C kultiviert bis eine Dichte von 10⁸ Zellen pro ml erreicht wurde.
Reinigung von OspA Protein aus Borrelia Stamm B31
Borrelia burgdorferi, entweder mit ¹⁴C-Palmitinsäure markiert oder unmarkiert, wurde geerntet und gewaschen wie beschrieben (Brandt, M. E. et al., Infect. Immun. 58: 983–991 (1990)). Die vollständigen Organismen wurden entsprechend dem Protokoll von Barbour et al. mit einigen Modifikationen trypsiniert (Infect. Immun. 45: 94–100 (1984)). Das Pellet wurde in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 10mM, pH 7.2) suspendiert, welches 0.8% Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethylketon (TPCK)-behandeltes Trypsin (Sigma, St. Louis, Missouri) enthielt, wobei das Letztere in einen Verhältnis von 1 μg pro 10⁸ Zellen vorlag. Die Reaktion wurde bei 25°C für 1 Stunde ausgeführt, wonach die Zellen zentrifugiert wurden. Das Pellet wurde in PBS mit 100 μg / ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) zugewaschen. Das Partitionieren des Pellets mit Triton X-114 wurde wie von Brandt et al. (Infect. Immun. 58: 983–991 (1990)) beschrieben ausgeführt. Nach der Trypsinbehandlung wurden die Zellen in eiskaltem 2% (V/V) Triton X-114 in PBS in einer Konzentration von 10⁹ Zellen pro ml resuspendiert. Die Suspension wurde über Nacht bei 4°C geschüttelt, und die unlösliche Fraktion als Pellet nach einer Zentrifugation bei 10.000 X g für 15 Minuten bei 4°C entfernt. Der Überstand (die lösliche Fraktion) wurde bei 37°C 15 Minuten inkubiert und bei Raumtemperatur bei 1000 X g 15 Minuten zentrifugiert, um die wässrige und die Detergens-Phasen zu trennen. Die wässrige Phase wurde dekantiert, zu der unteren Tritonphase wurde eiskaltes PBS hinzugefügt, gemischt, auf 37°C angewärmt, und erneut bei 1000 X g 15 Minuten zentrifugiert. Dieses Waschen wurde noch zweimal wiederholt. Schliesslich wurde das Detergens unter Verwendung einer Zentrifugensäule aus der Präparation mit Biobeads SM2 (BioRad, Melville, New York) wie beschrieben Holloway, P. W., Anal. Biochem. 53: 304–308 (1973)) entfernt.
Die Ionenaustauschchromatographie wurde mit geringen Abänderungen wie von Dunn et al. (Prot. Exp. Purif. 1: 159–168 (1990) beschrieben durchgeführt. Roh aufgereinigtes OspA wurde in Puffer A (1% Triton X-100, 10 mM Phosphatpuffer (pH 5.0)) gelöst und auf eine SP Sepharose Harz Säule(Pharmacia, Piscataway, New Jersey), welche mit Puffer A bei 25°C prääquilibriert war, aufgebracht. Nach Waschen der Säule mit 10fachem Säulenbett-Volumen Puffer A wurde das gebundene OspA mit Puffer B eluiert (1% Triton X-100, 10mM Phosphatpuffer (pH 8.0)). Die OspA Fraktionen wurden mittels eines Proteintests unter Verwendung der BCA Methode (Pierce, Rockford, Illinois) nachgewiesen, oder über die Radioaktivität, wenn intrinsisch markiertes Material fraktioniert wurde. Triton X-100 wurde unter Verwendung einer Zentrifugationssäule mit Biobeads SM2 entfernt.
Mit diesem Verfahren wird OspA aus einer Oberflächenmembran Präparation gereinigt. Wird die Trypsinbehandlung weggelassen, sind OspA und B die Hauptkomponenten der löslichen Fraktion, welche nach dem Aufschluss von Stamm B31 mit Triton erhalten wird. Im Gegensatz dazu tritt die OspB Bande nicht auf, wenn die Tritonextraktion nach der Trypsinbehandlung durchgeführt wurde. Die weitere Reinigung von OspA-B31 mittels einer SP Sepharose Säule resultierte in einer einzelnen Bande in der SDS-Page. Die Ausbeute nach Entfernen des Detergens lag bei etwa 2 mg pro Liter Kulturbrühe. Dieses Reinigungsverfahren für OspA, welches vorliegend für den Stamm B31 beschrieben wurde, kann genauso gut für andere Isolate von Borrelia verwendet werden. Bei Stämmen wie K48, denen OspB fehlt, kann die Trypsinbehandlung weggelassen werden.
Lipidierungsstelle von OspA-B31
Mit ¹⁴C-Palmitinsäure markiertes OspA aus Stamm B31 wurde wie oben beschrieben gereinigt und mit Endoproteinase Asp-N partiell verdaut (Daten nicht gezeigt). Nach dem Verdau trat in der SDS-Page eine neue Bande geringeren Molekulargewichts auf, von der durch direkte aminoterminale Ansequenzierung gezeigt werden konnte, dass sie bei Asp₂₅ beginnt. Diese Bande wies in der Autoradiographie keine Radioaktivität auf (Daten nicht gezeigt). OspA und B enthalten eine Signalsequenz (L-X-Y-C) die identisch ist zu der Konsensussequenz, die für die Lipoproteine von E. coli beschrieben wurde, und es wurde vorgeschlagen, dass die Lipidierungsstelle von OspA und B das aminoterminale Cystein sein solle (Brandt, M.E. et al., Infect. Immun. 58: 983-991 (1990)). Die vorliegend vorgestellten Resultate unterstützen diese Vorhersage.
B. Vergleich von OspA Antikörper bindenden Regionen in neun Stämmen von Borrelia burgdorferi
Das Vorliegen der Aminosäuresequenzen von OspA aus einer Reihe von unterschiedlichen Isolaten, zusammen mit der Peptid Kartierung und der Westernblot Analyse erlaubte die Identifizierung der antigenen Domänen, die durch monoklonale Antikörper (MAbs) erkannt werden, und erlaubten die Bestimmung der für die spezifische Antikörperreaktivität verantwortlichen Aminosäurereste.
Borrelia burgdorferi Stämme
Neun Borrelia-Stämme einschließlich sieben europäischer und zwei nordamerikanischer Stämme wurden zur Untersuchung der antikörperbindenden Domäne einiger Proteine eingesetzt. Die diese Stämme betreffende Information ist in der unten wiedergegebenen Tabelle 1 zusammengefasst.
Die Stämme K48, PGau und DK29 wurden von R. Johnson, Universität von Minnesota, bereitgestellt; PKo und PTrob wurden von B. Wilske und V. Preac-Mursic, Pettenkhofer Institut, München, Deutschland zur Verfügung gestellt; und Ip3 und Ip90 wurden von L. Mayer, Zentrum für Krankheitskontrolle (Center for Disease Control), Atlanta, Georgia, zur Verfügung gestellt. Die nordamerikanischen Stämme umfassten Stamm 25015, zur Verfügung gestellt von J. Anderson vom Landwirtschaftsministerium in Connecticut (Connecticut Department of Agriculture); und Stamm B31 (ATCC 35210).
Monoklonale Antikörper
Für die vorliegende Studie wurden sieben monoklonale Antikörper (Mabs) verwendet. Fünf der Mabs (12, 13, 15, 83 und 336) wurden unter Verwendung von Hybridomazellen hergestellt, die wie schon früher beschrieben kloniert und subkloniert wurden (Schubach, W. H. et al., Infect. Immun. 59(6): 1911–1915 (1991)). Mab H5332 (Barbour, A. G. et ad., Infect. Immun. 41: 795–804 (1983)) war eine Gabe von Drs. Alan Barbour, Universität Texas, und Mab CIII78 (Sears, J.E. et al., J. Immunol. 147(6): 1995–2000 (1991)) war eine Gabe von Richard A. Flavell, Universität Yale. Mab 12 und 15 wurden unter Verwendung von vollständigem, mit Ultraschall beschalltem B3 hergestellt; Mab 336 wurde unter Verwendung von vollständigem PGau hergestellt, und die Mabs 13 und 83 waren gegen eine verkürzte Form von OspA gerichtet, welche aus dem K48 Stamm kloniert und in E. coli unter Verwendung des T7 RNA Polymerase Systems exprimiert wurde (McGrath, B. C. et al., Vakzines, Cold Springer Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, pp. 365–370 (1993)). Alle Mabs wurden als Immunglobulin G (IgG) charakterisiert.
Methoden der Proteinspaltung, des Western Blottings und der aminoterminalen Sequenzieren
Die Vorhersage der unterschiedlichen Schnittstellen wurde durch die Kenntnis der primären Aminosäuresequenz ermöglicht, welche aus den vielen zur Zeit verfügbaren vollständigen Nukleotidsequenzen von OspA abgeleitet wurde (siehe Tabelle 2, unten). Die Schnittstellen können ebenso auf Basis der Peptidsequenz von OspA vorhergesagt werden, welche nach der Isolierung und Reinigung von OspA über das oben beschriebene Verfahren durch Standardverfahren bestimmt werden können. Verschiedene OspA Isolate wurden gespalten, um den Ort der Bindung der monoklonalen Antikörper an die Proteine bestimmen zu können.
Die Spaltung von OspA mit Hydroxylamin-HCl (HA), N-Chlorsuccinimid (NCS) und Bromcyan wurde entsprechend der von Bornstein (Biochem. 9 (12): 2408-2421 (1970)), Shechter et al., (Biochem. 15 (23): 5071–5075 (1976)) und Gross (in Hirs, C.H.W. (ed) : Methods in Enzymology, (N.Y. Acad. Press), 11: 238–255 (1967)) jeweils beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Protease vermittelte Spaltung durch Endoproteinase Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana), wurde wie von Cleveland D. W. et al., (J. Biol. Chem. 252: 1102–1106 (1977)) beschrieben durchgeführt. Für jede Reaktion wurden zehn Mikrogramm OspA verwendet. Das Verhältnis von Enzym zu OspA betrug etwa 1 zu 10 (Gew./Gew.).
Die durch die Spaltung hergestellten Proteine und Peptide wurden über eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page) (Laemmli, U. K. Nature (London) 227: 680–685 (1970)) aufgetrennt, und auf eine Immobilon Polyvinylidindifluorid (PVDF) Membran elektrogeplottet (Ploskal, M. G. et al., Biotechniques 4: 272-283 (1986)). Sie wurden durch Amidoschwarz („amido black") Färbung oder durch Immunfärbung mit murinen Mabs, gefolgt von mit alkalischer Phosphatase konjungiertem IgG gegen Maus aus Ziege nachgewiesen. Die spezifische Bindung wurde unter Verwendung von 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP)/Nitroblau Tetrazolium (NBT) Entwicklungssysteme (KPL Inc., Gathersburg, Maryland) nachgewiesen.
Zusätzlich wurde mit einigen Spaltprodukten eine aminoterminale Aminosäure Sequenz Analyse wie von Luft et al. (Infect. Immun. 57: 3637–3645 (1989)) beschrieben durchgeführt. Die mit Amidoschwarz („amido black") gefärbten Banden wurden aus den PVDF Blots ausgeschnitten und über Edman-Abbau unter Verwendung eines Biosystems Modell 475A Sequenziergerätes mit einer 120A PTH Analysiervorrichtung und einer Modell 900A Kontroll/Daten Analysiervorrichtung sequenziert.
Spaltprodukte des äußeren Oberflächenprotein A Isolates
Gereinigtes OspA-B31, welches mit ¹⁴C-Palmitinsäure markiert war, wurde mit Hydroxylamin-HCl (HA) in zwei Peptide fragmentiert, welche HA1 und HA2 genannt wurden (Daten nicht gezeigt). Die HA1 Bande wanderte bei 27 kd und behielt ihre Radioaktivität, was darauf hinwies, dass das Peptid die Lipidbindungsstelle am N-Terminus des Moleküls umfasste (Daten nicht gezeigt). Ausgehend von der vorhergesagten Spaltstelle sollte HA1 den Resten 1 bis 251 von Osp-A-B31 entsprechen. HA2 besaß ein MW von 21.6 KD in der SDS-Page, und die aminoterminale Sequenzanalyse zeigte, dass es bei Gly72 begann, d.h. Reste 72 bis 273 von OspA-B31. Im Gegensatz hierzu spaltete HA OspA-K48 in drei Peptide, welche HA1, HA2 und HA3 genannt wurden, und welche scheinbare MWs von 22 kd, 16 kd und 12 kd zeigten. Die aminoterminale Sequenzanalyse zeigte, dass HA1 bei Gly72 begann, und HA3 bei Gly142. Es wurde festgestellt, dass HA2 einen blockierten Aminoterminus aufwies, genau wie es auch für das vollständige OspA Protein festgestellt wurde. Es wurde vorhergesagt, dass HA1, 2 und 3 aus OspA-K48 den Resten 72 bis 274, 1 bis 141 bzw. 142 bis 274 entsprechen.
N-Chlorsuccinimid (NCS) spaltet Tryptophan (W), welches an Rest 216 von OspA-B31 bzw. Rest 217 von OspA-K48 vorkommt (Daten nicht gezeigt). NCS spaltete OspA-B31 in zwei Fragmente, NCS 1 mit einem MW von 23 kd, Reste 1 bis 216 des Proteins, und NCS2 mit einem MW von 6.2 kd, Reste 217 bis 273 (Daten nicht gezeigt). In ähnlicher Weise wurde K48 OspA in zwei Teile gespalten, NCS 1 Reste 1 bis 217, und NCS2 Reste 218 bis 274 (Daten nicht gezeigt).
Die Spaltung von OspA über Bromcyan (CNBr) geschieht an der Carboxyfunktion des Methionins, Rest 39. Das größere Fragment, CNBr1, besitzt ein MW von 25.7 kd, und besteht aus den Resten 39 bis 274, wie durch aminoterminale Aminosäuresequenzanalyse gezeigt werden konnte (Daten nicht gezeigt). CNBr2 (etwa 4 kd) konnte durch Amidoschwarz Färbung nicht sichtbar gemacht werden; allerdings wurden leicht gefärbte Banden von etwa 20 kd MW beobachtet. Diese Banden reagierten mit Anti-OspA Mabs, und stellen wahrscheinlich wohl Abbauprodukte aufgrund einer Spaltung durch Ameisensäure dar.
Bestimmung der Antikörper bindenden Domänen für Anti-OspA monoklonale Antikörper
Die Spaltprodukte von OspA-B31 und OspA-K48 wurden einer Westernblot Analyse unterzogen, um deren Fähigkeit zu untersuchen, an sechs unterschiedlichen Mabs zu binden. Vorläufige Westernblot Analysen der Spaltprodukte zeigten, dass die Stämme K48 und DK29 ebenso wie Ip3, PGau und PKo gleiche Reaktivitätsmuster zeigen. Das OspA aus dem Stamm PTrob war immunologisch von den anderen OspAs distinkt und wurde nur von Mab 336 erkannt. Mab 12 erkannte nur die beiden nordamerikanischen Stämme B31 und 25015. Wurden die Isolate in verschiedenen Genogruppen separiert, fiel auf, dass alle Mabs außer Mab 12 Kreuzreaktionen mit verschiedenen Genogruppen zeigten. Mab 12, welcher spezifisch war für OspA-B31, band sowohl an HA1 als auch an HA2 aus OspA-B31. Die Spaltung von OspA-B31 durch NCS am Rest Trp216 erzeugte jedoch Fragmente, welche mit Mab 12 nicht reagierten, was darauf hinwies, dass die entsprechende Domäne nahe bei diesem Rest liegt oder strukturell von der Unversehrtheit dieses Restes abhängt (Daten nicht gezeigt). Mab 13 band nur an OspA-K48 und an Peptide, die den Aminoterminus dieses Moleküls enthielten (z.B. HA2; NCS 1). Dieser Antikörper band nicht an die CNBr1 Reste 39 bis 274. Daher liegt die von Mab 13 erkannte Domäne am aminoterminalen Ende des OspA-K48 nahe Met38.
Mab15 reagiert sowohl mit OspA aus Stamm B31 als auch aus Stamm K48 und mit Peptiden, welche den N-Terminus des OspA enthalten wie beispielsweise HA1 aus OspA-B31 und NCS1, aber nicht mit den Peptiden HA2 aus OspA-B31 und HA1 aus OspA-K48 (Daten nicht gezeigt). Beide Peptide beinhalten den Rest 72 des C-Terminus des Moleküls. Mab 15 band an CNBr1 aus OspA-K48, was darauf hinwies, dass die Domäne für diesen Antikörper die Reste 39 bis 72 sind, insbesondere nahe Gly72 (Daten nicht gezeigt).
Mab83 bindet an OspA-K48 und an Peptide, welche den C-terminalen Anteil des Moleküls umfassen, wie beispielsweise HA1. Sie binden nicht an das HA2 aus OspA-K48, höchstwahrscheinlich, weil der C-Terminus von HA2 des OspA-K48 bei 141 endet. Ähnlich wie bei Mab 12 und OspA-B31 wird die Bindung von Mab 83 an CIII.78 durch Spaltung von OspA am Tryptophanrest verhindert. Somit hängt die Bindung der Mabs 12, 83 und CIII.78 an OspA von der strukturellen Integrität des Restes Trp216 ab, welcher für die Antigenizität kritisch zu sein scheint. Ebenso fällt auf, dass obwohl diese Antikörper eine gemeinsame antigene Domäne binden, die genauen Epitope, welche sie erkennen, unterschiedlich sind, was daraus gefolgert werden kann, dass diese Antikörper innerhalb der Stämme unterschiedliche Grade von Kreuzreaktivität zeigen.
Obwohl bei Spaltung bei Rest Trp216 der Antikörper Mab 336 einen gleichartigen Verlust an Bindungsaktivität zeigt, bindet dieser Mab nicht an HA1 aus OspA-B31, was darauf hinweist, dass die Domäne für diesen Antikörper das carboxyterminale Ende des Moleküls umfasst, einschließlich der Reste 251 bis 273. Peptide mit geringem MW, wie beispielsweise HA3 (10 kd) und NCS2 (6 kd) aus OspA-K48 binden diesen Mab in Westernblot Analysen nicht. Um diese Beobachtung zu bestätigen, untersuchten wir die Bindung der sechs Mabs an ein rekombinantes Fusionskonstrukt p3A/EC, welches ein trpE Leader Protein fusioniert mit den Resten 217 bis 273 aus OspA-B31 umfasst (Schubach, W. H. et al., Infect. Immun. 59(6): 1911–1915 (1991)). Nur Mab 336 reagierte mit diesem Konstrukt (Daten nicht gezeigt). Die Peptide und antigenen Domänen, die durch Fragmentierung von OspA lokalisiert wurden, sind in 1 zusammen gefasst.
Kartieren von Domänen zur Definition der molekularen Basis der Serotyp Analyse Um die molekulare Basis für die Serotyp Analyse von OspA zu definieren, verglichen wir die abgeleitete Aminosäuresequenz von OspA für die neun Isolate (2). Diese Vorhersagen können wegen der relativ geringen Anzahl von Aminosäureaustauschen in dieser Region verglichen mit dem Carboxyterminus am Aminoterminus des Proteins hier genauer sein. Die Domäne 1, die durch Mab 13 erkannt wird, umfasst die Reste Leu34 bis Leu41. Mab 13 bindet ausschließlich an das OspA aus den Stämmen K48, DK29 und Ip90. Innerhalb dieser Region ist der Rest 37 variabel, jedoch ist Gly37 unter den drei reaktiven Stämmen konserviert. Wird Gly37 zu Glu37 ausgetauscht, wie es im OspA der Stämme B31, PTrob, PGau und PKo der Fall ist, erkennt Mab 13 das Protein nicht (Daten nicht gezeigt). Durch gleichartige Analysen kann gezeigt werden, dass Asp70 für Domäne 2, welche die Reste 65 bis 75 umfasst und von Antikörper Mab 15 erkannt wird, ein gleichermaßen ausschlaggebender Rest ist. Die Domäne 3 reagiert mit Mab H5332, 12 und 83, und umfasst die Reste 190 bis 220. Es ist klar, dass zwischen den Mabs, die mit dieser Domäne reagieren, eine signifikante Heterogenität existiert, und das mehr als ein konformatorisches Epitop innerhalb der Sequenz enthalten sein muß. Die Domäne 4 bindet Mab 336 und umfasst die Reste 250 bis 270. In dieser Region ist der Rest 266 variabel und könnte daher eine wichtige Determinante sein. Es ist jedoch offensichtlich, dass auch andere Reaktivitätsdeterminanten dieses monoklonalen Antikörpers in der Region umfassend Aminosäuren 217–250 vorkommen. Weiterhin ist die strukturelle Integrität des Trp216 für die Antikörperreaktivität im intakten Protein essentiell. Schließlich ist es wichtig zu betonen, dass 2 nur die Domänen lokalisiert, und nicht notwendigerweise die vollständige Domäne umfasst. Exakte Epitope wurden durch gerichtete Mutagenese von ausgewählten Resten analysiert.
Insgesamt liegen Anzeichen dafür vor, dass der N-terminale Teil nicht die immundominante Domäne von OspA ist, möglicher weise wegen dessen Lipidierung, und der möglichen Funktion des Lipidrestes, dass Protein in der äußeren Hülle zu verankern. Das C-terminale Ende ist immundominant und umfasst Domänen, die teilweise für die strukturelle Heterogenität verantwortlich sind (Wilske, B. et al., Med. Microbiol. Immunol. 181: 191–207 (1992)), und die Epitope für die antikörpervermittelte Neutralisierung bereitstellen können (Sears, J. E. et al., J. Immunol. 1 47(6): 1995–2000 (1991)), und die auch mit anderen Aktivitäten funktionell verbunden sind, wie beispielsweise die Induktion der T-Zell Proliferation (Shanafel, M. M. et al., J. Immunol. 148: 218–224 (1991)). Es gibt gemeinsame Epitope im Carboxyende des Proteins, die bei allen Genospeziesvorkommen, und die immunoprotektives Potential aufweisen können (Wilske, B. et al., Med. Microbiol. Immunol. 181: 191–207 (1992)).
Die Vorhersage der Sekundärstruktur auf Basis von Hydropathieanalyse und Zirkulardichroismus sowie auch fluoreszenzspektrospkopischen Messungen (McGrath, B. C. et al., Vakzines, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, pp. 365–370 (1993)) legt die Vermutung nahe, dass die Domänen 3 und 4 in einer Region des Moleküls mit einer Neigung zur Ausbildung einer Alpha-Helix liegen, während die Domänen 1 und 2 anscheinend in Regionen liegen, von denen vorhergesagt wird, dass sie Beta-Faltblätter sind (siehe 1). Diese Unterschiede können die Domänen hinsichtlich ihrer Zugänglichkeit zum Antikörper oder zu der reaktiven T-Zelle voneinander abgrenzen (Shanafel, M. M. et al., J. Immunol. 148: 218–224 (1992)). Die gerichtete Mutagenese von spezifischen Epitopen, wie sie unten in Beispiel 2 beschrieben wird, hilft dabei, exakte Epitope zu identifizieren.
Beispiel 2. Identifizierung einer immunologisch wichtigen hypervariablen Domäne des Hauptproteins A der äußeren Oberfläche von Borrelia
Dieses Beispiel beschreibt Epitopkartierungsstudien unter Verwendung von chemisch gespaltenen OspA und TrpE-OspA Fusionsproteinen. Die Untersuchungen zeigen eine hypervariable Region, welche den einzigen konservierten Tryptophanrest von OspA (Rest 216, oder in manchen Fällen 217) umgibt, was durch eine bewegliche Fenster-Populationsanalyse („moving window population analysis") von OspA aus fünfzehn europäischen und nordamerikanischen Isolaten von Borrelia bestimmt werden konnte. Die hypervariable Region ist wichtig für die Immunerkennung.
Ebenso wurde eine gerichtete Mutagenese durchgeführt, um die hypervariablen Regionen näher zu untersuchen. Fluoreszenz- und Zirkulardichroismus-Spektrospkopie wiesen darauf hin, dass das konservierte Tryptophan Teil einer alphahelikalen Region ist, in welcher das Tryptophan in einer hydrophoben Umgebung verborgen ist (McGrath, B. C. et al., Vakzines, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York; pp. 365–370 (1993)). Polarere Aminosäureseitenketten, die das Tryptophan flankieren, sind wahrscheinlich dem hydrophilen Lösungsmittel ausgesetzt. Die Hypervariabilität dieser dem Lösungsmittel exponierten Reste unter den verschiedenen Stämmen von Borrelia liefert Anlass zu der Vermutung, dass diese Aminosäurereste zu der antigenen Variabilität von OspA beitragen. Daher wurde eine gerichtete Mutagenese durchgeführt, um einige der potentiell exponierten Aminosäureseitenketten in dem Protein aus einem ausgewählten Stamm mit dem analogen Rest aus einem zweiten Stamm auszutauschen. Die veränderten Proteine wurden dann mit Hilfe einer Westernblot Analyse unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, welche OspA auf der Oberfläche des intakten, nicht mutierten Spirochäten binden, untersucht. Die Resultate zeigten, dass ausgewählte Aminosäureaustausche nahe dem Tryptophan die Reaktivität von OspA mit den entsprechenden monoklonalen Antikörpern beseitigen.
A. Bestätigung von gruppierten Polymorphismen in Sequenzen des Protein A der äußeren Oberfläche
Die Klonierung und die Sequenzierung des OspA Proteins aus fünfzehn europäischen und nordamerikanischen Isolaten (oben in Tabelle 1 beschrieben) zeigten, dass der Aminosäurepolymorphismus innerhalb des Proteins nicht zufällig verteilt auftritt, sondern das dieser Polymorphismus die Neigung zeigt, in drei Regionen des OspA gruppiert aufzutreten. Die Analyse wurde durchgeführt, in dem der sich bewegende, gewichtete Durchschnittspolymorphismus eines Fensters (eines Ausschnittes aus der Gesamtsequenz mit einer bestimmten Länge) aufgetragen wird, während es über die Sequenz hinweg bewegt wird. Die Fenstergröße in dieser Analyse betrug dreizehn Aminosäuren, basierend auf der Bestimmung der größten Anzahl an signifikant abweichenden Punkten durch die Methode von Tajima (J. Mol. Evol. 33: 470–473 (1991)). Der durchschnittliche Gewichtspolymorphismus wurde durch Summieren der Anzahl der unterschiedlichen Allele für jeden Rest errechnet. Die Polymorphismusberechnungen wurden aufgrund der Bedeutung des Aminosäureaustauschs gewichtet (Dayhoff, M. O. et al., in: Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure NBRF, Washington Vol. 5 Suppl. 3: 345 (1978)). Die Summe wurde über die Fenstergröße normalisiert und aufgetragen. Die Aminosäuresequenzposition korrespondiert mit einem Fenster, welches die Aminosäuren 1 bis 13 umfasst. Ein Bootstrap Resampling wurde verwendet, um in der beweglichen Fensteranalyse 95% Confidence Intervalle zu erreichen. Da gezeigt wurde, dass Borrelia klonal existiert, sollte die Bootstrapanalyse eine vertrauenswürdige Schätzung der aus den Polymorphismusberechnungen erwarteten Varianz ergeben. Die Bootstrapanalyse wurde an jeder Position fünfhundert Mal wiederholt und aus der Summe aller Positionen wurde der Durchschnitt errechnet. Die klonale Natur von Borrelia stellt sicher, dass die aus den unterschiedlichen genialogischen Historien der Sequenzpositionen resultierende Varianz (welche zu erwarten wäre, falls Rekombinationsereignisse vorherrschend wären) minimiert werden wird.
Dieser Test bestätigte, dass die drei Regionen um die observierten Höchstwerte alle signifikant auftretende Polymorphismusüberschüsse aufweisen. Polymorphismusüberschüsse wurden in den Regionen umfassend die Aminosäurereste 132–145, Reste 163–177 und Reste 208–221 beobachtet (Figur 3). Ein Aminosäurealignment der Reste 200 und 220 aus B31, K48 und aus den vier aus gerichteter Mutagenese hervorgegangenen Mutanten ist in 4 gezeigt. Die Aminosäureregion 208–221 umfasst die Region von OspA, für welche das Modell einer orientierten Alpha-Helix, in der der einzige Tryptophanrest bei Aminosäurerest 216 in einer hydrophoben Tasche verborgen liegt, wodurch polarere Aminosäuren dem Lösungsmittel zugewandt liegen, entwickelt wurde (5) (France, L. L. et al., Biochem. Biophys. Acta 1120: 59 (1992)). Diese potentiell dem Lösungsmittel zugewandten Reste zeigen eine bemerkenswerte Variabilität unter den OspAs aus verschiedenen Stämmen und könnten wichtige Komponenten der antigenischen Variabilität von OspA sein. Für das Herstellen von chimären Proteinen sind die interessanten hypervariablen Domänen die Domäne A, welche die Aminosäurereste 120–140 von OspA beinhaltet; die Domäne B, welche die Reste 150–180 beinhaltet; und Domäne C, welche die Reste 200–216 oder 217 beinhalten.
B. Gerichtete Mutagenese der hypervariablen Region
Um Reste innerhalb der 204–219 Domäne des rekombinanten B31 OspA in die analogen Reste einer europäischen OspA Variante, K48, auszutauschen, wurde eine gerichtete Mutagenese durchgeführt. In der Region von OspA zwischen den Resten 204 und 219, welche die helikale Domäne beinhaltet (Aminosäuren 204-217), treten sieben Aminosäureunterschiede zwischen OspA-B31 und OspA-K48 auf. Es wurden drei Oligonukleotide hergestellt, welche Nukleotidaustausche beinhalteten, welche K48 Aminosäuren an ihren analogen Positionen in das B31 OspA Protein einführen würden. Die Oligos, die verwendet wurden, um die gerichteten Mutanten herzustellen waren

5'-CTTAATGACTCTGACACTAGTGC-3' (#613, welches Threonin an Position 204 gegen Serin autauscht, und Serin bei 206 gegen Threonin (Thr204-Ser, Thr206-Ser)) (SEQ ID No. 1);
5'-GCTACTAAAAAAACCGGGAAATGGAATTCA-3' (#625, welches Alanin bei 214 gegen Glycin austauscht und Alanin bei 215 gegen Lysin (Ala214-Gly, Ala215-Lys)) (SEQ ID No. 2); und
5'-GCAGCTTGGGATTCAAAAACATCCACTTTAACA-3' (#640, welches Asparagin bei 217 gegen Aspartat austauscht und Glycin bei 219 gegen Lysin (Asn217-Asp, Gly219-Lys)) (SEQ ID No. 3).

Die gerichteten Mutagenese wurde ausgeführt, in dem die Mutagenese mit Paaren der oben angegebenen Oligos durchgeführt wurde. Drei gerichtete Mutanten wurden hergestellt, jeder mit zwei Austauschen: OspA 613 (Thr204-Ser, Thr206-Ser), OspA 625 (Ala214-Gly, Ala215-Lys), und 640 (Asn217-Asp, Gly219-Lys). Außerdem waren zwei Proteine mit vier Austauschen vorhanden: OspA 613/625 (Thr204-Ser, Thr206-Ser, Ala214-Gly, Ala215-Lys) und OspA 613/640 (Thr204-Ser, Thr206-Ser, Asn217-Asp, Gly219-Lys).
Spezifität der Antikörperbindung an Epitope in der nicht mutierten hypervariablen Region
Monoklonale Antikörper, die Spirochäten agglutinieren, und unter denen einige sind, welche in-vitro neutralisieren, erkennen Epitope, die der hypervariablen Region um Trp216 zugeordnet werden (Barbour, A. G. et al., Infect. and Immun. 41: 759 (1983); Schubach, W. H. et al., Infect. and Immun. 59: 1911 (1991)). Die Westernblot Analyse zeigte, dass die chemische Spaltung von OspA aus dem Stamm B31 bei Trp216 die Reaktivität des Proteins mit dem agglutinierenden Mab 105, einem monoklonalen Antikörper, welcher gegen B31 Spirochäten gerichtet ist, verschwinden lässt (Daten nicht gezeigt). Das Reagenz, n-Chlorsuccinimid (NCS) spaltet OspA bei Trp216, wodurch ein 23.2 kd Fragment und ein 6.2 kd Peptid, welches nach Transfer an der Immobilon-P Membrane nicht haften bleibt, gebildet werden. Das ungespaltene Material bindet Mab 105; das 23.2 kd Fragment ist jedoch nicht reaktiv. Identische Westernblot Analysen mit einem TrpE-OspA Fusionsprotein, welches die carboxyterminalen Anteile des OspA Proteins enthält, zeigte, dass das kleine 6.2 kd Stück Mab 105 ebenso nicht binden kann (Schubach, W. H. et al., Infect. and Immun. 59: 1911 (1991)).
Für die monoklonalen Antikörper H5332 und H3TS (Barbour, A. G. et al., Infect. and Immun. 41: 759 (1983)) konnte durch Immunfluoressenz gezeigt werden, dass diese die Oberfläche von fixierten Spirochäten markieren (Wilske, B. et al., World J. Microbiol. 7: 130 (1991)). Diese monoklonalen Antikörper inhibieren auch das Wachstum des Organismus in Kultur. Die Kartierung des Epitops mit Fusionsproteinen bestätigte, dass die Epitope, welche diese Antikörper binden, konformatorisch bestimmt sind und in der Carboxyhälfte des Proteins liegen. Mab H5332 zeigte bei allen bekannten phylogenetischen Gruppen eine Kreuzreaktivität, während Mab H3TS und Mab 105 für den Stamm B31 spezifisch zu sein scheinen, gegen den sie hervorgebracht wurden. Wie im Falle des Mab 105 werden die Reaktivitäten von H5332 und H3TS gegenüber OspA durch Fragmentierung des Proteins an Trp216 aufgehoben (Daten nicht gezeigt). Mab 336 wurde gegen vollständige Spirochäten des Stammes P/Gau selektiert. Er kreuzreagiert mit OspA aus Gruppe 1 (die Gruppe, zu der B31 gehört) aber nicht mit Gruppe 2 (von der K48 ein Mitglied ist). Frühere Studien unter Verwendung von Fusionsproteinen und chemischer Spaltung haben darauf hingewiesen, dass dieser Antikörper eine Domäne des OspA in der Region zwischen den Resten 217 und 273 erkennt (Daten nicht gezeigt). Alle diese Mabs werden den B31 Spirochäten agglutinieren.
Westernblot Analyse der Antikörperbindung an mutierte hypervariable Region Mabs wurden für die Westernblot Analyse der gerichteten OspA Mutanten verwendet, welche in E. coli unter Verwendung des T7 Expressionssystems induziert wurden (Dunn, J. J. et al., Protein Expression and Purification 1: 159 (1990)). E. coli Zellen, die Pet9c Plasmide trugen, die ein gerichtetes OspA Mutationsinsert trugen, wurden in der zeitlichen Mitte des Wachstums in der Log-Phase mit IPTG für vier Stunden bei 37°C induziert. Zelllysate wurden durch Kochen eines Aliquots der induzierten Kulturen in SDS Gel Auftragsfarbstoff hergestellt, und dieses Material wurde dann auf ein 12% SDS Gel aufgetragen (BioRad mini-Protean II) und einer Elektrophorese unterzogen. Die Proteine wurden dann auf Immobilon-P Membranen (Millipore) bei 70V 2 Stunden bei 4°C unter Verwendung des BioRad mini-Transfer-Systems transferiert. Die Western Analyse wurde durchgeführt wie von Schubach et al. beschrieben (Infect. Immun. 59: 1911 (1991)).
Die Westernblot Analyse zeigte, dass nur die Mutante 625 (Ala214-Gly und Ala215-Lys) weiterhin an den agglutinierenden monoklonalen H3TS binden konnte (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu band die 613/625 Mutante, welche zusätzliche Veränderungen am Aminoterminus des Trp216 (Ser204-Thr und Thr206-Ser) aufwies, nicht an diesen monoklonalen Antikörper. Sowohl 640 und 613/640 OspAs, welche die Asn217-Asp und Gly219-Lys Austausche am carboxyterminalen Seite des Trp216 aufwiesen, konnte MAb H3TS ebenfalls nicht binden. Dies zeigte, dass das Epitop des B31 OspA, welches H3TS bindet, aus Aminosäureseitenketten von beiden Seiten des Trp216 besteht.
Die 613/625 Mutante konnte Mabs 105 und H5332 nicht binden, während die andere Mutanten ihre Fähigkeit diese Antikörper zu binden, behielten. Dies ist wichtig wenn man bedenkt, dass Daten vorliegen, die unter Verwendung von Fusionsproteinen generiert wurden und die zeigen, dass Mab 105 sich hinsichtlich seiner serotypischen Spezifität und seines Bindungsverhaltens an OspA eher wie Mab H3TS verhält (Wilske, B. et al., Med. Microbiol. Immunol. 181: 191 (1992)). Das 613/625 Protein weist zusätzlich zu den Unterschieden an den Resten Thr204 und Ser206 weiterhin Austausche direkt aminoterminal zu Trp216 (Ala214-Gly und Ala215-Lys) auf. Der Verlust der Reaktivität der Mabs 105 und H5332 mit diesem Protein zeigt, dass die Epitope von OspA, welche diese monoklonalen Antikörper binden, Reste umfassen, die auf der aminoterminalen Seite von Trp216 liegen.
Die beiden Proteine, die die Asn217-Asp und Gly219-Lys Austausche auf der carboxyterminalen Seite von Trp216 tragen (OspAs 640 und 613/640) behielten die Bindung an die Mabs 105 und H5332; sie konnten jedoch nicht mit Mab 336 reagieren, einem monoklonalen Antikörper, welcher mit TrpE-OspA Fusionsproteinen und durch chemische Spaltung als zu einer weiteren carboxyterminal gelegenen Domäne zugehörig kartiert wurde. Dieses Ergebnis kann möglicherweise erklären, warum Mab 336 den K48-Typ von OspA (Gruppe 2) nicht erkennen konnte.
Es ist klar, dass die Aminosäuren Ser204 und Thr206 eine wichtige Rolle in den agglutinierenden Epitopen in der Region spielen, welche bei B31 OspA das Trp216 flankiert. Ein Ersetzen dieser zwei Reste veränderte die Epitope von OspA, die die Mabs 105, H3TS und H5332 binden. Die Tatsache, dass die 640 Austausche einzig die Reaktivität mit Mab 336 zum Verschwinden brachten, zeigte, dass Thr204 und Ser206 nicht in die direkte Interaktion Mab 336 involviert sind.
Diese Resultate zeigten, dass die Epitope des OspA, welche Mabs, die Spirochäten agglutinieren, zur Verfügung stehen, zumindest teilweise von Aminosäuren umfasst werden, die in unmittelbarer Nachbarschaft zu Trp216 liegen. Da seit kurzem vorliegende Zirkulardichroismus Analysen zeigten, dass sich Strukturen von OspA aus B31 und K48 innerhalb dieser Domäne nur sehr wenig unterscheiden, ist es unwahrscheinlich, dass die durch Mutation eingeführten Austausche die Gesamtstruktur des OspA Proteins radikal verändert hätten (France, L. L. et al., Biochem. Biophys. Acta 1120: 59 (1992); und France et al., Biochem. Biophys. Acta, eingereicht (1993)). Diese Hypothese wird durch die Erkenntnis unterstützt, dass die rekombinanten, mutierten OspAs die gleiche hohe Löslichkeit und die selben Reinigungseigenschaften wie das ursprüngliche B31 Protein zeigen (Daten nicht gezeigt).
Zusammenfassend sind die Aminosäureseitenketten bei Ser204 und Thr206 von hoher Bedeutung für viele der agglutinierenden Epitope. Ein begrenzter Satz an konservativen Austausche an diesen Stellen war jedoch nicht ausreichend, um die Bindung aller agglutinierenden Mabs zu verhindern. Diese Resultate legen die Vermutung nahe, dass die agglutinierenden Epitope von OspA distinkt sind, jedoch überlappen können. Die Resultate unterstützen weiterhin die Hypothese, dass das Oberflächen exponierte Epitop um Trp216, von dem angenommen wird, dass es für die Immunerkennung und die Neutralisierung wichtig ist, eine konformatorisch bestimmte und komplexe Domäne des OspAs ist.
Beispiel 3. Borrelia Stämme und Proteine
Proteine und Gene von jedwedem Stamm von Borrelia können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Verwendung finden. Stellvertretende Stämme sind in Tabelle 1 oben zusammengefasst.
A. Gene, welche Borrelia-Proteine kodieren
Die chimären Peptide der vorliegenden Erfindung können Peptide umfassen, die von irgendwelchen Borrelia-Proteinen abstammen. Beispielhafte Proteine umfassen OspA, OspB, OspC, OspD, p12, p39, p41 (fla), p66 und p93. Nukleinsäuresequenzen, die verschiedene Borrelia-Proteine kodieren, sind zur Zeit erhältlich (siehe Tabelle 2, unten); alternativ hierzu können Nukleinsäuresequenzen, die für Borrelia-Proteine kodieren, unter Verwendung von Methoden wie den unten beschriebenen isoliert und charakterisiert werden. Tabelle 2 Literaturangaben für Nukleinsäuresequenzen für verschiedene Proteine aus verschiedenen Borrelia Stämmen
B. Isolierung von Borrelia Genen
Nukleinsäuresequenzen, die für vollständige, lipidierte Proteine aus bekannten Borrelia Stämmen kodieren, wurden unter Verwendung der Polymerase Kettenreaktion (PCR) wie unten beschrieben isoliert. Zusätzlich wurden Nukleinsäuresequenzen hergestellt, welche für trunkierte Proteine kodierten (Proteine, bei denen das Signal für die Lipidierung entfernt wurde, beispielsweise durch Eliminieren der Nukleinsäuresequenz welche die ersten 18 Aminosäuren kodiert, woraus nicht-lipidierte Proteine resultierten). Es wurden weiterhin andere Proteine hergestellt, welche für Polypeptide eines bestimmten Gens kodieren (d.h. kodierend für ein Segment des Proteins, welches eine andere Anzahl an Aminosäuren aufweist, als es das Protein natürlicherweise tut). Unter Verwendung der gleichen Methoden wie sie unten beschrieben werden, können Primer aus bekannten Nukleinsäuresequenzen, die für Borrelia-Proteine kodieren, abgeleitet und verwendet werden, um andere Gene, die für Borrelia-Proteine kodieren, zu isolieren. Die Primer können so abgeleitet werden, dass sie das vollständige Gen amplifizieren, oder auch so, dass sie eine Nukleinsäuresequenz, die für eine trunkierte Proteinsequenz kodiert, amplifizierten, wie es unten für OspC beschrieben wird, oder für Nukleinsäuresequenzen, die für ein Polypeptid, welches von einem Borrelia-Protein abgeleitet wurde, kodieren. Die Primer können auch so ausgestaltet sein, dass sie einzelne Schnittstellen für Restriktionsenzyme in die amplifizierte Nukleinsäuresequenz einbauen. Die Sequenzanalyse der amplifizierten Nukleinsäuresequenzen kann dann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden.
Klonieren und Sequenzieren von OspA Genen und relevanten Nukleinsäuresequenzen
Borrelia OspA Sequenzen wurden auf folgende Weise isoliert :100 μl Reaktionsgemisch enthaltend 50 mM KCl, 10 mM TRIS-HCl (pH 8,3), 1.5 mM MgCl₂, jeweils 200 μM NTP, 2.5 units TagI DNA Polymerase (Amplitaq, Perkin-Elmer/Cetus) und je 100 pmol des 5'- und 3'- Primers (unten beschrieben) wurden verwendet. Die Amplifikation wurde in einem Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler wie beschrieben durchgeführt (Schubach, W. H. et al., Infect. Immun. 59: 1811–1915 (1991). Das Amplikon wurde mit Hilfe eines Agarosegels durch Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht. Zwanzig Nanogramm des mit Chloroform extrahierten PCR Produkts wurden nach Herstellerangaben direkt in den PC-TA Vektor (Invitrogen) kloniert. Rekombinante Kolonien, die das amplifizierte Fragment enthielten, wurden selektiert, die Plasmide präpariert, und die Nukleinsäuresequenz eines jeden OspA wurde durch die Didesoxy-Kettenterminationstechnik unter Verwendung des Sequenasekits (United States Biochemical) bestimmt. Ein gerichtetes Sequenzieren wurde unter Verwendung von M13 Primern gefolgt von OspA-spezifischen Primern, die vorher aus der Sequenz unter Verwendung von M13 Primern erhalten wurden durchgeführt.
Da die 5' und 3' Enden des OspA Gens hoch konserviert sind (Fikrig, E. S. et al., J. Immunol. 7: 2256–2260 (1992); Bergstrom, S. et al., Mol. Microbiol. 3: 479-486 (1989); Zumstein, G. et al., Med. Microbiol. Immunol. 181: 57–70 (1992)), können die für das Klonieren verwendeten 5' und 3' Primer auf jeder bekannten OspA Sequenz basieren. Beispielsweise wurden die folgenden Primer verwendet, die auf der Nukleinsäuresequenz des OspA aus Stamm B31 basieren

5'-GGAGAATATATTATGAAA-3' (–12 bis +6) (SEQ ID No. 4); und
5'-CTCCTTATTTTAAAGCG-3' (+826 bis +809) (SEQ ID No. 5). (Schubach, W.H. et al., Infect. Immun. 59: 1811–1915 (1991)).

Auf diese Weise isolierte OspA Gene umfassen solche aus den Stämmen B31, K48, PGau und 25015; die Nukleinsäuresequenzen sind in dem Sequenzprotokoll als SED ID No. 6 (OspA-B31), SEQ ID No. 8 (OspA-K48), SEQ ID No. 10 (OspA-PGau), und SEQ ID No. 12 (OspA-25015) dargestellt. Ein Alignment dieser und anderer OspA Nukleinsäuresequenzen ist in 42 dargestellt. Die Aminosäuresequenzen der durch diese Nukleinsäuresequenzen kodierten Proteine sind als SEQ ID No. 7 (OspA-B31), SEQ ID No. 9 (OspA-K48), SEQ ID No.11 (OspA-PGau) und SEQ ID No. 13 (OspA-25015) dargestellt.
Die folgenden Primer wurden verwendet, um spezifische Nukleinsäuresequenzen des OspA Gens herzustellen, welche verwendet werden sollten, um chimäre Nukleinsäuresequenzen zu generieren (wie in Beispiel 4 beschrieben)
Klonieren und Sequenzieren von OspB
Die gleichen Methoden wurden auch verwendet um OspB Gene zu isolieren. Ein isoliertes OspB Gen ist als SEQ ID No. 21 dargestellt (OspB-B31); die hiervon kodierte Aminosäuresequenz ist SEQ ID No. 22.
Die folgenden Primer wurden verwendet um spezifische Nukleinsäuresequenzen des OspB Gens herzustellen, welche zur Herstellung von chimären Nukleinsäuresequenzen verwendet werden sollten (siehe Beispiel 4):
Klonieren und Sequenzieren von OspC
Die gleichen Verfahren wurden auch verwendet um OspC Gene zu isolieren. Die folgenden Primer wurden verwendet um vollständige OspC Gene aus den Borrelia Stämmen B31, K48, PKo und pTrob zu isolieren:
Die Nukleinsäuresequenzen des OspC Genes wurden dann unter Verwendung des Didesoxy-Kettenterminationstechnik unter Verwendung des Sequenasekits (United States Biochemical) bestimmt. Auf diese Weise isolierte und sequenzierte OspC Gene umfassten die der Stämme B31, K48, PKo und Tro; die Nukleinsäuresequenzen sind dargestellt im Sequenzprotokoll als SEQ ID No. 29 (OspC-B31), SEQ ID No. 31 (OspC-K48), SEQ ID No. 33 (OspC-PKo), und SEQ ID No. 35 (OspC-Tro). Ein Alignment dieser Sequenzen ist in 38 gezeigt. Die von diesen Nukleinsäuren kodierten Aminosäuresequenzen der Proteine sind als SEQ ID No. 30 (OspC-B31), SEQ ID No. 32 (OspC-K48), SEQ ID No. 34 (OspC-PKo) und SEQ ID No. 36 (OspC-Tro) dargestellt.
Trunkierte OspC Gene wurden unter Verwendung anderer Primer hergestellt. Diese Primer waren so abgeleitet, dass sie Nukleinsäuresequenzen amplifizierten, die von dem OspC Gen abgeleitet waren, und denen die Nukleinsäuren, die für die Signalpeptidasesequenz des vollständigen Proteins kodieren, fehlten. Die Primer entsprachen den Basenpaaren 58–75 des natürlichen Proteins, wobei ein Codon für Met-Ala am Anfang angefügt war.
Für Stamm B31 wurde der folgende Primer verwendet:
Es wurden zusätzliche Primer für die Amplifikation von Nukleinsäuren abgeleitet, die bestimmte Polypeptide zur Verwendung bei der Herstellung von _Chimären Nukleinsäuresequenzen kodieren (siehe Beispiel 4). Diese Primer beinhalteten
Klonieren und Sequenzieren von OspD
Die gleichen Verfahren können auch verwendet um OspD Gene zu isolieren. Ein Alignment von vier OspD Nukleinsäuresequenzen (aus den Stämmen pBo, PGau, DK29 und K48) ist in 39 dargestellt.
Klonieren und Sequenzieren von p12
Das p12 Gen wurde in gleicher Weise identifiziert. Die zur Klonierung des vollständigen p12 Gens verwendeten Primer umfassten:
Um ein verkürztes p 12 Gen (eines, bei dem das transferierte Protein nicht-lipidiert ist und welches bei Aminosäure 18 der nativen Sequenz beginnt) zu amplifizieren wurden die folgenden Primer verwendet
Klonieren und Sequenzieren von p41 (fla)
Der gleiche Ansatz wurde verwendet um Gene, die für das p41 (fla) Protein kodieren, zu klonieren und zu sequenzieren. Die in Tabelle 2 mit den Zugangsnummern der Datenbank „GenBank" gelisteten p41 Sequenzen wurden unter Verwendung der folgenden Primer aus Stamm B31 isoliert:
Die auf diese Weise isolierten Nukleinsäuresequenzen von p41 sind im Sequenzprotokoll als SEQ ID No. 51 (p41-PGau), und SEQ ID No. 53 (p41-DK29) dargestellt. Ein Alignment von einigen p41 Nukleinsäuresequenzen einschließlich derer aus den Stämmen B31, pKa1, PGau, pBo, DK29, und pKo ist in 41 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen der durch diese Nukleinsäuresequenzen kodierten Proteine sind dargestellt als SEQ ID No. 50 (p41-K48), SEQ ID No. 52 (p41-PGau), SEQ ID No. 54 (p41-DK29), SEQ ID No. 56 (p41-PTrob) und SEQ ID No. 58 (p41-PHei).
Andere Primer wurden zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide aus p41 kodieren, zur Verwendung in chimären Nukleinsäuresequenzen abgeleitet. Diese Primer beinhalteten
Klonieren und Sequenzieren von p93
Der selbe Ansatz wurde auch verwendet um das Protein p93 zu klonieren und zu sequenzieren. Die für p93 kodierenden Gene wie sie in Tabelle 2 zusammen mit den Zugangsnummern der Datenbank „Genbank" aufgelistet sind, wurden durch diese Methode mit Hilfe der folgenden Primern aus Stamm B31 isoliert
Die auf diese Weise isolierten Nukleinsäuresequenzen aus p93 sind in dem Sequenzprotokoll als SEQ ID No. 65 (p93-B31), SEQ ID No. 67 (p93-K48), SEQ ID No. 69 (p93-PBo), SEQ ID No. 71 (p93-PTrob), SEQ ID No. 73 (p93-PGau), SEQ ID No. 75 (p93-25015) und SEQ ID No. 77 (p93-PKo), dargestellt. Die Aminosäuresequenzen der durch diese Nukleinsäuresequenzen kodierten Proteine sind dargestellt als SEQ ID No. 66 (p93-B31), SEQ ID No. 68 (p93-K48), SEQ ID No. 70 (p93-PBo), SEQ ID No. 72 (p93-PTrob), SEQ ID No. 74 (p93-PGau), SEQ ID No. 76 (p93-25015) und SEQ ID No. 78 (p93-PKo).
Andere Primer wurden verwendet um Nukleinsäuresequenzen zu amplifizieren die für Polypeptide aus p93 kodieren, und die bei der Herstellung von _Chimären Nukleinsäuresequenzen verwendet werden sollen. Diese Primer beinhalten
C. Expression von Proteinen von Borrelia Genen
Die oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen können unter Verwendung von Standardtechniken in Expressionsplasmide eingebaut werden und in kompatible Wirtszellen transfiziert werden, um die durch die Nukleinsäuren kodierten Proteine zu exprimieren. Beispielhaft ist die Expression des p12 Gens und die Isolierung des p 12 Proteins dargestellt.
Die Amplifizierung der p12 Nukleinsäuresequenz wurde mit Primern durchgeführt, die eine Nde 1 Restriktionsschnittstelle in die Nukleinsäuresequenz einführten. Das PCR Produkt wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das präzipierte Produkt wurde verdaut und in ein Expressionsplasmid wie folgt ligiert: 15 μl (etwa 1 μg) PCR DNA wurde mit 2 μl 10X Restriktionspuffer für Nde 1 (Gibco/BRL), 1 μl Nde 1 (Gibco/BRL) und 2 μl destilliertem Wasser vereinigt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Dieses Gemisch wurde nachfolgend mit 3 μl 10X Puffer (Puffer 3, New England BioLabs), 1 μl BamH1 (NEB), und 6 μl destilliertem Wasser vereinigt und bei 37°C für zwei Stunden inkubiert. Das resultierende Material wurde über eine präparative Gelelektrophorese unter Verwendung von niedrig schmelzender Agarose gereinigt, und die entsprechende Bande wurde unter langwelligem ultraviolettem Licht visualisiert und aus dem Gel ausgeschnitten. Das Gelstückchen wurde mit Gelase nach Herstellerangaben (Epicentre Technologies) behandelt. Das resultierende DNA Pellet wurde in 25–50 μl 10 mM TRIS-CL (pH 8.0) und 1 mM EDTA (TE) resuspendiert. Ein Aliquot dieses Materials wurde in den Pet9c Expressionsvektor (Dunn, J. J. et al., Protein Expression and Purification 1: 159 (1990)) ligiert.
Um das Material in den Pet9c Expressionsvektor zu ligieren, wurden 20–50 ng der wie oben beschrieben geschnittenen und gereinigten p12 Nukleinsäuresequenzen mit 5 μl 10 0ne-Phor-All(OPA) Puffer (Pharmazia), 30–60 ng Pet9c geschnitten mit Nde 1 und BamH 1, 2.5 μl mM ATP, 2 μl T4 DNA Ligase (Pharmazia) verdünnt 1:5 in 1X OPA Puffer und genügend destilliertem Wasser um das Endvolumen auf 50 μl einzustellen, vereinigt. Dieses Gemisch wurde bei 12°C über Nacht inkubiert.
Die resultierenden Ligationen wurden in kompetente DH5-alpha Zellen transformiert und auf Agarplatten, welche 50 μg / ml Kanamycin enthielten, ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. DH5-alpha wird als ein „Lagerstamm" für T7 Expressionsklone verwendet, da es RecA defizient ist, so dass die Rekombination und die Konkatenation keine Probleme bereiten, und weil das T7 PNA Polymerasegen fehlt, welches notwendig ist, um das klonierte Gen zu exprimieren. Die Verwendung dieses Stammes erlaubt das Klonieren von potentiell toxischen Genprodukten, während die Gefahr der Deletion und/oder des Rearrangements der gewünschten Gene minimiert wird. Andere Zelllinien mit gleichen Eigenschaften können ebenso verwendet werden.
Kanamycin resistente Kolonien wurden auf mit 50 μg / ml suplementierten Agarplatten gepickt. Eine Kolonie eines jeden Isolates wurde in 3–5 ml flüssiges Medium, welches 50 μg / ml Kanamycin enthielt, überimpft, und bei 37°C ohne Schütteln inkubiert. Die Plasmid DNA wurde aus 1 ml eines jeden Isolats unter Verwendung der heissen alkalischen Lyseprozedur erhalten (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)).
Die Plasmid DNA wurde mit EcoRI und BgIII auf folgende Weise gespalten: 15 μl Plasmid DNA wurde mit 2 μl 10X Puffer 3 (NEB), 1 μ EcoRI (NEB), 1 μl BgIII (NEB) und 1 μl destilliertem Wasser vereinigt und für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Das gesamte Reaktionsgemisch wurde dann einer analytischen Agarosegelelektrophorese unterzogen. Plasmide, die das p12 Insert trugen, wurden durch Gegenwart einer Bande, die entweder 925 Basen-Paaren (vollständiges p12) oder 875 Basen-Paaren (nicht-lipidiertes p12) entsprach, identifiziert.
Ein oder zwei Plasmid DNAs aus den vollständigen und den nicht-lipidierten p 12 Klonen in Pet9c wurden verwendet, um BL21 DE3 pLysS wie von Studier et al. beschrieben zur Kanamycinresistenz zu transformieren (Methods in Enzymology, Goeddel, D. (Ed.), Academic Press, 185: 60–89 (1990)). Ein oder zwei Transformanten der vollständigen bzw. nicht-lipidierten Klone wurden auf 25 μg / ml Chloramphenicol (um pLysS zu erhalten) und 50 μl/ml Kanamycin enthaltenden bei 37°C gepickt. Eine Kolonie eines jeden Isolates wurde in mit Chloramphenicol und Kanamycin supplementiertem flüssigen Medium angeimpft und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Übernachtkultur wurde am folgenden Morgen in 500 ml Kulturbrühe mit 25 μg / ml Chloramphenicol und 50 μg / ml Kanamycin subkultiviert und unter Belüftung bei 37°C in einem orbitalen Luftschüttler subkultiviert, bis die Absorbtion bei 600 nm den Wert 0.4 – 0.7 erreichte. Isopropylthiogalaktosid (IPTG) wurde zu einer Endkonzentration von 0.5 mM zur Induktion hinzugefügt, und die Kultur wurde 3 – 4 Stunden bei 37° wie zuvor inkubiert. Die induzierten Zellen wurden durch Zentrifugation niedergeschlagen und in 25 ml 20 mM NaPO₄ (pH 7.7) resuspendiert. Ein kleines Aliquot wurde für die Analyse durch Gelelektrophorese entnommen. Exprimierende Klone produzierten Proteine, welche an die 12 kDa Position wanderten.
Aus der Kultur wurde wie von Dunn J. J. et al. (Protein Expression and Purification 1: 159 (1990)) für rekombinantes OspA beschrieben ein rohes Zelllysat präpariert. Das Rohlysat wurde zuerst über eine Q-Sepharosesäule (Pharmazia), die mit Puffer A: 10 mM NaPO₄ (pH 7.7), 10 mM NaCl, 0.5 mM PMSF prääquilibriert worden war, geschickt. Die Säule wurde mit 10 mM NaPO₄, 50 mM NaCl und 0.5 mM PMSF gewaschen und dann wurde p12 mit 10 mM NaPO₄, 0.5 mM PMSF unter Anlegen eines NaCl Gradienten von 50–400 mM eluiert. p12 eluierte etwa in der Mitte des Gradienten zwischen 100 und 200 mM NaCl. Die Spitzenfraktionen wurden gesammelt und gegen 10 mM NaPO₄ (pH 7.7), 10 mM NaCl, 0.5 mM PMSF dialysiert. Das Protein wurde dann aufkonzentriert und auf eine Sephadex G50 Gelfiltrationssäule mit etwa 50 ml Bettvolumen (Pharmazia) in 10 mM NaPO₄, 200 mM NaCl, 0.5 mM PMSF aufgetragen. p12 sollte typischer Weise kurz nach dem Durchlauf des Volumenmarkers eluieren. Die Spitzenfraktionen wurden durch Gelläufe von kleinen Aliquots aller Fraktionen bestimmt. Die p12 Spitzenfraktion wurde vereinigt und in kleinen Aliquots bei –20°C gelagert.
Beispiel 4. Herstellung von chimären Nukleinsäureseguenzen und chimären Proteinen
A. Allgemeine Vorschrift für die Herstellung von chimären Nukleinsäuresequenzen
Zur Herstellung von chimären Nukleinsäuresequenzen wurde die Megaprimermethode der gerichteten Mutagenese und deren Modifikation benutzt (Sarkar and Sommer, Biotechniques 8(4): 404–407 (1990); Aiyar, A. and J. Leis, Biotechniques 14(3): 366–369 (1993)). Ein 5' Primer für das erste genomische Template und ein 3' Fusionsoligo wurden verwendet, um die gewünschte Region zu amplifizieren. Der Fusionsprimer besteht aus einem 3' Ende aus dem ersten Template (DNA, die für das aminoproximale Polypeptid des Fusionsproteins kodiert), gebunden an ein 5' Ende des zweiten Templates (DNA, die für das carboxyproximale Polypeptid des Fusionsproteins kodiert).
Die PCR Amplifikationen werden unter Verwendung von Taq DNA Polymerase, 10X PCR Puffer und MgCl₂ (Promega Corp, Madison, WI) und Ultrapur dNTPs (Pharmazia, Piscataway, NJ) durchgeführt. Ein μg genomisches Template 1, 5 μ 10 μM 5' Oligo und 5 μl 10 μM Fusionsoligo werden mit den folgenden Reagenzien zu den angegebenen Endkonzentrationen vereinigt: 10X Puffer-Mg FREE (1X), MgCl₂ (2 mM), dNTP Mix (je dNTP 200 μM), Taq DNA Polymerase (2.5 units), und Wasser um das Volumen auf 100 μl einzustellen. Ein Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) wird zur Amplifikation unter folgenden Bedingungen verwendet: 35 Zyklen bei 95°C für eine Minute, 55°C für zwei Minuten und 72° für drei Minuten. Dieses Verfahren führt zur Bildung eines „Megaprimers".
Der resultierende Megaprimer wird auf einem 1X TAE, 4% niedrigschmelzendem Agarosegel analysiert. Die Megaprimer Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung des Promega Magic PCR Preps DNA Reinigungssystems gereinigt. Der gereinigte Megaprimer wird dann in einem zweiten PCR Schritt verwendet. Ein μg genomisches Template 2, etwa 0.5 μg des Megaprimers und 5μ 10 μM 3' Oligo werden zu einem Cocktail aus 10X Puffer, MgCl₂, dNTPs und Taq zur selben Endkonzentration wie oben angegeben hinzugefügt, und mit Wasser auf ein Endvolumen von 100 μl eingestellt. Die PCR Bedingungen sind die gleichen wie oben. Das aus dieser Amplifikation resultierende Fusionsprodukt wird ebenfalls unter Verwendung des Promega Magic PCR Preps DNA Reinigungssystems gereinigt.
Das Fusionsprodukt wird dann in den TA Vektor legiert und in E. coli unter Verwendung des Invitrogen (San Diego, CA) TA Kloningkits transformiert. Etwa 50 ng des PCR Fusionsproduktes wird dann mit 50 ng pCRII Vektor mit 1X Ligationspuffer, 4 Units T4 Ligase ligiert und auf 10 N1 mit Wasser eingestellt. Dieses ligierte Produktgemisch wird bei 12°C über Nacht inkubiert (etwa 14 Stunden). Zwei μl des Ligationsproduktgemisches wird zu 50 μl kompetenten INC F' Zellen und 2 μ β-Mercaptoenthanol hinzugefügt. Die Zellen werden dann für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von einer Hitzeschockbehandlung bei 42°C für 60 Sekunden und 2 Minuten Kühlung auf Eis. Dann werden 450μl angewärmtes SOC Medium zu den Zellen hinzugefügt, woraus eine transformierte Zellkultur resultiert, welche bei 37°C eine Stunde mit leichtem Schütteln inkubiert wird. 50 μl der transformierten Zellkultur wird auf LB + 50 μg/μl Ampicillinplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne weiße Kolonien werden gepickt und zu individuellen Übernachtkulturen hinzugefügt, die 3 ml LB mit 50 μg/μl Ampicillin enthalten.
Die individuellen Übernachtkulturen werden unter Verwendung von Promega Magic Minpräp DNA Reinigungssystem gereinigt. Eine kleine Menge der resultierenden DNA wird unter Verwendung eines Restriktionsenzyms zur Probe geschnitten. Die DNA Sequenzanalyse wird dann unter Verwendung des Sequenase DNA Sequenzierkits Version 2.0 von United States Biochemical (Cleveland, OH) durchgeführt, um die Sequenz der Fusionsnukleinsäuresequenz zu überprüfen. Drei bis fünf μg Plasmid DNA werden pro Reaktion verwendet. 2 μl 2M NaOH/2mM EDTA werden zu der DNA hinzugefügt und das Volumen wird mit Wasser auf 20 μl eingestellt. Das Gemisch wird dann bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubiert. Dann werden 7 μl Wasser, 3μl 3M NaAC und 75 μl EtOH hinzugefügt. Das resultierende Gemisch wird gevortext, 10 Minuten bei –70°C inkubiert und dann einer Mikrofugation unterzogen. Nach zehnminütiger Mikrofugation wird der Überstand abgesaugt und das Pellet wird in einer Speed Vac 30 Sekunden getrocknet. 6 μl Wasser, 2 μl Hybridisierungspuffer und 2 μl 10 μM des jeweiligen Oligos werden dann hinzugefügt. Dieses Gemisch wird 10 Minuten bei 37°C inkubiert und dann 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nachfolgend werden 5.5 μl Markierungscocktail (oben beschrieben) zu jeder Probe des Gemisches hinzugefügt, welche dann bei Raumtemperatur für nochmals fünf Minuten inkubiert werden. 3.5 μl markierte DNA wird dann zu jeder Probe hinzugefügt, welche dann fünf Minuten bei 37°C inkubiert wird. Dann wird in jedes Gefäß 4 μl Stoplösung zugefügt. Die DNA wird bei 95° zwei Minuten denaturiert und dann auf Eis überführt.
Klone mit den gewünschten Fusionsnukleinsäuresequenzen werden im Leseraster in dem pEt Expressionssystem in der lipidierten (vollständig) und der nicht lipidierten (trunkiert, d.h. ohne die ersten 17 Aminosäuren) Formen rekloniert. Das Produkt wird unter Verwendung der Restriktionsschnittstelle, die in den PCR Primern enthalten sind, amplifiziert. Der Vektor und das Produkt werden mit den gleichen Enzymen geschnitten und mit T4 Ligase zusammenligiert. Das resultierende Plasmid wird unter Verwendung von Standardtransformationsverfahren in kompetente E. coli Zellen transformiert. Die Kolonien werden wie früher beschrieben durchmustert, und positive Klone werden in Expressionszellen wie E. coli BL21 zur Expression mit IPTG Induktion transformiert. Das exprimierte Protein, entweder in Form des bakteriellen Kulturlysats und/oder in einer gereinigten Form, wird dann in Mäuse zur Antikörperproduktion injiziert. Die Mäuse werden ausgeblutet, und die Seren für die Agglutination, die in-vitro-Wachstumsinhibierung und Komplementabhängige und -unabhängige Lysistests gesammelt.
B. Spezifische chimäre Nukleinsäuresequenzen
Verschiedene chimäre Nukleinsäuresequenzen wurden hergestellt. Diese Nukleinsäuresequenzen werden als solche beschrieben, die für Polypeptide aus Borrelia-Proteinen kodieren. Die chimären Nukleinsäuresequenzen werden so hergestellt, dass die Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, im selben Leseraster liegt wie die Nukleinsäuresequenz, welche für das nächste Polypeptid in der chimären Proteinsequenz, welche durch die chimäre Nukleinsäuresequenz kodiert wird, kodiert. Die Proteine werden in der Beschreibung der chimären Nukleinsäuresequenz sequenziell (der Reihenfolge des Auftretens der kodierten Sequenz) aufgelistet. Wäre beispielsweise eine chimäre Nukleinsäuresequenz bestehend aus bp 1–650 aus OspA-1 und bp 651–820 aus OspA-2 sequenziert worden, würde die Sequenz des Chimären die ersten 650 Basenpaare aus OspA-1 gefolgt unmittelbar durch die Basenpaare 651–820 von OspA-2 umfassen.
OspA-K48/OspA-PGau
Unter Verwendung der oben beschriebenen Methode wurde ein Chimäres aus OspA aus Stamm K48 (OspA-K48) und OspA aus Stamm PGau (OspA-PGau) hergestellt. Diese chimäre Nukleinsäuresequenz umfasste bp 1–654 aus OspA-K48, gefolgt von bp 655–820 aus OspA-PGau. Die verwendeten Primer umfassten die aminoterminale Sequenz des OspA Primers #607 (SEQ ID No. 16), den Fusionsprimer, 5'-AAAGTAGAAGTTTTTGAATCCCATTTTCCAGTTTTTTT-3' (minus Strang Primer #668–654) (SEQ ID No. 84); die carboxyterminale Sequenz des OspA Primers #586 (SEQ ID No. 19); und die Sequenz des Primers #369 (SEQ ID No. 14) und #357 (SEQ ID No.15). Die chimäre Nukleinsäuresequenz ist in SEQ ID No. 85 dargestellt; das durch die chimäre Nukleinsäuresequenz kodierte Protein ist in SEQ ID No. 86 dargestellt.
OsnA-B31/OspA-PGau
Unter Verwendung der oben beschriebenen Methode wurde ein Chimäres aus OspA aus Stamm B31 (OspA-B31) und OspA aus Stamm PGau (OspA-PGau) hergestellt. Die Chimäre Nukleinsäuresequenz umfasste bp 1–651 aus OspA-B31, gefolgt von bp 652–820 aus OspA-PGau. Die verwendeten Primer umfassten : den Fusionsprimer 5'-AAAGTAGAAGTTTTTGAATTCCAAGCTGCAGTTTT-3' (minus Strang Primer #668–651) (SEQ ID No. 87); und die Sequenzprimer, #369 (SEQ ID No. 14). Die chimäre Nukleinsäuresequenz ist dargestellt in SEQ ID No. 88; das durch die chimäre Nukleinsäuresequenz kodierte chimäre Protein ist dargestellt in SEQ ID No. 89.
OspA-B31/OspA-K48
Ein Chimäres aus OspA aus Stamm B31 (OspA-B31) und OspA aus Stamm K48 (OspA-K48) wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Methode hergestellt. Diese chimäre Nukleinsäuresequenz umfasste bp 1–651 aus OspA-B31, gefolgt von bp 652–820 aus OspA-K48. Die verwendeten Primer umfassten den Fusionsprimer, 5'-AAAGTGGAAGTTTTTGAATTCCAAGCTGCAGTTTTTTT-3' (minus Strang Primer #671–651) (SEQ ID No. 90); und die Sequenzprimer, #369 (SEQ ID No. 14). Die chimäre Nukleinsäuresequenz ist in SEQ ID No. 91 dargestellt; das von dieser chimären Nukleinsäuresequenz kodierte chimäre Protein ist dargestellt in SEQ ID No. 92.
OspA-B31/OspA-25015
Ein Chimäres aus OspA aus Stamm B31 (OspA-B31) und OspA aus Stamm 25015 (OspA-25015) wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Methode hergestellt. Die chimäre Nukleinsäuresequenz umfasste bp 1–651 aus OspA-B31, gefolgt von bp 652–820 aus OspA-25015. Die verwendeten Primer umfassten den Fusionsprimer, 5'-TAAAGTTGAAGTGCCTGCATTCCAAGCTGCAGTTT-3' (SEQ ID No. 93). Die chimäre Nukleinsäuresequenz ist dargestellt als SEQ ID No. 94; das von dieser Chimären Nukleinsäuresequenz kodierte chimäre Protein ist dargestellt als SEQ ID No. 95.
OspA-K48/OspA-B31/OspA-K48
Ein Chimäres aus OspA aus Stamm B31 (OspA-B31) und OspA aus Stamm K48 (OspA-K48) wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Methode hergestellt. Diese chimäre Nukleinsäuresequenz umfasste bp 1–570 aus OspA-B31, gefolgt von bp 570–651 aus OspA-B31, gefolgt von bp 650–820 aus OspA-K48. Die verwendeten Primer umfassten : den Fusionsprimer, 5'-CCCCAGATTTTGAAATCTTGCTTAAAACAAC-3' (SEQ ID No. 96); und den Sequenzprimer, #357 (SEQ ID No. 15). Die chimäre Nukleinsäuresequenz ist dargestellt als SEQ ID No. 97; das durch diese chimäre Nukleinsäuresequenz kodierte chimäre Protein ist dargestellt als SEQ ID No. 98.
OspA-B31/OspA-K48/OsnA-B31/OsnA-K48
Ein Chimäres aus OspA aus Stamm B31 (OspA-B31) und OspA aus Stamm K48(OspA-K48) wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Methode hergestellt. Diese chimäre Nukleinsäuresequenz umfasste bp 1–420 aus OspA-B31, gefolgt von 420–570 aus OspA-K48, gefolgt von bp 570–650 aus OspA-B31, gefolgt von bp 651–820 aus OspA-K48. Die verwendeten Primer umfassten : den Fusionsprimer, 5'-CAAGTCTGGTTCCAATTTGCTCTTGTTATTAT-3' (minus Strang Primer #436–420) (SEQ ID No. 99); und den Sequenzprimer, #357 (SEQ ID No. 15). Die chimäre Nukleinsäuresequenz ist dargestellt als SEQ ID No. 100; das von dieser Chimären Nukleinsäuresequenz kodierte chimäre Protein ist dargestellt als SEQ ID No. 101.
OsnA-B31/OspB-B31
Ein Chimäres aus OspA und OspB aus Stamm B31 (OspA-B31, OspB-B31) wurde unter Verwendung der oben dargestellten Methode hergestellt. Die chimäre Nukleinsäuresequenz umfasste bp 1–651 aus OspA-B31, gefolgt von bp 652–820 aus OspB-B31. Die verwendeten Primer umfassten den Fusionsprimer, 5'-GTTAAAGTGCTAGTACTGTCATTCCAAGCTGCAGTTTTTTT-3' (minus Strang Primer #740–651) (SEQ ID No. 102); die carboxyterminale Sequenz des OspB Primers #1106 (SEQ ID No. 25); und den Sequenzprimer #357 (SEQ ID No. 15). Die chimäre Nukleinsäuresequenz ist als SEQ ID No. 103 dargestellt; das von dieser chimären Nukleinsäuresequenz kodierte chimäre Protein ist dargestellt als SEQ ID No. 104.
OsnA-B31/OspB-B31/OspC-B31
Ein Chimäres aus OspA, OspB und OspC aus Stamm B31 (OspA-B31, OspB-B31 und OspC-B31) wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Methode hergestellt. Die chimäre Nukleinsäuresequenz umfasste bp 1–650 aus OspA-B31, gefolgt von bp 652–820 aus OspB-B31, gefolgt von bp 74–630 aus OspC-B31. Die verwendeten Primer umfassten : den Fusionsprimer, 5'-TGCAGATGTAATCCCATCCGCCATTTTTAAAGCGTTTTT-3' (SEQ ID No. 105); und die carboxyterminale Sequenz des OspC Primers (SEQ ID No. 28). Die chimäre Nukleinsäuresequenz ist als SEQ ID No. 106 dargestellt, das von dieser chimären Nukleinsäuresequenz kodierte chimäre Protein ist dargestellt als SEQ ID No. 107.
OspC-B31/OspA-B31/OspB-B31
Ein Chimäres aus OspA, OspB und OspC aus Stamm B31 (OspA-B31, OspB-B31 und OspC-B31) wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Methode hergestellt. Die chimäre Nukleinsäuresequenz umfasste bp 1–630 aus OspC-B31, gefolgt von bp 52–650 aus OspA-B31, gefolgt von bp 650–820 aus OspB-B31. Die verwendeten Primer umfassten : Die aminoterminale Sequenz des OspC Primers mit der SEQ ID No. 27; den Fusionsprimer, 5'-GCTGCTAACATTTTGCTTAGGTTTTTTTGGACTTTC-3' (minus Strang Primer #69–630) (SEQ ID No. 108); und die Sequenzprimer #520 (SEQ ID No. 40) und #200 (SEQ ID No. 18). Die chimäre Nukleinsäuresequenz ist als SEQ ID No. 109 dargestellt; das durch diese chimäre Nukleinsäuresequenz kodierte chimäre Protein ist als SEQ ID No. 110 dargestellt.
Zusätzliche chimäre Nukleinsäuresequenzen
Unter Verwendung der oben beschriebenen Methoden wurden weitere chimäre Nukleinsäuresequenzen hergestellt. Chimäre Nukleinsäuresequenzen und die von ihnen kodierten Proteine sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3 Chimäre Nukleinsäuresequenzen und die kodierten Proteine
C. Reinigung von Proteinen die von chimären Nukleinsäuresequenzen hergestellt wurden
Die oben beschriebenen chimären Nukleinsäuresequenzen wie auch chimäre Nukleinsäuresequenzen, die nach den oben beschriebenen Methoden hergestellt wurden, werden verwendet, um chimäre Proteine zu produzieren, die durch die Nukleinsäuresequenzen kodiert sind. Standardverfahren wie sie in Beispiel 3 bezüglich der Expression von Proteinen von Borrelia Genen beschrieben werden, können verwendet werden, um die Proteine in einem kompatiblen Wirtsorganismus zu exprimieren. Die chimären Proteine können dann unter Verwendung von Standardverfahren isoliert und gereinigt werden.
Ist das chimäre Protein löslich, kann es über eine Sepharosesäule gereinigt werden. Unlösliche Proteine können in Guanidin gelöst werden und über eine Ni++ Säule gereinigt werden; alternativ hierzu können sie in 10 mM NaPO₄ mit 0.1–1 % TRIXON X 114 gelöst werden und nachfolgend über eine S Säule (Pharmazia) gereinigt werden. Lipidierte Proteine wurden im Allgemeinen nach der letzteren Methode gereinigt. Die Löslichkeit wurde bestimmt, in dem sowohl lösliche als auch unlösliche Fraktionen von Zelllysat auf einem 12% PAGE Gel getrennt wurden, und das Vorkommen des Proteins durch Coomasie-Färbung oder durch Westernblotting mit monoklonalen Antikörpern, die gegen ein antigenes Polypeptid des chimären Proteins gerichtet waren, überprüft wurde.
Äquivalente
Der Fachmann wird leicht erkennen können oder fähig sein sich vorzustellen, dass ohne etwas anderes als Routineexperimente zu verwenden, viele Äquivalente zu den vorliegend beschriebenen spezifischen Ausführungsbeispielen der Erfindung existieren. Diese Äquivalente sollen vom Umfang der folgenden Ansprüche ebenfalls umfasst sein.
Sequenzprotokoll

Claims

Rekombinant hergestelltes, chimäres Protein, das zwei Polypeptide aufweist, die vom äußeren Oberflächenprotein A oder äußeren Oberflächenprotein B aus unterschiedlichen Lyme-Borreliose verursachenden Stämmen der Borrelia abgeleitet sind, wobei das erste Polypeptid des äußeren Oberflächenprotein A oder B vom N-Terminus bis einschließlich einem konservierten Tryptophan umfasst, und das zweite Polypeptid das äußere Oberflächenprotein A oder B vom konservierten Tryptophan zum C-terminalen Ende des Proteins umfasst, wobei besagtes erstes Polypeptid und besagtes zweites Polypeptid aus unterschiedlichen Stämmen der Lyme-Borreliose verursachenden Borrelia sind, und wobei die Aminosäuresequenz des besagten chimären Proteins nicht die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz von entweder dem äußeren Oberflächenprotein A oder B, von denen das erste Polypeptid und das zweite Polypeptid erhalten werden, und worin jedes Polypeptid im chimären Protein Antigenizität bewahrt.
Chimäres Protein nach Anspruch 1, bei dem: a) das erste Polypeptid das äußere Oberflächenprotein A oder B vom N-Terminus bis einschließlich einem konservierten Tryptophan umfasst, wobei das erste Polypeptid hypervariable Bereiche des äußeren Oberflächenproteins A, welche die Reste 120 bis einschließlich 140, die Reste 150 bis einschließlich 180 und die Reste 200 bis einschließlich 217 aufweisen, einschließt, und b) das zweite Polypeptid das äußere Oberflächenprotein A oder das Oberflächenprotein B vom konservierten Tryptophan zum C-terminalen Ende des Proteins umfasst; wobei der Lyme-Borreliose verursachende Stamm der Borrelia, von dem zumindest ein Bestandteil aus der Gruppe, bestehend aus: jeglichem der hypervariablen Bereiche und dem zweiten Polypeptid, erhalten ist, sich vom Lyme-Borreliose verursachenden Stamm der Borrelia, woraus der Rest des ersten Polypeptid erhalten ist, unterscheidet, und wobei der hypervariable Bereich, der die Reste 200 bis einschließlich 217 umfasst, und das zweite Polypeptid von verschiedenen Lyme-Borreliose verursachenden Stämmen der Borrelia sind, und worin die Aminosäuresequenz des chimären Proteins nicht die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz eines beliebigen anderen, äußeren Oberflächenproteins A oder B, woraus das erstes Polypeptid und das zweite Polypeptid erhalten wurden, und worin das chimäre Protein die für das äußere Oberflächenprotein A oder B der Mutter-Borrelia-Stämme charakteristische Antigenizität bewahrt.
Chimäres Protein nach Anspruch 2, wobei der erste und der zweite hypervariable Bereich vom äußeren Oberflächenproteinen A aus unterschiedlichen Stämmen der Borrelia-burgdorferi abgeleitet sind.
Nucleinsäuresequenz, die ein rekombiniert hergestelltes chimäres Protein kodiert, das zwei Polypeptide aufweist, die vom äußeren Oberflächenprotein A oder äußeren Oberflächenprotein B aus unterschiedlichen Lyme-Borreliose verursachenden Stämmen der Borrelia abgeleitet sind, wobei das erste Polypeptid des äußeren Oberflächenprotein A oder B vom N-Terminus bis einschließlich einem konservierten Tryptophan umfasst, und das zweite Polypeptid das äußere Oberflächenprotein A oder B vom konservierten Tryptophan zum C-terminalen Ende des Proteins umfasst, wobei besagtes erstes Polypeptid und besagtes zweites Polypeptid aus unterschiedlichen Stämmen der Lyme-Borreliose verursachenden Borrelia sind, und wobei die Aminosäuresequenz des besagten Chimären Proteins nicht die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz von entweder dem äußeren Oberflächenprotein A oder B, von denen das erste Polypeptid und das zweite Polypeptid erhalten werden, und worin jedes Polypeptid im chimären Protein Antigenizität bewahrt.
Nucleinsäuresequent nach Anspruch 4, bei dem: a) das erste Polypeptid das äußere Oberflächenprotein A oder B vom N-Terminus bis einschließlich einem konservierten Tryptophan umfasst, wobei das erste Polypeptid hypervariable Bereiche des äußeren Oberflächenproteins A, welche die Reste 120 bis einschließlich 140, die Reste 150 bis einschließlich 180 und die Reste 200 bis einschließlich 217 aufweisen, einschließt, und b) das zweite Polypeptid das äußere Oberflächenprotein A oder das Oberflächenprotein B vom konservierten Tryptophan zum C-terminalen Ende des Proteins umfasst; wobei der Lyme-Borreliose verursachende Stamm der Borrelia, von dem zumindest ein Bestandteil aus der Gruppe, bestehend aus: jeglichem der hypervariablen Bereiche und dem zweiten Polypeptid, erhalten ist, sich vom Lyme-Borreliose verursachenden Stamm der Borrelia, woraus der Rest des ersten Polypeptid erhalten ist, unterscheidet, und wobei der hypervariable Bereich, der die Reste 200 bis einschließlich 217 umfasst, und das zweite Polypeptid von verschiedenen Lyme-Borreliose verursachenden Stämmen der Borrelia sind, und worin die Aminosäuresequenz des chimären Proteins nicht die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz eines beliebigen anderen, äußeren Oberflächenproteins A oder B, woraus das erstes Polypeptid und das zweite Polypeptid erhalten wurden, und worin das chimäre Protein die für das äußere Oberflächenprotein A oder B der Mutter-Borrelia-Stämme charakteristische Antigenizität bewahrt.
Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 5, wobei der erste und der zweite hypervariable Bereich vom äußeren Oberflächenprotein A aus unterschiedlichen Stämmen der Borrelia-burgdorferi abgeleitet sind.
Nucleinsäuresequenz mit einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO (Sequenzidentitätsnummer): 85, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141 und SEQ ID NO: 143, oder ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142 und SEQ ID NO: 144.
Rekombiniant hergestelltes, chimäres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 7 zur Verwendung in Therapie oder Diagnose, beispielsweise als Impfstoff gegen eine Borrelia burgdorferi Infektion, in immundiaganostischen Untersuchungen, um die Gegenwart von Antikörpern auf Borrelia burgdorferi zu testen oder zum Messen der T- Zellen Reaktivität, wobei die immundiagnostische Untersuchung beispielsweise ein Dotblot, ein Westernblot, ELISA oder ein Agglutinationsassay ist.
Verwendung eines chimären Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 7, oder der Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 4 bis 7 zur Herstellung einer Verbindung zur Verwendung in Therapie und Diagnose, beispielsweise als Impfstoff gegen eine Borrelia burgdorferi Infektion, in immundiagnostischen Untersuchungen, um die Gegenwart von Antikörpern auf Borrelia burgdorferi zu testen oder zum Messen der T-Zellen Reaktivitäten, wobei die immundiagnostische Untersuchung beispielsweise ein Dotblot, ein Westernblot, ELISA oder ein Agglutinationsassay ist.