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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft Proteine und Polypeptide des Bordetella-Außenmembranproteins,
welches als Pertaktin bezeichnet wird, und die Polynukleotide, welche
diese codieren. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung
dieser Proteine und Polypeptide in immunogenen Zusammensetzungen,
diagnostischen Verfahren und diagnostischen Kits.
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Die
Gattung Bordetella schließt
sieben Spezies ein. Die am besten untersuchten Spezies sind B. pertussis,
B. parapertussis und B. bronchiseptica. B. pertussis ist für Atemwegsinfektionen
nur in Menschen verantwortlich. B. parapertussis verursacht Infektionen
in Menschen und Schafen, und B. bronchiseptica infiziert viele Tierarten,
einschließlich
Menschen.
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Diese
Pathogene erzeugen eine Reihe von Virulenzfaktoren, deren Synthese
von dem aus zwei Komponenten bestehenden bvg AS (2,21)-System reguliert
wird. Diese Faktoren schließen
Toxine, wie Pertussistoxin, welches das einzige für B. pertussis
spezifische Toxin ist, tracheales Cytotoxin, Adenylatcyclase-Hämolysin
und Adhäsine,
wie filamentöses
Hämagglutinin,
Fimbrien und Pertaktin (PRN), ein.
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PRN
ist ein Außenmembranprotein
mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 69 kDa in B. pertussis,
70 kDa in B. parapertussis und 68 kDa in B. bronchiseptica (5, 14,
15). Die Vorläufer
von PRN weisen eine Größe von 91,5
kDa, 93 kDa bzw. 92,5 kDa auf. In B. pertussis ist PRN nachgewiesenermaßen ein
Agglutinogen (4), welches die Anheftung an gewisse eukaryotische
Zellen durch ein Arg-Gly-Asp(RGD)-Motiv fördert (13).
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Für das B.
bronchiseptica-PRN spezifische Antikörper werden bei hohem Titer
in immunisierten Ferkeln nachgewiesen, wohingegen wenige, falls überhaupt
irgendwelche, dieser Antikörper
in ungeschützten Tieren
nachgewiesen werden (19). Die Synthese des PRN durch B. bronchiseptica
korreliert mit dem Schutz (16). Die Immunisierung von Mäusen oder
Ferkeln mit Präparationen
des PRN induziert eine schützende
Immunität
gegen Infektion mit B. bronchiseptica (12, 19)), und passiv verabreichte
monoklonale Antikörper
verhindern den Tod von Tieren, die mit B. bronchiseptica herausgefordert
werden (16). Von B. pertussis-PRN ist ebenfalls gezeigt worden, eine
schützende
Immunität
gegen intracerebrale, Aerosol-vermittelte und intranasale Herausforderungen
mit B. pertussis in Mäusen
zu induzieren (11, 18, 20).
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PRN
wird heute daher in einigen azellulären Pertussis-Impfstoffen eingeschlossen
(d. h. Impfstoffe, welche aus gereinigten bakteriellen Proteinen
zusammengesetzt sind) (9). Allerdings besitzen die PRN-Proteine
dieser drei Spezies, obwohl deutlich verwandt, unterschiedliche
immunogene Eigenschaften. Zum Beispiel schützen Präparationen von B. pertussis-PRN
Mäuse gegen
intranasale B. pertussis-Herausforderung aber nicht gegen intranasale
B. parapertussis-Herausförderung
(11). Sie schützen
Mäuse ebenfalls
gegen intracerebrale B. pertussis-Herausforderung, wohingegen das
B. bronchiseptica-PRN-Protein dies nicht vermag (18).
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Ein
Vergleich der abgeleiteten Aminosäuren der drei Proteine, B.
pertussis-PRN, B. parapertussis-PRN und B. bronchiseptica-PRN, enthüllt einen
hohen Grad an Ähnlichkeit,
wobei die B. bronchiseptica- und B. parapertussis-Proteine ähnlicher
zueinander sind als zu dem B. pertussis-PRN-Protein (5, 14, 15).
Die Literaturbezugsstelle 14 lehrt, dass Hauptunterschiede zwischen
den Pertaktinen der drei Spezies in Hinsicht auf die Anzahl von
Wiederholungen der zwei Familien, (GGXXP)n und
(PQP)n, von wiederholt auftretenden Sequenzmotiven
bestehen.
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Die
Sequenzen der drei Proteine unterscheiden sich hinsichtlich der
Anzahl von Wiederholungen in den Regionen I und II (1a).
Unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern identifizierten und charakterisierten
Charles et al. ein schutzgebendes immunodominantes Epitop des P.69-PRN-Proteins
(6). Dieses Epitop überspannt
die (Pro-Gln-Pro)5-Wiederholungssequenzen, welche in der Region
II lokalisiert sind. Unterschiede in dieser Region können für die Beobachtung,
dass Seren aus Ferkeln, welche B. bronchiseptica-PRN erkennen, trotz
des hohen Grads an Ähnlichkeit
zwischen diesen Proteinen nicht mit B. pertussis-PRN reagieren (12),
sowie für
das Fehlen von durch die drei Proteine bereitgestelltem Kreuzschutz
verantwortlich sein (11, 18, 20).
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Es
ist kürzlich
gezeigt worden, dass das von klinischen Isolaten von B. pertussis
hergestellte PRN variiert. Sequenzen des prn-Gens von verschiedenen
klinischen Isolaten enthüllten
drei Haupttypen der PRN-Variante (17). Es ist vorgeschlagen worden,
dass die Epidemie in den Niederlanden aus Änderungen in den Sequenzen
der Gene resultiert, welche PRN und PT codieren, weil sich die Proteine,
welche in den derzeit im Umlauf befindlichen klinischen Isolaten
vorhanden sind, hinsichtlich der Sequenz von denjenigen unterscheiden,
welche bei den, in diesem Land verwendeten, Impfstämmen beobachtet
werden (17).
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Für PRN von
B. pertussis sind alle beobachteten Aminosäureunterschiede in der Region
I lokalisiert. Die allelischen prn-Typen A = 1 und C = 3 sind sehr ähnlich,
wobei sie sich nur um zwei Aminosäuren unterscheiden, wohingegen
Typ B = 2 ziemlich verschieden ist, wobei er eine Fünf-Aminosäuren-Insertion
in der gleichen Region aufweist (17).
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Nur
von einem Typ wurde festgestellt, sich in der Region II zu unterscheiden.
Dieser Typ (A* = 6) wird von dem B. pertussis-WHO-Referenzstamm
18323 und einem französischen
klinischen Isolat hergestellt (3). Er scheint jedoch nicht verbreitet
zu sein, weil er nur in einem klinischen Isolat nachgewiesen worden
ist (3). Die Produktion dieses ungewöhnlichen Typs von PRN durch
diesen B. pertussis-Stamm reflektiert die vielen gemeinsamen Eigenschaften,
welche er mit den B. parapertussis- und B. bronchiseptica-Spezies
teilt. Es wurden keine Unterschiede im Phänotyp und Verhalten im Tiermodell
von klinischen B. pertussis-Isolaten mit unterschiedlichem PRN festgestellt
(3).
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Auf
dem Fachgebiet besteht ein Bedarf nach Zusammensetzungen, welche
Proteine und Polypeptide von Bordetella-Pertaktinen enthalten, welche
in immunogenen Zusammensetzungen zum Schützen gegen Bordetella-Infektion
und zum Behandeln von mit Bordetella infizierten Subjekten verwendet
werden können. Idealerweise
werden die Proteine, Polypeptide und die Polynukleotide, welche
sie codieren, ebenfalls beim Diagnostizieren einer Bordetella-Infektion
und in Kits für
die Diagnose einer solchen Infektion nützlich sein.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung hilft bei der Erfüllung
dieser Anforderungen im Fachgebiet. In einer Ausführungsform stellt
diese Erfindung eine immunogene Zusammensetzung bereit, umfassend
eine Mischung von mindestens zwei Bordetella. bronchiseptica-Pertaktinen
oder -Pertaktin-Fragmenten,
wobei die Pertaktine oder Fragmente mindestens die Region II oder
sowohl Region I als auch Region II enthalten und wobei die Pertaktine
oder Fragmente sich in ihren jeweiligen Aminosäuresequenzen in mindestens
der Region II oder den Regionen I und II voneinander unterscheiden.
Die immunogene Zusammensetzung kann auch Pertaktin von Bordetella pertussis
in einer ausreichenden Menge zum Induzieren einer humoralen oder
zellulären
Immunantwort gegen Bordetella pertussis in einem Tier umfassen,
an welches die immunogene Zusammensetzung verabreicht wird. Die
Patentanmeldung beschreibt ebenfalls eine immunogene Zusammensetzung,
umfassend eine Mischung von Pertaktinen von Bordetella-Spezies,
wobei die Zusammensetzung umfasst: (a) Pertaktin von Bordetella parapertussis,
und (b) Pertaktin von Bordetella bronchiseptica, in ausreichenden
Mengen zum Induzieren einer humoralen oder zellulären Immunantwort
gegen Bordetella parapertussis und Bordetella bronchiseptica in
einem Tier, an welches die immunogene Zusammensetzung verabreicht
wird, sowie eine immunogene Zusammensetzung der Erfindung, welche
eine Mischung von Pertaktinen von Bordetella-Spezies oder Fragmente
davon umfasst. Im Genaueren umfasst, in der Mischung der Erfindung,
jede Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Variante 6, 7, 8 oder 9
sich wiederholende PQP-Aminosäuresequenzen
in der Region II davon. Die Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten
sind in ausreichenden Mengen vorhanden, um eine humorale oder zelluläre Immunantwort
gegen Bordetella bronchiseptica in einem Tier zu induzieren, an
welches die immunogene Zusammensetzung verabreicht wird. Diese immunogene
Zusammensetzung kann auch Pertaktine von Bor detella parapertussis,
Bordetella pertussis oder Mischungen davon, in ausreichenden Mengen
zum Induzieren einer humoralen oder zellulären Immunantwort gegen Bordetella
parapertussis oder Bordetella pertussis in einem Tier, an welches
die immunogene Zusammensetzung verabreicht wird, umfassen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung, in der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung,
umfasst jede Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Variante 1, 2 oder
3 sich wiederholende GGXXP-Aminosäuresequenzen in der Region
I davon. Die Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten sind in ausreichenden
Mengen vorhanden, um eine humorale oder zelluläre Immunantwort gegen Bordetella
bronchiseptica in einem Tier zu induzieren, an welches die immunogene
Zusammensetzung verabreicht wird. Diese immunogene Zusammensetzung
kann auch Pertaktin von Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis
oder Mischungen davon in ausreichenden Mengen umfassen, um eine
humorale oder zelluläre
Immunantwort gegen Bordetella parapertussis oder Bordetella pertussis
in einem Tier zu induzieren, an welches die immunogene Zusammensetzung
verabreicht wird.
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Die
Zusammensetzungen, wie in der Patentanmeldung beschrieben, können eine
Mischung von Fragmenten der Pertaktin von Bordetella-Spezies umfassen.
Die immunogenen Zusammensetzungen können auch mindestens ein Polypeptid
der Erfindung in einer ausreichenden Menge, um eine immunogene oder schützende Antwort
in vivo zu induzieren, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür umfassen. Darüber hinaus
kann die immunogene Zusammensetzung eine neutralisierende Menge
von mindestens einem Polypeptid der Erfindung umfassen.
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Eine
in der Patentanmeldung offenbarte immunogene Zusammensetzung umfasst
eine Mischung von Pertaktinen von Bordetella bronchiseptica-Spezies
oder Fragmenten davon, wobei die Pertaktine oder Fragmente davon
eine Mischung von Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten
umfassen, in welcher mindestens eine der Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten
die Region II von Pertaktin von Bordetella bronchiseptica mit 6,
7, 8 oder 9 sich wiederholenden PQP-Aminosäuresequenzen in der Region
II davon umfasst, und mindestens eine andere der Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten
die Region I von Pertaktin von Bordetella bronchiseptica mit 1,
2 oder 3 sich wiederholenden GGXXP-Aminosäuresequenzen in der Region
I davon umfasst.
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Eine
in der Patentanmeldung beschriebene immunogene Zusammensetzung besteht
im Wesentlichen aus (A) einem Polypeptid, umfassend die Region I
und Region II, oder einem Polypeptid, umfassend die Region I, und
einem Polypeptid, umfassend die Region II, eines Pertaktins von
Bordetella pertussis; (B) einem Polypeptid, umfassend die Region
I und Region II, oder einem Polypeptid, umfassend die Region I,
und einem Polypeptid, umfassend die Region II, eines Pertaktins
von Bordetella parapertussis; (C) einem Polypeptid, umfassend die
Region I und Region II, oder einem Polypeptid, umfassend die Region
I, und einem Polypeptid, umfassend die Region II, eines Pertaktins
des Bordetella bronchiseptica-Stamms 9.73, und einem Polypeptid, umfassend
die Region I und Region II, oder einem Polypeptid, umfassend die
Region I, und einem Polypeptid, umfassend die Region II, eines Pertaktins
von Bordetella bronchiseptica des Stamms SEI.
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Polynukleotide
werden offenbart, codierend die Proteine und Polypeptide der Erfindung,
sowie Antikörper,
welche die Proteine und Polypeptide erkennen. Ebenfalls offenbart
wird ein DNA-Chip,
wobei der Chip mindestens ein Polynukleotid, wie hierin offenbart,
oder ein Fragment davon, oder einen Mikroarray, umfassend Mikrokügelchen,
wobei die Mikrokügelchen
jeweils mehrere Kopien eines Polynukleotids, wie hierin offenbart,
oder ein Fragment davon tragen und wobei das Polynukleotid oder
Fragment davon von einem Kügelchen
zu einem anderen unterschiedlich ist, umfasst.
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Die
Antikörper
können
monoklonale oder polyklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können zur
Behandlung von Bordetella-Infektionen verwendet werden. Ebenfalls
vorgesehen sind immunologische Komplexe, umfassend ein Protein oder
Polypeptid der Erfindung und einen Antikörper, welcher das Protein oder
Polypeptid spezifisch erkennt.
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Ferner
offenbart die Patentanmeldung ein Verfahren zum Nachweisen einer
Infektion durch Bordetella. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen
einer Zusammensetzung, umfassend ein biologisches Material, welches
im Verdacht steht, mit Bordetella infiziert zu sein, und den Assay
hinsichtlich des Vorhandenseins eines Proteins oder Polypeptids,
wie hierin offenbart. Das Polypeptid kann zum Beispiel durch Elektrophorese oder
durch Immunoassay mit Antikörpern,
welche mit dem Polypeptid immunologisch reaktiv sind, geassayt werden.
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Das
Verfahren kann ebenfalls das Kontaktieren des Antigens mit einem
biologischen Fluid während einer
Zeit und unter Bedingungen, welche ausreichen, damit das Antigen
und Antikörper
in dem biologischen Fluid einen Antigen-Antikörper-Komplex bilden, und das
Detektieren der Bildung des Komplexes umfassen. Das Verfahren kann
gegebenenfalls das Messen der Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes
einschließen. In
bevorzugten Ausführungsformen
wird die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplex durch auf der
Western-Blot-Technik basierendem Immunoassay, ELISA, indirekten
Immunfluoreszenzassay oder Immunpräzipitationsassay nachgewiesen.
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Weiterhin
beschreibt die Patentanmeldung ein diagnostisches Kit zum Nachweis
der Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörpern, welche ein Protein oder
Polypeptid der Erfindung, oder Mischungen davon, binden. Das Kit
kann ein Antigen, welches das Protein oder Polypeptid oder Mischungen
der Proteine und Polypeptide umfasst, sowie Mittel zum Nachweisen
der Bildung von Immunkomplexen zwischen dem Antigen und Antikörpern umfassen.
Die Mittel sind in einer ausreichenden Menge zum Durchführen des
Nachweises vorhanden.
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Ein
anderes Verfahren [der Erfindung] zum Nachweisen der Gegenwart oder
Abwesenheit von Bordetella umfasst (1) In-Kontakt-Bringen einer
Probe, welche im Verdacht steht, genetisches Material von Bordetella
zu enthalten, mit mindestens einer Nukleotidsonde, und (2) Nachweisen
einer Hybridisierung zwischen der Nukleotidsonde und dem genetischen
Material in der Probe. Die Nukleotidsonde ist komplementär zu einer Polynukleotidsequenz,
wie hierin beschrieben.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Diese
Erfindung wird in größerer Ausführlichkeit
unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben, in welchen:
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1a eine
Karte der zwei Regionen mit Wiederholungen, Region I und Region
II, im Pertaktin-Außenmembranprotein
von Bordetella bronchiseptica ist.
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1b ein
Alignment der Region I des Pertaktin-Außenmembranproteins von unterschiedlichen Stämmen von
B. bronchiseptica ist.
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1c ein
Alignment der Region II des Pertaktin-Außenmembranproteins von unterschiedlichen Stämmen von
B. bronchiseptica ist.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Es
ist früher
aufgezeigt worden, dass speziesspezifische Vertreter der Pertaktin-Familie
Außenmembranproteine
(OMPs) sind. In B. bronchiseptica ist Pertaktin das Produkt des
prn-Gens und wird als ein Protein mit einem Mr von
68 kDa (P.68), in B. pertussis als ein Protein mit einem Mr von 69 kDa (P.69), und in B. parapertussis
als ein Protein mit einem Mr von 70 kDa
(P.70) repräsentiert.
Die Nukleotidsequenzen der Pertaktine von diesen drei Spezies sind
in der begleitenden Sequenzauflistung als SEQ ID Nr.: 1, SEQ ID
Nr.: 2 bzw. SEQ ID Nr.: 3 eingeschlossen. Die von diesen Nukleotidsequenzen
codierten, entsprechenden Aminosäuresequenzen
sind in der Sequenzauflistung als SEQ ID Nr.: 4, SEQ ID Nr.: 5 bzw.
SEQ ID Nr.: 6 eingeschlossen.
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Ein
Vergleich der abgeleiteten Proteinsequenzen für die Proteine P.68, P.69 und
P.70 zeigt den hohen Grad an Homologie zwischen den Proteinen. Ein
Vergleich zwischen den Proteinen P.68 und P.70 zeigt lediglich 17
Aminosäureunterscheide,
während
ein ähnlicher
Vergleich zwischen P.68 und P.69 80 Unterschiede zeigt, und 79 Unterschiede
zwischen P.69 und P.70 zeigt. Die Mehrheit der Aminosäureunterscheide
zwischen den drei abgeleiteten Proteinsequenzen tritt in der Anzahl
von Wiederholungseinheiten in den zwei Familien von Wiederholungssequenzen
auf, welche in allen drei Proteinen vorhanden sind. P.68 besitzt
drei Kopien der Gly-Gly-Xaa-Xaa-Pro-Wiederholung
(d. h. GGXXP in 1b), während P.70 vier und P.69 fünf besitzt.
In ähnli cher
Weise besitzt P.68 sieben Pro-Gin-Pro-Wiederholungen (d. h. PQP
in 1c), P.70 besitzt neun und P.69 besitzt fünf.
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Es
ist kürzlich
gezeigt worden, dass das von klinischen Isolaten von B. pertussis
hergestellte PRN variiert. Sequenzen des prn-Gens von verschiedenen
klinischen Isolaten enthüllten
drei Haupttypen der PRN-Variante. Es ist vorgeschlagen worden, dass
die Epidemie in den Niederlanden aus Änderungen in den Sequenzen
der Gene, welche PRN und PT codieren, resultiert, weil die in den
derzeitig im Umlauf befindlichen klinischen Isolaten vorhandenen
Proteine sich hinsichtlich der Sequenz von denjenigen unterscheiden,
welche bei den Impfstämmen
beobachtet werden, die in diesem Land verwendet werden.
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Ein
Ziel der Untersuchungen, welche zur vorliegenden Erfindung führten, bestand
darin, zu analysieren, ob der in B. pertussis-Spezies beobachtete
PRN-Polymorphismus auch in B. parapertussis und B. bronchiseptica
auftritt. Die zwei wiederholten Regionen der prn-Gene von 10 B.
parapertussis-Isolaten menschlichen Ursprungs und von 40 B. bronihiseptica-Isolaten
von tierischem oder menschlichem Ursprung wurden sequenziert und
verglichen (1a).
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Die
Tabelle I enthält
eine Liste der Isolate und entsprechenden Pertaktin-Typen, welche
in dieser Erfindung verwendet wurden. TABELLE I
| Bordetella-Spezies | Repräsentatives
Isolat | Typen
der PRN-Regionen
I und II/Anzahl d. Isolate | Zugangsnummer*,
Region I, Region II |
| BB | 9.73H+ | I-1,
II-3/3 | AJ250076,
AJ250077 |
| BB | LAPR | I-2,
II-3/8 | AJ250078,
AJ250079 |
| BB | 5 | I-2,
II-4/8 | AJ250080,
AJ250081 |
| BB | 335 | I-2,
II-1/3 | AJ250082,
AJ250083 |
| BB | CVGEO | I-2,
II-5/6 | AJ250084,
AJ250085 |
| BB | BBCH | I-2,
II-6/4 | AJ250086,
AJ250087 |
| BB | DEL | I-1,
II-2/5 | AJ250088,
AJ25089 |
| BB | CAT1 | I-1,
II-7/1 | AJ250090,
AJ250091 |
| BB | 286 | I-3,
II-8/1 | AJ250093,
AJ250092 |
| BB | SEI | I-3,
II-9/1 | AJ250094,
AJ250095 |
| BPP | 63.2 | I-1,
II-2/10 | Identisch
zu P24328 |
| |
| |
| Spezies | Stamm | PRN-Typ | Zugangsnummer |
| BPP | CN2591 | I-1,
II-2 | P24328 |
| BB | CN7531 | I-2,
II-4 | Q03035 |
| |
| Bordetella-Spezies | Repräsentatives
Isolat | Typen
der PRN-Regionen
I und II/Anzahl d. Isolate | Zugangsnummer*,
Region I, Region II |
| Spezies | Stamm
oder Isolat | Allelischer
prn-Typ | Zugangsnummer |
| BP | Tohama | prnl | AJ006158 |
| BP | 18323 | prn6 | AJ006152 |
| BP | Hav | prn2 | AJ007361 |
| BP | Fr287 | prn3 | AJ006156 |
- BB: B. bronchiseptica, BP: B. pertussis;
BPP: B. parapertussis
- * EMBL-Bank.
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Bei
der Ausführung
dieser Erfindung wurde DNA extrahiert, mittels PCR amplifiziert
und sequenziert, wie früher
beschrieben (3). Ampflizierte PCR-Produkte wurden von der Firma
ESGS (ESGS, Cybergene group, Evry, Frankreich) gereinigt und sequenziert.
Abgeleitete Aminosäuresequenzen
wurden mit der Software GCG (Wisconsin Package, Version 9.1, Genetics
Computer Group, Madison, WI, USA) analysiert. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen
der Regionen I und II wurden verglichen, und Mehrfach-Alignments
der Aminosäuresequenzen
wurden mit dem Programm CLUSTAL W von GCG (10) für jede Region erstellt (1b,
c).
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Es
wurde kein Unterschied zwischen den Sequenzen der Regionen I und
II des PRN, welches von den 10 B. parapertussis-Isolaten produziert
wird, und der veröffentlichten
Sequenz (15) festgestellt. Allerdings wurden drei verschiedene Typen
unter den 40 B. bronchiseptica-prn-Genen gefunden, bei welchen Unterschiede in
der Anzahl von Wiederholungen (1 bis 3) in der Region I analysiert
wurden (1b). Die größte Gruppe entsprach Sequenzen
mit drei Kopien der wiederholten Sequenz, was identisch zu der früher berichteten
Sequenz (14) ist. Es wurde keine Korrelation zwischen dem Muster
der Variation und der Herkunft des Isolats festgestellt.
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Ein
höheres
Ausmaß an
Variabilität
wurde in der zweiten wiederholten Region des B. bronchiseptica-PRN
beobachtet (1c). Es wurden neun Varianten
beobachtet. Unter diesen neun Varianten beläuft sich die Anzahl an Wiederholungen
auf 6 bis 9.
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Keine
der B. bronchiseptica-Varianten zeigte das gleiche Muster wie die
B. pertussis-Varianten. Darüber
hinaus wurde keine einzigartige Assoziation zwischen einem Typ an
Region I und einem Typ an Region II beobachtet. Es wurde in keiner
der drei Spezies das Auftreten eines Musters beobachtet, welches ähnlich zu denjenigen
des 18323-Stamms und des CZ-Isolats (3) ist, die als intermediär zwischen
B. pertussis, B. bronchiseptica und parapertussis angesehen werden.
Diese Daten sind konsistent damit, dass die prn-Gene von B. parapertussis
und B. bronchiseptica zueinander ähnlicher sind als zum prn-Gen
von B. pertussis (1). Es wurde in Hinsicht auf den PRN-Typ keine
Wirtsspezifität
beobachtet.
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Es
ist gezeigt worden, dass die Region II eine wichtige Rolle bei der
Induktion einer schutzgebenden Immunität spielt (6). Das Fehlen von
Kreuzschutz zwischen PRN aus B. pertussis, B. parapertussis und
B. bronchiseptica-PRN ist konsistent hiermit, weil die Hauptunterschiede
zwischen diesen Proteinen in dieser Region auftreten. Es wurde keine
Variation in dieser Region für
das PRN, welches von B. pertussis-Isolaten hergestellt wurde, beobachtet.
Diese Daten legen nahe, dass dreißig Jahre Impfung eine Variation
in einer immundominanten Wiederholungs-Region induziert haben können, aber
nicht in der Region, welche an der Induktion von schutzgebender
Immunität
am stärksten
beteiligt ist. Die Variation in der B. pertussis-PRN-Region II kann auf
eine Verringerung in der B. pertussis-Impfstoffeffektivität hindeuten.
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Im
Gegensatz dazu zeigte die Analyse des PRN von B. bronchiseptica
einen Polymorphismus in beiden Regionen. Dies kann für das Unvermögen von
B. bronchiseptica-Impfstoffen verantwortlich sein, einen lang anhaltenden
Schutz zu induzieren. Dieser Polymorphismus kann auch mit dem Vermögen von
B. bronchiseptica gekoppelt sein, chronische Infektionen auszulösen (7,
8, 22). Er kann einen Weg für
dieses Bakterium bereitstellen, Wirtsimmunantworten zu entgehen.
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Die
Erfindung, welche aus diesen Experimenten und Beobachtungen resultierte,
beinhaltet daher Zusammensetzungen, welche bestimmte Bordetella-Pertaktine
und Fragmente davon enthalten. Diese Pertaktine und Pertaktin-Fragmente
wie auch die Polynukleotide, welche diese codieren, sind in immunogenen
Zusammensetzungen und in diagnostischen Anwendungen nützlich.
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Im
Besonderen ist diese Erfindung das Ergebnis der Feststellung, dass
es verschiedene Spezies des Volllängen-Pertaktins von Bordetella
bronchiseptica gibt, nämlich
Spezies, welche 6, 7, 8 oder 9 sich wiederholende PQP-Aminosäuresequenzen
in der Region II davon enthalten, und Spezies von Volllängen-Pertaktin von
B. bronchiseptica, welche 1, 2 oder 3 sich wiederholende GGXXP-Aminosäuresequenzen
in der Region I davon enthalten, wobei XX für FD, FG oder AV stehen kann.
Diese Volllängen-Pertaktine
und Mischungen dieser Pertaktine in jedweder Kombination der sich
wiederholenden Sequenzen werden daher von dieser Erfindung bereitgestellt.
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Wie
hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "Pertaktin von Bordetella bronchiseptica" ein Außenmembranprotein
von Bordetella bronchiseptica, welches ein Virulenzfaktor ist und
welches ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 68 kDa besitzt
und welches die zwei Regionen von Bordetella bronchiseptica-Pertaktin
enthält,
die als Region I und Region II bekannt sind. Die Region I und Region
II der Pertaktine von verschiedenen Bordetella-Stämmen werden
in Klammern in SEQ ID Nr.: 1 bis 6 identifiziert. Es versteht sich,
dass die Pertaktine von verschiedenen Isolaten von Bordetella bronchiseptica
Aminosäuresequenzen
besitzen können,
welche sich, beispielsweise in der Region I, Region II oder sowohl
Region I als auch Region II, sowie in anderen Regionen, voneinander
unterscheiden.
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Wie
hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten" Pertaktine von Bordetella
bronchiseptica oder Fragmente von Pertaktinen von Bordetella bronchiseptica,
welche wenigstens die Region I, die Region II oder sowohl die Region
I als auch Region II enthalten, wobei die Pertaktine von Bordetella
bronchiseptica oder die Fragmente davon sich wenigstens in Region
I, Region II oder sowohl Region I als auch Region II in ihren jeweiligen
Aminosäuresequenzen
voneinander unterscheiden. Die nachfolgenden einmaligen Bordetella
bronchiseptica-Pertaktin-Varianten sind ermittelt worden.
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Wie
hierin verwendet, beziehen sich die Ausdrücke "Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Fragmente", "Bordetella parapertussis-Pertaktin-Fragmente" und "Bordetella pertussis-Pertaktin-Fragmente" auf Polypeptide,
welche Bereiche von Volllängen-Pertaktinproteinen
sind und welche in der Lage sind, eine humorale oder zelluläre Immunantwort
gegen Bordetella-Infektionen
zu induzieren.
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In
spezifischen Ausführungsformen
umfasst das in der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung enthaltene
Polypeptid eine Sequenz, ausgewählt
aus der Gruppe, welche aus SEQ ID Nr.: 7, SEQ ID Nr.: 8, SEQ ID
Nr.: 9, SEQ ID Nr.: 14, SEQ ID Nr.: 15, SEQ ID Nr.: 16, SEQ ID Nr.:
17, SEQ ID Nr.: 18, SEQ ID Nr.: 19, SEQ ID Nr.: 20, SEQ ID Nr.:
21 oder SEQ ID Nr.: 22 besteht. Das Polypeptid kann aus den Aminosäuren in
SEQ ID Nr.: 7, SEQ ID Nr.: 8, SEQ ID Nr.: 9, SEQ ID Nr.: 14, SEQ
ID Nr.: 15, SEQ ID Nr.: 16, SEQ ID Nr.: 17, SEQ ID Nr.: 18, SEQ
ID Nr.: 19, SEQ ID Nr.: 20, SEQ ID Nr.: 21 oder SEQ ID Nr.: 22 oder
Fragmenten davon bestehen. Die Patentanmeldung offenbart Polynukleotide,
welche eines dieser Polypeptide codieren, und eine gereinigte DNA-
oder RNA-Sequenz, welche unter mäßigen oder
hohen Stringenzbedingungen an die Polynukleotide oder wenigstens
an 15 Nukleotide davon hybridisiert.
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Wie
hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "Mischung von Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten" zwei oder mehr Bordetella
bronchiseptica-Pertaktin-Varianten in Vermischung in fester, flüssiger, Emulsions-
oder Suspensionsform. Mindestens zwei der Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten
in der Mischung werden sich selbstverständlich voneinander in wenigstens
der Region I, Region II oder sowohl Region I als auch Region II
in ihren jeweiligen Aminosäuresequenzen
unterscheiden.
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Es
wird unmittelbar offensichtlich sein, dass die Patentanmeldung Polypeptidfragmente
des Pertaktins von B. bronchiseptica offenbart, wobei die Fragmente
6, 7, 8 oder 9 sich wiederholende PQP-Aminosäuresequenzen in der Region
II davon oder 1, 2 oder 3 sich wiederholende GGXXP-Aminosäuresequenzen
in der Region I davon umfassen. Mischungen dieser Polypeptidfragmente
in jedweder Kombination der sich wiederholenden Sequenzen liegen
ebenfalls innerhalb des Umfangs dieser Erfindung.
-
Wenn
ein Polypeptidfragment nur die Region I eines Pertaktins von B.
bronchiseptica umfasst, enthält das
Polypeptidfragment typischerweise mindestens etwa 46 bis etwa 56
Aminosäuren,
was die Region I-Wiederholungssequenzen einschließt. Wenn
das Polypeptidfragment der Erfindung nur die Region II umfasst,
enthält
das Polypeptidfragment typischerweise mindestens etwa 48 bis etwa
60 Aminosäuren,
was die Region II-Wiederholungssequenzen einschließt. Wenn
das Polypeptidfragment der Erfindung sowohl die Region I als auch
die Region II von B. bronchiseptica umfasst, enthält das Fragment
typischerweise mindestens etwa 906 bis etwa 928 Aminosäuren, was
die Wiederholungssequenzen der Regionen I und II einschließt.
-
Somit
stellt diese Erfindung, in einer veranschaulichenden Ausführungsform,
eine Zusammensetzung bereit, umfassend eine Mischung von Bordetella
bronchiseptica-Pertaktin-Varianten, wobei jede Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Variante
die Region II von Pertaktin von Bordetella bronchiseptica umfasst,
und wobei ferner jede Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Variante
6, 7, 8 oder 9 sich wiederholende PQP-Aminosäuresequenzen in der Region
II davon umfasst, und die Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten
sich hinsichtlich der Anzahl der sich wiederholenden PQP-Aminosäuresequenzen,
die darin enthalten sind, unterscheiden. Die Zusammensetzung kann
auch Pertaktine von Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis oder
Mischungen davon umfassen. Bei dem Polypeptid kann es sich um ein
Volllängen-Pertaktin
oder ein Fragment davon handeln.
-
In
einer anderen Ausführungsform
offenbart diese Anmeldung eine Zusammensetzung, umfassend eine Mischung
von Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten, wobei jede Bordetella
bronchiseptica-Pertaktin-Variante die Region I eines Pertaktins
von Bordetella bronchiseptica umfasst, und wobei ferner jede Bordetella
bronchiseptica-Pertaktin-Variante 1, 2 oder 3 sich wiederholende
GGXXP-Aminosäuresequenzen
in der Region I davon umfasst, und sich die mindestens zwei der
Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten hinsichtlich der Anzahl
der sich wiederholenden GGXXP-Aminosäuresequenzen, welche darin
enthalten sind, unterscheiden. Diese Zusammensetzung kann ebenfalls
Pertaktine von Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis oder
Mischungen davon umfassen. Bei den Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten kann es sich
um eine Volllängen-Form
oder ein Fragment handeln.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
offenbart die Anmeldung eine Zusammensetzung, umfassend eine Mischung
von Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten, wobei eine der
Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten die Region II von
Pertaktin von Bordetella bronchiseptica mit 6, 7, 8 oder 9 sich
wiederholenden PQP-Aminosäuresequenzen
in der Region II davon umfasst, und eine andere der Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten
die Region I von Pertaktin von Bordetella bronchiseptica mit 1,
2 oder 3 sich wiederholenden GGXXP-Aminosäuresquenzen in der Region I
davon umfasst. Diese Zusammensetzung kann auch Pertaktine von Bordetella
parapertussis, Bordetella pertussis oder Mischungen davon umfassen.
Die Bordetella bronchiseptica-Pertaktin-Varianten können die
Volllängen-Form
oder ein Fragment sein.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das in der Zusammensetzung der Erfindung enthaltene Polypeptid
eine Sequenz, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus SEQ ID Nr.:
7, SEQ ID Nr.: 8 oder SEQ ID Nr.: 9 besteht.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
umfasst das in der Zusammensetzung der Erfindung enthaltene Polypeptid
eine Sequenz, welche aus der Gruppe gewählt wird, die aus SEQ ID Nr.:
14, SEQ ID Nr.: 15, SEQ ID Nr.: 16, SEQ ID Nr.: 17, SEQ ID Nr.:
18, SEQ ID Nr.: 19, SEQ ID Nr.: 20, SEQ ID Nr.: 21 oder SEQ ID Nr.:
22 besteht.
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Die
Zusammensetzungen gemäß der Erfindung
verursachen eine humorale Immunantwort und eine zelluläre Immunantwort.
Nach einer Infektion mit B. bronchiseptica besteht eine Induktion
einer humoralen Immunität
und einer zellulären
Immunität,
wie im Fall einer B. pertussis- und B. parapertussis-Infektion.
Darüber hinaus
besteht, nach Impfen mit Zusammensetzungen dieser Erfindung, eine
Induzierung einer Immunität
vom humoralen und zellulären
Typ, ähnlich
zu derjenigen, welche mach einer Infektion oder Reinfektion induziert wird.
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird eine Vakzinierungs-Zusammensetzung bereitgestellt, welche
als Wirkstoff eine immunogene Zusammensetzung der Erfindung umfasst,
in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel, und,
falls angemessen, mit einem Adjuvans.
-
Wie
die derzeitig auf dem Markt erhältlichen
Keuchhusten-Impfstoffe, kann die immunogene Zusammensetzung gemäß der Erfindung
mit anderen Vakzinierungs-Wirkstoffen kombiniert werden, zum Beispiel denjenigen
des Impfstoffs gegen Diphtherie, Polio oder Erkrankungen, welche
durch Haemophilus verursacht werden, oder, allgemein gesprochen,
mit jedwedem immunogenen Bestandteil, zum Beispiel einem jeweiligen inaktivierten
pathogenen Agens oder Toxin.
-
Eine
Vakzinierungs-Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann speziesspezifisch
und folglich zur Induzierung eines Schutzes gegen B. pertussis oder
B. parapertussis oder B. bronchiseptica in der Lage sein. Alternativ
dazu kann sie eine Mischung sein, welche als Wirkstoff eine immunogene
Zusammensetzung gegen B. bronchiseptica, wie oben definiert, und
eine immunogene Zusammensetzung gegen B. parapertussis und/oder
B. pertussis umfasst.
-
Als
ein Ergebnis von neueren Techniken in der Molekularbiologie sind
eine Reihe von Faktoren, welche an der Virulenz von B. pertussis
beteiligt sind, charakterisiert worden, und die Regulierung ihrer
Expression wurde verstanden. Diese Faktoren können in zwei Kategorien klassifiziert
werden, nämlich
diejenigen, welche an dem infektiösen Syndrom beteiligt sind
(Adhäsine),
und diejenigen, welche eine Rolle in dem Toxin-induzierten Syndrom
spielen (Toxine). Die Adhäsine
und Toxine, welche Bordetella betreffen, können in den Zusammensetzungen
dieser Erfindung eingeschlossen werden. Beispiele für die Adhäsine sind:
filamentöses Hämagglutinin
oder FHA, von welchem angenommen wird, eine wichtige Rolle bei der
Adhäsion des
Bakteriums an das bewimperte Epithel zu spielen;
die zwei Agglutinogene
oder AGGs von B. pertussis, welche ermöglichen, dass Stämme in Serotypen
klassifiziert werden können;
und
Pertussis-Toxin oder PTX, ein sezerniertes Toxin vom Typ
A-B, welches, neben seinen cytopathogenen Effekten, an der Adhäsion über seine
B-Untereinheit beteiligt ist.
-
Beispiele
der Toxine zur Verwendung in der Erfindung sind die Folgenden:
Pertussis-Toxin
oder PTX, welches sezerniert wird;
dermonekrotisches Toxin
oder DNT, dessen Funktion noch nicht gut charakterisiert worden
ist, und tracheales Cytotoxin oder TCT, ein sezerniertes kleines
Glykoprotein der Muramylpeptidfamilie, abgeleitet aus dem Peptidoglykan
des Bakteriums, welche im Zusammenspiel zur Zerstörung der
bewimperten Zellen des Wirts-Atmungsapparats zu wirken scheinen;
Adenylatcyclase-Hämolysin
oder Ac-Hly, ein bifunktionelles Protein, welches Adenylatcyclaseaktivität und hämolytische
Aktivität
besitzt, von welchem festgestellt wurde, der Familie von Toxinen
anzugehören,
welche als "RTX", für "Repetitionen in Toxinen", bezeichnet wird.
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In ähnlicher
Weise sind die Faktoren, welche an der Virulenz von B. parapertussis
und B. bronchiseptica beteiligt sind, identifiziert worden und können in
die Zusammensetzungen der Erfindung eingeschlossen werden.
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Die
veröffentlichten
Ergebnisse zeigen, dass die getesteten, einwertigen (PTX), zweiwertigen
(PTX, FHA), dreiwertigen (PTX, FHA, PRN) oder fünfwertigen (PTX, FHA, PRN,
AGG2, AGG3) azellulären
Impfstoffe sehr wenig Nebenwirkungen induzieren, sämtlich immunogen
sind und alle eine Wirksamkeit gegen die Krankheit (gemäß der WHO-Definition)
aufweisen, welche größer oder
gleich als 70% ist. Die Zusammensetzungen der Erfindung können in
diese Impfstoffe oder andere azelluläre Impfstoffe eingeschlossen
werden. Zum Beispiel kann die immunogene Zusammensetzung ferner
mindestens ein Adhäsin
von Bordetella, das aus der Gruppe, bestehend aus FHA, AGG2, AGG3,
gewählt
ist, und/oder mindestens ein Toxin von Bordetella, das aus der Gruppe,
bestehend aus PTX, DNT, TCT und Ac-Hly, gewählt ist, umfassen.
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Die
Proteine und Polypeptide der Zusammensetzungen dieser Erfindung
können
in gereinigter Form vorliegen. Der Begriff "gereinigt", wie hierin verwendet, bedeutet, dass
die Pertaktine und Fragmente davon im Wesentlichen frei von einer
Assoziierung mit anderen Proteinen oder Polypeptiden sind, zum Beispiel
als ein Aufreinigungsprodukt einer rekombinanten Wirtszellkultur
oder als ein gereinigtes Produkt aus einer nicht-rekombinanten Quelle.
Der Begriff "im
wesentlichen gereinigt",
wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Mischung, welche Pertaktine
oder Fragmente davon enthält
und im wesentlichen frei von einer Assoziation mit anderen Proteinen
oder Polypeptiden ist, außer
hinsichtlich der Gegenwart von bekannten Proteinen, welche unter
Verwendung eines spezifischen Antikörpers entfernt werden können, und
wobei im wesentlichen gereinigte Pertaktin-Polypeptide als Antigene
verwendet werden können.
-
Innerhalb
eines Aspekts der Patentanmeldung können das Pertaktin und Fragmente
davon verwendet werden, um Antikörper
herzustellen, welche spezifisch an Pertaktin-Polypeptide binden.
Der Begriff "Antikörper" schließt beabsichtigtermaßen polyklonale
Antikörper,
monoklonale Antikörper,
Fragmente davon, wie F(ab')2-
und Fab-Fragmente, sowie jegliche rekombinant hergestellten Bindungspartner
ein. Antikörper
werden als spezifisch bindend definiert, wenn sie Pertaktine und
Fragmente davon mit einem Ka größer als
oder gleich zu etwa 107 M–1 binden.
Affinitäten
von Bindungspartnern oder Antikörpern
können
leicht unter Anwendung herkömmlicher
Techniken bestimmt werden, zum Beispiel denjenigen, welche von Scatchard
et al., Ann. N. Y. Acad Sci., 51: 660 (1949), beschrieben wurden.
Polyklonale Antikörper
können
ohne weiteres aus einer Vielzahl von Quellen erzeugt werden, zum
Beispiel Pferden, Kühen,
Ziegen, Schafen, Hunden, Hühnern,
Kaninchen, Mäusen
oder Ratten, wobei Vorgehensweisen angewandt werden, die im Fachgebiet
allgemein bekannt sind.
-
Die
Patentanmeldung offenbart ferner isolierte Fragmente und Oligonukleotide,
welche von der Nukleotidsequenz der Pertaktine von B. bronchiseptica,
B. pertussis und B. parapertussis (SEQ ID Nr.: 1, SEQ ID Nr.: 2
und SEQ ID Nr.: 3) abgeleitet sind, codierend 6, 7, 8 oder 9 sich
wiederholende PQP-Aminosäuresequenzen
in der Region II davon und/oder 1, 2 oder 3 sich wiederholende GGXXP-Aminosäuresequenzen
in der Region I davon. Die Anmeldung offenbart ebenfalls von diesen
Fragmenten und Oligonukleotiden codierte Polypeptide. Mischungen
können
Nukleotidsequenzen umfassen, enthaltend sich wiederholende Sequenzen, in
welchen jede Einheit in der Mischung unabhängig aus den Polynukleotiden
gewählt
ist, die in der Patentanmeldung offenbart sind.
-
Nukleinsäuresequenzen
[innerhalb des Umfangs der Erfindung] schließen isolierte DNA- und RNA-Sequenzen
ein, welche an die hierin offenbarten nativen Pertaktin-Nukleinsäuren unter
Bedingungen mäßiger oder
strenger Stringenz hybridisieren, und welche Pertaktin-Polypeptide
codieren. Wie hierin verwendet, schließen Bedingungen von mäßiger Stringenz,
wie dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt, und wie definiert
von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.
Ausgabe, Band 1, S. 1.101–104,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), die Verwendung einer
Vorwaschlösung
für die
Nitrozellulosefilter, 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), Hybridisierungsbedingungen
von 50% Formamid, 6X SSC bei 42°C
(oder eine andere ähnliche
Hybridisierungslösung,
wie Stark'sche Lösung, in
50% Formamid bei 42°C),
und Waschbedingungen von etwa 60°C,
0,5X SSC, 0,1% SDS, ein. Bedingungen von hoher Stringenz werden
als Hybridisierungsbedingungen, wie oben, und bei Waschen bei 68°C, 0,2X SSC,
0,1% SDS, definiert. Der Fachmann wird erkennen, dass die Temperatur
und dass die Waschlösungs-Salzkonzentration wie
notwendig gemäß Faktoren,
wie der Länge
der Sonde, angepasst werden können.
-
Auf
Grund der bekannten Degeneriertheit des genetischen Codes, in welchem
mehr als ein Codon die gleiche Aminosäure codieren kann, kann eine
DNA-Sequenz variieren und immer noch ein Pertaktin-Polypeptid mit
der Aminosäuresequenz
von SEQ ID Nr.: 7 bis SEQ ID Nr.: 24 codieren. Solche varianten
DNA-Sequenzen können
aus stillen Mutationen (welche z. B. während einer PCR-Amplifikation
auftreten) resultieren oder können
das Produkt einer absichtlichen Mutagenese einer nativen Sequenz
sein.
-
Die
Anmeldung beschreibt äquivalente
isolierte, Pertaktin-Polypeptide codierende DNA-Sequenzen, die ausgewählt werden
aus: (a) DNA, abgeleitet aus der codierenden Region eines nativen
Pertaktin-Gens; (b) cDNA, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ
ID Nr.: 7 bis SEQ ID Nr.: 24; (c) DNA, welche zur Hybridisierung
an eine DNA von (a) unter Bedingungen mäßiger Stringenz in der Lage
ist, und welche Pertaktin-Polypeptide codiert; und (d) DNA, welche
als Ergebnis des genetischen Codes hinsichtlich einer in (a), (b)
oder (c) definierten DNA degeneriert ist und welche Pertaktin-Polypeptide
codiert. Von derartigen äquivalenten DNA-Sequenzen codierte
Pertaktin-Polypeptide werden ebenfalls offenbart.
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Es
versteht sich, dass die vorliegende Patentanmeldung die zuvor beschriebenen
Proteine und Polypeptide in isolierter oder gereinigter Form offenbart,
ungeachtet dessen, ob sie unter Anwendung der hierin beschriebenen
Techniken oder anderer Verfahren erhalten werden. In einer bevorzugten
Ausführungsform sind
die Pertaktin-Polypeptide im wesentlichen frei von menschlichem
oder sonstigem tierischen Gewebe und menschlichen oder sonstigen
tierischen Gewebekomponenten, Nukleinsäuren, fremden Proteinen und
Lipiden und verunreinigenden Mikroorganismen, wie Bakterien und
Viren. Es versteht sich ebenfalls, dass äquivalente Proteine mit im
wesentlichen den gleichen biologischen und immunogenen Eigenschaften
ebenfalls beschrieben werden. Daher beschreibt diese Patentanmeldung
serotypische Varianten der Polypeptide, wie hierin offenbart.
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Abhängig von
der Anwendung, für
welche die Pertaktin-Polypeptiden gedacht sind, kann es wünschenswert
sein, diese zu markieren. Beispiele für geeignete Markierungen sind
radioaktive Markierungen, enzymatische Markierungen, fluoreszierende
Markierungen, chemolumineszente Markierungen und Chromophore. Die
Verfahren zur Markierung unterscheiden sich im wesentlichen nicht
von denjenigen, welche weithin zur Markierung von Immunglobulin
angewandt werden. Die Notwendigkeit zur Markierung kann durch Einsetzen
von markiertem Antikörper
gegen das Antigen oder Anti-Immunglobulin gegen die Antikörper gegen
das Antigen, als einem indirekten Marker, vermieden werden.
-
Sobald
die Pertaktin-Polypeptide erhalten worden sind, können sie
zur Herstellung von damit reaktiven polyklonalen und monoklonalen
Antikörpern
verwendet werden. Somit kann ein Protein oder Polypeptid verwendet
werden, um einen tierischen Wirt durch im Fachgebiet bekannte Techniken
zu immunisieren. Derartige Techniken beinhalten üblicherweise eine Inokulierung,
aber sie können
andere Arten der Verabreichung beteiligen. Eine ausreichende Menge
des Proteins oder des Polypeptids wird verabreicht, um eine immunogene Antwort
in dem tierischen Wirt hervorzurufen. Jeder Wirt, der Antikörper gegen
das Antigen der Erfindung produziert, kann verwendet werden. Sobald
das Tier immunisiert worden ist und eine ausreichende Zeit verstrichen
ist, damit es mit der Produktion von Antikörpern gegen das Antigen beginnt,
können
polyklonale Antikörper
gewonnen werden. Das allgemeine Verfahren umfasst das Entnehmen
von Blut aus dem Tier und das Trennen des Serums aus dem Blut. Das
Serum, welches Antikörper
gegen das Antigen enthält,
kann als ein Antiserum gegen das Antigen verwendet werden. Alternativ
dazu können
die Antikörper
aus dem Serum gewonnen werden. Affinitätsreinigung ist eine bevorzugte
Technik zur Rückgewinnung
gereinigter polyklonaler Antikörper
gegen das Antigen aus dem Serum.
-
Monoklonale
Antikörper
gegen die oben offenbarten Antigene können ebenfalls hergestellt
werden. Ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, welche
mit den Antigenen reaktiv sind, umfasst die Schritte des Immunisierens
eines Wirts mit dem Antigen; Rückgewinnens
von Antikörper
produzierenden Zellen aus der Milz des Wirts; Fusionierens der Antikörper produzierenden
Zellen mit Myelomzellen, welche hinsichtlich des Enzyms Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase
defizient sind, unter Bildung von Hybridomen; Selektierens von mindestens
einem der Hybridome durch Kultivieren in einem Medium, welches Hypoxanthin,
Aminopterin und Thymidin umfasst; Identifizierens von mindestens
einem der Hybridome, welches einen Antikörper gegen das Antigen produziert,
Kultivierens des identifizierten Hybridoms zum Produzieren von Antikörper in
einer gewinnbaren Menge; und Gewinnens der Antikörper, welche von dem kultivierten
Hybridom produziert werden.
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Diese
polyklonalen oder monoklonalen Antikörper können in einer Vielzahl von
Anwendungen verwendet werden. Unter diese zählt die Neutralisierung von
entsprechenden Proteinen. Sie können
auch verwendet werden, um Bordetella-Antigene in biologischen Präparationen
nachzuweisen oder bei der Reinigung entsprechender Proteine, Glykoproteine
oder Mischungen davon verwendet werden, zum Beispiel bei Anwendung
in einer Affinitätschromatographie-Säule.
-
Die
Pertaktin-Polypeptide, wie hierin definiert, können als Antigene zum Identifizieren
von Antikörpern gegen
Bordetella in Materialien und zur Bestimmung der Konzentration der
Antikörper
in diesen Materialien verwendet werden. Somit können die Antigene für eine qualitative
oder quantitative Bestimmung von Bordetella in einem Material verwendet
werden. Solche Materialien schließen selbstverständlich humane
oder andere tierische Gewebe oder humane oder andere tierische Zellen
sowie biologische Fluide, wie humane oder andere tierische Körperflüssigkeiten,
einschließlich
humanen Seren, ein. Bei Verwendung als ein Reagenz in einem Immuno-Assay
zum Bestimmen des Vorhandenseins oder der Konzentration der Antikörper gegen
Bordetella stellen die Antigene, wie oben definiert, einen Assay
bereit, welcher zweckdienlich, schnell, empfindlich und spezifisch
ist.
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Genauer
gesagt, können
die Antigene, wie oben definiert, für den Nachweis von Bordetella
mittels Immunoassays verwendet werden, welche zur Verwendung beim
Bestimmen oder Quantifizieren humoraler Komponenten in Fluiden allgemein
bekannt sind. Somit können
Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen
direkt beobachtet oder mittels sekundärer Reaktionen bestimmt werden,
wie Präzipitation
oder Agglutination. Darüber
hinaus können
auch Immun- Elektrophorese-Techniken
eingesetzt werden. Zum Beispiel kann die klassische Kombination
aus Elektrophorese in Agar, gefolgt von Reaktion mit Antiserum,
sowie zweidimensionale Elektrophorese, Rocket-Elektrophorese und
Immunmarkierung von Polyacrylamidgel-Mustern (Western-Blot oder
Immunoblot) angewandt werden. Andere Immunoassays, in welchen die
Antigene, wie oben definiert, verwendet werden können, schließen, ohne
jedoch darauf eingeschränkt
zu sein, Radioimmunoassay, kompetitiven Immunpräzipitations-Assay, Enzym-Immunoassay und Immunfluoreszenz-Assay
ein. Es versteht sich, dass turbidometrische, colorimetrische und
nephelometrische Techniken angewandt werden können. Ein auf der Western-Blot-Technik basierender
Immunoassay wird bevorzugt.
-
Immunoassays
können
durch Immobilisieren von einem der Immunreagenzien, entweder einem
Antigen, wie oben definiert, oder einem Antikörper gegen das Antigen, auf
einer Trägeroberfläche durchgeführt werden,
während
die Immunreaktivität
des Reagenzes beibehalten wird. Das reziproke Immunreagenz kann unmarkiert
oder in einer solchen Weise markiert sein, dass die Immunreaktivität ebenfalls
erhalten bleibt. Diese Techniken sind speziell geeignet zur Anwendung
in Enzym-Immunoassays, wie Enzyme-Linked-Immunosorbens-Assay (ELISA)
und kompetitivem Inhibitions-Enzym-Immunoassay (CIEIA).
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Wenn
entweder das Antigen, wie oben definiert, oder ein Antikörper gegen
das Antigen an einen festen Träger
angeheftet wird, handelt es sich bei dem Träger üblicherweise um ein Glas- oder
Kunststoffmaterial. Kunststoffmaterialien, welche in der Form von
Platten, Röhren,
Kügelchen
oder Scheiben gegossen sind, werden bevorzugt. Beispiele von geeigneten
Kunststoffmaterialien sind Polystyrol und Polyvinylchlorid. Wenn
das Immunreagenz nicht ohne Weiteres an den festen Träger bindet,
kann ein Trägermaterial
zwischen dem Reagenz und dem Träger
zwischengelagert werden. Beispiele von geeigneten Trägermaterialien
sind Proteine, wie Rinderserumalbumim, oder chemische Reagenzien,
wie Glutaraldehyd oder Harnstoff. Die Beschichtung der festen Phase
kann unter Anwendung herkömmlicher
Techniken durchgeführt
werden.
-
Die
Erfindung stellt immunogene Pertaktin-Polypeptide und genauer gesagt
schutzgebende Polypeptide zur Verwendung in der Herstellung von
Impfstoffzusammensetzungen gegen Bordetella bereit. Diese Polypeptide
können
somit als Impfstoffe durch Verabreichen der Polypeptide an einen
Säuger,
welcher für
Bordetella-Infektion anfällig
ist, verwendet werden. Herkömmliche
Arten zur Verabreichung können
angewandt werden. Zum Beispiel kann die Verabreichung durch orale,
respiratorische oder parenterale Routen ausgeführt werden. Die intradermalen,
subkutanen und intramuskulären
Wege der Verabreichung werden bevorzugt, wenn der Impfstoff parenteral
verabreicht wird.
-
Der
Hauptzweck der Immunantwort in einem Bordetella-infizierten Säuger besteht
darin, den Bordetella zu inaktivieren und Bordetella-infizierte
Zellen zu eliminieren. Der B-Zell-Zweig der Immunantwort trägt einen Großteil der
Verantwortung für
die Inaktivierung von Bordetella. Die hauptsächliche Weise, auf welche dies
erzielt wird, besteht in einer Neutralisierung des Infektionsvermögens. Ein
anderer Hauptmechanismus für
die Zerstörung
der Bordetella-infizierten Zellen wird durch zytotoxische T-Lymphozyten
(CTL) vorgesehen, welche Pertaktin-Antigene erkennen, die in Kombination
mit Klasse-I-Histokompatibilitäts-Antigenen
an der Zelloberfläche
exprimiert werden. Die CTLs erkennen Pertaktin-Polypeptide, welche
innerhalb von Zellen aus einem Pertaktin-Protein prozessiert wurden,
welches beispielsweise von der infizierten Zelle produziert wird oder
welches von einer phagozytischen Zelle internalisiert wird. Somit
können
die immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung angewandt werden,
um eine B-Zell-Antwort gegen Pertaktin-Polypeptide, sowie Immunität, vermittelt
durch eine CTL-Antwort im Anschluss an eine Infektion, zu stimulieren.
Die CTL-Antwort kann eine bedeutende Rolle bei der Vermittlung einer
Erholung von einer primären
Bordetella-Infektion und bei der Beschleunigung der Erholung während anschließender Infektionen
spielen.
-
Die
Fähigkeit
der Pertaktin-Polypeptide, wie definiert in den Zusammensetzungen
der Erfindung, und Impfstoffe der Erfindung, schutzgebende Spiegel
an neutralisierendem Antikörper
in einem Wirt zu induzieren, kann durch Emulgieren mit einem Adjuvans,
Einbringen in ein Liposom, Koppeln an einen geeigneten Träger oder
durch Kombinationen dieser Techniken gesteigert werden. Zum Beispiel
können
die Pertaktin-Polypeptide, wie definiert in den Zusammensetzungen
der Erfindung, mit einem herkömmlichen
Adjuvans, wie Aluminiumphosphat und Aluminiumhydroxid-Gel, in einer
ausreichenden Menge zur Potenzierung der humoralen oder zellvermittelten
Immunantwort im Wirt, verabreicht werden. In ähnlicher Weise können die
Pertaktin-Polypeptide an Lipidmembranen gebunden oder in Lipidmembranen
eingebracht werden, um Liposomen zu bilden. Zu diesem Zweck kann
man auf die Verwendung nicht-pyrogener Lipide, welche frei von Nukleinsäuren und
anderen Fremdmaterialien sind, zurückgreifen.
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Das
Impfungs-Schema wird von mehreren Faktoren abhängen, wie der Anfälligkeit
des Wirts gegenüber
einer Infektion und dem Alter des Wirts. Eine einzelne Dosis des
Impfstoffs der Erfindung kann an den Wirt verabreicht werden, oder
eine anfängliche
Runde der Immunisierung kann befolgt werden, in welcher mehrere
Dosen in zeitlichen Abständen
verabreicht werden. Anschließende,
als Auffrischungen verwendete, Dosierungen können nach Bedarf im Anschluss
an die anfängliche
Runde verabreicht werden.
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Die
Pertaktin-Proteine, -Polypeptide und -Impfstoffe können an
den Wirt in einer ausreichenden Menge verabreicht werden, um Bordetella-Infektion
oder -Replikation in vivo zu verhindern oder zu hemmen. In jedem
Fall sollte die verabreichte Menge wenigstens ausreichend sein,
um den Wirt gegen eine ernste Immunsuppression zu schützen, selbst
obwohl eine Bordetella-Infektion
nicht vollkommen verhindert werden kann. Eine immunogene Antwort
kann erhalten werden durch Verabreichen der Proteine oder Polypeptide
der Erfindung an den Wirt in einer Menge von beispielsweise etwa
1 bis etwa 50 Mikrogramm Antigen je Kilogramm Körperge wicht, vorzugsweise etwa
5 bis etwa 10 Mikrogramm Antigen je Kilogramm Körpergewicht. Die Proteine,
Polypeptide und Impfstoffe der Erfindung können zusammen mit einem physiologisch
annehmbaren Träger
verabreicht werden. Zum Beispiel kann ein Verdünnungsmittel, wie Wasser oder
eine Kochsalzlösung,
verwendet werden.
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Ein
anderer Aspekt, welcher in der Patentanmeldung offenbart wird, schließt die Verabreichung
einer beliebigen Kombination der Nukleinsäuren, welche Pertaktin-Polypeptide
codieren, der Proteine und Polypeptide per se, mit oder ohne Trägermoleküle, an ein
Individuum ein. Bei dem Individuum kann es sich um ein Tier handeln.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "Tier" einen
Säuger,
und vorzugsweise wird der Säuger aus
der Gruppe gewählt,
welche aus einem Menschen, einem Kaninchen, einer Maus, einem Hund,
einer Katze, einem Rind, einem Schwein und einem Pferd besteht.
In einer speziell bevorzugten Ausführungsform ist der Säuger ein
Mensch.
-
Die
Verfahren zur Behandlung beinhalten das Verabreichen von immunogenen
Zusammensetzungen, welche Pertaktin-Proteine oder -Polypeptide umfassen,
und ebenfalls von Zusammensetzungen, welche Nukleinsäuren umfassen,
die Pertaktin-Proteine oder -Polypeptide codieren. Der Fachmann
auf dem Gebiet wird das Konzept, die Anwendung und die Wirksamkeit
von Nukleinsäureimpfstoffen
(z. B. DNA-Impfstoffen) und Nukleinsäure-Impfstofftechnologie sowie
Protein- und Polypeptid-basierende Technologien kennen. Die Nukleinsäure-basierende
Technologie gestattet die Verabreichung von Nukleinsäuren, welche
Pertaktin-Polypeptide, nackt oder eingekapselt, codieren, direkt
an Gewebe und Zellen ohne die Notwendigkeit der Produktion der codierten
Proteine vor einer Verabreichung. Die Technologie beruht auf der
Fähigkeit
dieser Nukleinsäuren,
von Zellen des Empfängerorganismus
aufgenommen und exprimiert zu werden, um eine immunogene Determinante
zu produzieren, auf welche das Immunsystem des Empfängers antwortet.
Typischerweise werden die exprimierten Antigene auf der Oberfläche von
Zellen präsentiert,
welche die Nukleinsäuren
aufgenommen und exprimiert haben, aber eine Expression und ein Export
der codierten Antigene in das Kreislaufsystem des Empfängerindividuums
liegt ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Eine derartige Nukleinsäure-Impfstofftechnologie
schließt,
ohne jedoch darauf eingeschränkt
zu sein, die Zuführung
von nackter DNA und RNA und die Zuführung von Expressionsvektoren,
welche Pertaktin-Polypeptide
codieren, ein. Obwohl die Technologie als "Impfstoff" bezeichnet wird, ist sie gleichermaßen auf
immunogene Zusammensetzungen anwendbar, welche nicht zu einer schutzgebenden
Antwort führen.
Derartige, keinen Schutz herbeiführende,
Zusammensetzungen und Verfahren werden in der vorliegenden Patentanmeldung
beschrieben.
-
Obwohl
die vorliegende Anmeldung die Zuführung von Nukleinsäuren, codierend
Pertaktin-Polypeptide
und Trägermoleküle, als
nackte Nukleinsäure
offenbart, offenbart die vorliegende Patentanmeldung ebenfalls die
Zuführung
von Nukleinsäuren
als Teil von größeren oder
komplexeren Zusammensetzungen. Eingeschlossen unter diesen Zuführungssystemen
sind Viren, virusartige Partikel oder Bakterien, welche die Nukleinsäure enthalten,
die Pertaktin-Polypeptide codiert. Auch Komplexe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und
Trägermoleküle mit Zellpermeabilisierenden
Verbindungen, wie Liposomen, sind innerhalb des Umfangs der Erfindung
eingeschlossen. Andere Verbindungen, wie molekulare Vektoren (
EP 696 191 , Samain et al.) und
Zuführungssysteme
für Nukleinsäure-Impfstoffe
sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und werden zum Beispiel
in der
WO 93 06223 und
WO 90 11092 ,
U.S. 5 580 859 und
U.S. 5 589 466 (Vical-Patente), welche
hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, veranschaulicht und
können
ohne ungebührlichen
oder übermäßigen experimentellen
Aufwand hergestellt und eingesetzt werden.
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Um
die Ziele fernerhin zu erreichen, und gemäß den Absichten der vorliegenden
Erfindung, wird ein Kit beschrieben, welches zum Diagnostizieren
einer Bordetella-Infektion in der Lage ist. Dieses Kit enthält, in einer
Ausführungsform,
die DNA-Sequenzen, wie oben definiert, welche fähig zum Hybridisieren an bakterielle RNA-
oder analoge DNA-Sequenzen sind, um das Vorliegen einer Bordetella-Infektion
anzuzeigen. Es können unterschiedliche
diagnostische Techniken angewandt werden, welche, ohne jedoch darauf
eingeschränkt
zu sein, einschließen:
(1) Southern-Blot-Vorgehensweisen zum Identifizieren von zellulärer DNA,
welche mit Restriktionsenzymen verdaut sein kann, oder nicht; (2)
Northern-Blot-Techniken zum Identifizieren von aus Zellen extrahierter
RNA; und (3) Dot-Blot-Techniken, d. h. direkte Filtration der Probe
durch eine Membran, wie Nitrozellulose oder Nylon, ohne vorherige
Auftrennung auf einem Agarosegel. Geeignetes Material für die Dot-Blot-Technik
könnte
aus Körperfluiden,
einschließlich,
ohne jedoch darauf eingeschränkt
sein, Serum und Plasma, Überständen aus
kultivierten Zellen oder Cytoplasma-Extrakten erhalten werden, welche
man nach Zelllyse und Entfernen von Membranen und Zellkernen der
Zellen durch Zentrifugation erhält.
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Nachstehend
sind Bezugsstellen hinsichtlich der Stämme aufgeführt, welche bei der Suche im
Hinblick auf die vorliegende Erfindung verwendet wurden:
- – 9.73H
+ 5, DEL, SEI: Infect. Immun.-(1993) 61''4072–4078. Gueirard,
P., und Guiso N., eingereicht bei der CNCM am 12. Mai 1989, Nr.
858.
- – CVGEO,
identisch zum Stamm CVHAI 286, 335: Microbiol. (1997) 143: 1433–1441. Le
Blay, K., et al.
- – 63.2:
CIP – Lab.
Ident., Inst. Pasteur, Paris, Frankreich – J. Clin. Microbiol., 1993,
31, 2745
- – TI:
CIP81.32 – Lab.
Ident., Inst. Pasteur, Paris, Frankreich – J. Clin. Microbiol., 1993,
31, 2746
- – Fr287:
Vaccine (1999) 17: 2651: 2660. Boursaux-Sude, C., et al.
- – 18232:
ref OMS: ATCC97.97 (CIP63.1).
B.
bronchiseptica p. 68 Pertactin-Gen [SEQ ID Nr.: 1] B.
bronchiseptica p. 68 Pertactin-Protein (SEQ ID Nr.: 4] B.
pertusis p. 68 – Gen
[SEQ ID Nr.: 2] B.
pertusis p. 68 – Protein
[SEQ ID Nr.: 5] B.
parapertussis p. 70 – Gen
[SEQ ID Nr.: 3] B.
parapertussis p. 70 – Protein
[SEQ ID Nr.: 6]
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REFERENZEN
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Die
folgenden Referenzen sind in dieser Anmeldung zitiert worden. Auf
die gesamte Beschreibung von jeder dieser Referenzen wird sich gestützt, und
sind werden hierin durch den Bezug darauf einbezogen.
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relationships in the genus Bordetella. Mol. Microbiol. 1: 301–308.
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Falkow, R. Gross und R. Rappuoli. 1989. Sequences required-for expression
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