DE69629304T2

DE69629304T2 - Membranproteine von leptospira

Info

Publication number: DE69629304T2
Application number: DE69629304T
Authority: DE
Inventors: A. David HAAKE; S. Ellen SHANG
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1995-05-19
Filing date: 1996-05-17
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2016-05-18
Also published as: DE69629304D1; ES2203704T3; US6699482B2; EP0837694B1; US5837263A; CA2220674A1; JPH11505708A; WO1996036355A1; AU5863796A; ATE246002T1; EP0837694A4; US20020127240A1; AU712882B2; EP0837694A1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf ein antigenes Präparat und insbesondere auf Leptospira-Membranproteine, die zum Hervorrufen einer schützenden Immunreaktion bei Tieren verwendet werden. Derartige Proteine können immunologisch als Impfstoffe gegen die von diesem Organismus verursachte Leptospirose eingesetzt werden. Alternativ kann die Diagnose von Leptospirose durchgeführt werden, indem das Vorhandensein der Proteine, von Antikörpern der Proteine oder von die Proteine codierenden Polynucleotiden nachgewiesen wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Leptospirose ist ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem bei Mensch und Tier. Sie ist eine weit verbreitete, von Tieren übertragbare Krankheit, die von krankheitserregenden Leptospira-Stämmen verursacht wird, welche die meisten Säugetierarten infizieren können. Zu einer Infektion kommt es entweder durch direkten Kontakt mit einem infizierten Tier oder durch indirekten Kontakt mit verseuchter Erde oder verseuchtem Wasser. Beim Vieh verursacht die Krankheit wirtschaftliche Verluste aufgrund von Fehlgeburten, Totgeburten, Unfruchtbarkeit, verringerter Milchproduktion und Verendung.
Bemühungen, die Leptospirose unter Kontrolle zu halten, wurden erschwert, da virulente Leptospiren die Fähigkeit sowohl zum langen Überleben in der Umwelt als auch zum andauernden Infizieren und Verbreitetwerden durch Wild und Vieh besitzen. Derzeit erhältliche Leptospirenimpfstoffe erzeugen eine kurzzeitige Immunität und bewirken keinen übergreifenden Schutz gegenüber vielen der 170 Serovaren der krankheitserregenden Leptospira {Thiermann, et al., J. Am. Vet. Med. Assoc., 184: 722 (1984)}. Diese Impfstoffe bestehen aus inaktivierten ganzen Organismen oder Außenhüllenpräparaten, die eine Serumreaktivität hervorrufen, wie durch eine mikroskopische Zusammenballung intakter Organismen festgestellt. Die Natur der schützenden Immunogene in diesen Impfpräparaten wurde nicht schlüssig erklärt, obwohl mehrere Beweislinien nahe legen, dass eine lipopolysaccharidartige Substanz (LLS) ein Maß an Schutz verleihen kann. Im Handel erhältliche Impfstoffe, die aus durch Hitze oder Formalin abgetöteten Leptospiren bestehen, erzeugen eine unvollständige oder nur kurzzeitige Immunität, wobei eine jährliche oder halbjährliche Verabreichung erforderlich ist. Im Fall des L. interrogans-Serovar hardjo, des in Nordamerika häufig vorkommenden Krankheitserregers des Rindes, sind auf diese Weise hergestellte Impfstoffe unwirksam {Bolin, C. A., et al., Am. J. Vet. Res., 50: 161–165 (1989) und Bolin, C. A., et al., Am. J. Vet. Res., 50: 2004–2008 (1989)}. Somit besteht ein bedeutender Bedarf an der Entwicklung eines verbesserten Leptospirenimpfstoffs.
Die Pathogenese der Leptospirose ist jener von anderen Spirochätenerkrankungen, einschließlich Syphilis (von Treponema pallidum verursacht) und Lyme-Borreliose (von Borrelia burgdorferi verursacht), äußerst ähnlich. Sowohl Syphilis als auch die Lyme-Borreliose sind durch eine weite Ausbreitung früh im Verlauf der Erkrankung, einschließlich eines Befalls des Zentralnervensystems, gekennzeichnet. Die Leptospira teilen diese Fähigkeit mit anderen krankheitserregenden Spirochäten, so dass die Meningitis eine übliche Erscheinungsform der Leptospirose ist. Ein weiteres Merkmal von Spirochäteninfektionen ist die Fähigkeit, chronisch im Wirt zu verweilen, wie dies in Fällen einer Syphilis dritten Grades und einer chronischen Lyme-Arthritis zu Tage tritt.
Lipid-modifizierte, integrale Membranproteine wurden in einer großen Anzahl von Bakterienarten identifiziert {Hayashi, S., et al., Bioenerg. Biomembr., 22: 451–471 (1990)}. In gramnegativen Bakterien werden diese Lipoproteine nach einer kovalenten Bindung von drei Fettsäureresten an ein N-terminales Cystein {Hantke, et al., Eur. J. Biochem., 34: 384–296 (1973)} von der Signalpeptidase II {Pugsley, A. P., Microbiol. Rev., 57: 50–108 (1993)} verarbeitet. Die Fettsäurereste verankern die Lipoproteine entweder an der cytoplas-matischen Membran oder an der Außenmembran. Obwohl der Polypeptidanteil der Lipoproteine im Allgemeinen hydrophil ist, macht eine Lipidmodifizierung diese amphiphil und bewirkt, dass sie sich während der Triton X-114-Phasenteilung in die hydrophobe Phase teilen {Chamberlain, N. R., et al., Infect. Immun., 57: 2872–2877 (1989)}.
Lipoproteine wurden in einer Reihe von Spirochäten, einschließlich Treponema pallidum {Chamberlain, N. R., et al., Infect. Immun., 57: 2872–2877 (1989) und Chamberlain, N. R., et al., Infect. Immun., 57: 2878–2885 (1989)}, Treponema denticola {Miyamoto, M., et al., Infect. Immun., 59: 1941–1947 (1991)}, Serpulina hyodysenteriae {Thomas, W., et al., Infect. Immun., 61: 1136–1140 (1993)}, Borrelia burgdorferi {Brandt, et al., Infect. Immun., 58: 983–991 (1990)} und der Fieberrückfall-Borrelia {Burman, N., et al., Mol. Microbiol., 4: 1715–1726 (1990)}, identifiziert. Die Lipoproteine scheinen beider Entstehung von Spirochätenerkrankungen eine wichtige Rolle zu spielen. Beispielsweise sind viele der T. pallidum-Lipoproteine immundominante Antigene, welche eine starke humorale und zellulare Immunreaktion auslösen {Akins, D. R., et al., Infect. Immun., 61: 1202–1210 (1993)} Zusätzlich stellt das Außenflächenprotein A (OspA) von Borrelia burgdorferi bei Tiermodellen einer Lyme-Erkrankung einen Immunschutz dar {Fikrig, E., et al., Science, 250: 553–556 (1990)}.
Triton X-114-gelöstes Material sowohl von virulenten als auch von abgeschwächten L. kirschneri (ehemals L. alstoni und L. interrogans)-Stämmen teilte sich in die hydrophobe Detergentienphase und enthielt eine lipopolysaccharidartige Substanz (LLS) von den Außenmembranbestandteilen des Organismus {Haake, D. A., et al., Infection & Immunity, 59: 1131–40 (1991)}. In der Studie enthielt der virulente Stamm von L. kirschneri größere Mengen eines LLS-Bestandteils mit einer offensichtlichen Molekülmasse von 30 Kilodalton (kDa). Eine spätere Haake, D. A., et al.-Veröffentlichung offenbart das Klonieren und Sequenzieren eines Gens, welches das OmpL1 (mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 31,113 Da)-Protein von krankheitserregenden Leptospira spp codiert {Haake, D. A., et al., J. Bacteriol., 175: 4225–4234 (1993)}. Dies könnte das erste Spirochätentransmembran-Außenmembranprotein sein, für welches das Strukturgen kloniert und sequenziert wurde.
Eine nicht erfolgreiche Forschung bezüglich der Identifizierung von Leptospira- und T. pallidum-OMPs zeigte die Wichtigkeit auf, die Anfälligkeit der Spirochäten-Außenmembran und den Mangel an einer Außenmembran-Selektivität von ionischen Detergentien, wie z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS) {Cunningham, et al., J. Bacteriol., 170: 5789 (1988); Penn, et al., J. Gen. Microbiol., 131: 2349 (1985); Stamm, et al., Infect. Immun., 55: 2255 (1987)}, in Betracht zu ziehen. Außenmembranproteine sind von großer Bedeutung, da sie bei der bakteriellen Pathogenese eine Schlüsselrolle spielen. Die Identifizierung von Außenmembranproteinen, die bei der Leptospira-Pathogenese eine Rolle spielen, ist nicht nur für das Verständnis der Leptospiren-Außenmembranproteine und deren Rolle bei der Pathogenese, sondern auch für das Verständnis anderer Spirochäten-Außenmembranproteine und deren Rolle bei der Pathogenese von Bedeutung.
KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung präsentiert zwei neuartige Leptospirenmembranproteine: LipL1, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie in SEQ ID NO: 3 dargestellt ist, und LipL2, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie in SEQ ID NO: 6 dargestellt ist. Diese Proteine sind insbesondere Lipoproteine, die krankheitserregenden Leptospira-Stämmen zugeordnet sind. LipL1 besitzt etwa 35 kDa, und LipL2 besitzt etwa 41 kDa. Ebenso geoffenbart sind das Verfahren zur Reinigung dieser Proteine von Leptospira, deren Nucleotid- und Aminosäuresequenzen, das Klonieren der die Proteine und deren rekombinante Proteine codierenden Gene, Verfahren zur Herstellung von Antikörpern dieser Proteine und die resultierenden Antikörper. Diese Proteine, deren immunisierenden Fragmente und Antikörper, die an diese binden können, sind nützlich zum Hervorrufen einer Immunreaktion auf krankheitserregendes Leptospira sowie zum Schaffen eines diagnostischen Ziels für die Leptospirose.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt die teilweise Restriktionskarte des das lipL1-Gen enthaltenden 2,3-kb EcoRI-Fragments und eine Strategie zur Bestimmung der Nucleotidsequenz dar. Das lipL1-Gen besitzt eine Länge von 1092 Basenpaaren. Der Pfeil unter der Karte zeigt die Richtung und das Ausmaß der Sequenzanalyse an. Die einzelnen Buchstaben über der Karte bedeuten die folgenden Restriktionsenzyme: EcoRI (E), PvuII (P), Bam HI (B), EcoRV (Ev), Hinc II (Hc) und Hind III (Hd).
2 stellt die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von lipL1 dar. Mutmaßliche -35- und -10-Promotor-Bereiche und die Ribosomen-Bindungsstelle (RBS) sind dargestellt. Die mutmaßliche Signalpeptidase II-Spaltstelle ist durch einen Pfeil (T) angedeutet. Die durch den Staphylokokken-V8-Protease-Aufschluss des nativen Proteins erhaltene Aminosäuresequenz ist unterstrichen. Die Position des TAA-Stopcodons ist durch ein Sternchen markiert. Durch die horizontalen unterbrochenen Pfeile ist eine invertierte Sequenzwiederholung angedeutet. Diese kann als Rho-unabhängiger Transcriptionsterminator wirken.
3 stellt ein Diagramm der Kyte-Doolittle-Hydrophobizität von LipL1 dar.
4 stellt eine teilweise Restriktionskarte des das LipL2-Gen enthaltenden 2,25-kb Eco RI-Fragments und eine Strategie zur Bestimmung der Nucleotidsequenz dar. Das lipL2-Gen besitzt eine Länge von 1065 Basenpaaren. Die Pfeile unter der Karte zeigen die Richtung und das Ausmaß der Sequenzanalyse an. Die einzelnen Buchstaben über der Karte bedeuten die folgenden Restriktionsenzyme: EcoRI (E), DraI (D), HaeIII (H), ScaI (S), PuvII (P), HindIII (Hd), ClaI (C), HincII (Hc), RsaI (R) und SspI (Ssp).
5 stellt die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von lipL2 dar. Mutmaßliche -35- und -10-Promotor-Bereiche und die Ribosomen-Bindungsstelle (RBS) sind dargestellt. Die mutmaßliche Signalpeptidase II-Spaltstelle ist durch einen Pfeil (T) angedeutet. Die durch den Staphylokokken-V8-Protease-Aufschluss des nativen Proteins erhaltene Aminosäuresequenz ist unterstrichen. Die Position des TAA-Stopcodons ist durch ein Sternchen markiert. Durch die horizontalen unterbrochenen Pfeile ist eine invertierte Sequenzwiederholung angedeutet. Diese kann als Rho-unabhängiger Transcriptionsterminator wirken.
6 stellt ein Diagramm der Kyte-Doolittle-Hydrophobizität von LipL2 dar.
7 stellt das Ergebnis eines Immunpräzipitationsversuchs an LipL1 mit einem Anti-LipL1-Antiserum dar. LipL1 wird durch L. kirschneri acyliert. Bahn 1: Das gesamte L. kirschneri wird intrinsisch mit [³H]-Palmitat markiert. Bahn 2: L. kirschneri wird intrinsisch mit [³H]-Palmitat markiert, mit Triton X-100 extrahiert und mit einem Anti-LipL1-Antiserum immunpräzipitiert.
8 stellt das Ergebnis eines Immunpräzipitationsversuchs an LipL2 mit einem Anti-LipL2-Antiserum dar. LipL2 wird durch L. kirschneri acyliert. Bahn 1: Das gesamte L. kirschneri wird intrinsisch mit [³H]-Palmitat markiert. Bahn 2: L. kirschneri wird intrinsisch mit [³H]-Palmitat markiert, mit Triton X-100 extrahiert und mit einem Anti-LipL2-Antiserum immunpräzipitiert. Der Pfeil zeigt die Position von LipL2 an.
9 stellt ein mit Coomassie-Blau gefärbtes SDS-PAGE-Gel einer Liste von Leptospirenarten dar. L. interrogans, L. noguchii, L. kirschneri, L. borgpetersenii, L. santarosai und L. weilii sind krankheitserregende Leptospira-Arten. L. biflexa, L. wolbachii und L. inadai sind drei bekannte nicht krankheitserregende Leptospira-Arten, so wie der verwandte Organismus Leptonema illini. Die Positionen der Molekülgrößenstandards sind auf der linken Seite (in Kilodalton) dargestellt.
10 stellt den Immunoblot einer Liste von Leptospirenarten unter Verwendung eines Anti-LipL1-Antiserums dar. L. interrogans, L. noguchii, L. kirschneri, L. borgpetersenii, L. santarosai und L. weilii sind krankheitserregende Leptospira-Arten. L. biflexa, L. wolbachii und L. inadai sind drei bekannte nicht krankheitserregende Leptospira-Arten, so wie der verwandte Organismus Leptonema illini. Die Positionen der Molekülgrößen-standards sind auf der linken Seite (in Kilodalton) dargestellt.
11 stellt den Immunoblot einer Liste von Leptospirenarten unter Verwendung eines Anti-LipL2-Antiserums dar. L. interrogans, L. noguchii, L. kirschneri, L. borgpetersenii, L. santarosai und L. weilii sind krankheitsenegende Leptospira-Arten. L. biflexa, L. wolbachii und L. inadai sind drei bekannte nicht krankheitsenegende Leptospira-Arten, so wie der verwandte Organismus Leptonema illini. Die Positionen der Molekülgrößen-standards sind auf der linken Seite (in Kilodalton) dargestellt.
12 zeigt, dass sich LipL1 selektiv in die Triton X-114-Detergentienphase teilt. Sie stellt einen Immunoblot von Kultur-abgeschwächten L. kirschneri-Organismen, die mit einem Anti-LipL1-Antiserum sondiert wurden, dar. Die analysierten Fraktionen waren der gesamte Organismus (W) und das Triton X-114-unlösliche Pellet (P), die wässrige Phase (A) und das Material der Detergentienphase(D). Die Positionen der Molekülgrößenstandards sind auf der linken Seite (in Kilodalton) dargestellt.
13 zeigt, dass sich LipL2 selektiv in die Triton X-114-Detergentienphase teilt. Sie stellt einen Immunoblot von Kultur-abgeschwächten L. kirschneri-Organismen, die mit einem Anti-LipL2-Antiserum sondiert wurden, dar. Die analysierten Fraktionen waren der gesamte Organismus (W) und das Triton X-114-unlösliche Pellet (P), die wässrige Phase (A) und das Material der Detergentienphase (D). Die Positionen der Molekülgrößenstandards sind auf der linken Seite (in Kilodalton) dargestellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung präsentiert zwei neuartige Leptospirenmembranproteine: LipL1 und LipL2. Diese Proteine sind insbesondere Lipoproteine, die krankheitserregenden Leptospira-Stämmen zugeordnet sind. LipL1 besitzt etwa 35 kDa, und LipL2 besitzt etwa 41 kDa. Ebenso geoffenbart sind das Verfahren zur Reinigung dieser Proteine von Leptospira, deren Nucleotid- und Aminosäuresequenzen, das Klonieren der die Proteine und deren rekombinante Proteine codierenden Gene, Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen diese Proteine und die resultierenden Antikörper. Diese Proteine, deren immunisierende Fragmente und Antikörper, die an diese binden können, sind nützlich zum Hervorrufen einer Immunreaktion auf krankheitserregendes Leptospira sowie zum Schaffen eines diagnostischen Ziels für die Leptospirose.
Es wird vermutet, dass LipL1 und LipL2 eine Amino-Terminus-Lipidmodifikation aufweisen, und zwar basierend auf einer Sequenzanalyse ihrer abgeleiteten Aminosäuresequenzen. In beiden Fällen folgt dem Signalpeptid eine L-X-Y-C-Signalpeptidase II-Spaltstelle. LipL1 ist am häufigsten in der Detergentienphase von Leptospira kirschneri-Triton X-114-Extrakten vorgefundene Proteine. Die Gewinnung von LipL1 erfordert die Gegenwart von Proteasehemmern während der Detergentiensolubilisation. LipL2 wurde in Studien zur Oberflächenimmunpräzipitation als potentielles Membranprotein identifiziert und ist auch ein hervorstechendes Triton X-114-Detergentienphasenprotein. LipL1 und LipL2 sind integrale Membranproteine. Rekombinante LipL1- und LipL2-Fusionsproteine wurden in Escherichia coli zur Herstellung spezifischer Kaninchen-Antiseren produziert. Beide Lipoproteine werden von einem Großteil der krankheitserregenden Leptospira-Arten produziert. Während die Menge an produziertem LipL1 unter den Leptospira-Arten variabel ist, ist die Expression von LipL2 hochkonserviert. Die Molekülmassen von LipL1 schwankten von etwa 35 bis 40 kDA (siehe z. B. 10). Die Molekülmassen von LipL2 waren unveränderlich: 41 ± 1 kDa (siehe z. B. 11). LipL1 und LipL2 können in verschiedenen Leptospira durch ihre Immunreaktivität mit Antikörpern, die gegen das im untenstehenden „BEISPIEL"-Abschnitt beschriebene LipL1 und LipL2 gezüchtet werden, identifiziert werden. Die Proteine können von den verschiedenen Leptospira gereinigt und deren LipL1 und LipL2 durch ihre Immunreaktivität mit Antiseren, die mit Hilfe von mit dem LipL1 und LipL2 des „BEISPIELS" immunisierten Tieren gezüchten werden, identifiziert werden, und zwar gemäß dem im „BEISPIEL"-Abschnitt beschriebenen Verfahren. Diese Proteine sind als pharmazeutische Zusammensetzungen nützlich zum Hervorrufen einer Immunreaktion auf krankheitserregende Leptospira sowie zum Schaffen eines diagnostischen Ziels für die Leptospirose.
Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von LipL1 und LipL2 sind in den 2 und 5 dargestellt und werden wie folgt als SEQ. ID NOS. identifiziert.
TABELLE 1
Die Sequenzen in Tabelle 1 umfassen sowohl native als auch synthetische Sequenzen. Sofern nicht anderweitig abgewandelt, umfasst der Begriff „Protein", wie hierin verwendet, sowohl das native als auch das synthetische Polypeptid und Peptid. Das synthetische Protein umfasst das rekombinante und das chemisch synthetisierte Protein. Sofern nicht anders angezeigt, umfassen „LipL1"- und „LipL2"-Proteine sowohl deren native als auch deren synthetische Versionen.
Die in Tabelle 1 und den 2 und 5 geoffenbarten Nucleotidsequenzen liegen in DNA-Form vor. Basierend auf den geoffenbarten Sequenzen könnte ein Fachmann jedoch deren komplementäre DNA- und RNA-Sequenzen und die zum Vorhergehenden komplementären RNA-Sequenzen bestimmen. Somit umfasst der Begriff „Nucleotidsequenz" sowohl die DNA- als auch die RNA-Sequenzen. Weiters umfassen die SEQ. ID Nos. und die geoffenbarten Nucleotidsequenzen, wie in dieser Anmeldung und diesen Ansprüchen verwendet: (1) die geoffenbarten DNA-Sequenzen, (2) die zu den geoffenbarten Sequenzen komplementären Nucleotidsequenzen (welche RNA oder DNA sein können), (3) die zu den aufgelisteten DNA-Sequenzen korrespondierenden RNA-Sequenzen, wobei das Thymidin („T") in den geoffenbarten DNA-Sequenzen durch Uracil („U") ersetzt ist, (4) Nucleotidsequenzen, wobei andere im Stand der Technik bekannte Nucleotide, wie z. B. Nucleotidanaloga jene in den vorhergehenden Sequenzen ersetzen, z. B. 5-Methylcytosin als Ersatz für Cytosin, und (5) Nucleotidsequenzen, die innerhalb einer 10%igen Abweichung von den jeweiligen SEQ. ID Nos. oder geoffenbarten Nucleotidsequenzen liegen.
Da Nucleotid-Codone redundant sind, sind innerhalb des Umfang dieser Erfindung auch äquivalente Nucleotidsequenzen, die Folgendes umfassen: Nucleotidsequenzen, die LipL1, LipL2 codieren oder zu diesen translatiert werden können, deren Proteinvarianten, funktionelle Äquivalente oder Derivate. Diese Nucleotidsequenzen können auch bei der praktischen Anwendung der Erfindung eingesetzt werden.
Zusätzlich zu Obenstehendem umfassen die LipL1- und LipL2-Nucleotidsequenzen auch: (1) Nucleotidsequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit den codierenden Sequenzen der jeweiligen Nucleotidsequenzen hybridisieren können, und (2) Fragmente der SEQ. ID Nos. 1, 2, 4 und 5, welche Proteine codieren, die im Wesentlichen dieselben biologischen Charakteristika/Aktivitäten von LipL1 bzw. LipL2 haben. Vorzugsweise ist das bestimmende biologische Charakteristikum/die bestimmende biologische Aktivität die Bewahrung von zumindest einem Immunepitop. Vorzugsweise sind diese Proteine bei Verwendung in einem Immunoassay hinsichtlich Leptospira mit auf Leptospira gerichteten Antikörpern immunreaktiv, sie sind jedoch mit Antikörpern, die nicht Leptospira-spezifisch und in einer biologischen Probe zu finden sind, nicht nachweisbar immunreaktiv. Wie hierin definiert, kann eine „biologische Probe" eine biologische Flüssigkeits- oder Gewebeprobe sein. Beispiele für eine biologische Flüssigkeitsprobe umfassen: Blut, Serum, Plasma, Tränenflüssigkeit, Milch, Urin und Zerebrospinalflüssigkeit. Beispiele für eine biologische Gewebeprobe umfassen Gewebeproben von Leber und Niere und Gewebeteile endothelialen Ursprungs. Eine biologische Probe kann auch Exkremente und Ausscheidungen umfassen. So kann mit diesen Gewebeproben beispielsweise eine immunhistochemische Analyse durchgeführt werden. Vorzugsweise stammen diese Proben von Säugetieren, wie z. B. Menschen, wildlebenden und domestizierten Säugetieren. Noch bevorzugter können diese Proteine und die Immunoassays zusätzlich zwischen krankheitserregenden Leptospira und nicht krankheitserregenden Leptospira unterscheiden. Wahlweise können die Fragmente von Nucleotidsequenzen Nucleotidsonden sein, die zumindest 10 Nucleotide lang sind. Vorzugsweise hybridisieren diese Sonden, wenn sie unter moderaten bis stringenten Hybridisierungsbedingungen bei einer Hybridisierungsanalyse hinsichtlich Leptospira verwendet werden, nicht nachweisbar mit den Nucleotidsequenzen von Nicht-Leptospira-Organismen, die in einer biologischen Probe zu finden sind. Wahlweise hybridisieren die Nucleotidsequenzen mit zumindest 10 aufeinanderfolgenden Nucleotiden in den codierenden Sequenzen der obenstehend aufgelisteten Nucleotidsequenzen. Die Nucleotidsequenzen umfassen eine Nucleotidsequenz, die ein zumindest 8, noch bevorzugter 5 bis 6 und am meisten bevorzugt 4 Aminosäuren enthaltendes Protein codiert. Vorzugsweise ist das Protein Leptospira-spezifisch oder bewahrt eine oder mehrere biologische Funktionen der Leptospira. Am meisten bevorzugt können diese Nucleotidsequenzen und die Hybridisierungsanalysen zusätzlich zwischen krankheitserregenden Leptospira und nicht krankheitserregenden Leptospira unterscheiden.
Die Begriffe „LipL1" und „LipL2", wie sie in Verbindung mit Proteinen verwendet werden, sind jeweils wie obenstehend in Tabelle 1 und den 2 und 5 definiert, und zwar zusammen mit: (1) Proteinvarianten, welche Aminosäuresequenzen enthalten, bei denen zumindest 95% der Aminosäuren mit den Sequenzen SEQ. ID NO. 3 und 6 zusammenpassen, jeweils mit Ausnahme von deren Signalpeptiden; (2) den funktionellen Äquivalenten dieser Proteine bzw. ihrer Varianten; und (3) den Derivaten, einschließlich Fragmenten, von LipL1-, LipL2-Proteinen bzw. deren Varianten. Vorzugsweise sind diese Proteine bei Verwendung in einem Immunoassay hinsichtlich Leptospira mit auf Leptospira gerichteten Antikörpern immunreaktiv, sie sind jedoch mit Antikörpern, die nicht Leptospira-spezifisch und in einer biologischen Probe zu finden sind, nicht nachweisbar immunreaktiv. Noch bevorzugter können diese Proteine und die Immunoassays zusätzlich zwischen krankheitserregenden Leptospira und nicht krankheitserregenden Leptospira unterscheiden. Vorzugsweise sind die Proteine Leptospira-spezifisch oder bewahren eine oder mehrere biologische Funktionen der Leptospira. Somit enthält das in dieser Anmeldung beanspruchte Fragment vorzugsweise zumindest ein immunisierendes Epitop von Leptospira und noch bevorzugter von krankheitserregenden Leptospira. Noch bevorzugter kann das Fragment durch auf Leptospira gerichtete, polyklonale Antikörper gebunden werden. Antikörper, welche lineare Epitopen erkennen, binden im Allgemeinen an Epitopen, die durch etwa 3 bis 10 Aminosäuren definiert sind.
Wahlweise oder zusätzlich besitzen diese Proteine vorzugsweise die Fähigkeit, bei einem mit den Proteinen geimpften Tier eine zellulare und/oder humorale Reaktion hervorzurufen. Noch bevorzugter richtet sich die zellulare und/oder humorale Reaktion gegen Leptospira, insbesondere krankheitserregende Leptospira. Am meisten bevorzugt werden mit diesen Proteinen geimpfte Tiere gegen Leptospirose immunisiert oder mildern solche Impfungen die Erkrankung bei infizierten Tieren. Das Tier ist vorzugsweise ein Säugetier. Noch bevorzugter ist das Tier ein Mensch oder ein Haustier. Wahlweise sind diese Proteine oder deren Aminosäuresequenzen vorzugsweise von den Leptospira-Membranproteinen ableitbar und sind mit Antikörpern immunreaktiv, die gegen das im untenstehenden „BEISPIEL" geoffenbarte LipL1 oder LipL2 gezüchtet werden.
Die Varianten können z. B. von einer Substitution, Insertion oder Deletion der in Tabelle 1 gezeigten Aminosäuresequenzen herrühren. Die Derivate der Proteine und deren Varianten umfassen Fragmente dieser Proteine und deren immunisierende Epitope. Wie obenstehend beschrieben, bewahrt jede Variante vorzugsweise auch zumindest ein Immunepitop von Leptospira und noch bevorzugter von krankheitserregenden Leptospira. Vorzugsweise ist das Immunepitop hinsichtlich Leptospira und noch bevorzugter hinsichtlich krankheitserregenden Leptospira spezifisch.
Zwei Aminosäuresequenzen sind funktionell äquivalent, wenn sie im Wesentlichen dieselben biologischen Aktivitäten aufweisen, wie z. B. die Fähigkeit, bei einem mit den Proteinen geimpften Tier eine zellulare und/oder humorale Reaktion hervorzurufen. Die Proteine können mit anderen Proteinen fusioniert werden, beispielsweise können Signalsequenzfusionen eingesetzt werden, um die Absonderung des LipL1- oder LipL2-Proteins rascher zu steuern. Weiters kann LipL1 mit LipL2 fusioniert werden. Die diese Fusionsproteine codierenden Nucleotidsequenzen sind auch in der vorliegenden Erfindung enthalten. Das heterologe Signal ersetzt das native LipL1- oder LipL2-Signal, und bei Erkennung, d. h. Verarbeitung und Spaltung, der resultierenden Fusion durch die Wirtszelle wird das LipL1- oder LipL2-Protein abgesondert. Signale werden auf Basis der vorgesehenen Wirtszelle ausgewählt und können Bakterien-, Hefepilz-, Insekten- und Virussequenzen enthalten.
Substitutionsvarianten der hierin geoffenbarten Proteine sind jene, bei denen zumindest ein Rest in den geoffenbarten Sequenzen entfernt und an dessen Stelle ein anderer Rest eingefügt wurde. Vorzugsweise ist die Aminosäurenveränderung konservativ. Somit umfassen Modifikationen von primären LipL1- und LipL2-Aminosäuresequenzen auch konservative Variationen. Der Begriff „konservative Variation", wie hierin verwendet, bezeichnet das Ersetzen eines Aminosäurerests durch einen anderen biologisch ähnlichen Rest. Beispiele für konservative Variationen umfassen die Substitution eines hydrophoben Rests, wie z. B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, durch einen anderen oder die Substitution eines polaren Rests durch einen anderen, wie z. B. die Substitution von Arginin durch Lysin, von Glutamin- durch Asparaginsäure oder von Glutamin durch Asparagin und dergleichen. Der Begriff „konservative Variation" umfasst auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer nicht substituierten Ausgangsaminosäure, vorausgesetzt, dass für das substituierte Polypeptid gezüchtete Antikörper auch mit dem nicht substituierten Polypeptid immunreagieren.
Weiters hängt die genaue chemische Struktur von einer Reihe von Faktoren ab, wie dies bei allen Proteinen der Fall ist. Da ionisierbare Amino- und Carboxylgruppen im Molekül vorhanden sind, kann ein bestimmtes Protein als saures oder basisches Salz oder in neutraler Form erhalten werden. Alle derartigen Präparate, die ihre Aktivität bewahren, wenn sie geeigneten Umweltbedingungen ausgesetzt werden, sind in der Definition enthalten. Zusätzlich kann die primäre Aminosäuresequenz durch Derivatisierung unter Verwendung von Zuckeranteilen (Glycosylierung) oder durch andere ergänzende Moleküle, wie z. B. Lipide, Phosphat, Acetylgruppen und dergleichen, üblicher durch Konjugation mit Sacchariden, verstärkt werden. Die primäre Aminosäurestruktur kann sich auch zusammenballen, um Komplexe, am häufigsten Dimere, zu bilden. Gewisse Aspekte einer solchen Verstärkung werden durch posttranslationelle Verarbeitungssysteme des produzierenden Wirts erzielt; andere solche Modifikationen können in vitro eingeführt werden. In jedem Fall werden solche Modifikationen in die Definition aufgenommen, solange die Aktivität des Proteins nicht zerstört wird. Es wird erwartet, dass solche Modifikationen die Aktivität quantitativ oder qualitativ beeinflussen können, und zwar entweder durch Verstärkung oder durch Verringerung der Aktivität des Proteins in verschiedenen Analysen.
Einzelne Aminosäurereste in der Kette können auch durch Oxidation, Reduktion oder eine andere Derivatisierung modifiziert werden, und das Protein kann gespalten werden, um Fragmente zu erhalten, die eine Aktivität bewahren. Solche Veränderungen, welche die Aktivität nicht zerstören, nehmen die Proteinsequenz nicht aus der Definition. Im Folgenden werden einige der Modifikationen anhand eines Beispiels detaillierter besprochen.
Somit sind im Umfang von LipL1 und LipL2 Glycosylierungsvarianten inkludiert. Diese umfassen Varianten, denen eine Glycosylierung vollkommen fehlt (nicht glycosyliert), und Varianten mit zumindest einer glycosylierten Stelle weniger ist als bei der nativen Form (entglycosyliert), sowie Varianten, bei denen die Glycosylierung verändert wurde.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung der Leptospira-Membranlipoproteine unter Anwendung von rekombinanten DNA-Techniken. Rekombinante LipL1- und LipL2-Fusionsproteine wurden in Escherichia coli (E. coli) produziert. Diese Proteine können zur Immunisierung eines Säugetieres zwecks Erzeugung von Antiseren eingesetzt werden. Die Gene für die L. kirschneri-LipL1- und LipL2-Proteine wurden in einem Plasmidvektor kloniert, der dann zur Transformation von E. coli eingesetzt wurde. Molekülmasse und Menge des bei krankheitserregenden Leptospira-Arten exprimierten LipL2 sind hochkonserviert. Obwohl LipL1 von einem Großteil der Leptospirenerreger produziert wird, sind andererseits Molekülmasse und Menge des produzierten LipL1 variabel.
Es bestand eine starke Wechselbeziehung zwischen der Leptospiren-Pathogenität und der Reaktivität mit Antiseren gegen LipL1 und LipL2: Dies trifft besonders auf LipL2 zu, das in allen Stämmen der krankheitserregenden Leptospira-Arten L. interrogans, L. noguchii, L. kirschneri, L. borgpetersenii, L. santarosai und L. weili, jedoch nicht in den nicht krankheitserregenden Leptospira-Arten L. biflexa, L. wolbachii und L. inadai und im verwandten Organismus Leptonema illini nachgewiesen wurde. LipL1 wurde in den meisten krankheitserregenden Leptospira-Arten, jedoch nicht in den nicht krankheitserregenden Leptospira-Arten L. biflexa, L. wolbachii und L. inadai und im verwandten Organismus Leptonema illini nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass LipL1 und LipL2 bei krankheitserregenden Leptospira nicht nur exprimiert, sondern auch in antigener Weise konserviert werden, und zwar ungeachtet der Spezies, und daher sind diese Proteine sowohl ausgezeichnete Impfstoffkandidaten als auch ausgezeichnete Markerantigene für die Diagnose von Leptospirose.
Eine Extraktion von Proteinen aus vollständigen L. kirschneri-Zellen unter Verwendung von nicht ionischem Detergenz-Triton X-114 (TX-114) führte zum Aufschluss einer Reihe von Proteinen, einschließlich Detergentienphasen-Proteinen der LipL1- und LipL2-Proteine. Eine Oberflächenimmunpräzipitation unter Verwendung eines gegen vollständige L. kirschneri gezüchteten Antiserums wurde zur Erzeugung einer Fraktion verwendet, die einer reduzierenden SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ausgesetzt wurde. Die Elektrophorese-behandelte Fraktion wurde daraufhin in eine Sequenziermembran übertragen, und N-terminale Sequenzen des 35 bzw. 41 kDa-Proteins wurden bestimmt. Basierend auf der N-terminalen Aminosäuresequenz wurden für jedes der Proteine zwei degenerierte Oligonucleotid-Sonden synthetisiert. Eine genomische L. kirschneri-DNA-Bibliothek wurde mit den Oligonucleotiden untersucht, und Einfügungen wurden als die codierende Sequenz für LipL1 bzw. LipL2 enthaltend identifiziert.
Eine Sequenzanalyse zeigte, dass das LipL1-Strukturgen aus 1092 Basen besteht, die ein Protein von 364 Aminosäuren codieren. Wie für ein Lipoprotein zu erwarten ist, das über die innere Membran hinaus exportiert werden soll, beginnt die abgeleitete Aminosäuresequenz mit einem 20-Rest-Signalpeptid. Das LipL2-Strukturgen besteht aus 1065 Basen, die ein Protein von 355 Aminosäuren codieren. Wie für ein Lipoprotein zu erwarten ist, das über die innere Membran hinaus exportiert werden soll, beginnt die abgeleitete Aminosäuresequenz mit einem 19-Rest-Signalpeptid. Immunoblot-Studien zeigten, dass eine starke Wechselbeziehung zwischen der Leptospira-Pathogenität und der Reaktivität mit Antiseren gegen LipL1 und LipL2 besteht. LipL2 reagierte mit allen Stämmen von krankheitserregenden Leptospira, die untersucht wurden, jedoch nicht mit allen untersuchten, nicht krankheitserregenden Leptospira-Stämmen. LipL1 reagierte mit den meisten Stämmen von krankheitserregenden Leptospira, die untersucht wurden, jedoch nicht mit allen untersuchten, nicht krankheitserregenden Leptospira-Stämmen; obwohl in L. inadai eine geringe Menge an Reaktivität bestand, wurden in L. biflexa, L. wolbachii oder L. illini keine 41-kDa-Antigene nachgewiesen (11).
Die Bakteriengene für die LipL1- und LipL2-Membranproteine können von jedem Stamm krankheitserregender Leptospira abgeleitet werden. Vorzugsweise stammen die Proteine von Leptospira kirschneri, Serovar-Grippotyphosa.
Die Erfindung stellt Polynucleotide bereit, welche die Leptospira-LipL1- und LipL2-Proteine codieren. Diese Polynucleotide umfassen DNA- und RNA-Sequenzen, die das Protein codieren. Wie zuvor besprochen, ist zu verstehen, dass alle Polynucleotide, welche das gesamte LipL1 und LipL2 oder einen Teil davon codieren, hierin ebenfalls inbegriffen sind, solange sie eine Funktion von LipL1 und LipL2 aufweisen, wie z. B. die Fähigkeit, einen Antikörper zu stimulieren oder zu binden. Solche Polynucleotide umfassen sowohl natürlich auftretende als auch absichtlich manipulierte, beispielsweise mutagenisierte Polynucleotide.
Erfindungsgemäße DNA-Sequenzen können durch mehrere Verfahren erhalten werden. Beispielsweise kann die DNA unter Anwendung von im Stand der Technik wohlbekannten Hybridisierungsverfahren isoliert werden. Diese umfassen: 1) die Hybridisierung von Sonden mit genomischen Bibliotheken zum Nachweis gemeinsamer Nucleotidsequenzen und 2) das Antikörper-Screening von Expressionsbibliotheken zum Nachweis gemeinsamer struktureller Merkmale, ohne darauf beschränkt zu sein.
Hybridisierungsverfahren sind nützlich zum Screenen rekombinanter Klone durch Verwendung von markierten, gemischten, synthetischen Oligonucleotid-Sonden, wobei jede Sonde potentiell das vollständige Complement einer spezifischen DNA-Sequenz in der Hybridisierungsprobe ist, welche eine heterogene Mischung aus denaturierter doppelsträngiger DNA umfasst. Für ein solches Screening wird die Hybridisierung vorzugsweise entweder an einzelsträngiger DNA oder an denaturierter doppelsträngiger DNA durchgeführt. Durch Anwendung von stringenten Hybridisierungsbedingungen, die auf die Vermeidung einer nicht spezifischen Bindung abzielen, ist es beispielsweise möglich, durch Hybridisierung der Ziel-DNA mit jener einzelnen Sonde in der Mischung, die ihr vollständiges Complement ist, die autoradiographische Sichtbarmachung eines spezifischen DNA-Klons zu ermöglichen {Wallace, et al., Nucleic Acid Research, 9: 879 (1981)}.
Wahlweise kann eine Expressionsbibliothek indirekt auf LipL1- und LipL2-Peptide mit zumindest einem Epitop gescreent werden, wobei Antikörper gegen LipL1 und LipL2 eingesetzt werden. Solche Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal abgeleitet und zum Nachweis eines Expressionsprodukts, das die Gegenwart von LipL1- und LipL2-DNA anzeigt, verwendet werden. Im Allgemeinen wird eine Lambda gt11-Bibliothek immunologisch gemäß dem Verfahren von Huynh, et al., konstruiert und gescreent {in DNA Cloning: A Practical Approach, D. M. Glover, Hrgb., 1: 49 (1985)}.
Die Entwicklung von spezifischen DNA-Sequenzen, die LipL1 und LipL2 codieren, kann auch mittels: (1) einer Isolierung einer doppelsträngigen DNA-Sequenz von der genomischen DNA und (2) einer chemischen Herstellung einer DNA-Sequenz zwecks Schaffung der notwendigen Codone für das Polypeptid, das von Interesse ist, erzielt werden.
DNA-Sequenzen, die LipL1 und LipL2 codieren, können in vitro durch einen DNA-Transfer in eine geeignete Wirtszelle exprimiert werden. „Rekombinante Wirtszellen" oder „Wirtszellen" sind Zellen, in denen ein Vektor vermehrt und dessen DNA exprimiert werden kann. Der Begriff umfasst auch jegliche Nachkommen der gegenständlichen Wirtszelle. Es ist zu verstehen, dass nicht alle Nachkommen mit der elterlichen Zelle identisch sind, da es Mutationen geben kann, die bei der Replikation auftreten. Solche Nachkommen sind jedoch inbegriffen, wenn die obenstehenden Begriffe verwendet werden.
Der Begriff „Wirtszelle", wie er bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, soll nicht nur Prokaryonten, sondern auch Eukaryonten, wie z. B. Hefepilze, Fadenpilze sowie Pflanzen- und Tierzellen, umfassen. Der Begriff „Prokaryont" soll alle Bakterien umfassen, die mit dem Gen für die Expression des Leptospira-LipL1- und LipL2-Außenmembranproteins transformiert werden können. Prokaryontenwirte können sowohl gramnegative als auch grampositive Bakterien, wie z. B. E. coli, S. typhimurium und Bacillus subtilis, umfassen.
Ein rekombinantes DNA-Molekül, welches das LipL1- oder LipL2-Protein codiert, kann zur Transformation eines Wirts eingesetzt werden, wobei irgendeine der üblicherweise einem durchschnittlichen Fachmann bekannten Techniken angewandt wird. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines die LipL1- oder LipL2-codierende Sequenz enthaltenden Plasmids zum Zweck der Prokaryontentransformation. Wo der Wirt prokaryotisch ist, wie z. B. bei E. coli, können kompetente Zellen, die zu einer DNA-Aufnahme in der Lage sind, aus Zellen, die nach einer Phase des exponentiellen Wachstums geerntet und danach durch das CaCl₂-Verfahren behandelt werden, mit im Stand der Technik wohlbekannten Prozessen hergestellt werden. Wahlweise kann MgCl₂ oder RbCl eingesetzt werden. Eine Transformation kann auch nach der Bildung eines Protoplasten der Wirtszelle durchgeführt werden.
Bei der vorliegenden Erfindung kann die LipL1- oder LipL2-Sequenz in einen rekombinanten Expressionsvektor eingesetzt werden. Der Begriff „rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf ein Plasmid, einen Virus oder ein anderes im Stand der Technik bekanntes Vehikel, das durch Einfügung oder Einbau einer genetischen LipL1- oder LipL2-Sequenz manipuliert wurde. Solche Expressionsvektoren enthalten eine Promotor-Sequenz, welche die wirksame Transcription der eingefigten genetischen Sequenz im Wirt erleichtert. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Startpunkt für die Replikation, einen Promotor sowie spezifische Gene, die eine phänotypische Auswahl der transformierten Zellen ermöglichen. Die transformierten Prokaryontenwirte können gemäß im Stand der Technik bekannten Mitteln gezüchtet werden, um ein optimales Zellwachstum zu erhalten. Über verschiedene Shuttle-Vektoren für die Expression fremder Gene im Hefepilz wurde berichtet {Heinemann, et al., Nature, 340: 205 (1989); Rose, et al., Gene, 60: 237 (1987)}. Im Stand der Technik sind biologisch funktionelle DNA-Vektoren bekannt, die zur Expression und Replikation in einem Wirt in der Lage sind. Solche Vektoren werden zum Einbau von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen verwendet.
Verfahren zur Herstellung fusionierter, betriebsfähig verbundener Gene und zu deren Expression in Bakterien sind bekannt und beispielsweise im U.S.-Patent Nr. 4,366,246 dargestellt, das durch Bezugnahme hier inkludiert ist. Die darin beschriebenen genetischen Konstrukte und Verfahren können zur Expression von Leptospira-LipL1 und -LipL2 in Prokaryontenwirten eingesetzt werden.
Beispiele für Promotoren, die bei der Erfindung verwendet werden können, sind: rec A, trp, lac, tac und Bakteriophage Lambda p_R oder p_L. Beispiele für Plasmide, die bei der Erfindung verwendet werden können, sind bei Sambrook, et al. {Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982} aufgelistet.
Von der vorliegenden Erfindung bereitgestellte Antikörper sind mit dem LipL1- oder LipL2-Protein immunreaktiv. Diese Antikörper können polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper sein. Polyklonale Antikörper können gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie z. B. der Impfung eines Tieres mit LipL1- oder LipL2-Proteinen, der Sammlung und Reinigung der auf LipL1 oder LipL2 gerichteten Antiseren des Tieres, produziert werden. Monospezifische polyklonale Antikörper können ebenfalls unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren produziert werden. Ein Antikörper, der im Wesentlichen aus gepoolten monoklonalen Antikörpern mit verschiedenen epitopischen Spezifitäten besteht, sowie bestimmte monoklonale Antikörperpräparate werden ebenfalls bereitgestellt. Monoklonale Antikörper werden aus Fragmenten des Proteins, die das Antigen enthalten, durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren hergestellt {Kohler, et al., Nature, 256: 495 (1975); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Hrgb., (1989)}. Beispielsweise können monoklonale Antikörper durch das Verfahren von Kohler und Milstein hergestellt werden {Nature, 256: 495–497 (1975)}, indem Milzzellen von einem mit dem Immunogen oder einem Fragment davon geimpften Tier immortalisiert werden, und zwar üblicherweise durch Fusion mit einer immortalisierten Zelllinie (vorzugsweise einer Myelom-Zelllinie), die von derselben oder einer anderen Spezies wie das geimpfte Tier stammt, gefolgt von geeigneten Klonierungs- und Screening-Schritten. Die Antikörper können auch rekombinante monoklonale Antikörper sein, die gemäß den bei Reading, U.S.-Patent Nummer 4,474,893, oder Cabilly et al., U.S.-Patent Nummer 4,816,567, geoffenbarten Verfahren hergestellt werden. Die Antikörper können auch gemäß dem bei Segel et al., U.S.-Patent Nummer 4,676,980, geoffenbarten Verfahren chemisch konstruiert werden.
Der Begriff Antikörper oder Immunglobulin, wie er bei dieser Erfindung verwendet wird, umfasst intakte Moleküle sowie Fragmente davon, wie z. B. Fab, F(ab')₂, Fv, und einen einkettigen Antikörper (SCA), die einen Epitopen-Determinanten an LipL1 oder LipL2 binden können. SCA ist ein genetisch konstruiertes, fusioniertes, einkettiges Molekül, bei dem die variable Region der leichten Kette und die variable Region der schweren Kette durch einen geeigneten Polypeptid-Linker verkoppelt enthalten sind. Verfahren zur Herstellung dieser Fragmente sind im Stand der Technik bekannt, siehe z. B. Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988).
Wie zuvor besprochen, können geringfügige Modifikationen der primären LipL1- und LipL2-Aminosäuresequenzen zu Proteinen führen, die im Vergleich zu den hier beschriebenen LipL1- und LipL2-Proteinen eine im Wesentlichen äquivalente Funktion haben. Solche Modifikationen können beabsichtigt sein, wie durch eine auf die Sequenz gerichtete Mutagenese, oder können spontan sein. Alle durch diese Modifikationen hergestellten Proteine sind hier inbegriffen, solange LipL1- und LipL2-Funktionen existieren.
Die Isolierung und Reinigung von mikrobiell exprimierten Proteinen oder Fragmenten davon, die von der Erfindung bereitgestellt werden, kann durch herkömmliche Mittel, einschließlich der präparativen Chromatographie und immunologischer Trennungen unter Einschluss von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, durchgeführt werden.
Die Erfindung erstreckt sich auf alle Proteine, die gemäß den beschriebenen Verfahren durch einen Wirt modifiziert werden oder durch irgendwelche anderen, dem durchschnittlichen Fachmann bekannten Verfahren, wie beispielsweise durch Transfer von genetischem Material unter Verwendung eines lysogenen Phagen, modifziert werden, und die zu einem Prokaryonten (ihren, der das Leptospira-Gen für das LipL1- oder LipL2-Protein exprimiert. Prokaryonten, die mit dem das LipL1- oder LipL2-Protein codierenden Leptospira-Gen transformiert sind, sind besonders nützlich für die Herstellung von Proteinen, die zur Immunisierung eines Tieres eingesetzt werden können.
Bei einer Ausführungsform sieht die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung vor, die nützlich ist zum Hervorrufen einer Immunreaktion auf krankheitserregende Leptospira bei einem Tier und eine immunologisch wirksame Menge von LipL1 und/oder LipL2 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. Der Begriff „für die Immunitätserzeugung wirksame Menge", wie er für die Beschreibung der Erfindung verwendet wird, soll jene Menge an Leptospira-Antigen bezeichnen, die notwendig ist, um bei einem Tier die Erzeugung einer Immunreaktion auf Leptospira hervorzurufen. LipL1 und LipL2 sind besonders. nützlich für die Sensibilisierung des Immunsystem eines Tieres, so dass als ein Ergebnis eine Immunreaktion geschaffen wird, welche die Auswirkung einer Leptospira-Infektion mildert.
Nach den LipL1- und LipL2-Proteinen, d. h. deren Varianten, funktionellen Äquivalenten und Derivaten, welche wirksame Impfstoffe gegen Leptospirose sind, kann unter Anwendung der bei Bolin, C. A., et al., Am. J. Yet. Res., 52: 1639–1643 (1991) und Bey, R. F., et al., Infect. Immun., 10: 1051–1056 (1974), beschriebenen Verfahren gescreent werden.
Die in diesen Referenzen geoffenbarten Impfverfahren können auch zur Impfung von Tieren mit LipL1- und LipL2-Proteinen angewandt werden.
LipL1- und LipL2-Proteine können allein oder in Kombination z. B. parenteral durch eine Injektion, eine rasche Infusion, eine Aufnahme durch den Nasenschlund, eine Aufnahme über die Haut, und über den Magen-Darm-Kanal, z. B. oral, verabreicht werden. Pharmazeutisch akzeptable Trägerpräparate für die parenterale Verabreichung umfassen sterile oder wässrige oder nicht wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht wässrige Lösungsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöle, wie z. B. Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie z. B. Ethyloleat. Zur Steigerung der Hautdurchlässigkeit und zur Förderung der Antigenabsorption können Träger für Okklusiwerbände verwendet werden. Formen zur Flüssigkeitsdosierung für die orale Verabreichung können im Allgemeinen eine Liposomenlösung umfassen, welche die Form zur Flüssigkeitsdosierung enthält. Zum Suspendieren der Liposomen geeignete Formen umfassen Emulsionen, Suspensionen, Lösungen, Sirupe und Elixiere, welche im Stand der Technik häufig verwendete inerte Verdünnungsmittel, wie z. B. gereinigtes Wasser, enthalten.
Neben den inerten Verdünnungsmitteln können derartige Zusammensetzungen auch Hilfsstoffe, Benetzungsmittel, Emulgier- und Suspensionsmittel und Süßungs-, Aroma- und Duftmittel umfassen.
Beispielsweise können rekombinante Bakterien und Viren, die LipL1 und/oder LipL2 exprimieren, als Impfstoffe in den obenstehenden Zusammensetzungen verwendet und z. B. oral verabreicht werden. Die Impfstoffe können auch zu Ködern für mögliche Leptospira-Überträger, wie z. B. Nagetiere, hinzugefügt werden, so dass diese nicht mit Leptospira infiziert und zu Überträgern bei der Ausbreitung von Leptospira und der Krankheit auf Menschen und andere Tiere, wie z. B. Haustiere, werden.
Es ist auch möglich, dass die antigenen Präparate, welche die erfindungsgemäßen LipL1- und/oder LipL2-Proteine enthalten, einen Hilfsstoff umfassen. Hilfsstoffe sind Substanzen, die zur unspezifischen Verstärkung einer spezifischen Immunreaktion eingesetzt werden können. Normalerweise werden der Hilfsstoff und das Antigen vor der Einbringung in das Immunsystem vermischt, oder sie werden getrennt eingebracht, jedoch in dieselbe Stelle beim Tier, das immunisiert wird. Basierend auf ihrer Zusammensetzung können Hilfsstoffe lose in mehrere Gruppen unterteilt werden. Diese Gruppen umfassen Öladjuvanten (beispielsweise Freund's Complete and Incomplete Adjuvants), Mineralsalze {beispielsweise AlK(SO₄)₂, AlNa(SO₄)₂, AlNH₄(SO₄), Siliciumdioxid, Alaun, Al(OH)₃, Ca₃(PO₄)₂, Kaolin und Kohlenstoff}, Polynucleotide (beispielsweise Poly-IC- und Poly-AU-Säuren) und gewisse natürliche Substanzen (beispielsweise Wachs D vom Mycobacterium tuberculosis sowie Substanzen, die im Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis und Mitgliedern der Gattung Brucella gefunden werden).
Bei einer weiteren Ausführungsform ist eine Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines Tieres durch das Hervorrufen einer Immunreaktion auf krankheitserregende Leptospira beim Tier vorgesehen. Bei Anwendung eines Mehrfachimmunisierungssystems existieren viele verschiedene Techniken hinsichtlich der zeitlichen Festlegung der Immunisierungen. Es ist möglich, das antigene Präparat der Erfindung mehr als einmal zu verwenden, um die Stärken und die Diversität der Expression der Immunreaktion beim immunisierten Tier zu steigern. Werden Mehrfachimmunisierungen verabreicht, so werden diese typischerweise im Abstand von zwei bis vier Wochen angesetzt. Die Testsubjekte, bei denen eine Immunreaktion auf Leptospira wünschenswert ist, umfassen alle Tiere, die für eine Leptospira-Infektion anfällig sind. Die Tiere sind vorzugsweise Säugetiere. Beispiele für die Säugetiere sind: Menschen, domestizierte und wildlebende Säugetiere. Die domestizierten Säugetiere umfassen: Vieh wie Rinder, Schweine, Ziegen, Pferde, Büffel; und Haustiere wie Hunde.
Im Allgemeinen variiert die Dosis der einem Tier verabreichten LipL1- und/oder LipL2-Proteine in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie dem Alter, der Kondition, dem Geschlecht und dem Ausmaß der Erkrankung, falls vorhanden, und von anderen Variablen, die vom durchschnittlichen Fachmann angepasst werden können.
Die antigenen Präparate der Erfindung können entweder als Einfach- oder als Mehrfachdosierungen verabreicht werden und können z. B. von etwa 10 μg bis etwa 1.000 μg Leptospira-LipL1- und/oder LipL2-Antigen pro Dosis, noch bevorzugter von etwa 50 μg bis etwa 700 μg LipL1- und/oder LipL2-Antigen pro Dosis, am meisten bevorzugt von etwa 50 μg bis etwa 300 μg LipL1- und/oder LipL2-Antigen pro Dosis, variieren.
Bei Verwendung für die Immuntherapie können die erfindungsgemäßen Antikörper, vorzugsweise monoklonale Antikörper oder SCA, unmarkiert oder mit einem therapeutischen Mittel markiert sein. Diese Mittel können entweder direkt oder indirekt an die erfindungsgemäßen Antikörper gekoppelt werden. Ein Beispiel für eine indirekte Ankoppelung besteht in der Verwendung einer Spacergruppe. Diese Spacergruppen wiederum können entweder unlöslich oder löslich sein {Diener, et al., Science, 231: 148 (1986)} und können ausgewählt werden, um an der Zielstelle eine Arzneimittelfreisetzung aus dem Antikörpermolekül zu ermöglichen. Beispiele für therapeutische Mittel, die für die Immuntherapie an die Antikörper gekoppelt werden können, sind Arzneimittel, Radioisotope, Lektine und Toxine.
Die markierten oder unmarkierten Antikörper können auch in Kombination mit therapeutischen Mitteln, wie z. B. den obenstehend beschriebenen, verwendet werden. Besonders bevorzugt sind therapeutische Kombinationen, die den Antikörper und Immunmodulatoren und andere biologische Ansprechmodifikatoren umfassen.
Bei Verwendung des Antikörpers in Kombination mit verschiedenen therapeutischen Mitteln, wie z. B. den hierin beschriebenen, erfolgt die Verabreichung des Antikörpers und des therapeutischen Mittels üblicherweise im Wesentlichen gleichzeitig. Der Begriff „im Wesentlichen gleichzeitig" bedeutet, dass der Antikörper und das therapeutische Mittel in zeitlicher Hinsicht ziemlich nahe beieinander verabreicht werden. Üblicherweise wird es vorgezogen, das therapeutische Mittel vor dem Antikörper zu verabreichen. Beispielsweise kann das therapeutische Mittel 1 bis 6 Tage vor dem Antikörper verabreicht werden. In Abhängigkeit von solchen Faktoren wie z. B. der Natur der Störung, dem Zustand des Patienten und der Halbwertszeit des Mittels kann die Verabreichung des therapeutischen Mittels täglich oder in jedem anderen Intervall erfolgen.
Die Dosierungsbereiche für die Verabreichung von Antikörpern sind solche, die groß genug sind, um die gewünschte Wirkung zu erzielen, bei der die Anfangsymptome der Leptospirenerkrankung gemildert werden. Die Dosis sollte nicht so groß sein, um schädliche Nebenwirkungen, wie z. B. unerwünschte Kreuzreaktionen, anaphylaktische Reaktionen und dergleichen, hervorzurufen. Im Allgemeinen variiert die Dosis mit dem Alter, der Kondition, dem Geschlecht und dem Ausmaß der Erkrankung der Testperson und kann vom Fachmann festgelegt werden. Die Dosis kann bei Auftreten irgendeiner Komplikation vom jeweiligen Arzt angepasst werden. Die Dosis kann bei täglicher Verabreichung einer oder mehrerer Dosierungen über einen oder mehrere Tage hinweg z. B. von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 2000 mg/kg, vorzugsweise von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 500 mg/kg, variieren. Im Allgemeinen können bei Verabreichung der Antikörper in Verbindung mit therapeutischen Mitteln geringere Dosierungen eingesetzt werden, vergleichbar mit jenen, die für das diagnostische in vivo-Abbilden verwendet werden.
Die Antikörper können parenteral mittels Injektion oder mittels einer allmählichen, über die Zeit erfolgenden Perfusion verabreicht werden. Die Antikörper können intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrakavitär oder transdermal, allein oder in Kombination mit Effektorzellen, verabreicht werden.
Präparate zur parenteralen Verabreichung umfassen sterile wässrige oder nicht wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht wässrige Lösungsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöle, wie z. B. Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie z. B. Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Salzlösung und gepufferter Medien. Parenterale Vehikel umfassen die Natriumchloridlösung, die Ringersche Dextrose, Dextrose- und Natriumchlorid, intravenöse Ringersche Lactatvehikel umfassen flüssige und nährende Ergänzungsstoffe, Elektrolytergänzungsstoffe (wie z. B. jene, die auf Ringerscher Dextrose basieren) und dergleichen. Konservierungsmittel und andere Zusätze können ebenfalls vorhanden sein, wie z. B. antimikrobielle Mittel, Antioxidationsmittel, Chelatbildner und Inertgase, vorzugsweise isoliert oder im Wesentlichen rein, und dergleichen.
Ein Tier kann auch unter Verwendung der geoffenbarten, vorzugsweise isolierten oder in einer im Wesentlichen reinen Zusammensetzung vorliegenden Nucleinsäure-sequenzen, deren mutagenisierten Sequenzen oder Fragmenten davon, welche direkt injiziert oder in ein Plasmid eingebaut und dem Tier injiziert werden können, geimpft werden. Die Nucleinsäuresequenzen können vor der Injizierung mit einem pharmazeutisch akzeptablen. Träger vermischt werden. Die Injektionen können mit Hilfe einer Genpistole durchgeführt werden, wie z. B. bei Yang, N.-S. et al., Gene Therapy via Particle Bombardment: Applications of the Accell Gene Gun, in Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer, Wolff, J. A., Hrgb., Birkhauser, USA (1994), beschrieben.
Bei einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen einer mit krankheitserregenden Leptospira zusammenhängenden Störung bei einer Testperson vor, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer Zellkomponente mit einem Reagens, das an die Zellkomponente bindet. Die Zellkomponente kann eine Nucleinsäure, wie z. B. DNA oder RNA, oder ein Protein sein. Ist die Komponente eine Nucleinsäure, so ist das Reagens eine Nucleinsäuresonde oder ein PCR-Primer. Ist die Zellkomponente ein Protein, so ist das Reagens eine Antikörpersonde. Die Sonden werden detektierbar markiert, beispielsweise mit einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Verbindung, einer biolumineszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung, einem Metallchelatbildner oder einem Enzym. Der durchschnittliche Fachmann kennt andere geeignete Markierungen für die Bindung an den Antikörper oder kann diese unter Anwendung von routinemäßigen Versuchen feststellen.
Für die Zwecke der Erfindung kann ein Antikörper oder eine Nucleinsäuresonde, der bzw. die LipL1- oder LipL2-spezifisch ist, zum Nachweisen des Vorhandenseins des jeweiligen LipL1- oder LipL2-Proteins (unter Verwendung eines Antikörpers) oder Polynucleotids (unter Verwendung einer Nucleinsäuresonde) in biologischen Proben eingesetzt werden. Jede Probe, die eine nachweisbare Menge eines LipL1- oder LipL2-Antigens oder Polynucleotids enthält, kann verwendet werden. Bei dieser Erfindung bevorzugte Proben bestehen aus einer biologischen Flüssigkeits- oder Gewebeprobe. Bevorzugte Beispiele für eine biologische Flüssigkeitsprobe umfassen: Blut, Serum, Plasma, Tränenflüssigkeit, Milch, Urin und Zerebrospinalflüssigkeit. Bevorzugte Beispiele für eine biologische Gewebeprobe umfassen Gewebeproben von Leber und Niere und Gewebeteile endothelialen Ursprungs.
Ist die Zellkomponente eine Nucleinsäure, so kann es notwendig sein, die Nucleinsäure vor der Verbindung mit einer Leptospira-spezifischen Sonde zu amplifizieren. Vorzugsweise wird eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt, jedoch können andere Verfahren zur Nucleinsäure-Amplifizierung, wie z. B. die Ligase-Kettenreaktion (LCR), die ligasierte aktivierte Transcription (LAT) und die auf einer Nucleinsäuresequenz basierende Amplifikation (NASBA), eingesetzt werden.
Eine weitere Technik, die ebenfalls zu einer größeren Sensitivität führen kann, besteht in der Ankoppelung von Antikörpern an Haptene von geringer Molekülmasse. Diese Haptene können dann mittels einer zweiten Reaktion spezifisch nachgewiesen werden. Es ist beispielsweise üblich, solche Haptene wie Biotin, das mit Avidin reagiert, oder wie Dinitrophenyl, Pyridoxal und Fluorescein, die mit spezifischen Antihapten-Antikörpern reagieren können, zu verwenden.
Wahlweise kann das LipL1- oder LipL2-Protein zum Nachweisen von Antikörpern des jeweiligen LipL1- oder LipL2-Proteins in einer Probe eingesetzt werden. Das LipL1 und das LipL2 der Erfindung sind besonders geeignet für die Verwendung in Immunoassays, wobei sie in der Flüssigphase verwendet oder an einen Festphasenträger gebunden werden können. Zusätzlich können LipL1 und LipL2, die bei diesen Analysen verwendet werden, auf verschiedene Arten detektierbar markiert werden.
Beispiele für Immunoassays, welche das LipL1 und das LipL2 der Erfindung nutzen können, sind konkurrierende und nicht konkurrierende Immunoassays entweder im direkten oder im indirekten Format. Beispiele für solche Immunoassays sind der Radioimmunoassay (RIA), der Sandwich- (immunometrische Assay) und der Western-Blot-Assay. Die Detektion von Antikörpern, die an das erfindungsgemäße LipL1 oder LipL2 binden, kann unter Anwendung von Immunoassays durchgeführt werden, welche entweder im Vorwärts-, im Rückwärts- oder im gleichzeitigen Modus ablaufen, einschließlich immunhisto-chemischer Analysen mit biologischen Proben. Die LipL1- und LipL2-Konzentration, die eingesetzt wird, schwankt in Abhängigkeit vom Typ des Immunoassays und der Natur der nachweisbaren Markierung, die verwendet wird. Ungeachtet des Immunoassaytyps, der angewandt wird, kann die eingesetzte LipL1- und LipL2-Konzentration jedoch unter Anwendung von routinemäßigen Versuchen leicht von einem durchschnittlichen Fachmann festgestellt werden.
Das LipL1 und das LipL2 der Erfindung können an viele verschiedene Träger gebunden und zum Nachweisen des Vorhandenseins eines spezifisch mit dem Polypeptid reaktiven Antikörpers eingesetzt werden. Beispiele für wohlbekannte Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Dextran, Nylon, Amylosen, natürliche und modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Die Natur des Trägers kann für die Zwecke der Erfindung entweder löslich oder unlöslich sein. Der Fachmann kennt andere für die Bindung von LipL1 und LipL2 geeignete Träger oder wird unter Anwendung von routinemäßigen Versuchen in der Lage sein, solche festzustellen.
Es gibt viele verschiedene Markierungen und Markierungsverfahren, die dem durchschnittlichen Fachmann bekannt sind. Beispiele für die Typen von Markierungen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Enzyme, Radioisotope, Kolloidmetalle, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen und biolumineszierende Verbindungen.
Für die Zwecke der Erfindung kann der Antikörper, der an das erfindungsgemäße LipL1 oder LipL2 bindet, in verschiedenen biologischen Proben vorhanden sein. Jegliche Probe, die eine nachweisbare Menge von Antikörpern gegen LipL1 oder LipL2 enthält, kann verwendet werden. Bevorzugte Proben dieser Erfindung sind: eine biologische Flüssigkeits- oder Gewebeprobe. Bevorzugte Beispiele für eine biologische Flüssigkeitsprobe umfassen: Blut, Serum, Plasma, Tränenflüssigkeit, Milch, Urin und Zerebrospinalflüssigkeit. Bevorzugte Beispiele für eine biologische Gewebeprobe umfassen Gewebeproben von Leber und Niere und Gewebeteile endothelialen Ursprungs.
Die erfindungsgemäßen Antikörper, vorzugsweise monoklonale Antikörper und SCA, die auf LipL1 oder LipL2 abzielen, sind auch nützlich für den in vivo-Nachweis eines Antigens. Der detektierbar markierte Antikörper wird in einer Dosierung verabreicht, die diagnostisch wirksam ist. Der Begriff „diagnostisch wirksam" bedeutet, dass der Anteil an detektierbar markiertem monoklonalem Antikörper in einer Menge verabreicht wird, die ausreicht, um die Detektion des Leptospira-LipL1- oder LipL2-Antigens, für welches die Antikörper spezifisch sind, zu ermöglichen.
Die Konzentration des detektierbar markierten Antikörpers, der verabreicht wird, sollte ausreichend sein, so dass die Bindung an jene Zellen, jene Körperflüssigkeit oder jene Gewebeteile, die LipL1 und/oder LipL2 aufweisen, im Vergleich zum Hintergrund nachweisbar ist. Weiters ist es wünschenswert, dass der detektierbar markierte Antikörper rasch aus dem Kreislaufsystem herausgefiltert wird, um das beste Verhältnis zwischen Ziel und Hintergrundsignal zu ergeben.
In der Regel variiert die Dosis des detektierbar markierten Antikörpers für die in vivo-Diagnose in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie dem Alter, dem Geschlecht und dem Ausmaß der Erkrankung der Testperson. Die Antikörperdosis kann z. B. von etwa 0,001 mg/m² bis etwa 500 mg/m², vorzugsweise von 0,1 mg/m² bis etwa 200 mg/m², am meisten bevorzugt von etwa 0,1 mg/m² bis etwa 10 mg/m², variieren. Solche Dosierungen können zum Beispiel abhängig davon, ob Mehrfachinjektionen verabreicht werden, und von anderen, dem Fachmann bekannten Faktoren variieren.
Für die diagnostische in vivo-Abbildung ist der Typ des verfügbaren Nachweisinstruments ein Hauptfaktor bei der Auswahl eines bestimmten Radioisotops. Das gewählte Radioisotop muss eine Zerfallsart aufweisen, die für einen bestimmten Instrumententyp nachweisbar ist. Ein weiterer wichtiger Faktor bei der Auswahl eines Radioisotops für die in vivo-Diagnose besteht darin, dass die Halbwertszeit des Radioisotops lang genug ist, um zum Zeitpunkt der maximalen Aufnahme durch das Ziel noch nachweisbar zu sein, jedoch kurz genug ist, damit eine in Bezug auf den Wirt schädliche Strahlung minimiert wird. Idealerweise fehlt einem für die in vivo-Abbildung verwendeten Radioisotop eine Teilchenemission, es erzeugt im 140-250-Schlüsselbereich jedoch eine goße Anzahl an Photonen, die mit herkömmlichen Gammakameras leicht nachgewiesen werden können.
Für die in vivo-Diagnose können Radioisotope unter Verwendung einer funktionellen Zwischengruppe entweder direkt oder indirekt an Immunglobulin gebunden werden. Funktionelle Zwischengruppen, die oft zur Bindung von als Metallionen existierenden Radioisotopen an Immunglobuline verwendet werden, sind die bifunktionellen Chelat-bildner, wie z. B. die Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und die Ethylendiamintetra-essigsäure (EDTA) sowie ähnliche Moleküle. Typische Beispiele für Metallionen, welche an die monoklonalen Antikörper der Erfindung gebunden werden können, sind ¹¹¹In ⁹⁷Ru, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ⁸⁹Zr und ²⁰¹Tl.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können für die Zwecke der in vivo-Diagnose auch mit einem paramagnetischen Isotop markiert werden, wie bei der magnetischen Resonanzabbildung (MRI) oder der Elektronenspinresonanz (ESR). Im Allgemeinen kann jedes, herkömmliche Verfahren zur Sichtbarmachung einer diagnostischen Abbildung eingesetzt werden. Üblicherweise werden Gamma und Positronen emittierende Radioisotope für die Kameraabbildung und paramagnetische Isotope für MRI verwendet. Elemente, die bei solchen Techniken besonders nützlich sind, umfassen¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn ¹⁶²Dy, ⁵²Cr und ⁵⁶Fe.
Die erfindungsgemäßen Antikörper, vorzugsweise monoklonale Antikörper und SCA, können auch zur Überwachung des Besserungsverlaufs einer mit Leptospira zusammenhängenden Störung verwendet werden. Somit wäre es möglich, durch Messung der Zunahme oder Verringerung von Leptospira-LipL1- und/oder LipL2-Proteinen oder Antikörpern gegen LipL1- und/oder LipL2-Proteine, die in verschiedenen Körperflüssigkeiten oder Gewebeteilen vorhanden sind, festzustellen, ob eine bestimmte, auf die Besserung der Störung abzielende, therapeutische Behandlungsweise effektiv ist.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden Materialien sind für die Zusammenstellung einer Ausstattung ideal geeignet. Eine derartige Ausstattung kann eine Trägereinrichtung umfassen, die in Fächer unterteilt ist, um eng begrenzt einen oder mehrere Behältereinrichtungen, wie z. B. Ampullen, Röhrchen und dergleichen, aufzunehmen, wobei jede Behältereinrichtung eines der separaten Elemente, die beim Verfahren zu verwenden sind, enthält. Beispielsweise kann eine der Behältereinrichtungen ein LipL1- und/oder LipL2-bindendes Reagens, wie z. B. einen Antikörper, enthalten. Ein zweiter Behälter kann weiters LipL1- und/oder LipL2-Proteine enthalten. Die Bestandteile können, je nach Wunsch, in flüssiger oder gefriergetrockneter Form vorliegen.
Gemäß der obenstehenden Diskussion kann mittels der diagnostischen Tests, z. B. Nucleinsäure-Hybridisierungsanalysen oder Immunoassays, entweder hinsichtlich LipL1 oder LipL2 oder hinsichtlich beiden getestet werden. Wahlweise können sie aus Panel-Tests bestehen, mittels welcher hinsichtlich sowohl LipL1- als auch LipL2-Proteinen oder hinsichtlich Nucleinsäuresequenzen getestet wird, und zwar in Kombination mit anderen Proteinen oder Nucleinsäuresequenzen, die für Leptospira, insbesondere krankheits-erregende Leptospira, wie z. B. OmpL1 {Haake, D. A., et al., J. Bacteriol., 175: 4225–4234 (1993); U.S.- Patentanmeldung Seriennr. 08/040,747, „Cloned Leptospira Outer Membrane Protein" von Haake D. A., et al., eingereicht am 31. März 1993} und OmpL2 {U.S.-Patentanmeldung Seriennr. 08/249,013, „Cloned Leptospira Outer Membrane Protein" von Haake D. A., et al., eingereicht am 25. Mai 1994}, spezifisch sind. Gleichermaßen können die Zusammensetzungen beispielsweise für Immunoassays oder Impfungen einzeln aus LipL1 oder LipL2 bestehen. Wahlweise können sie aus einem Cocktail bestehen, der sowohl LipL1 als auch LipL2 oder diese Proteine in Kombination mit anderen Proteinen, die für Leptospira, insbesondere krankheitserregende Leptospira, wie z. B. OmpL1 und OmpL2, spezifisch sind, enthält. Die Antikörperzusammensetzungen können aus LipL1- oder LipL2-spezifischen Antikörpern bestehen. Wahlweise können sie aus einem Cocktail bestehen, der Antikörper gegen LipL1 und LipL2 oder gegen diese Proteine und andere Proteine, die für Leptospira, insbesondere krankheitserregende Leptospira, wie z. B. OmpL1 und OmpL2, spezifsch sind, enthält. Die Hybridisierungsanalysen werden vorzugsweise bei gemäßigten bis stringenten Bedingungen durchgeführt. Die Immunoassays werden vorzugsweise unter den Bedingungen einer reduzierten, nicht spezifischen Bindung durchgeführt. Somit sind die Testausstattungen und Verfahren, welche diese Zusammensetzungen einsetzen, dementsprechend mannigfaltig.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht einschränken. Obwohl sie für die Verfahren, die eingesetzt werden könnten, typisch sind, können wahlweise andere, dem Fachmann bekannte Verfahren angewandt werden.
BEISPIEL
Das nachfolgende Beispiel beschreibt die Identifizierung, Klonierung, Sequenzierung und Charakterisierung von LipL1 und LipL2. Es bestand eine starke Wechselbeziehung zwischen der Leptospiren-Pathogenität und der Reaktivität mit Antiseren gegen LipL1 und LipL2.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Leptospirenstämme. Virulente und Kultur-abgeschwächte Leptospira kirschneri, Stamm RM52, (ehemals L. alstoni) wurden von C. A. Bolin (National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Ames, Iowa) erhalten. Dieser Stamm wurde ursprünglich aus Material isoliert, das während eines Auftretens von Fehlgeburten bei Schweinen im Jahr 1983 dem Veterinary Diagnostic Laboratory an der Iowa State University übermittelt wurde {Thiermann, A. B., et al., Ann. Proc. Amer. Assn. Veterinary Laboratory Diagnosticians, 27: 233–244 (1984)}. Proben des Isolats wurden entweder in flüssigem Stickstoff aufbewahrt {Alexander, A. D., et al., International J. System. Bacteriol., 22: 165–169 (1972)} oder jede bzw. jede zweite Woche durch ein flüssiges EMJH-Medium geleitet {Johnson, R. C., et al., J. Bacteriol., 94: 27–31 (1967)}. Der virulente Stamm wurde weniger als fünf Passagen unterzogen. Der abgeschwächte Stamm wurde seit 1983 mehr als 200 Passagen unterzogen. Andere Leptospira-Arten wurden freundlicherweise von C. A. Bolin zur Verfügung gestellt.
Escherichia coli. E. coli DHSα (supE44, Δ1acU169, [∅80, lacZ, ΔM15], hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1) wurde als Wirtsstamm für Transformationen von rekombinanter DNA verwendet. Der E. coli-Stamm PLK-F' (recA, lac, mcrA, mcrB, hsdR, gal, supE [F' proAB, lacIgZΔM15, Tn10 (tet^R)]) wurde als Wirtsstamm für eine Infektion mit dem λzap II-Vektor (Stratagene, San Diego, Kalifornien) verwendet. Der E. coli-Stamm JM109 (recA1, supE44, endA1, hsdR17, gyrA96, relA1, thiΔ[lacproAB], F'[traD36, proAB⁺, lacI^q, lacZΔM15)) wurde als Wirtsstamm für den pRSET-Expressionsvektor (Invitrogen Corp., San Diego, Kalifornien) verwendet.
SDS-PAGE und Immunoblotting. Proben für eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurden in einem Endprobenpuffer (FSB), der, falls nicht anders angemerkt, aus 62,5 mM Trishydrochlorid (pH 68), 10% Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol, 2% SDS und 8 M Harnstoff zusammengesetzt war, aufgelöst. Proteine wurden auf einem 10%igen Gel mit einem diskontinuierlichen Puffersystem abgetrennt {Laemmli, U.K., Nature (London), 227: 680–685 (1970)} und für das Immunoblotting auf Nitrocellulose (Schleicher & Schuell Inc., Keene, New Hampshire) übertragen. Für einen Antigen-Nachweis mittels Immunoblots wurde die Nitrocellulose mit 5%iger fettfreier Trockenmilch in phosphatgepufferter Salzlösung – 0,1 % Tween-20 (PBS-T) – blockiert, eine Stunde lang mit einem 1 : 5000 (falls nicht anders angemerkt) in PBS-T verdünnten Antiserum inkubiert und mit einem mit Meerrettichperoxidase konjugierten Anti-Kaninchen-Antiserum vom Esel (Amersham Corporation, Arlington Heights, Illinois) untersucht. Unter Anwendung des verbesserten Chemilumineszenzsystems (ECL, Amersham) wurde die Antigen-Antikörper-Bindung nachgewiesen. Die Blots wurden eine Minute lang in ECL-Reagenzien inkubiert und danach einem XAR-S-Film (Fuji Medical Systems, Stamford, Connecticut) ausgesetzt.
Triton X-114-Extraktion von Leptospira. Mittels einer Modifikation des zuvor beschriebenen Verfahrens wurden Kultur-abgeschwächte L. kirschneri mit 1%igem Triton X-114 extrahiert {Haake; D. A., et al., Infection & Immunity, 59: 1131–40 (1991)}. Kurz gesagt, die Kultur-abgeschwächten L. kirschneri wurden zweimal in phosphatgepufferter Salzlösung, 5 mM MgCl₂, gewaschen und in Gegenwart von 1%igem Triton X-114 der Proteinklasse (Calbiochem, La Jolla, Kalifornien), 10 mM Tris, pH 8,1 mM PMSF, 1 mM Jodacetamid und 10 mM EDTA bei 4°C extrahiert. Das unlösliche Material wurde durch zehnminütige Zentrifugation bei 17.000 x g entfernt. Die Triton X-114-Konzentration des Überstands wurde auf 2% angehoben. Eine Phasentrennung wurde durchgeführt, indem der Überstand auf 37° erhitzt und einer zehnminütigen Zentrifugation bei 2.000 x g ausgesetzt wurde. Die Proteine der Detergentienphase und der wässrigen Phase wurden mit Aceton ausgefällt.
N-terminale Aminosäuresequenzierung. Lipoproteine wurden mittels SDS-PAGE isoliert und mit Staphylokokken-V8-Protease aufgeschlossen. Die Polypeptidfragmente wurden einer SDS-PAGE unterzogen, auf eine Trans-Blot-PVDF-Proteinsequenzierungsmembran (Bio-Rad, Richmond, Kalifornien) übertragen und an die University of California, Los Angeles (LTCLA), Protein Microsequencing Facility, übermittelt. Mit Hilfe eines Porton-1090-E-Gasphasen-Sequenators wurde mit einer Online-Detektion von PTH-Aminosäuren eine N-terminale Aminosäuresequenzanalyse durchgeführt.
Southern-Blot-Analyse. Durch das Verfahren von {Yelton, D. B., et al., Gene, 28: 147–152 (1984)} wurde genomische L. kirschneri-DNA hergestellt. Leptospiren-DNA wurde mit Eco RI aufgeschlossen und in einem 1,0%igen Agarosegel elektrophoretisch behandelt. Nach der Guanidinabspaltung, Denaturierung und Neutralisierung wurde die DNA nach dem Verfahren von Southern auf einen Nylonfilter (Zeta-Probe, Bio-Rad) übertragen {Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)}. Die Filter wurden 2 Stunden lang bei 80°C unter Vakuum gebrannt und 3 Stunden lang bei 37°C in einem Puffer, das 6X SSC, 1X Denhardtsche Lösung, 0,05% Natriumpyrophosphat, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt, prähybridisiert. Die Filter wurden danach mit radiomarkierten Oligonucleotiden über Nacht bei 37°C hybridisiert.
Zwei degenerierte Oligonucleotid-Sonden, von denen jede eine Länge von zwanzig Basenpaaren hatte, wurden auf Basis der N-terminalen Aminosäuresequenzen der Lipoproteinfragmente synthetisiert. Unter Verwendung eines automatischen Oligonucleotid-Synthetisierers (380B, Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien) wurden synthetische Oligonucleotide hergestellt. Die Filter wurden für die degenerierten Oligonucleotid-Sonden bei 47°C in 3,0 M Tetramethylammoniumchlorid (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin), 50 mM Tris, pH 8,0, 2,0 mM EDTA, 1,0% SDS gewaschen, wie zuvor beschrieben {Wood, W. I, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1585-1588 (1985)}. Die degenerierten Oligonucleotid-Sonden wurden mittels T4-Polynucleotidkinase (Promega Corp., Madison, Wisconsin) mit ³²P-dATP endmarkiert.
Klonierung und Sequenzierung des lipL1- und des lipL2-Gens. Standardverfahren mit rekombinanter DNA wurden wie beschrieben durchgeführt {Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)}. Restriktions-Endonuclease-Aufschlüsse wurden wie von den Lieferanten (New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts und Promega) empfohlen durchgeführt. Eco RI-Fragmente von genomischer L. kirschneri-DNA wurden in den Lambda Zap II-Vektor (Stratagene) ligasiert. Die ligasierte DNA wurde mit einem Gigapack II Gold-Verpackungsextrakt (Stratagene) verpackt und bei 4°C in 0,3%igem Chloroform aufbewahrt. Der Plaque-Titer wurde durch Infizierung mit E. coli PLK F'(Stratagene) bestimmt. Die Plaquen wurden plattiert, in doppelter Ausführung auf Filter übertragen und verarbeitet wie zuvor beschrieben {Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)}. Dieselbe Oligonucleotid-Sonden-Hybridisierung und dieselben Waschbedingungen, wie obenstehend hinsichtlich der Southern-Hybridisierung beschrieben, wurden angewandt. Mittels einer in vivo-Excision gemäß dem Hersteller wurden aus Phagen-produzierenden positiven Plaquen rekombinante pBluescript SK(-)-Klone gewonnen. Nach der Restriktionskartierung wurden geeignete DNA-Fragmente zu pBluescript SK subkloniert und an der UCLA Core DNA Sequencing Facility durch das Didesoxy-Kettenabbruch-verfahren mit Fluorescein-markierten Didesoxynucleotiden (Applied Biosystems Inc.) sequenziert.
DNA-Sequenzanalyse. Die DNA-Sequenzinformationen wurden durch das DNA-Strider-Programm analysiert {Marck, C., Nucleic Acids Res., 16: 1829–1836 (1988)}. Mit dem BLAST-, dem FASTA- und dem Profilsuchprogramm, die im Paket, Version 7.0, der University Of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Inc. (Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wisconsin) zu finden sind, wurden Homologie-Untersuchungen durchgeführt {Devereux, J. et al., Nucl. Acids Res., 12: 387–395 (1984)}. Voraussagen über die sekundäre Struktur basierten auf einer Analyse unter Verwendung der Programme PEPPLOT und PLOTSTRUCTURE, die auch im GCG-Paket zu finden sind.
Immunisierung mit dem His6-LipL1-Fusionsprotein. Aufgrund des Fehlens einer geeigneten Restriktions-Endonuclease-Schnittstelle nahe dem Amino-Terminus des reifen LipL1-Proteins wurde die Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifizierung des Abschnitts des lipLl-Gens eingesetzt, welcher das reife Protein codiert, und zwar beginnend mit dem ersten Rest nach dem aminoterminalen Cystein. Das 5'-Oligonucleotid enthielt die Nucleotidsequenz-Codierung für die sechs Aminosäuren, die dem aminoterminalen Cystein des reifen LipL1 folgten, einschließlich einer Bg/II-Restriktions-Endonuclease-Schnittstelle (unterstrichen): 5'-TTA ACG AGA TCT AAA AGT GAC GAC GAT GAT-3'. Das 3'-Oligonucleotid bestand aus einer 24-Basenpaar-Nucleotidsequenz, beginnend 133 Basenpaare stromabwärts vom lipL1-Stopcodon: 5'-CAT GAT AAA AAT TGA AAA TGA TTC AAG AAT-3'. Die Nucleotidsequenz zwischen dem lipL1-Stopcodon und der 3'-Oligonucleotidsequenz umfasst eine einmal vorhandene HindIII-Restriktions-Endonuclease-Schnittstelle. Als Matrize wurde genomische L. kirschneri-DNA, welche wie zuvor beschrieben hergestellt wurde {Yelton, et al., Gene, 28: 147–152 (1984)}, eingesetzt. Das 1144-Basenpaar-Bg/II- HindIII-Fragment des amplifizierten lipL1-Gens wurde zu mit Bg1II und HindIII aufgeschlossenem pRSETb (Invitrogen) ligasiert. Das resultierende Konstrukt pRSETb-JR2 wurde in E. coli JM109 (Invitrogen) transformiert. Die Expression des His6-LipL1-Fusionsproteins wurde erzielt durch eine Isopropylthio-b-D-Galactosid (IPTG, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri)-Induktion, gefolgt von einer Infektion mit einem M13/T7-Phagen, der das vom E. coli lac-Promotor getriebene T7-Polymerasegen enthielt. Das His6LipL1-Fusionsprotein wurde in 6 M Guanidin aufgelöst und durch eine Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ni²⁺-NTA-Agarose (Qiagen) gereinigt und in 20 mM Tris, pH 8, 50 mM NaCl und 10% Glycerin dialysiert. Ungefähr 30 Mikrogramm His6-LipL1 wurden mit einem Freundschen Volladjuvans vermischt und subkutan und intramuskulär einem männlichen New Zealand White-Kaninchen eingeimpft. Bei der Sekundärimmunisierung wurden ungefähr 30 Mikrogramm gereinigtes His6-LipL1-Fusionsprotein in einem unvollständigen Freundschen Adjuvans eingesetzt. Dem Kaninchen wurde zwei Wochen nach der Sekundärimmunisierung Blut abgenommen.
Immunisierung mit einem His6-LipL2-Fusionsprotein. Ein 842-Basenpaar-HaeIII-ClaI-Fragment des lipL2-Gens, welches die aminoterminalen Dreiviertel des Proteins codierte, wurde zu mit PvuII und ClaI aufgeschlossenem pRSETa (Invitrogen) ligasiert. Das resultierende Konstrukt pRSETa-800HC wurde in E. coli JM109 (Invitrogen) transformiert. Die Expression des His6-LipL2-Fusionsproteins wurde erzielt durch eine Isopropylthio-b-D-Galactosid (IPTG, Sigma)-Induktion, gefolgt von einer Infektion mit einem M13/T7-Phagen, der das vom E. coli lac-Promotor getriebene T7-Polymerasegen enthielt. Das His6-LipL2-Fusionsprotein wurde in 6 M Guanidin aufgelöst und durch eine Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ni²⁺-NTA-Agarose (Qiagen) gereinigt und in 20 mM Tris, pH 8, 50 mM NaCl und 10% Glycerin dialysiert. Ungefähr 400 Mikrogramm His6-LipL2 wurden mit einem Freundschen Volladjuvans vermischt und subkutan und intramuskulär einem männlichen New Zealand White-Kaninchen eingeimpft. Bei der Sekundärimmunisierung wurden ungefähr 450 Mikrogramm gereinigtes His6-LipL2-Fusionsprotein in einem unvollständigen Freundschen Adjuvans eingesetzt. Dem Kaninchen wurde zwei Wochen nach der Sekundärimmunisierung Blut abgenommen.
ERGEBNISSE
Design von Oligonucleotid-Sonden und Klonierung des lipL1-Gens. Ein Staphylokokken-V8-Protease-Aufschluss von LipL1 erbrachte Fragmente mit Molekülmassen in der Größenordnung von 21, 9 und 5 kDa. Eine N-terminale Aminosäuresequenzanalyse des 21 kDa-Fragments enthüllte die Sequenz YFGKTVLVRPSEQAKQKQIVLL. Eine 23-Basenpaar-Oligonucleotid-Sonde mit 256-facher Degeneration, nämlich GA(AG)CA(AG)GC(AGCT)AA(AG)CA(AG)AA(AG)CA(AG)AT, wurde basierend auf dem Sequenzabschnitt EQAKQKQI entworfen. Die Oligonucleotid-Sonde identifizierte mittels Southern-Hybridisierung des L. kirschneri-Genoms unabhängig ein 2,3 kb Eco RI-Fragment. Das 2,3 kb Eco RI-Fragment wurde, wie zuvor beschrieben, aus einer teilweisen Lambda-ZAP II (Stratagene)-Bibliothek der genomischen L. kirschneri-DNA kloniert {Haake, D. A., et al., J. Bacteriol., 175: 4225–4234 (1993)}.
Design von Oligonucleotid-Sonden und Klonierung des LipL2-Gens. Ein Staphylokokken-V8-Protease-Aufschluss von LipL2 erbrachte Fragmente mit Molekülmassen in der Größenordnung von 21 und 17 kDa. Eine N-terminale Aminosäuresequenz analyse des 17 kDa-Fragments enthüllte die Sequenz ASLSLTGITKNRAKIGNL. Eine 20-Basenpaar-Oligonucleotid-Sonde mit 864-facher Degeneration, nämlich AC(TAG)GG (TAG)AT(CAT)AC(TCAG)AA(AG)AA(TC)(AC)G, wurde basierend auf dem Sequenzabschnitt TGITKNR entworfen. Eine Codon-Ausrichtung wurde für den ersten Threoninrest und den Glycinrest eingesetzt, und zwar basierend auf dem geringen GC-Gehalt der Leptospira spp. {Johnson, et al., Family II. Leptospiraceae, In N. R. Krieg und J. G. Holt (Hrgb.) Bergeys Handbuch der systematischen Bakteriologie, Band 1, S. 62–67, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, (1984)}. Die Oligonucleotid-Sonde identifizierte mittels Southern-Hybridisierung des L. kirschneri-Genoms unabhängig ein 2,3 kb Eco RI-Fragment. Das 2,3 kb Eco RI-Fragment wurde, wie zuvor beschrieben, aus einer teilweisen Lambda-ZAP II (Stratagene)-Bibliothek der genomischen L. kirschneri-DNA kloniert {Haake, D. A., et al., J. Bacteriol., 175: 4225–4234 (1993)}.
Sequenzanalyse des lipL1-Gens. Restriktionskartierung, Southern-Blot-Analyse und DNA-Sequenzierung zeigten, dass das gesamte lipL1-Gen durch das 2,3 kb Eco RI-Fragment codiert wird (1). Ein intakter offener Leseraster wurde 430 Basenpaare stromabwärts von der Eco RI-Stelle identifiziert. Das lipL1-Strukturgen besteht aus 1092 Basen, die ein Protein aus 364 Aminosäuren codieren. E. coli-artige -35 (TTGACC) und -10 (TATTAT)-Promotor-Bereiche und eine Consensus-Ribosomen-Bindungsstelle (AAGAGG) sind stromaufwärts vom Start-Codon vorhanden (2). Wie für ein Lipoprotein zu erwarten, beginnt die abgeleitete Aminosäuresequenz mit einem 20-Rest-Signalpeptid, das durch den N-terminalen Peak in der Hydrophobizitätskurve dargestellt ist (3). Die LipL1-Sequenz stimmt mit den für Prokaryonten-Lipoprotein-Signalpeptide aufgestellten Regeln überein {Pugsley, A. P., Microbiol. Rev., 57: 50–108 (1993); Hayashi, S., et al., J. Bioenerg. Biomembr., 22: 451–471 (1990)}. Das LipL1-Signalpeptid besitzt einen basischen aminoterminalen Bereich (einschließlich Argininen an den Positionen 2 und 3), einen hydrophoben Kern (Aminosäuren 8 bis 20) und eine carboxyterminale Leu-X-Y-Cys-Signalpeptidase II-Spaltstelle. Die Staphylokokken-V8-Protease spaltet bekanntermaßen Peptide, die sauren Aminosäuren folgen. Unmittelbar nach dem Glutaminsäurerest 174 befindet sich eine Sequenz, die in 20 der 22 Aminosäuren mit der durch die N-terminale Aminosäuresequenzanalyse des nativen Proteins erhaltenen Sequenz identisch ist (2). Nach der Furchungsteilung des 20-Aminosäure-Signalpeptids durch die Leptospiren-Signalpeptidase II hätte das reife Polypeptid eine vorhergesagte Molekülmasse von 35,3 kDa. Dreißig Basenpaare stromabwärts vom Terminator-Codon befindet sich eine invertierte Sequenzwiederholung, die als Rhounabhängiger Transcriptionsterminator fungieren kann (2). Eine Datenbankdurchsuchung unter Anwendung des FASTA-, des BLAST- und des Profilsuchprogramms enthüllte keinerlei signifikanten Aminosäure-Homologien. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von LipL1 besitzt zwei ungewöhnliche Merkmale. Das erste ist eine Reihe von sechs aufeinanderfolgenden Asparaginsäureresten, beginnend drei Reste nach dem N-terminalen Cystein des reifen Proteins. Das zweite ungewöhnliche Merkmal ist das reichliche Vorkommen von Alaninresten. Im reifen LipL1-Protein sind 55/344 Reste Alanine, wovon 25 in Paaren oder Tripletts angeordnet sind.
Sequenzanalyse des lipL2-Gens. Restriktionskartierung, Southern-Blot-Analyse und DNA-Sequenzierung zeigten, dass das gesamte lipL2-Gen durch das 2,25 kb Eco RI-Fragment codiert wird (4). Ein intakter offener Leseraster wurde 170 Basenpaare stromabwärts von der EcoRI-Stelle identifiziert. Das lipL2-Strukturgen besteht aus 1065 Basen, die ein Protein aus 355 Aminosäuren codieren. E. coli-artige -35 (TTGACA) und -10 (TTAAAT)-Promotor-Bereiche und eine Consensus-Ribosomen-Bindungsstelle (AGGA) sind stromaufwärts vom Start-Codon vorhanden (5). Wie für ein Lipoprotein zu erwarten, beginnt die abgeleitete Aminosäuresequenz mit einem 19-Rest-Signalpeptid, das durch den Nterminalen Peak in der Hydrophobizitätskurve dargestellt ist (6). Die LipL2-Sequenz stimmt mit den für Prokaryonten-Lipoprotein-Signalpeptide aufgestellten Regeln überein {Pugsley, A. P., Microbiol. Rev., 57: 50–108 (1993); Hayashi, S., et al., J. Bioenerg. Biomembr., 22: 451–471 (1990)}. Das LipL2-Signalpeptid besitzt einen basischen aminoterminalen Bereich (einschließlich eines Arginins an der Position 2 und eines Lysins an der Position 3), einen hydrophoben Kern (Aminosäuren 4 bis 17) und eine carboxyterminale Leu-X-Y-Cys-Signalpeptidase II-Spaltstelle. Die Staphylokokken-V8-Protease spaltet bekanntermaßen Peptide, die sauren Aminosäuren folgen. Unmittelbar nach dem Glutaminsäurerest 104 befindet sich eine Sequenz aus 18 Aminosäuren, die zu 100% mit jener Sequenz identisch ist, die durch die N-terminale Aminosäuresequenzanalyse des nativen Proteins erhalten wird (5). Nach der Furchungsteilung des 19-Aminosäure-Signalpeptids durch die Leptospiren-Signalpeptidase II hätte das reife Polypeptid eine vorhergesagte Molekülmasse von 36,8 kDa. Siebenundzwanzig Basenpaare stromabwärts vom Terminator-Codon befindet sich eine invertierte Sequenzwiederholung, die als Rho-unabhängiger Transcriptionsterminator fungieren kann (5). Eine Datenbank-durchsuchung unter Anwendung des ASTA-, des BLAST- und des Profilsuchprogramms enthüllte keinerlei signifikanten Aminosäure-Homologien. Die Ausrichtung der LipL2-Aminosäuresequenz auf die OspA-Sequenz von B. burgdorferi unter Anwendung des GAP-Programms enthüllte jedoch einen Bereich von 53% Identität in den 15 carboxyterminalen Resten.
L. kirschneri acyliert LipL1 und LipL2. Die intrinsische Markierung von Kulturabgeschwächten L. kirschneri mit dem [³H]-Palmitat führte zum Einbau der Markierung in ein Leptospiren-Glycolipid (lipopolysaccharidartige Substanz), das am Boden der gesamten Organismus-Bahn diffus aufscheint, sowie zu mindestens zehn Proteinen, die in der gesamten Organismus-Bahn getrennte Banden bilden (7 und 8). Immunpräzipitationsversuche mit einem Anti-LipL1-Antiserum (7) und einem Anti-LipL2-Antiserum (8) bestätigen, dass diese beiden Proteine das zweit- bzw. das drittkleinste Lipoprotein sind, die in diesen Autoradiogrammen identifiziert werden.
Expression von LipL1 und LipL2 in Leptospira-Arten. Um die Stärke und Verteilung der LipL1- und LipL2-Expression anzusprechen, wurde an einer Liste von Leptospira-Arten unter Verwendung spezifischer Antiseren eine Immunoblot-Analyse durchgeführt. 10 zeigt, dass Molekülmasse und Menge des produzierten LipL1 extrem variabel sind, obwohl LipL1 von einem Großteil der Leptospirenerreger produziert wird. Es zeigte sich, dass der L. kirschneri-RM52-Stamm unter den untersuchten Leptospira-Arten das meiste LipL1 produzierte. Ein Vergleich des LipL1-Immunoblots mit dem Coomassieblaugefärbten Gel (9) zeigt, dass die beobachteten Unterschiede nicht völlig auf Basis der bevorzugten Reaktivität des LipL1-Antiserums mit dem Ausgangsstamm erklärt werden können. Im Gegensatz dazu zeigt 11, dass Molekülmasse und Menge von unter krankheitserregenden Leptospira-Arten exprimiertem LipL2 hochkonserviert sind. LipL2 wird von allen untersuchten Leptospirenerregern in verhältnismäßig derselben Menge exprimiert.
Es bestand eine starke Wechselbeziehung zwischen der Leptospiren-Pathogenität und der Reaktivität mit Antiseren gegen LipL1 und LipL2. LipL1 wurde weder in L. biflexa, L. inadai oder L. wolbachii, noch in drei nicht krankheitserregenden Leptospira-Arten, noch im verwandten Nichterreger Leptonema illini nachgewiesen (10). Obwohl es in L. inadai ein geringes Maß an Reaktivität gab, wurden in L. biflexa, L. wolbachii oder L. illini keine 41 kGa-Antigene nachgewiesen (11).
Verhalten von LipL1 und LipL2 während der Triton X-114-Extraktion und der Phasenteilung. Sowohl LipL1 als auch LipL2 teilten sich selektiv in die Triton X-114-Detergentienphase (12 und 13), ein bekanntes Charakteristikum von Lipoproteinen. LipL1 wurde in 1%igem Triton X-114 vollständig extrahiert, wie durch die komplette Entfernung aus dem Detergenz-unlöslichen Pellet demonstriert (12). Im Gegensatz dazu wurde im unlöslichen Pellet eine restliche LipL2-Reaktivität vorgefunden (13), ein Muster, das zuvor hinsichtlich OmpL1 beobachtet wurde {Haake, D. A., et al., J. Bacteriol., 175: 4225–4234 (1993)}.
Hinweise, die nahelegen, dass LipL1 und LipL2 zwei Leptospiren-Lipoproteine sind. Mehrere Beweislinien stützen die Schlussfolgerung, dass diese Proteine Lipoproteine sind. Erstens wurde entdeckt, dass beide Proteine gegenüber einer N-terminalen Aminosäuresequenzierung blockiert sind, bis sie einem Staphylokokken-V8-Protease-Aufschluss ausgesetzt werden. Zweitens enthüllt eine Analyse ihrer abgeleiteten Aminosäuresequenzen ein Signalpeptid, gefolgt von einer L-X-Y-C-Signalpeptidase II-Spaltstelle. Drittens werden LipL1 und LipL2 mit einer intrinsischen [³H]-Palmitat-Markierung von L. kirschneri markiert. Schließlich teilen sich sowohl LipL1 als auch LipL2 selektiv in die Triton X-114-Detergentienphase.
Obwohl sich sowohl LipL1 als auch LipL2 in die Triton X-114-Detergentienphase teilen, scheinen sie sich vom von Zuerner, et al. im L. interrogans-Serovar Pomona identifizierten 31 kDa-Protein {Zuerner, et al., Microbial. Pathogenesis, 10: 311–322 (1991)} zu unterscheiden. Antiseren gegen LipL1 und LipL2 reagierten mit L. interrogans-Serovar-Pomona-Antigenen, die deutlich größer waren als 1 kDa (10 und 11).
Das Vorangegangene soll den Umfang der Erfindung veranschaulichen, aber nicht einschränken. Auf Basis der hier enthaltenen Lehren kann der durchschnittliche Fachmann in der Tat mit Leichtigkeit weitere Ausführungsformen ohne unnötiges Experimentieren planen und herstellen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Protein, umfassend die Aminosäuresequenz eines Proteins, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: LipL1, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die als Aminosäurereste 1 bis 364 in SEQ ID NO: 3 oder als Aminosäurereste 21 bis 364 in SEQ ID NO: 3 dargestellt ist, und LipL2, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die als Aminosäurereste 1 bis 355 in SEQ ID NO: 6 oder als Aminosäurereste 20 bis 355 in SEQ ID NO: 6 dargestellt ist.
Im Wesentlichen reines Protein, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: LipL1, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie in SEQ ID NO: 3 dargestellt ist, und LipL2, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie in SEQ ID NO: 6 dargestellt ist.
Im Wesentlichen reines Protein mit einer Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 6, ohne deren jeweilige Signalpeptidsequenzen.
Isoliertes Polynucleotid mit einer Nucleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, 2, 4 und 5, ohne einen eine Signalpeptidsequenz codierenden Bereich.
Isoliertes Polynucleotid mit einer Nucleinsäuresequenz, welche das isolierte Protein des Anspruchs 1 codiert.
Rekombinanter Vektor, welcher die Nucleinsäuresequenz des Anspruchs 5 umfasst.
Zelle, welche vom Vektor des Anspruchs 6 transformiert wird.
Zelle des Anspruchs 7, wobei die Zelle ein Prokaryont ist.
Prokaryont des Anspruchs 8, wobei der Prokaryont E. coli ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, umfassend eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 6, welches die folgenden Schritte umfasst: die Transformation eines Wirts mit der Nucleinsäuresequenz des Anspruchs 5; und die Expression der Nucleinsäuresequenz im Wirt.
Verfahren des Anspruchs 10, welches weiters die Schritte des Isolierens des Proteins umfasst.
Verfahren des Anspruchs 11, wobei der Wirt ein Prokaryont ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die nützlich ist zum Hervorrufen einer Immunreaktion auf krankheitserregende Leptospira bei einem Tier und die eine für die Immunitätserzeugung wirksame Menge des Proteins mit der Aminosäuresequenz, die als Aminosäurereste 1 bis 364 in SEQ ID NO: 3 oder als Aminosäurereste 21 bis 364 in SEQ ID NO: 3 dargestellt ist, oder des Proteins mit der Aminosäuresequenz, die als Aminosäurereste 1 bis 355 in SEQ ID NO: 6 oder als Aminosäurereste 20 bis 355 in SEQ ID NO: 6 dargestellt ist, allein oder in Kombination in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung des Anspruchs 13, wobei der pharmazeutisch akzeptable Träger einen Hilfsstoffumfasst.
Zusammensetzung des Anspruchs 13 zur Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines Tieres durch Hervorrufen einer Immunreaktion auf krankheits-erregende Leptospira beim Tier.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die nützlich ist zum Hervorrufen einer Immunreaktion auf krankheitserregende Leptospira bei einem Tier und eine für die Immunitätserzeugung wirksame Menge von Antikörpern umfasst, die das Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 oder das Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 oder beide binden, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Antikörper, der ein Protein binden kann, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus dem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 und dem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6.
Antikörper des Anspruchs 17, wobei der Antikörper polyklonal ist.
Antikörper des Anspruchs 18, wobei der Antikörper monoklonal ist.
Verfahren zum Nachweisen von Leptospira in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte: das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Nucleinsäuresequenzsonde, die an eine Nucleinsäuresequenz binden kann, welche das Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 oder das Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ II) NO: 6 codiert, und das Nachweisen einer solchen Bindung.
Verfahren zum Nachweisen von Leptospira in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte: das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Antikörper, der an das Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 oder das Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 binden kann, und das Nachweisen einer solchen Bindung.
Verfahren des Anspruchs 21; wobei die Probe eine biologische Probe ist.
Verfahren des Anspruchs 22, wobei die Probe von einem Säugetier stammt.
Verfahren zum Nachweisen eines Antikörpers, der ein Antigen binden kann, in einer Probe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem Antigen unter Bedingungen, welche erlauben, dass der Antikörper an das Antigen bindet, und das Nachweisen der Bindung des Antikörpers an das Antigen; wobei das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus dem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 und dem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6.
Verfahren des Anspruchs 24, wobei das Antigen detektierbar markiert ist.
Ausstattung, die nützlich ist zum Nachweisen eines Antigens, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus dem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 und dem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6, wobei die Ausstattung einen oder mehrere Behälter umfasst, die ein Reagens enthalten, welches das Antigen binden kann.
Ausstattung des Anspruchs 26, wobei das Reagens ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Antikörper und einer Nucleinsäuresequenz, die für das Antigen spezifisch sind.
Ausstattung, die nützlich ist zum Nachweisen eines Antikörpers gegenüber einem Antigen, wobei die Ausstattung einen oder mehrere das Antigen enthaltende Behälter umfasst, wobei das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus dem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 und dem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6.
Verfahren des Anspruchs 20, wobei das Leptospira krankheitserregend ist.
Verfahren des Anspruchs 21, wobei das Leptospira krankheitserregend ist.
Im Wesentlichen reine Polynucleotidzusammensetzung,umfassend eine Nucleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, 2, 4 und 5, ohne einen eine Signalpeptidsequenz codierenden Bereich.
Im Wesentlichen reine Polynucleotidzusammensetzung des Anspruchs 31, welche weiters einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.