NO329227B1 - Anvendelse av borreliacidal(e) epitoper av Borrelia burgdorferi ytre overflateprotein C som vaksine - Google Patents
Anvendelse av borreliacidal(e) epitoper av Borrelia burgdorferi ytre overflateprotein C som vaksine Download PDFInfo
- Publication number
- NO329227B1 NO329227B1 NO20010412A NO20010412A NO329227B1 NO 329227 B1 NO329227 B1 NO 329227B1 NO 20010412 A NO20010412 A NO 20010412A NO 20010412 A NO20010412 A NO 20010412A NO 329227 B1 NO329227 B1 NO 329227B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- ospc
- antibody
- seq
- borreliacidal
- fragment
- Prior art date
Links
- 230000001449 borreliacidal effect Effects 0.000 title abstract description 82
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 19
- 101900341261 Borrelia burgdorferi Outer surface protein C Proteins 0.000 title 1
- 108700023315 OspC Proteins 0.000 claims abstract description 109
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 101
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims abstract description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 43
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 42
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 42
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 42
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 17
- 206010061591 Borrelia infection Diseases 0.000 claims description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 abstract description 70
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 8
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 41
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 32
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 description 31
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 27
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 19
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 18
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 17
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 16
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 16
- 101150055083 ospC gene Proteins 0.000 description 16
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 16
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 16
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 11
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 8
- 239000007434 bsk-medium Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 229940042470 lyme disease vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241001473877 Biserrula isolate Species 0.000 description 3
- 241000483002 Euproctis similis Species 0.000 description 3
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 2
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 2
- 241001148604 Borreliella afzelii Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010062488 Erythema migrans Diseases 0.000 description 2
- 101000578940 Homo sapiens PDZ domain-containing protein MAGIX Proteins 0.000 description 2
- -1 Isopropyl- Chemical group 0.000 description 2
- 241000238703 Ixodes scapularis Species 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 102100028326 PDZ domain-containing protein MAGIX Human genes 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- KBTZIRDXUNOZMF-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.NC1=CC=CC=C1N KBTZIRDXUNOZMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 2
- UPLPHRJJTCUQAY-WIRWPRASSA-N 2,3-thioepoxy madol Chemical compound C([C@@H]1CC2)[C@@H]3S[C@@H]3C[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@](C)(O)[C@@]2(C)CC1 UPLPHRJJTCUQAY-WIRWPRASSA-N 0.000 description 1
- 101710157236 41 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 239000005996 Blood meal Substances 0.000 description 1
- 241001148605 Borreliella garinii Species 0.000 description 1
- 206010062746 Carditis Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241000256135 Chironomus thummi Species 0.000 description 1
- 108010034753 Complement Membrane Attack Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010015108 Epstein-Barr virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000238681 Ixodes Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000021646 inflammation of heart layer Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000030175 lameness Diseases 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000020470 nervous system symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 230000003571 opsonizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/828—Bacterial vaccine for canidae or mustelidae, e.g. dogs, foxes, minks
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører et isolert immunogenisk polypeptidfragment av OspC av Borrelia burgdorferi, et isolert polypeptid, et isolert DNA-molekyl, en ekspresjonsvektor, en farmasøytisk sammensetning for å vaksinere mot, og for å behandle borrelia-infeksjon i pattedyr, inkludert mennesker, anvendelse av et isolert polypeptid, en fremgangsmåte for å detektere borrelia-infeksjon i pattedyr, inkludert mennesker,samt et kit for diagnostisering av borrelia-infeksjon i pattedyr, inkludert mennesker.
Derved vedrører den foreliggende oppfinnelse materialer og fremgangsmåter som er nyttige for å hindre, og behandle og tidlig diagnostisere Lyme-sykdom i mennesker og andre dyr. Nærmere bestemt vedrører foreliggende oppfinnelse polypeptider av ytre overflateprotein (OSP) som er i stand til å utløse, i en pasient, dannelse av en spesifikk immunrespons som er effektiv for å diagnostisere, predikere suksessfull utrydding av infeksjon eller beskytte mot Lyme-sykdommen i en mammalsk vert. Oppfinnelsen vedrører også screene-metoder for å detektere anti-Osp borreliacidal antistoffaktivitet, og antistoff som reagerer med et proteinfragment kodet for av et Dral-Smal DNA-fragment av OspC. Også innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er et diagnosekitt omfattende antistoffer eller polypeptidene, og vaksiner som anvender borreliacidale etitoper av OspA, OspB eller OspC eller et konservert DNA-sekvensfragment sammen med eller eller uten en vaksinebærer.
Lyme-sykdommen (Lyme borreliosis) spredes med et bitt fra en infisert midd, og er den mest vanlige rapporterte blodmiddbårede infeksjon i Europa og i Nord-Amerika. Denne multiforstyrrelse har forårsaket signifikant dødelighet verden over.
Lyme-sykdommen er forårsaket av spirocheten Borrelia burgdorferi ( B. b), som i hovedsak overføres ved blodmating av Ixodes ssp blodmidd. Innledningsvis infiserer spirochetene huden, og i de fleste av de tidligere tilfeller, forårsaker en skade i erythema migrans (2). De som blir rammet trenger ikke bli syk før etter uker, og nervesystem-symptomer (hodepine, svimmelhet, høreproblemer, prikking og konsentrasjonsvansker) trenger ikke å forekomme før etter uker eller måneder. Det er kjent at infeksjon kan spredes til nervesystemet eller ledd, og risikoen for nevrologiske komplikasjoner eller komplikasjoner i ledd øker jo lenger sykdommen får foregå ubehandlet. Infeksjonen kan være asymptomatisk, eller ha en rekke kliniske presentasjoner avhengig av det vev som er angrepet, infeksjonens varighet, vertfaktorer såsom immunsystemets sårbarhet og immunogeniske faktorer som kan predisponere en pasient for utvikling av visse komplikasjoner.
Behandlingen av symptomatiske pasienter foregår i dag med en rekke antibiotika, f.eks. tetracykliner, penicillin og cefalosporiner, men forsøk viser blandete resultater. Dersom den ikke blir behandlet kan bakteriene spredes til det sentrale nervesystem, hjerte, hjerne eller ledd, og forårsake arthritis, hjerteinfeksjoner og neurologiske problemer, og i sjeldne tilfeller død (3-6).
Ved infeksjon med borrelia starter B-celler i kroppen å produsere antistoff som gjenkjenner den fremmede organisme. Det er minst to funksjonelle typer antistoff produsert i respons til en borrelia infeksjon. En respons er en ikke-spesifikk binding/opsonering (belegging) respons som «markerer» antigenet og kan resultere i et opptak av B. b. av phagocytiske celler. Disse ikke-spesifikke antistoff produseres mot proteiner som er felles for flere bakterieformer (viz. 41 kDa proteiner for mange bakterielle flageller). Disse antistoff vil således gjenkjenne og koples til liknende antigener på andre bakterier. På grunn av dette er diagnostiske tester som detekterer disse ikke-spesifikke binding/opsonerings antistoff generelt ikke-spesif ikke .
En andre funksjonell antistoffrespons er produksjon av borreliacidale (dødelige) antistoff som spesifikt gjenkjenner epitoper på noen av proteinene på B. b. organismer. Etter feste av disse antistoff til B. b. organismene vil komplement interagere med antistoffene for å danne et membranangreps kompleks som dreper B. b.-organismene uten hjelp av de utryddende phagocytiske celler. Denne sterkt spesifikke borreliacidale antistoffrespons er ofte detekterbar i løpet av de to første uker etter infeksjon. Suksessrik deteksjon og indusjon av borreliacidale antistoff får økende viktighet i Lyme-sykdomsdiagnostikk, og hindring og utrydding.
Kort tid etter oppdagelse av Lyme-borreliosis, bestemte forskere at vaksinering av eksperimentdyr med hele B. b. tilveiebrakte beskyttelse mot utfordringen (7,8). Ytterligere forsøk etablerte rollen for antistoff-mediert beskyttelse, og bekreftet evnen til vaksinering med B. b. til å indusere antistoff som tilveiebrakte beskyttelse mot B. b. infeksjon (9-11). Opptil i dag har vaksinering av dyr med Osp'er av B. b., spesielt OspA (12-14), OspB (12,14), og OspC (14-16), tilveiebrakt beskyttelse mot infeksjon med Lyme-spirocheten. Beskyttelse etter vaksinering med OspA og OspB har blitt vist å være grunnet i induksjon av borreliacidale antistoff som spesifikt dreper B. b.-organismene (13,14,17-24). I motsetning har anti-OspC borreliacidale antistoff ikke blitt detektert etter vaksinering (14-16), og forskere har postulert at beskyttelse etter vaksinering med OspC skyldes andre mekanismer (16).
De fleste forsøk opptil i dag på å utvikle en OspA-vaksine har i hovedsak fokusert på de store mengder OspA uttrykt på overflaten av mange B. b. laboratorieisolater. I dag har de fleste borrelia spirocheter ytre overflater som omfatter i hovedsak OspA. Derfor har det blitt antatt at å indusere borreliacidale antistoff mot OspA vil tilveiebringe beskyttelse mot spirochetene. SmithKline Beecham (Philadelphia, Penn.) og Pasteur Merieux Connaught (Lyon, France) har utviklet vaksiner basert på dannelse av borreliacidale antistoff mot OspA. SmithKline Beecham-vaksinen har blitt godkjent for generell bruk, og vaksinen til Pasteur Merieux Connaught undersøkes i dag av U.S. Food and Drug Administration. Som man kan forvente har OspA-vaksiner blitt vist å være effektive i dyremodeller dersom dyrene har blitt utfordret med en nål. I tillegg har OspA-vaksinering gitt beskyttelse mot blodmidd infisert med B. b. Imidlertid har beskyttelse mot en blodmiddutfordring vært avhengig av nærvær av høye nivåer av anti-OspA-borreliacidale antistoff. Schwan et al (28) har nylig vist at spirocheter i infiserte blodmidd nedregulerer OspA på deres overflate ved inntak av et blodmåltid. Dermed må OspA-vaksiner indusere høye titer av anti-OspA borreliacidale antistoff for å ødelegge spirochetene i midttarmen av infisert blodmidd før de nedregulerer OspA. Derfor er varighet av høye titer av anti-OspA borreliacidale antistoff en kritisk faktor i langtidseffekt av en OspA-vaksine.
Søkere av foreliggende patentsøknad har nylig dokumentert en kommersiell OspA-vaksinerings manglende evne til å opprettholde det adekvate nivået til anti-OspA borreliacidale antistoff i mennesker (23). Det er også usannsynlig at en anamnestisk respons vil forekomme hurtig nok til å eliminere B. b. organismer fra infiserte blodmidd. Til støtte, har infeksjoner med B. b. blitt dokumentert i OspA-vaksinerte mennesker og hunder (26,27). Disse resultater understreket behovet for å evaluere andre Lyme-borreliosis vaksinekomponenter.
I tillegg vil Lyme-sykdommen vanligvis diagnostiseres ved å detektere antistoff i blodet eller spinalvæske, men de mest vanlige tester som anvendes er ofte unøyaktige. Falske-negative, eller mer vanlig, falske-positive resultater fortsetter å ødelegge for serodiagnose av Lyme-sykdom. Flere regimer som anvender konvensjonelle diagnostiske analyser har blitt utviklet for mer nøyaktig å detektere Lyme-sykdom. Dessverre har liten forbedring forekommet, og feildiagnoser fortsetter å forårsake konstante økonomiske og helsemessige effekter. I tillegg vil den nylig godkjente OspA-Lyme-sykdomsvaksinen videre «forvirre» konvensjonell diagnostisk testing. Det er således fremdeles behov for en sensitiv og spesifikk Lyme-test som kan gjøres bredt tilgjengelig som et kommersielt kitt og som kan diskriminere mellom vaksinerte individer og pasienter med Lyme-sykdom.
Deteksjon av borreliacidale antistoff kan også løse dette problem. Borreliacidale antistoff har blitt vist å fungere som basis for en sensitiv og sterkt spesifikk serodiagnostisk test (17,25-27). Faktisk har en diagnoseanalyse for Lyme-sykdom, som detekterer denne antistoffrespons, tidligere blitt utviklet, patentert (37), og er kommersielt tilgjengelig. Denne test er basert på deteksjon av sterkt spesifikke borreliacidale antistoff som induseres av flere B. b. Osp'er kort tid etter infeksjon. Det er viktig å bemerke at dersom tilstrekkelig høye nivåer av borreliacidale antistoff induseres ved vaksinering så beskyttes den vaksinerte. Imidlertid, dersom et individ infiseres før de borreliacidale antistoff foreligger, kan personen få Lyme-sykdom til tross for nærvær til slutt av høye konsentrasjoner av borreliacidale antistoff. Denne test gir en mer sensitiv og spesifikk alternativ løsning for påvisning av Lyme-sykdom. I tillegg vil antistoff detektert av den borreliacidale antistofftest ikke korrelere med antistoff detektert ved konvensjonelle analyser. I forsøk med hamster ble deteksjon av borreliacidale antistoff redusert med eliminering med av B. b. fra verten (43). I motsetning forble antistoffresponsen detektert ved konvensjonelle analyser fortsatt høye, eller fortsatte å stige. Disse resultater antyder at testen med borreliacidale antistoff er en prognoseindikator for klaring av spirocheter.
Callister et al. (30) viste nylig muligheten for å øke sensitiviteten for borreliacidal antistofftest mens man fortsatt opprettholdt den fortreffelige spesifisitet gjennom anvendelse av et testantigen ( B. b. 50772) som ikke inneholder OspA eller OspB på overflaten. Den forbedrede sensitivitet med B. b. 50772 foreslås av søkerne av foreliggende oppfinnelse å skyldes deteksjon av borreliacidale antistoff av OspC eller andre Osp'er. Disse resultater øker sterkt evnen av den borreliacidale antistoffprosedyren beskrevet i US-patent 5.385.826, av Schell et al.
I tillegg har flere forsøk vist evnen av vaksinering med OspC til å beskytte laboratoriedyr mot nålutfordring (14-15) og naturlig infeksjon (16). En nylig undersøkelse har vist at passiv overføring av immunserum til OspC kan løse problemet med arthritis, carditis og infeksjon med B. b. (44). Disse resultater viser at vaksinering med OspC kan være mer effektiv enn vaksinering med OspA. Imidlertid, siden høye konsentrasjoner av anti-OspC borreliacidal antistoff ikke har blitt detektert i immunserum (14-16), så har det vært spekulasjoner om at ytterligere mekanismer er ansvarlig for OspC-mediert beskyttelse (16). Å ikke vite mekanismen gjør det langt mer vanskelig å forfølge en OspC Lyme-sykdomsvaksine. I tillegg har forfølgelse av OspC som en kandidat for Lyme-borreliosis-vaksine blitt hindret på grunn av at OspC synes å være mer immunogen og genetisk heterogen enn OspC (35-37), noe som har forårsaket at forskere spekulerer i at utvikling av en omfattende OspC-vaksine er økonomisk ugunstig. Imidlertid har Schwan et al (28) nylig vist at relativt store mengder OspC hurtig syntetiseres av B. b. kort tid etter feste av en infisert blodmidd til mammalsk vert, og at OspA ikke lenger uttrykkes i høye konsentrasjoner på overflaten av B. b.
Det er nylig blitt rapport at B. b. organismer oppregulerer OspC, og samtidig nedregulerer OspA kort tid før blodmiddinokkulering av verten med spirocheten (31,32). Dette forklarer hvorfor anti-OspC-antistoff er blant de første antistoffresponser detektert i pasienter med tidlig Lyme-borreliosis. Som en respons til dette har flere forskere forsøkt, eller forsøker å utvikle enzymkoplete immunosorbente analyser (ELISA) ved anvendelse av hele rekombinante OspC-proteiner (38-42). Disse diagnoseanalyser har vært ganske sensitive, men mangler fortsatt spesifisitet. I tillegg har anti-OspC-antistoffresponser detektert med disse analyser forblitt forhøyet, eller har fortsatt å utvide seg selv etter klaring av B. b. fra verten. Spesiell bekymring knytter seg til utsiktene for OspC til å kryss-reagere med antistoff i serum fra pasienter til andre sykdommer, som cytomeggalovirus (CMV) eller Epstein-Barr (EBV) og gi en falsk positiv reaksjon. På grunn av denne signifikante mangel på spesifisitet og mangel på prognosepotensiale forblir OspC ELISAer ikke ideell.
Således er det isolerte immunogeniske
polypeptidfragmentet av OspC av Borrelia burgdorferi i følge oppfinnelsen kjennetegnet ved at det består av en etitop av OspC som har en immunosyresekvens som angitt i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2. Likeledes er det isolerte polypeptidet i følge oppfinnelsen kjennetegnet ved at det har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, og det Isolerte DNA-molekylet kjennetegnet ved at det koder for et polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 SEQ. ID. NO: 2, og ekspresjonsvektoren kjennetegnet ved at den omfatter en isolert DNA som koder for et polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2. Således er den farmasøytiske sammensetningen i følge oppfinnelsen kjennetegnet ved at den omfatter en mengde av et isolert polypeptid med en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, idet mengden er effektiv for å hindre eller for å behandle borrelia-infeksjoner i pattedyr.
Således er anvendelsen følge oppfinnelsen kjennetegnet ved at et isolert polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, anvendes for fremstilling av et medikament for å hindre og behandle borrelia-infeksjon i pattedyr, inkludert mennesker.
Således er fremgangsmåten i følge oppfinnelsen kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter: a) å sette et kroppsfluid fra en mammalsk vert som er mistenkt for å lide av borreliainfeksjon, i forbindelse med et isolert polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, og deretter
b) bestemme om det isolerte polypeptid konjugeres til antistoff som foreligger i kroppsfluidet i den mammalske vert, idet nærvær av konjugering indikerer nærvær av borrelia-infeksjon i verten.
Således er kittet i følge oppfinneslen kjennetegnet ved at det omfatter et isolert polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, arrangert i en dertil egnet beholder, og med instruksjoner for anvendelse.
Videre utførelser av oppfinnelsen er beskrevet i de uselvstendige kravene.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører et isolert, immunogenisk polypeptidfragment av OspC fra Borrelia burgdorferi som i hovedsak består av en epitop av OspC som har en aminosyresekvens med enheter 145 til 194 i SEQ, ID. NO: 2.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et isolert polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et isolert DNA-molekyl som koder for et polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en ekspresjonsvektor omfattende et isolert DNA-molekyl som koder for et polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2.
Videre vedrører foreliggende oppfinnelse et farmasøytisk materiale for å vaksinere mot, eller for å behandle borrelia-infeksjon i pattedyr, inkludert mennesker, idet materialet omfatter en mengde av et isolert polypeptid i hovedsak med en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, idet mengden er effektiv for å hindre eller behandle borrelia-infeksjon i pattedyr.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en anvendelse av et isolert polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, for fremstilling av et medikament for å hindre hindre og/eller behandle borrelia-infeksjon i pattedyr, inkludert mennesker.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et kitt for å diagnostisere borrelia-infeksjon i pattedyr, inkludert mennesker, idet kittet omfatter et isolert polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, anordnet i en egnet beholder dertil, og instruksjoner for anvendelse av kittet.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for å detektere borrelia-infeksjon i pattedyr, inkludert mennesker, omfattende å sette et kroppsfluid fra mammalsk vert, som er mistenkt for å lide av borrelia-infeksjon, i forbindelse med et isolert polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, og deretter bestemme om det isolerte polypeptid er konjugert til antistoff som foreligger i kroppsfluidet fra den mammalske vert, hvor nærværet av konjugering indikerer nærvær av borrelia-infeksjon i verten.
Fortrinnsvis «forvirres» ikke polypeptidet ifølge oppfinnelsen av tidligere vaksineringer av Lyme-sykdom. Deteksjon av anti-OspC borreliacidale antistoff mot Dra-fragmentet er nyttig for diagnostisering av Lyme-sykdom i pasienter fra alle steder i verden, og også for vaksinering mot Lyme-sykdom forårsaket av Borrelia ssp. Det er tre hovedformer av Lyme-sykdomsspirocheter som ikke er kjent: B. b, B. garinii og B. afzelii. Oppfinnerne har detektert anti-OspC borreliacidale antistoff i pasienter fra Slovenia infisert med B. afzelii. De detekterte disse anti-OspC borreliacidale antistoff ved anvendelse av B. b. 50772, det samme isolat som ble anvendt for å detektere en respons i pasienter infisert med B. b. Således synes Dra-fragmentet av OspC å være konservert i alle borrelia-former.
En Dra-fragmentbasert ELISA er en utmerket komplement-test til den borreliacidale antistofftest. Viktigere er det at en Dra-fragmentbasert ELISA er enkel å fremstille som et kommersielt kitt idet det diskriminerer mellom pasienter
vaksinert med tidlig Lyme-sykdom.
En test som detekterer borreliacidale antistoff mot de(n) borreliacidale epitop(er) av OspA og OspB i tillegg til OspC vil gi redusert kryssreaktivitet, økt spesifisitet, større nøyaktighet og færre falske positive diagnoser. Deteksjon av anti-OspC borreliacidale antistoff gir fordelaktig en tidlig diagnose som anti-OspA og anti-OspB borreliacidale antistoff ikke er i stand til. Imidlertid er identifiseringen av de(n) borreliacidale epitop(er) av OspB og OspA også verdifulle i tillegg til en diagnostisk test.
Inklusjon av borreliacidale epitoper av OspA og OspB med Dra-fragmenter av OspC gir også en mer komprehensiv Lyme-borreliosis-vaksine.
Ytterligere formål og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå av den påfølgende detaljerte beskrivelse av den foretrukne utførelse av oppfinnelsen, i forbindelse med de medfølgende tabeller og figurer. Fig. 1 er et restriksjonskart over plasmid pX3-22. Det mørke felt representerer området inneholdende genet B. b. S-1-20 ospC. Fig. 2 er et skjematisk diagram over trinnene anvendt for å etablere plasmid pX2-22-Dra som koder for OspC Dra-fragment-fusjonsproteinet. Fig. 3 er et restriksjonskart over plasmid pX2-22-Dra. Det mørke felt representerer området inneholdende B. b. S-l-10 ospC Dra-fragmentgenet. Fig. 4 er DNA og den kodete aminosyresekvens av Dra-fragment-fusjonsproteinet. Området som er innfelt i boksen er DNA og predikert aminosyresekvens som er unik for OspC-Dra-fragment av B. b. S-l-10. Se også SEQ ID NO:l.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører identifisering og karakterisering av epitopen(e) av OspC som er ansvarlig for å indusere borreliacidale antistoff kort tid etter infusjon med B. b. Denne antigenterminant tilveiebringer et overlegent diagnostisk antigen som detekterer tidlig Lyme-sykdomsinfeksjon, predikerer suksessrik utrydding av organismen fra verten, og diskriminerer mellom individer med Lyme-sykdom og som har blitt vaksinert med en OspA-Lyme-sykdomsvaksine. I tillegg er de(n) borreliacidale OspC-epitop(er) nyttige som en vaksine mot infeksjon med B. b. og de borreliacidale antistoff generert mot OspC-epitopen er nyttig som terapi for å løse etablert B. b. infeksjon og sykdom.
Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har påvist anti-OspC borreliacidale antistoff. Oppdagelsen av antistoffene i Lyme-sykdomssera som spesifikt dreper B. b. 50772 ( infra.), et blodmiddisolat som ikke har genene for å kunne fremstille OspA eller OspB, førte oppfinnerne til den spekulasjon at overflateproteinet var OspC og at en sterkt spesifikk borreliacidal antistoffrespons ble generert av dette protein.
I et tidligere forsøk fant Schwan et al (28) at idet et blodmidd ble matet på et menneske, utløste opptaket av blod B. b.-organismene til å nedregulere OspA og OspB, og oppregulere OspC. Søkerne av foreliggende oppfinnelse spekulerte dermed i at dette sannsynligvis hadde noe å gjøre med spirochetens evne til å passere fra blodmidden og inn i mennesket. Hypotesen var at spirocheten trenger OspC for å overleve i en ny vert. Hypotesen var derfor at spirocheten stenger ned OspA og OspB, og plasserer dermed OspC på dets overflate, og anti-OspC-antistoff vil derfor være mer effektive i å hindre infeksjon med B. b.
Dersom OspC faktisk induserer en tidlig B. b. borreliacidal antistoffrespons så følger det at deteksjon av denne sterkt spesifikke antistoffrespons kan anvendes for å detektere Lyme-sykdom mer nøyaktig, og å monitorere eliminering av organismen etter terapi bedre enn med andre diagnostiske analyser som ikke detekterer anti-OspC borreliacidale antistoff.
Dra- fragmentet
Ved å trekke dette videre oppdaget oppfinnerne at borreliacidal(e) epitop(er) er lokalisert på et lite fragment på OspC-proteinet. Genet for OspC-protein har en totallengde på ca. 600 basepar (bp). DNA som koder for det borreliacidale fragment er ca. 151 bp. Dette fragment er unikt for borrelia. Med henvisning til eksempel 2 er DNA-sekvensen av Dral- Smal ospC- genfragmentet (OspC Dra fragment) vist i fig. 4. Den kodete aminosyresekvens for dette «trunkerte» fusjonsprotein er også vist i fig. 4.
Fragmentet benevnes Dra-fragmentet, i hovedsak på grunn av at Dral er det restriksjonsenzym som ble anvendt for å kutte DNA-sekvensen ved et bestemt sted av baser som representerer enzymets gjenkjenningssete. Ved å anvende delen av ospC-genet som inneholder borreliacidal(e) epitop(er), forbedres spesifisiteten og det prognostiske potensiale for den diagnostiske test, uten signifikant tap av sensitivet.
Dra-fragmentet av OspC-proteinet er også en mer levedyktig vaksinekomponent sammenlignet med full-lengde OspC-proteinet. Ved å eliminere resten av OspC-proteinet minimeres vaksineringsproblemer på grunn av at de andre deler av proteinet ikke foreligger, og dermed elimineres vaksineringsbieffekter noe som gjør det enklere å indusere, opprettholde og monitorere den effektive beskyttende antistoffrespons. I tillegg kan immunoresponsen enkelt forhøyes mot kun den beskyttende del av OspC-proteinet ved å kombinere Dra-fragmentet med en adjuvans såsom tetanustoksoid eller andre vaksineadjuvanser som forårsaker immunresponsen til å økes. OspC-Dra-fragmentet kan også syntetiseres de novo ved anvendelse av konvensjonell løsnings- eller fastfase-peptidkjemi.
Vaksine- kandidat
Anvendelse av den borreliacidale antistofftest for å monitorere nivåene av anti-OspA borreliacidalt antistoff har gitt viktig innsikt med hensyn til effektiviteten av dagens OspA borreliosis-vaksiner (13,21,23). Faktisk er borreliacidale antistofftester kjennetegnet for monitorering av OspA-Lyme-sykdomsvaksinenes evne til å tilveiebringe beskyttelse. Vaksinering av gerbiler og laboratoriemus med OspC fører også til fullstendig beskyttelse mot eksperimentell utfordring og/eller blodmidd-bårete infeksjoner med homologe B. b. isolater. I tillegg kan forskjellig vaksinering med OspA, og vaksinering med OspC også resultere i klaring av spirocheter og lindring av symptomer selv om det administreres etter infeksjon med B. b. En Osp-vaksine vil derved være et verdifullt tillegg for å lindre virkningen av Lyme-sykdom.
Som angitt tidligere har forskere ikke tidligere funnet bevis for at OspC-vaksiner gir beskyttelse ved å indusere borreliacidale antistoff. Andre forskere har ikke detektert anti-OspC borreliacidale antistoff etter vaksinering til tross for OspC-vaksineringen til å indusere beskyttelse. Våre resultater bekrefter imidlertid at OspC faktisk induserer borreliacidale antistoff, og andre forskere vil hurtig realisere at de mest sannsynlig ikke er i stand til å detektere anti-OspC borreliacidale antistoff på grunn av at de anvendte en B. b. organisme, for testing som ikke uttrykte OspC på overflaten.
I dag anvender ingen vaksiner isolert borreliacidal(e) epitop(er). Den foreliggende oppfinnelse beskriver anvendelse av borreliacidal(e) epitop(er) av OspC, som en diagnostisk test for, og som en vaksine mot Lyme-sykdom.
Farmasøytisk materiale
Som et farmasøytisk materiale omfatter foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk akseptabel bærer og en terapeutisk effektiv mengde av OspC-Dra-polypeptidet ifølge oppfinnelsen. Med termen «terapeutisk effektiv mengde» benevnes den mengde av polypeptidet eller antistoffet som, idet det administreres til et dyr, utløser en immunrespons som er effektiv til å hindre eller redusere alvorligheten, for en viss tidsperiode av B. b. infeksjon.
Administrering av polypeptidet eller antistoffer ifølge oppfinnelsen til dyret, kan utføres på en rekke standardmåter. Fortrinnsvis, dersom et polypeptid anvendes, vil det administreres ed en farmasøytisk akseptabel adjuvans, såsom fullstendig eller ufullstendig Freunds adjuvans, RIBI (muramyl dipeptider) eller ISCOM (immunostimulerende komplekser). Slike adjuvanser kan beskytte polypeptidet fra hurtig oppløsning ved å «sekvestrere» det i en lokal avleiring, eller de kan inneholde substanser som stimulerer verten i å sekrere faktorer som er kjemotaktiske for makrofager og andre komponenter av immunsystemet. Fortrinnsvis, dersom polypeptidet administreres, vil immunoseringsregime involvere 2 eller flere administreringer av polypeptider, spredt over en tidsperiode på flere uker.
Det farmasøytiske materialet kan anvendes for å behandle eller hindre Lyme-sykdom i forskjellige dyr, inkludert mennesker. Det farmasøytiske materialet kan være i en rekke konvensjonelle former, såsom tabletter, piller, pulvere, væsker eller suspensjoner, kapsler, stikkpiller, injiserbare og infuserbare løsninger, slik det er kjent innen fagfeltet. Den foretrukne form avhenger av den tiltenkte modus for administrering, og den profylaktiske applikasjon. Imidlertid er i de fleste tilfeller den foretrukne administreringsvei parenteral, og i de fleste tilfeller intramuskulær.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et kitt for diagnostisering av borrelia-infeksjon i pattedyr, inkludert mennesker. Kittet omfatter et isolert polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, anordnet i egnet beholder dertil, og instruksjoner for anvendelse av kittet. Fortrinnsvis har det isolerte polypeptid en aminosyresekvens som vist i SEQ.
ID. NO: 2.
Eksempler
For å bedre illustrere foreliggende oppfinnelse tilveiebringes de påfølgende eksempler. Eksemplene som gir henvisning til de medfølgende figurer er kun tiltenkt som illustrasjonsformål og for å lette en bedre forståelse av oppfinnelsen. Eksemplene skal ikke begrense rammen av oppfinnelsen slik den er beskrevet og angitt i patentkravene.
Eksempel 1
Dette eksempel illustrerer B. b. OspCs evne til å indusere høye nivåer av borreliacidale antistoff idet det administreres kort tid etter B. b. infeksjon.
Materialer og metoder
Organismer. B. b. sensu stricto isolat 297 (deponert ved American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110 under ATTC Accession Number 53899) ble isolert fra humant spinalfluid. B. b. sensu stricto isolat 50772 (deponert med American Type Culture Collection den 30. juli 1999, i samsvar med Budapest traktaten), opprinnelig isolert fra en I. scapularis blodmidd, var tilgjengelig fra John F. Anderson (Connecticut Agricultural Experiment Station, New Haven, Connecticut). Blodmidden mangler OspA/B operonet, og uttrykker dermed ikke OspA eller OspB (25) . Den opprinnelige suspensjon av spirocheter ble seriefortynnet 10 ganger i Barbour-Stoenner-Kelly (BSK) medium i stand til å støtte vekst fra en enkelt organisme (46). Den resulterende populasjon av spirocheter ble deretter passert 10 ganger i ferskt BSK-medium ved 30°C eller 35°C, dispensert i 200 (il alikvoter i 1,5 ml skrukorkrør (Sarstedt, Newton, North Carolina) , og lagret ved -70°C inntil bruk. E. coli JM109 (Promega Corp., Madison, Wisconsin) ble anvendt i alle kloneforsøk.
Dyr 10 ukers gamle hunnkjønn C3H/HeJ-mus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) ble oppbevart tre i hvert bur, ved omgivende temperatur. Næringsstoffer og vann var tilgjengelig ad libitum.
Sera Lyme borreliosis sera ble opptatt fra pasienter ved Gundersen Lutheran Medical Center, La Crosse, Wisconsin. Ti prøver Lyme borreliosis sera var fra individer med klinisk dokumentert enkelt eller multippelt erythema migranes skader. To av disse sera prøver var fra pasienter med dermale hudkulturer positiv for B. b. Serum fra et individ ikke disponert til B. b. sensu lato ble anvendt som en normal serumkontroll. Denne serumprøve ble testet av 516 laboratorier som deltar i den nasjonale «Lyme Profiency Servey» sponset av Wisconsin State Laboratory of Hygiene og College of American Pathologists, og ble rapportert som negativ for antistoff mot B. b. (31).
Western blotting Western blotting ble utført som tidligere beskrevet (17). Kort forklart ble B. b. 50772 celler kokt i en prøvebuffer i 5 min. og 150 fig totalt protein ble applisert på en 0,1% SDS-12% polyakrylamidgel (4% polyakrylamid stacking gel uten komb.). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med Bio-Rad proteinbestemmelseskitt ved å følge produsentens instruksjoner (Bio-Rad Inc., Richmond, California). To geler ble kjørt samtidig i en elektroforeseenhet (SE600;Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, California) ved 55 mA i 3 timer med buffersystemet til Laemmli (32). Etter elektroforese ble proteinene oveført til nitrocellulose i 3 timer ved 300 mA under betingelser beskrevet av Towbin et al. (33). Nitrocellulosen ble kuttet opp i strimler og blokkert med fosfatbuffret løsning (PBS)-0,3% Tween 20 detergent i 30 min. ved 22<<>>C. Strimlene ble inkubert i 1 time ved 22^ med humant serum fortynnet 1:100 og vasket 3 ganger med PBS-0,05% Tween 20 detergent. Peroksidase-merket antihumant IgM eller IgG fra pepperrot (tunge og lette kjeder; Organon Teknika Cappel, Malvern, Pennsylvania) ble tilsatt, og strimlene ble inkubert i 30 min. ved 22°C. Etter inkubering ble strimlene vasket og utviklet (TMB Membrane Peroxidase Substrate System; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland).
Kloning og amplifisering av ospC genet Plasmid-anriket DNA ble isolert fra sensu stricto isolat S-l-10 (13). DNAen ble anvendt som en templat for mangfoldiggjøring av ospC-genet ved anvendelse av GeneAmp-kittet (Perkin Eimer Cetus, Norwalk, Connecticut) (34). Primer ble anvendt ved en finalkonsentrasjon ved 1,0 pM i en 1,5 mM konsentrasjon av MgC2- Termiske cykliske parametre var 95^ i 5 minutter etterfulgt av 35 sykluser av følgende: 1) 95<0>C i 30 sek., 2) 50oC i 30 sek., 3) 72<0>C i 90 sek. Den finale ekstensjon ble utført ved 72<*>C i 7 min. for fullt ut å utvide ethvert trunkert DNA-tråd. Den amino-terminale primer Cl (5'-CGTGGATCC ATGAAAAGAATACATTAAGTGCGATA-3') og den karboksy-terminale primer C2 (5'-AATTCCCGGG TTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3') ble anvendt for mangfoldiggjøring. Understrekninger indikerer regioner gjenkjent av primerne. Mangfoldiggjort DNA ble renset ved anvendelse av GeneClean (BiolOl, La Jolla, California). Etter oppkutting med Smal og BamHI (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland), rensete DNA-fragmenter ligert inn i PinPoint pXa-3 vektor (Promega Corp., Madison, Wisconsin) med T4 DNA-ligase (Gibco BRL, Rockville, Maryland). Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere kompetent E. coli JM10 9. Transformert E. coli ble utsådd på 2xTY medium inneholdende ampicillin (100 jig per ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), og inkubert i 24 timer ved 37<<>,C. Kolonier som uttrykker OspC ble detektert med Western blott analyser ved anvendelse av streptavidin-pepperrot-peroksidase konjugat (Gibco BRL), og et tidlig Lyme-sykdomsserum inneholdende anti-OspC antistoff.
DNA-sekvensen av ospC-genet ble bestemt med dobbelttrådet sekvensering (TaqTrack, Promega, Madison, Wisconsin). Analyser og BLAST-søk ble utført ved anvendelse av GCG-programvaresystem (GCG, Madison, Wisconsin). ospC-genet av B. b. sensu stricto S-l-10 var tilsvarende (78,5%) til B. b. sensu stricto B31 (35). I tillegg var S-l-10 OspC-nukleotidsekvensen forskjellig ved 3 baser (98% homologi) med B. b. sensu stricto B31 (36).
Rensing av rekombinant OspC. E. coli inneholdende OspC-genet fikk vokse i 100 ml 2xTY inneholdende ampicillin i 12 timer ved 37°C. Kulturen ble fortynnet 1:10 med 2xTY, og inkubert i ytterligere 1 time. Isopropyl-|$-D-tiogalaktopyranosid (finalkonsentrasjon 0,1 mM, Sigma) ble tilsatt til kulturen og inkubert i ytterligere 4 timer. Suspensjonen ble sentrifugert ved 10.000 x g i 15 min. ved 4^, resuspendert i rensebuffer (50 mM Tris (pH 8,0), 50 mM NaCl, 2 Mm EDTA, 0,1% Triton X-100) og lysert med en sonikator (Model W350; Branson Sonic Power Co., Danbury, Connecticut). Sonikert E. coli ble sentrifugert ved 10.000 x g i 15 min. og supernatanten ble overført til en kolonne inneholdende SoftLink resin (Promega, Madison, Wisconsin) med en hastighet på 0,5 ml per min. ved 4°C. Kolonnen ble deretter vasket med 5 kolonnevolumer rensebuffer. OspC ble eluert med 5 mM biotin (Sigma), og de gjenvunnete fraksjoner ble analysert med SDS-PAGE.
OspC ELISA. Rekombinant OspC ble fortynnet til 750 ng/mL i coatebuffer (0,015 M Na2C03, 0,035 M NaHC03, pH 9,6), og 100 (il mengder ble tilsatt til individuelle flatbunnete mikrotiterbrønner (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA). Mikrotiterplatene ble inkubert ved 35°C i 4 timer, etterfulgt av en inkubering over natten ved 4°C. Etter inkubering ble platene vasket 3 ganger med fosfat-buffret saltløsning (PBS, pH 7,2) inneholdende 0,05% TWEEN 20 detergent forseglet og lagret ved 4<<>>C. Før anvendelse ble platene blokkert med PBS-0,05% TWEEN 20 detergent inneholdende 1% bovint serumalbumin i 30 min. ved 22°C, vasket 2 ganger med PBS-0,05% TWEEN 20 detergent, og 100 (il av en seriell 2 gangers fortynning av normal eller Lyme-borreliosis serum i PBS ble tilsatt til de individuelle brønner. Platene ble inkubert i 1 time ved 22°C, etterfulgt av 3 vaskinger med PBS-0,05% TWEEN 20 detergent. 100 mikroliter anti-humant IgM pepperrot-peroksidase-konjugert antistoff (Organon Teknika Cappel) fortynnet 1:3000 i PBS-0,05% TWEEN 20 detergent ble tilsatt, og platene ble inkubert ved 22°C i 1 time. Etter inkubering ble 100 (il o-fenylendiaminfosfat (0,4 mg/ml, Sigma) tilsatt til hver brønn og inkubert ved 22^ i 30 min. Reaksjonene ble stoppet ved tilsetning av 100 (il 1 N H2SO4, og absorbansen ved 490 nm (Model EL307, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, Vermont) ble umiddelbart bestemt. En OD-verdi større enn 0,200 over den normale serumkontroll ble bestemt som positive.
Deteksjon av borreliacidale antistoff. Den flow-cytometriske borreliacidale antistofftest ble utført i samsvar med Callister et al. (29,30). Hurtig forklart, en frossen 200 (il alikvot av B. b. isolatet 50772 eller 297 ble opptint, inokulert i 6 ml ferskt BSK-medium, og kulturer ble inkubert i 72 timer ved SS^C. Etter inkubering ble konsentrasjonen av spirocheter bestemt ved anvendelse av Petroff-Hausser tellekammer, og fortynnet i ferskt BSK-medium til en konsentrasjon av 10^ organismer per ml. Serumprøver ble fortynnet 1:20 i ferskt BSK-medium, og sterilisert ved passering igjennom et 0,2 (im mikrofugefilter (Costar, Cambridge, Massachusetts) . En 100 (il alikvot ble overført til et 1,5 ml skrulokkmikrofugerør (Sarstedt), og det fortynnete serum ble varme-inaktivert ved 56°C i 10 min. Etter varmeinaktiveringen ble en 100 (il alikvot av B. b. 50772 og 15 (il sterilt serum fra marsvin
(200, 50% hemolytiske komplementenheter per ml, Sigma)
tilsatt til de fortynnete sera. Etter forsiktig røring ble analysesuspensjonene inkubert i 16-24 timer ved SS^C.
Etter inkubering ble 100 (il av analysesuspens jonene fortynnet 1:50 med PBS (0,01 mol/L, pH 7,2) inneholdende akridinorange (finalkonsentrasjon, 5,4x10^ mol/L. Borreliacidale antistoff ble detektert med et FACScan enkellaser flowcytometer (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California). Forløp ble opptatt i 1 til 20 minutter med strømningshastighet satt lavt (12 (il/min) og analysert med FACScan Lysys II forskningspgrogramvare. Side-scatter og fluorescens-intensitetsparametre ble anvendt for å skille B. b. fra BSK og komplementpartikler. Spirocheter ble «gated» under dataopptak og fluorescencesignaler ble logaritmisk amplifisert og omdannet til en lineær skala. En > 13% økning i fluorescence-intensitet sammenlignet med normale serumkontroller ble vurdert som positive (30). Alle analyser ble utført i duplikat eller triplikat.
Vaksinering av mus, og gjenvinning av anti- OspC Sera. Mus ble vaksinert intramuskulært med 75 (ig renset OspC i 100 (il Freunds komplette adjuvans (Sigma) . Deretter ble mus «boosted» med 75 (ig-mengder OspC i 100 (il Freunds ufullstendige adjuvans (Sigma) 2 og 4 uker etter den primære vaksinering. To uker etter den andre boost, ble blod innsamlet ved intrakardiær punktering. Blod til tillatt å klotte, og serum ble separert ved sentrifugering ved 3500 rpm i 5 min. Serum ble fjernet og lagret i 50 (il alikvoter ved -70*C inntil bruk.
Flow- cytometrisk immunofluorescens analyse. Museserumprøver inneholdende anti-OspC-antistoff ble serielt fortynnet i BSK-medium (1:20 til 1:40960). 100 mikroliter BSK-medium inneholdende 10^ levende B. b. 297 eller 50772 organismer ble tilsatt til hver fortynning. Suspensjonene ble forsiktig blandet og inkubert ved 35°C i 30 min. Etter inkubering ble 10 (il fluorescein-isotiocyanat (FITC)-konjugert anti-muse IgG fra geit (ICN/Cappel, Aurora, Ohio) antistoff fortynnet 1:20 i sterilt PBS (pH 7,2) tilsatt til hver analyse. Analysene ble forsiktig blandet og inkubert ved 35°C i ytterligere 30 min. Etter inkubering ble 100 (il alikvoter av hver suspensjon kombinert med 400 (il av 0,22 (uti filter-sterilisert PBS. Disse suspensjoner ble deretter analysert ved anvendelse av FACScan flow-cytometer.
Nøytralisering av borreliacidal aktivitet. Borreliacidal aktivitet av serumprøver etter fjerning av IgM eller IgG antistoff ble bestemt som tidligere beskrevet (17) . Kort forklart ble 125 (il dialysert anti-human IgM eller IgG fra geit (tung og lett kjede; Kallestad Diagnostics, Chaska, Minnesota) tilsatt til 25 (il normal eller Lyme-borreliosis serum, og blandingen ble inkubert i 2 timer ved 37^. Etter sentrifugering ved 5000 x g i 10 min. (Surespin; Helena Laboratories, Beaumont, Texas), ble supernatanten fortynnet 2 ganger med fersk BSK-medium, sterilisert ved passering gjennom et 0,2 (im mikrofugefilter (Costar), og analysert for borreliacidal aktivitet. Den borreliacidale aktivitet i normale og Lyme-borreliosis sera uten behandling med anti-IgM eller anti-IgG ble bestemt etter tilsetning av 125 (il PBS (pH 7,2).
Adsorpsjon av Lyme- borreliosis sera med OspC. Adsorpsjon av anti-OspC antistoff fra Lyme-borreliosis sera ble utført ved anvendelse av en modifisering av en tidligere beskrevet prosedyre (17). TetraLink Tetrameric Avidin resin (Promega) ble vasket med PBS, og 1 ml volum ble applisert på en kolonne. Tre mikrogram dialysert biotinylert OspC i et 1 ml volum ble plassert over kolonnen og absorbans (OD) ved 280 nm ble monitorert for å bekrefte bindingen av OspC til kolonnen. En 1 ml prøve av hver av 10 humane Lyme-borreliosis sera fortynnet 10 ganger med PBS (pH 7,2) ble deretter passert over kolonnen 10 til 15 ganger ved 4°C for å fjerne anti-OspC antistoff. Fjerning av anti-OspC antistoff ble bekreftet med Western blotting.
Dette forsøk viste at vaksinering av mus med OspC induserte høye konsentrasjoner av anti-OspC borreliacidale antistoff, og førte til økte anstrengelser (i de påfølgende eksempler) for å evaluere evnen til OspC til å tilveiebringe beskyttelse mot infeksjon med B. b. på grunn av at det tilveiebringer en plausibel immunmekanisme som forklarer en OspC vaksinerings evne til å beskytte mot eller kurere Lyme-sykdom. Videre ble det oppdaget at store konsentrasjoner av anti-OspC borreliacidale antistoff kan enkelt detekteres i serum fra pasienter over hele U.S.A., idet kun en enkelt organisme, B. b. 50772, anvendes som testantigen, noe som også indikerer at anti-OspC borreliacidale epitop(er) kan være konservert. OspC-heterogenisiteten vil således ikke hindre anstrengelser for å utvikle en komprehensiv OspC-vaksine.
Disse funn er i direkte kontrast til andre publiserte observasjoner. I tidligere rapporter var deteksjon avhengig av nærvær av høye nivåer av OspC på overflaten av B. b. Disse anti-OspC borreliacidale antistoff ble detektert kun når B. b. isolat 50772, som uttrykker høye nivåer av OspC på overflaten, ble anvendt.
Eksempel 2
Dette eksempel viser at borreliacidale epitoper av OspC er lokalisert innen Dra-fragmentregionen.
Trinn a: Isolering av plasmider, kloning og mangfoldiggjøring av genet ospC .
Plasmid-anriket DNA ble isolert fra B. b. sensu stricto isolat S-l-10 ved anvendelse av standardteknikker (13). DNA ble deretter anvendt som et templat for mangfoldiggjøring av genet ospC ved anvendelse av GeneAmp protokoll (Perkin Eimer Cetus, Norwalk, Connecticut) ved anvendelse av polymerase kjedereaksjon (34). Primere ble anvendt ved en finalkonsentrasjon på 1,0 jjM med en MgC^-konsentrasjon på 1,5 mM. Termiske sykleringsparametre var 95°C i 5 min. etterfulgt av 35 sykluser av det følgende: 1) 95°C i 30 sek., 2) 50°C i 30 sek., 3) 72°C i 90 sek. Den finale ekstensjon ble utført ved 72°C i 7 min. for fullt ut å utvide enhver trunkert DNA-tråd. Amino-terminale primer Cl 5'-CGTGGATCCATGAAAAGAATACATTAAGTGCGATA-3') og karboksy-terminal primer C2 5'-AATTCCCGGGTTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3' ble anvendt for mangfoldiggjøring. Det mangfoldiggjorte DNA ble renset ved anvendelse av GeneClean (BiolOl, La Jolla, California). Etter oppkutting med Smal og BamHI (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland), ble de rensete DNA-fragmenter ligert inn i PinPoint pXa-3 vektor (Promega Corp., Madison, Wisconsin). Innskuddet og plasmidet ble ligert med T4 DNA ligase (Bethesda Research Laboratories), og ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere kompetent E. coli JM10 9. Deretter ble organismene utsådd på 2x tryptongjær (TY) medium inneholdende ampicillin (100 fig/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), og inkubert i 24 timer ved 37<<>>C. Kolonier som uttrykker OspC fusjonsproteinet ble detektert med Western blott analyser ved anvendelse av et streptavidin-alkalisk fosfatasekonjugat (Bethesda Research Laboratories), og et tidlig Lyme-sykdomsserum inneholdende anti-OspC antistoff. Dette plasmid ble gitt designering pX3-22 og er illustrert i fig. 1.
Trinn b: Etablering av ospC- trunkeringen. For å konstruere karboksyterminalfragment av OspC-proteinet ble plasmid pX3-22 oppkuttet med restriksjonsenzymer BamHI og Smal (Gibco) . Det ~ 0, 6 kb BamHI- SmaI-fragment inneholdende OspC-genet ble deretter oppkuttet med restriksjonsenzymet Dral (Gibco) som illustrert i fig. 2. Denne oppkutting resulterte i et ~ 0,4 kb BamHI- Dral- fragment som koder for aminoterminalenden av OspC-proteinet og et — 0,2 kb Dral-Smal- fragment som koder for karboksyterminalenden. Dette Dra I- Smal- fragment ble deretter ligert med Smal-oppkuttet PinPoint vektor pXa-2 (Promega Corporation, Madison, WI) for å preservere den egnete leseramme i det resulterende trunkerte protein. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere kompetent E. coli JM109. Restriksjonskuttene ble utført for å identifisere en klon med den egnete håndtering av ospC-genfragmentinnskuddet. Dette plasmid ble designert pX2-22-Dra, og er illustrert i fig. 3.
Trinn c: Molekylær analyse av genfragmentet ospC . DNA-sekvensen av pX2-22-Dra ble bestemt ved dobbelttrådet sekvensering. Primer C2 (se trinn A i eksempel 2), konstruert for mangfoldiggjøring, og PinPoint sekvenseringsprimer (Promega) ble anvendt. Sekvensen av Dral- Smal ospC- genfragmentet (OspC Dra-fragment) er vist i fig. 4. Den predikerte aminosyresekvens av dette trunkerte OspC-fusjonsprotein er også vist i fig. 4.
Trinn d: Rensing av DNA- fragmentet ospC . Transformerte E. coli-organismer inneholdende enten pX3-22 eller pX2-22-Dra fikk vokse i 100 ml 2xTY inneholde ampicillin i 12 timer ved 37°C. Kulturen ble fortynnet 1:10 med 2xTY og inkubert i ytterligere 1 time. Isopropyl-|$-tiogalaktopyranosid (finalkonsentrasjon 0,1 mM, Sigma)
ble tilsatt til kulturen og inkubert i ytterligere 4 timer. Suspensjonen av bakterier ble deretter sentrifugert (10.000 x g i 15 min. ved 4<>C) , resuspendert i rensebuffer (50 mM Tris (pH 8,0), 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 buffer), og lysert ved 5 x 30 sek. pulser med en sonikator (Model W350; Branson Sonic Power Co., Danbury, Connecticut). De sonikerte E. coli organismer ble sentrifugert ved 10.000 x g i 15 min. for å fjerne uløselig materiale, og supernatanten fikk passere over en kolonne av typen SoftLink resin (Promega) med en hastighet på 0,5 ml per min. ved 4<*>C. Kolonnen ble deretter vasket med 5 kolonnevolumer av rensebuffer. Kolonne-bundet OspC Dra-fragment fusjonsprotein ble eluert ved anvendelse av rensebuffer inneholdende 5 mM biotin (Sigma). Fraksjonen bla analysert med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese.
Trinn e: Adsorpsjon av Lyme borreliosis sera med hele og Dra- fragment- ospC.
Adsorpsjon av anti-OspC eller Dra-fragmentantistoff fra Lyme-borreliosis sera ble utført ved å anvende en modifisering av en tidligere beskrevet prosedyre (17). TetraLink Tetrameric Avidin resin (Promega) ble vasket med PBS, og et 1 ml volum ble applisert på en kolonne. Tre mikrogram dialysert biotinylert hele OspC (fusjonsprotein fra pX3-22) eller Dra-fragment OspC (fusjonsprotein fra pX2-22-Dra) i et 1 ml volum fikk deretter passere over kolonnen, og absorbans ved 280 nm ble monitorert for å bekrefte binding av protein til kolonnen. En 1 ml prøve av hvert serum fortynnet 10 ganger med PBS (pH 7,2) fikk deretter passere over kolonnen 10 til 15 ganger for å fjerne anti-OspC eller anti-Dra-fragment antistoff.
Ved anvendelse av materialer og metoder gitt i eksempler 1 og 2 ble det innledningsvis testet 7 tidlig Lyme-sykdoms serumprøver som inneholdt høye titer av anti-OspC borreliacidale antistoff, og bekreftet at de boreliacidale antistoff var mot en spesifikk region av OspC-proteinet innen DNA-fragmentet beskrevet heri.
OspC- eller Dra-fragmentfusjonsproteinene ble bundet til agarosekuler, og separate immuno-affinitetskolonner ble fremstilt. Lyme-sykdomssera ble passert over kolonnene for å fjerne anti-OspC eller anti-Dra-fragment antistoff ved adsorpsjon til OspC eller Dra-fragmentfusjonsproteinet, respektivt. Borreliacidal aktivitet mot B. b. 50772 ble bestemt før og etter fjerning av antistoffene. Fjerning av anti-OspC og anti-Dra-fragmentantistoffer fra tidlig Lyme-sykdomssera forårsaket omtrent fullstendig reduksjon av den borreliacidale aktivitet som illustrert i tabell 1.
<a>Resiprokal fortynning av serum-titer
Tabell 1 viser borreliacidal antistoff-titer av tidlig Lyme-sera etter fjerning av antistoff mot hele OspC-fusjonsprotein eller OspC Dra-fragment. Med henvisning til tabell 1, fremgår det at borreliacidale antistoff var mot den spesifikke region av OspC-proteinet lokalisert innen Dra-fragmentet. Disse resultater viser at anti-OspC borreliacidale antistoff omtrent er fullstendig indusert av epitop(er) lokalisert innen Dra-fragmentregionen av OspC.
Eksempel 3
Dette eksempel viser at anti-OspC antistoff som er spesifikk for Dra-fragmentregionen av OspC kan detekteres med ELISA.
Dra- fragment ELISA. Renset OspC Dra-fragment ble fortynnet til 750 ng/ml i coatebuffer (0,015 M Na2C03, 0,035 M NaH03, pH 9,6) og ble tilsatt til flatbunnede N-oksysuccinimid-overflate-aminobindende mikrotiter brønner. ELISA-platene ble inkubert ved 35<*>0 i 4 timer, etterfulgt av en inkubering over natten ved 4^. Etter inkubering ble platene vasket 3 ganger med PBS inneholdende 0,05% TWEEN 20 detergent, forseglet og lagret ved 4<>C. Før anvendelse ble platene blokkert med PBS-0,05% TWEEN 20 detergent inneholdende 1% bovint serumalbumin i 30 min. ved omgivende temperatur. Platene ble vasket 2 ganger med PBS-0,05% TWEEN 20 detergent, og 100 \ il serielle 2-gangers fortynninger av serum i PBS ble tilsatt til de individuelle mikrotiter brønner. Platene ble inkubert i 1 time ved 22°C, etterfulgt av 3 vask med PBS-0,05% TWEEN 20 detergent. Anti-humant IgM eller IgG peroksidase-konjugert antistoff fra pepperrot (Organon Teknika Cappel, Malvern, Pennsylvania) ble fortynnet 1:3000 eller 1:5000 i PBS-0,05% TWEEN 20 detergent. Alikvoter (100 fil) av konjugater ble tilsatt til brønnene og inkubert ved 22°C i 1 time. Deretter ble 100 (il o-fenylendiaminfosfat (Sigma) tilsatt, og platene ble inkubert ved 22°C i 30 min. Reaksjoner ble stoppet ved tilsetning av 100 fil 1 N H2SO4, og absorbanser ved 490 nm ble bestemt.
Det ble bestemt om anti-Dra fragmentantistoffene som foreligger i de 7 tidlig Lyme-sykdoms serumsprøvene enkelt kunne detekteres ved anvendelse av et Dra-fragment med IgM eller IgG ELISA. Dra-fragment ELISA-plater ble fremstilt og anvendt for å måle mengden DRA-spesifikt antistoff detektert idet serumet ble fortynnet 1:200 med PBS (pH 7,2) inneholdende 0,5% TWEEN 20 detergent. Dette er en fortynning som vanligvis anvendes av diagnoselaboratorier ved utføring av ELISA-analyser. Signfikante nivåer av IgM anti-Dra-fragment antistoff ble detekterbare i alle 7 tidligere Lyme-sykdomsserumsprøver som illustrert i tabell 2. IgG ELISA detekterte også anti-Dra antifragment antistoff i 3 (42%) av de 7 tidlig seraprøver. Tabell 2 illustrerer OspC (helt protein) og Dra-fragment IgM-ELISA reaktivitet ved anvendelse av tidlig Lyme-sykdomssera (n=7) inneholdende anti-OspC og anti-Dra borreliacidale antistoff. Tabell 2 viser at et Dra-fragment ELISA kan detektere anti-Dra fragment antistoff i tidlig Lyme-sykdomssera ved en 0,200 absorbans og en 1:200 fortynning.<a>Sera fortynnet 1:200 i fosfat-buffret saltløsning (pH 7,2) inneholdende 0,05 TWEEN 20. Reaktivitet bestemt ved absorbans ved 490 nm.
Eksempel 4
Dette eksempel ble konstruert for å illustrere spesifisitet av en B. b. OspC ELISA og en Dra-fragment ELISA for å detektere Lyme-sykdom.
Det ble bestemt om Dra-fragment ELISA var mer spesifikk enn OspC ELISA ved å undersøke normale sera og sera fra pasienter med EBV- og CMV-infeksjoner. Også testet var seraprøver inneholdende rheumatoidfaktor og seraprøver fra pasienter med syfilis på grunn av at disse prøver sera også er kjent å reagere sterkt med konvensjonelle Lyme-sykdomstester. I tillegg ble seraprøver fra individer som tidligere var vaksinert med en OspA Lyme-sykdomsvaksine testet. Begge ELISAer ble ikke påvirket av tidligere vaksineringer mot Lyme-sykdom. Tilsvarende lave antall normale serumsprøver, var sera inneholdende den rheumatoide faktor og syfilissera positive ved anvendelse av IgM OspC eller Dra-fragment ELISA. Imidlertid var OspC ELISA ofte falskt positiv ved anvendelse av sera fra pasienter med andre sykdommer inkluderende EBV og CMV, primært ved testing for IgM. Dette er ikke overraskende siden IgM-antistoff foreligger i høye konsentrasjoner under tidlig Lyme-sykdom. IgG-antistoff forekommer vanligvis ikke før ved senere trinn av sykdommen. I motsetning var IgM Dra-fragment ELISA langt mindre reaktiv ved anvendelse av sera fra pasienter med CMV og EBV. Det henvises til tabell nedenfor. Dermed var Dra-fragment ELISA langt mer signifikant enn ELISA inneholdende hele OspC-proteinet.
Tabell 3 viser IgM OspC (helprotein) og Dra-fragment ELISA versus Lyme-sykdom kryssreaktive sera (serumsfortynning 1:200). Ved henvisning til tabell 3, var Dra-fragment ELISA signifikant mere spesifikk enn OspC ELISA.
<a>Sera fortynnet 1:200 i fosfat-buffret saltløsning (pH 7,2) inneholdende 0,05% TWEEN 20. Absorbans målt ved 490 nm.
Eksempel 5
Dette eksempel ble etablert for å vise at OspC og DRA-fragment ELISA hadde tilsvarende sensitiviteter. Sensitiviteten av DRA-fragment ELISA ble sammenlignet med OpsC ELISA ved å undersøke 20 seraprøver fra pasienter med kultur-definert Lyme-sykdom. Disse sera inneholdt også varierende nivåer av anti-OspC borreliacidale antistoff. OspC og Dra-fragment ELISAer hadde tilsvarende sensitivitet. OspC og Dra-fragment ELISAer detekterte IgM antistoff (absorbans > 0,200) i 12 (60%) og 10 (50%) av de 20 tidlig Lyme-sykdomssera, respektivt som illustrert i tabell 4.
<a>sera fortynnet 1:200 i fosfatbuffret saltløsning (pH 7,2) inneholdende 0,05% TWEEN 20. Absorbansverdier ble bestemt ved 490 nm.
I tillegg korrelerte evnen til å detektere anti-OspC eller anti-Dra-fragment antistoff nært med anti-B. b. borrelicidal aktivitet. Med få unntak ble høye konsentrasjoner av anti-OspC eller anti-Dra-fragmenter IgM antistoff detektert i tidlig Lyme-sykdomssera som også inneholdt høye konsentrasjoner av borreliacidale antistoff. Når borreliacidal aktivitet var lav var begge ELISAer ofte negative. Dette var ikke forventet siden den borreliacidale antistofftest har blitt vist å være ca. 3 ganger mer sensitiv enn en kommersiell ELISA (30).
Eksempel 6.
Vi arbeider for tiden med å forbedre sensitiviteten av Dra-fragment ELISA ved å senke fortynninger av testet serum. Dette skulle være mulig på grunn av den høye spesifikke natur av Dra-fragment antistoffresponsen. Vi antar at foredling av Dra-fragment ELISA testprosedyrene
(f.eks. serumsfortynning, konsentrasjon av antigen/brønn)
signifikant vil øke sensitiviteten til nivåer som er nærmere anti-B. b. 50772 borrelicidal antistoff deteksjonssensitivitet.
Eksempel 7
Dette eksempel bekrefter prognosemulighetene for Dra-fragment ELISA. Multiple seraprøver fra 2 tidlig Lyme-sykdomspasienter ble testet ved anvendelse av Dra-fragment ELISA. Serumprøvene ble innsamlet før, under og etter behandling med antimikrobielle midler. Anti-50772 borreliacidal aktivitet ble monitorert med Dra-fragment ELISA. I pasient 1 var anti-OspC antistoff detekterbare 5 dager etter infeksjon og 6 og 11 dager etter at antibiotikabehandling ble startet. Anti-50772 borreliacidal antistoff og anti-Dra-fragment antistoff var detekterbare 5 dager etter infeksjon og 6 dager etter behandling, men var ikke lenger detekterbare etter 11 dager. Tilsvarende var anti-OspC antistoff detekterbare 7 dager etter infeksjon og 10 og 24 dager etter antibiotisk behandling i serum fra pasient 2. Imidlertid var borreliacidale antistoff og anti-Dra-fragment antistoff kun detekterbare før antibiotisk behandling. Disse resultater demonstrerer evnen av Dra-fragment ELISA til å korrelere med infeksjon med B. b. Således er Dra-fragment ELISA også nyttig som en «test på behandling».
Eksempel 8
OspCs evne til å indusere borreliacidale antistoff har muliggjort identifisering av epitop(er) som er ansvarlig for å indusere aktiviteten. På grunn av at beskyttelse etter vaksinering med OspA er avhengig av induksjon og opprettholdelse av høye nivåer av anti-OspA borreliacidale antistoff vil beskyttelse eller klaring av B. b. fra infiserte individer også være avhengig av induksjon av anti-OspC borreliacidale antistoff. På grunn av at anti-OspC borreliacidale antistoff kan fjernes fra tidlig Lyme-sykdomssera ved adsorpsjon til Dra-fragmentet bør vaksinering med Dra-fragmentet også indusere borreliacidale antistoff. Mus vaksinert med rekombinant OspC produserer faktisk borreliacidale antistoff.
Ved å benytte fremgangsmåtene i eksempel 1 ble mus vaksinert med B. b. 50772, og nivåer av borreliacidale antistoff ble bestemt ved forskjellige tidsintervaller etter vaksinering. Borreliacidal aktivitet var detekterbar 14 dager etter den innledende vaksinering, og hadde en topp
56 dager etter, som vist i tabell 5.
<a>Mus ble vaksinert ved dag 0, og gitt 4 booster-vaksineringer med to ukers intervaller
^Resiprokal av høyeste serumsfortynning med signfikant borreliacidal aktivitet.
I et liknende forsøk ble anti-Dra-fragment antistoff fjernet ved adsorpsjon ved anti-Dra-fragment fusjonsprotein. De borreliacidale antistoffnivåer ble deretter målt før og etter adsorpsjon og fjerning av anti-Dra-f ragment antistoff. Borreliacidal aktivitet ble redusert fra 1:2560 til 1:640 etter fjerning av anti-Dra-fragment antistoff. Vaksinering med Dra-fragment vil således indusere beskyttende borreliacidale antistoff.
Eksempel 9
Dette eksempel er konstruert for å vise at Dra-fragmentet er en bedre kandidat som vaksine enn det hele OspC-protein. Dyr ble vaksinert med OspC, og serum med høye nivåer av borreliacidal aktivitet ble innsamlet. Serumet deles, og den borreliacidale aktivitet fra en prøve elimineres ved fjerning av anti-Dra-fragment antistoff. Dyrene som inneholder, eller som ikke inneholder borreliacidale antistoff (anti-Dra-fragment) til separate grupper av mottakende dyr administreres deretter passivt før de utfordres med B. b. og ved forskjellige intervaller etter infeksjon. Det serum som inneholder anti-Dra fragment borreliacidale antistoff vil beskytte mot og eliminere organismer og kliniske symptomer etter infeksjon. I motsetning forventer vi at anti-OspC serum uten borreliacidale antistoff å være ineffektiv i å hindre eller behandle infeksjon. Det er således definitive bevis på anvendelse av Dra-fragmentet som en viktig Lyme-sykdomsvaksinekomponent.
Eksempel 10
Lyme-sykdom forårsaker også betydelig morbiditet og noe dødelighet blant hunder og katter. Det er likheter mellom sykdommen i mennesker og hunder, inkluderende migrering av spirocheter til ledd, og utvikling av Lyme-arthritis (45). Det er interessant at Straubinger et al. (27) nylig har rapportert, at i motsetning til i mennesker, så produserer naturlig infiserte hunder ikke borreliacidale antistoff.
Vi har imidlertid nylig vist at naturlig infiserte hunder faktisk utvikler høye konsentrasjoner av borreliacidale antistoff. Vi infiserte naturlig 15 12-24 ukers gamle patogen-frie harehunder ved å feste 10 hunkjønn og 6 hannkjønn Ixodus scapularis blodmidd til dyrene og lot dem deretter fore seg til de var fulle. Ca. 44% av blodmiddene var infisert med B. b. Høye konsentrasjoner av anti-B. b. 50772 borreliacidale antistoff var detekterbare i 8 (53%) av 15 hunder 1 uke etter at blodmiddet ble festet. Det henvises til tabell 6.
a Ti hunkjønn og seks hannkjønn Ixodes scapularis blodmidd fikk fore seg til de var fulle (44% av blodmidden ble infisert med B. burgdorferi.) Sannsynligheten for at den sist utfordrete hund mottok minst én infisert blodmidd var 99,4%. Alle blodmidd ble innsamlet fra en endemisk Lyme-sykdom
fokus nær Ettrick, WI.
k Signifikant borreliacidal aktivitet ved en serum-fortynning > 20.
c Resiprok fortynning av gjennomsnittlig borreliacidal antistoff titer.
^ NRD, ingen respons detektert.
Fra 2 til 9 uker etter infisering, hadde > 86% av hundene høye konsentrasjoner av borreliacidale antistoff i deres serum. I tillegg hadde 83% av de infiserte hundene utviklet kliniske tegn og symptomer (halthet) assosiert med Lyme-sykdom, og B. b. organismer ble gjenvunnet fra deres hud og ledd i > 90% i dyrene. Vi fjernet også anti-OspC og anti-Dra-fragment antistoff fra 3 hundesera med høye titer av anti-B. b. 50772 borreliacidale antistoff. Fjerning av disse antistoff resulterte i omtrent fullstendig eliminering av den borreliacidale aktivitet. Disse funn er omtrent identiske til våre resultater der humant sera ble anvendt. Det er således sannsynlig at OspC Dra-fragment vil være nyttig for kjæledyr på samme måte som beskrevet for mennesker.
Referanseliste.
Claims (14)
1. Isolert immunogenisk polypeptidfragment av OspC av Borrelia burgdorferi,
karakterisert ved at det består av en etitop av OspC som har en immunosyresekvens som angitt i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2.
2. Isolert polypeptid, karakterisert ve d at det har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2.
3. Isolert DNA-molekyl, karakterisert ve d at det koder for et polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 SEQ. ID. NO: 2.
4. Isolert DNA-molekyl i samsvar med krav 3, k a r a k terisert ved at det har en nukleotidbaseparsekvens som vist i nukleotider 433-582 i SEQ. ID. NO: 1.
5. Isolert DNA-molekyl i samsvar med krav 3, k a r a k terisert ved at det ytterligere omfatter et Dral gjenkjenningssete ved dets 5' terminus, og et Smal gjenkjenningssete ved dets 3' terminus.
6. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter en isolert DNA som koder for et polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2.
7. Farmasøytisk sammensetning for å vaksinere mot, og for å behandle borrelia-infeksjon i pattedyr, inkludert mennesker, karakterisert ved at sammensetningen omfatter en mengde av et isolert polypeptid med en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, idet mengden er effektiv for å hindre eller for å behandle borrelia-infeksjoner i pattedyr.
8. Farmasøytisk sammensetning i samsvar med krav 7, ka rakterisert ved at den ytterligere omfatter en farmasøytisk egnet bærer.
9. Farmasøytisk sammensetning i samsvar med krav 7, ka rakterisert ved at den ytterligere omfatter en adjuvans.
10. Anvendelse av et isolert polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, for fremstilling av et medikament for å hindre og behandle borrelia-infeksjon i pattedyr, inkludert mennesker.
11. Anvendelse i samsvar med krav 10, for å hindre og behandle infeksjon av Borrelia burgdorferi.
12. Fremgangsmåte for å detektere borrelia-infeksjon i pattedyr, inkludert mennesker,
karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: a) å sette et kroppsfluid fra en mammalsk vert som er mistenkt for å lide av borreliainfeksjon, i forbindelse med et isolert polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, og deretter b) bestemme om det isolerte polypeptid konjugeres til antistoff som foreligger i kroppsfluidet i den mammalske vert, idet nærvær av konjugering indikerer nærvær av borrelia-infeksjon i verten.
13. Fremgangsmåte i samsvar med krav 12, karakter isert ved at i trinn b) detekteres nærvær av konjugering ved anvendelse av enzym-koplet immunosorbentanalyse.
14. Kit for diagnostisering av borrelia-infeksjon i pattedyr, inkludert mennesker,
karakterisert ved at kittet omfatter et isolert polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i enheter 145-194 i SEQ. ID. NO: 2, arrangert i en dertil egnet beholder, og med instruksjoner for anvendelse.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US9495598P | 1998-07-31 | 1998-07-31 | |
PCT/US1999/017270 WO2000006745A1 (en) | 1998-07-31 | 1999-07-30 | Uses of the borreliacidal epitope(s) of borrelia burgdorferi outer surface protein c (ospc) as vaccine |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20010412D0 NO20010412D0 (no) | 2001-01-24 |
NO20010412L NO20010412L (no) | 2001-03-29 |
NO329227B1 true NO329227B1 (no) | 2010-09-20 |
Family
ID=22248146
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20010412A NO329227B1 (no) | 1998-07-31 | 2001-01-24 | Anvendelse av borreliacidal(e) epitoper av Borrelia burgdorferi ytre overflateprotein C som vaksine |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6210676B1 (no) |
EP (1) | EP1100922B1 (no) |
JP (1) | JP3631960B2 (no) |
AT (1) | ATE386805T1 (no) |
AU (1) | AU5328299A (no) |
CA (1) | CA2332570C (no) |
CY (1) | CY1107944T1 (no) |
DE (1) | DE69938183T2 (no) |
DK (1) | DK1100922T3 (no) |
ES (1) | ES2302385T3 (no) |
NO (1) | NO329227B1 (no) |
PT (1) | PT1100922E (no) |
WO (1) | WO2000006745A1 (no) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7008625B2 (en) | 1993-11-01 | 2006-03-07 | Research Foundation Of The State University Of New York | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
ES2272296T3 (es) | 1999-06-18 | 2007-05-01 | Research Foundation Of State University Of New York | Grupos de borrelia burgdorferi que producen la enfermedad de lyme en humanos. |
EP1939294A1 (en) * | 2000-08-18 | 2008-07-02 | Research Foundation Of State University Of New York | Recombinant constructs of borrelia burgdorferi |
EP1311682B1 (en) * | 2000-08-18 | 2007-12-12 | Research Foundation Of State University Of New York | Recombinant constructs of borrelia burgdorferi |
EP1311540B1 (en) * | 2000-08-18 | 2007-12-19 | Research Foundation Of State University Of New York | Altered ospa of borrelia burgdorferi |
EP1865062A3 (en) * | 2000-08-18 | 2008-01-09 | Research Foundation Of State University Of New York | Altered OspA of Borrelia burgdorferi |
US20020142355A1 (en) * | 2000-11-14 | 2002-10-03 | Baylor College Of Medicine | Methods for the in vivo biotin labeling of polypeptides |
BRPI0719360B1 (pt) * | 2006-11-03 | 2016-09-06 | Intervet Int Bv | vacina da doença de lyme canina, e, uso de organismos de uma genoespécie de borrelia |
EP2361930A3 (en) | 2007-03-26 | 2011-10-26 | Dako Denmark A/S | Multimers of MHC-peptide complexes and uses thereof in Borrelia infectious diseases |
EP3023436A1 (en) | 2007-07-03 | 2016-05-25 | Dako Denmark A/S | Improved methods for generation, labeling and use of mhc multimers |
WO2009039854A2 (en) | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Dako Denmark A/S | Mhc multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
DK2254592T3 (da) | 2008-02-28 | 2019-09-09 | Dako Denmark As | MHC-multimerer til Borrelia-diagnostik og sygdom |
WO2009135118A2 (en) * | 2008-05-02 | 2009-11-05 | Virginia Commonwealth University | Lyme disease vaccine |
US10722562B2 (en) | 2008-07-23 | 2020-07-28 | Immudex Aps | Combinatorial analysis and repair |
GB0817244D0 (en) | 2008-09-20 | 2008-10-29 | Univ Cardiff | Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells |
WO2010037402A1 (en) | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
US11992518B2 (en) | 2008-10-02 | 2024-05-28 | Agilent Technologies, Inc. | Molecular vaccines for infectious disease |
CN103229055A (zh) | 2010-09-27 | 2013-07-31 | 康奈尔大学 | 莱姆病的诊断方法 |
EP3029073B1 (en) * | 2010-10-20 | 2019-09-04 | Virginia Commonwealth University | Polyvalent chimeric ospc vaccinogen and diagnostic antigen |
US9562079B2 (en) | 2012-04-18 | 2017-02-07 | Zoetis Services Llc | Vaccines and methods to treat lyme disease in dogs |
UY34745A (es) | 2012-04-18 | 2013-11-29 | Zoetis Llc | Vacunas y procedimientos para tratar la enfermedad de lyme en perros |
US11061028B2 (en) | 2014-09-24 | 2021-07-13 | Defined Diagnostics, Llc | Compositions and methods for the diagnosis of lyme disease |
CA3082959A1 (en) | 2017-12-04 | 2019-06-13 | Intervet International B.V. | Canine lyme disease vaccine |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5777095A (en) | 1988-10-24 | 1998-07-07 | Symbicom Aktiebolag | Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90 |
US5385826A (en) | 1989-04-21 | 1995-01-31 | Gundersen Medical Foundation, Ltd. | Diagnostic assay for lyme disease |
DE4015911A1 (de) | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
JPH05506987A (ja) | 1990-03-07 | 1993-10-14 | エフ.ホフマン ― ラ ロシュ アーゲー | ライム病の診断方法 |
SG47447A1 (en) | 1990-06-15 | 1998-04-17 | Univ Yale | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
DE69408135T2 (de) * | 1993-04-29 | 1998-06-10 | Immuno Ag | Ospc-antigen-impfstoffe immunogene zusammensetzung zur vorbeugung und behandlung von lyme-krankheit und rekombinante verfahren zur herstellung von derartige antigene |
US5656451A (en) | 1993-07-30 | 1997-08-12 | Yale University | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi |
AU8091694A (en) * | 1993-10-26 | 1995-05-22 | United Biomedical Inc. | Structured synthetic antigen libraries as diagnostics, vaccines and therapeutics |
US5558993A (en) | 1994-06-17 | 1996-09-24 | The Regents Of The University Of California | Cloned Borrelia burgdorferi virulence protein |
US5853987A (en) | 1995-04-24 | 1998-12-29 | The Texas A & M University System | Decorin binding protein compositions and methods of use |
EP1019546B1 (en) | 1996-03-26 | 2004-12-15 | Cylex, Inc. | Methods for measurement of lymphocyte function |
CA2253374C (en) * | 1996-05-02 | 2004-07-20 | Marianne Jartved Mathiesen | Novel osp-c derived peptide fragments |
US5846946A (en) | 1996-06-14 | 1998-12-08 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Compositions and methods for administering Borrelia DNA |
-
1999
- 1999-07-30 ES ES99938897T patent/ES2302385T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-30 JP JP2000562527A patent/JP3631960B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-30 DK DK99938897T patent/DK1100922T3/da active
- 1999-07-30 US US09/364,083 patent/US6210676B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-30 DE DE69938183T patent/DE69938183T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-30 EP EP99938897A patent/EP1100922B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-30 WO PCT/US1999/017270 patent/WO2000006745A1/en active IP Right Grant
- 1999-07-30 AU AU53282/99A patent/AU5328299A/en not_active Abandoned
- 1999-07-30 PT PT99938897T patent/PT1100922E/pt unknown
- 1999-07-30 AT AT99938897T patent/ATE386805T1/de active
- 1999-07-30 CA CA002332570A patent/CA2332570C/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-08-30 US US09/651,419 patent/US6464985B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-01-24 NO NO20010412A patent/NO329227B1/no not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-05-13 CY CY20081100502T patent/CY1107944T1/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2000006745A1 (en) | 2000-02-10 |
PT1100922E (pt) | 2008-05-30 |
US6210676B1 (en) | 2001-04-03 |
EP1100922B1 (en) | 2008-02-20 |
CA2332570C (en) | 2009-12-08 |
US6464985B1 (en) | 2002-10-15 |
CA2332570A1 (en) | 2000-02-10 |
ES2302385T3 (es) | 2008-07-01 |
CY1107944T1 (el) | 2013-09-04 |
JP3631960B2 (ja) | 2005-03-23 |
DE69938183T2 (de) | 2009-02-19 |
AU5328299A (en) | 2000-02-21 |
EP1100922A1 (en) | 2001-05-23 |
DK1100922T3 (da) | 2008-06-16 |
ATE386805T1 (de) | 2008-03-15 |
NO20010412D0 (no) | 2001-01-24 |
DE69938183D1 (de) | 2008-04-03 |
NO20010412L (no) | 2001-03-29 |
JP2002523019A (ja) | 2002-07-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO329227B1 (no) | Anvendelse av borreliacidal(e) epitoper av Borrelia burgdorferi ytre overflateprotein C som vaksine | |
Rousselle et al. | Borreliacidal antibody production against outer surface protein C of Borrelia burgdorferi | |
JP5390189B2 (ja) | 多価キメラospcワクシノーゲンおよび診断用抗原 | |
Demaerschalck et al. | Simultaneous presence of different Borrelia burgdorferi genospecies in biological fluids of Lyme disease patients | |
Lovrich et al. | Abilities of OspA proteins from different seroprotective groups of Borrelia burgdorferi to protect hamsters from infection | |
WO1988005823A2 (en) | Mycobacterium tuberculosis genes encoding protein antigens | |
Fikrig et al. | Vaccination against Lyme disease caused by diverse Borrelia burgdorferi. | |
US20040033236A1 (en) | Recombinant constructs of borrelia burgdorferi | |
Wallich et al. | Molecular and immunological characterization of a novel polymorphic lipoprotein of Borrelia burgdorferi | |
AU683260B2 (en) | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens | |
Schulte-Spechtel et al. | Molecular analysis of decorin-binding protein A (DbpA) reveals five major groups among European Borrelia burgdorferi sensu lato strains with impact for the development of serological assays and indicates lateral gene transfer of the dbpA gene | |
EP0524958A1 (en) | ANTI-EFFECTING PROTEINS OF -I (BORRELIA BURGDORFERI). | |
JP2013542942A (ja) | 多価キメラospcワクシノーゲンおよび診断用抗原 | |
AU699416B2 (en) | Nucleic acids of (rochalimaea henselae) and (rochalimaea quintana) and methods and compositions for diagnosing (rochalimaea henselae) and (rochalimaea quintana) infection | |
WO2013033092A2 (en) | Streptococcus suis pilus antigens | |
WO1992012235A1 (en) | FLAGELLA-LESS $i(BORRELIA) | |
US6685945B2 (en) | Cloned Leptospira outer membrane protein | |
AU712882B2 (en) | Leptospira membrane proteins | |
WO1999042478A2 (en) | LEPTOSPIRAL OUTER MEMBRANE PROTEIN, LipL32 | |
US6296855B1 (en) | 17-KDA Brucella abortus antigen, recombinant polypeptides, nucleic acids coding for the same and use thereof in diagnostic and prophylactic methods and kits | |
EP0693936B1 (en) | Cloned leptospira outer membrane protein | |
Coyle et al. | Management of Lyme disease | |
Fikrig et al. | Borrelia burgdorferi | |
US6248583B1 (en) | Chromosomally-encoded membrane protein of borrelia burgdorferi | |
Wikel et al. | OspE-Related, OspF-Related, and Elp |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |