JPWO2018135560A1 - マイコバクテリウム・カンサシイを検出するためのプライマーセット、プローブ、キット及び方法 - Google Patents
マイコバクテリウム・カンサシイを検出するためのプライマーセット、プローブ、キット及び方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2018135560A1 JPWO2018135560A1 JP2018562417A JP2018562417A JPWO2018135560A1 JP WO2018135560 A1 JPWO2018135560 A1 JP WO2018135560A1 JP 2018562417 A JP2018562417 A JP 2018562417A JP 2018562417 A JP2018562417 A JP 2018562417A JP WO2018135560 A1 JPWO2018135560 A1 JP WO2018135560A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- base sequence
- polynucleotide
- seq
- bases
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
(1)マイコバクテリウム・カンサシイのゲノムDNAにおける、配列番号1、9、11、13、15、2、10、12、14又は16に示す第1塩基配列或いは第1塩基配列に相補的な第2塩基配列の全体又は一部分を含む標的領域の、5’末端の部分塩基配列である塩基配列Aと同一又は相同な塩基配列A’を3’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第1プライマーと、
前記標的領域の3’末端の部分塩基配列である塩基配列Bの相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列B’を3’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第2プライマーと
を含む、プライマーセット。
(2)塩基配列A及び塩基配列Bが、それぞれ、配列番号17、18、19、20又は21に示す第4塩基配列或いは第4塩基配列に相補的な第5塩基配列に含まれる、連続した8塩基以上の部分塩基配列である、(1)に記載のプライマーセット。
(3)第1プライマーが
(2f)配列番号3、5又は7に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列2faに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列2fbを3’末端に含む40塩基以下のポリヌクレオチド
を含み、
第2プライマーが
(2r)配列番号4、6又は8に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列2raに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列2rbを3’末端に含む40塩基以下のポリヌクレオチド
を含む
(1)又は(2)に記載のプライマーセット。
(4)第1プライマーが
(1f)配列番号22、24、26、28、30、32、34又は36に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列1faに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列1fbを3’末端に含む40塩基以下のポリヌクレオチド
を含み、
第2プライマーが
(1r)配列番号23、25、27、29、31、33、35又は37に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列1raに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列1rbを3’末端に含む40塩基以下のポリヌクレオチド
を含む
(1)又は(2)に記載のプライマーセット。
(5)第1プライマー及び第2プライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、(1)〜(4)のいずれかに記載のプライマーセット。
(6)配列番号1、9、11、13、15、2、10、12、14又は16に示す第1塩基配列或いは第1塩基配列に相補的な第2塩基配列の部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むプローブ。
(7)前記ポリヌクレオチドが、
(2p)配列番号38、39又は40に示す塩基配列又はその相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列2paに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列2pbを含むポリヌクレオチド
である、(6)に記載のプローブ。
(8)標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部、及び/又は、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、(6)又は(7)に記載のプローブ。
(9)前記ポリヌクレオチドの5’末端に連結されたレポーター蛍光色素、及び、3’末端に連結されたクエンチャー色素を更に含む、(6)又は(7)に記載のプローブ。
(10)(1)〜(5)のいずれかに記載のプライマーセットを含む、マイコバクテリウム・カンサシイ及び/又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出するためのキット。
(11)(5)に記載のプライマーセットを含み、且つ、
前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体を更に含む、(10)に記載のキット。
(12)(6)〜(9)のいずれかに記載のプローブを含む、マイコバクテリウム・カンサシイ及び/又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出するためのキット。
(13)試料中のマイコバクテリウム・カンサシイ及び/又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出する方法であって、
試料中の、配列番号1、9、11、13、15、2、10、12、14又は16に示す第1塩基配列、第1塩基配列に相補的な第2塩基配列、或いは、第1塩基配列又は第2塩基配列における任意のTがUに置換された第3塩基配列を含むポリヌクレオチドを検出すること
を含む方法。
(14)試料中のポリヌクレオチドを鋳型とし、(1)〜(5)のいずれかに記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、及び、
核酸増幅反応により増幅したポリヌクレオチド断片を検出すること
を含む、(13)に記載の方法。
(15)試料中のポリヌクレオチド、又は、試料中のポリヌクレオチドを鋳型とし核酸増幅反応を行い増幅したポリヌクレオチド断片と、(6)〜(9)のいずれかに記載のプローブとを、ハイブリダイズ可能な条件下でインキュベートすること、及び、
前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチド断片と、前記プローブとのハイブリダイゼーションを検出すること
を含む、(13)に記載の方法。
<1.マイコバクテリウム・カンサシイのゲノムDNA>
2016年に公開された非特許文献5に、M.カンサシイのタイプ(又はサブタイプ)I、II、III、IV、Vのドラフトゲノム配列が公開された。
<2.用語>
本発明において「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)を指す。RNAにおいては、チミン(T)をウラシル(U)と読み替えることができる。ポリヌクレオチドとしては、任意の位置のTをUに置換して合成したUを含むDNAや、任意の位置のUをTに置換して合成したTを含むRNAも使用することができる。ポリヌクレオチドはイノシン(I)等の修飾ヌクレオチドを一部に含んでいてもよい。
<3.プライマーセット>
本発明は、
M.カンサシイのゲノムDNAにおける、配列番号1、9、11、13、15、2、10、12、14又は16に示す第1塩基配列或いは第1塩基配列に相補的な第2塩基配列の全体又は一部分を含む標的領域の、5’末端の部分塩基配列である塩基配列Aと同一又は相同な塩基配列A’を3’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第1プライマーと、
前記標的領域の3’末端の部分塩基配列である塩基配列Bの相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列B’を3’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第2プライマーと
を含む、プライマーセットに関する。
第1プライマーが、
(2f)配列番号3、5又は7に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列2faに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列2fbを3’末端に含む40塩基以下のポリヌクレオチド
を含むプライマーであり、
第2プライマーが、
(2r)配列番号4、6又は8に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列2raに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列2rbを3’末端に含む40塩基以下のポリヌクレオチド
を含むプライマーである、プライマーセットが例示できる。
第1プライマーが、
(1f)配列番号22、24、26、28、30、32、34又は36に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列1faに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列1fbを3’末端に含む40塩基以下のポリヌクレオチド
を含み、
第2プライマーが、
(1r)配列番号23、25、27、29、31、33、35又は37に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列1raに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列1rbを3’末端に含む40塩基以下のポリヌクレオチド
を含む、プライマーセットが例示できる。
(本発明のプライマーセットの好適な態様)
(標識部)
標識部は、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質のいずれかであり、好ましくは標識物質と結合可能なタグである。本明細書では、標識物質と結合可能なタグを標識用タグと呼ぶ場合がある。標識部が標識用タグである場合、核酸増幅反応の増幅産物と標識物質とを接触させることにより増幅産物の一端に含まれるタグを標識することができる。標識部が標識物質である場合、核酸増幅反応の増幅産物として標識物質を一端に含む増幅産物を得ることができる。
−O−CmH2m−O− 式(II)
(式中、一方の端の酸素原子は、一方のポリヌクレオチド分子の3’末端又は5’末端のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、他方の端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の3’末端又は5’末端のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、mは1以上40以下の整数を表す。Hは、置換基により置換されていてもよい。)
式(II)においてmは、好ましくは2以上36以下であり、より好ましくは3以上16以下である。式(II)中のHは、置換基により置換されていてもよく、置換基としては、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。置換基としてのアルキル基及びアルコキシ基の炭素数は1〜8であることが好ましく、より好ましくは1〜4である。また、2以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
−(OCnH2n)L−O− 式(III)
(式中、一方の端の酸素原子は、一方のポリヌクレオチド分子の3’末端又は5’末端のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、他方の端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の3’末端又は5’末端のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、nは2以上4以下の整数を表し、Lは、1以上の整数であって、(n+1)×Lは40以下となる整数を表す。Hは、置換基により置換されていてもよい。)
式(III)において(n+1)×Lは、好ましくは2以上36以下であり、より好ましくは3以上16以下である。式(III)中のHの置換基は、式(II)中の置換基と同様の態様が適用される。
(結合部及び固相担体)
結合部は、後述する固相担体と結合可能なタグである。本明細書では、固相担体と結合可能なタグを固定化用タグと呼ぶ場合がある。
<4.プローブ>
本発明はまた、配列番号1、9、11、13、15、2、10、12、14又は16に示す第1塩基配列或いは第1塩基配列に相補的な第2塩基配列の部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むプローブに関する。
(2p)配列番号38、39又は40に示す塩基配列又はその相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列2paに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列2pbを含むポリヌクレオチド
が例示できる。
<5.検出方法>
本発明はまた、
試料中のM.カンサシイ及び/又はM.カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出する方法であって、
試料中の、配列番号1、9、11、13、15、2、10、12、14又は16に示す第1塩基配列、第1塩基配列に相補的な第2塩基配列、或いは、第1塩基配列又は第2塩基配列における任意のTがUに置換された第3塩基配列を含むポリヌクレオチドを検出すること
を含む方法に関する。
<5.1.本発明のプライマーセットを用いる検出方法>
本発明の検出方法の一態様は、
試料中のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う工程1、及び、
核酸増幅反応により増幅したポリヌクレオチド断片を検出する工程2
を含む。
<5.1.1.固相担体を用いた検出工程>
この検出工程では、前記の工程1における核酸増幅反応の生成物を、結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、標識部を指標として固相担体の前記部分での増幅産物を検出する。
<5.1.2.標識工程>
標識工程は、本発明のプライマーセットに含まれる前記標識部が上述の標識用タグである場合に行う工程であり、核酸増幅反応の生成物と標識物質とを接触させ、標識用タグに標識物質に結合させることにより行う。標識工程は、核酸増幅反応の生成物を固相担体に接触させる前に行ってもよいし、接触させた後に行ってもよいし、接触させると同時に行ってもよい。
<5.1.3.検出デバイス>
上述の検出工程及び標識工程は、核酸クロマトグラフィーを利用する核酸検出デバイスを用いて行うことができる。当該核酸検出デバイスを利用することにより、核酸増幅反応の反応系中の増幅産物(標的領域を含むポリヌクレオチド断片)の有無を、特殊な装置を必要とすることなく検出・判別することができ、簡便かつ迅速に結果を得ることができる。
<5.2.本発明のプローブを用いる検出方法>
本発明の検出方法の他の一態様は、
試料中のポリヌクレオチド、又は、試料中のポリヌクレオチドを鋳型とし核酸増幅反応を行い増幅したポリヌクレオチド断片と、本発明のプローブとを、ハイブリダイズ可能な条件下でインキュベートする工程3、及び、
前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチド断片と、前記プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程4
を含む。
<6.キット>
本発明はまた、
本発明のプライマーセット及び/又は本発明のプローブを含む、マイコバクテリウム・カンサシイ及び/又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出するためのキット
に関する。
[実施例1]
(1)プライマーの設計
M. kansasiiに特異領域2内に、プライマーデザイン用のWebツールPrimer BLASTを用いてPCR増幅検出のためのプライマーセット1〜3を設計した。各プライマーの設計位置は図2−1、2−2及び2−3に示したとおり。プライマーセット1〜3のフォワードプライマー、リバースプライマーの塩基配列を以下に示す。
上記のプライマーセット1〜3を用いて、TaKaRa TaqHS perfect Mixのマニュアルに従い、下記のPCR用反応液を調製した。
(3)電気泳動
上記(2)で得られたPCR後の反応液5μLを、2%アガロースゲルを用いた電気泳動法により分離した。次いでエチジウムブロマイドで染色後、紫外線を照射してバンドを検出した。
[実施例2]
結核菌群4種(M.tuberculosis、M.bovis、M.bovis BCG、M.microti)および非結核性抗酸菌(M.kansasii、M.gastriなど)38種、一般細菌1種(Nocardia asteroides)から抽出したゲノムDNAを鋳型として使用し、プライマーセット2をプライマーセットとして使用した以外は、実施例1と同様の条件でPCRを行い、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動法により確認した。結果を下記表に示す。
[実施例3]
プライマーセット2を用いたPCRによる増幅産物を検出することができる核酸クロマトグラフィー検出系を構築した。この検出系を用いてM.kansasiiの臨床分離株の検出が可能であることを確認した。
(I)プライマーの構造
実施例1に記載のプライマーセット2のフォワードプライマー(KAN−2f)の5’末端に、ポリメラーゼ反応を阻害するアゾベンゼン構造を含む、上記式Iで表される二価基を介して、以下のフォワードプライマー用タグ配列からなるDNAを連結した。このとき、上記式Iに示すアゾベンゼンの構造を含む二価基の5’端と、フォワードプライマー用タグ配列からなるDNAの3’末端のヌクレオチドのリン酸基とがリン酸エステル結合を形成し、該二価基の3’端のリン酸基と、前記フォワードプライマーのプライマー部分の5’末端のヌクレオチドのデオキシリボースの5’位の水酸基とがリン酸エステル結合を形成する。
5’−GACAACGGAGACAGAGCCAA−3’(配列番号41)
実施例1に記載のプライマーセット2のリバースプライマー(KAN−2r)の5’末端には、ポリメラーゼ反応を阻害するアゾベンゼン構造を含む、上記式Iで表される二価基を介して、以下のリバースプライマー用タグ配列からなるDNAを連結した。このとき、上記式Iに示すアゾベンゼンの構造を含む二価基の一方の端の酸素原子と、リバースプライマー用タグ配列からなるDNAの3’末端のヌクレオチドのリン酸基とがリン酸エステル結合を形成し、該二価基の他方の端のリン酸基と、前記リバースプライマーのプライマー部分の5’末端のヌクレオチドのデオキシリボースの5’位の水酸基とがリン酸エステル結合を形成する。
5’−ATGCTACCGTATGCCCAGTG−3’(配列番号42)
(II)オリゴヌクレオチド結合金コロイドの作製
Gold Colloid(40nm,9.0×1010(粒子数/ml)、British Biocell International社製)と下記の配列番号43で表されるチオール基含有オリゴヌクレオチドを混合し、50℃で16時間インキュベートした。6000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去し、0.05M塩化ナトリウム、5mMリン酸バッファー(pH7)を添加し混和後、再度50℃で40時間インキュベートした。
配列番号43で示すチオール基含有オリゴヌクレオチドは、3’末端のシトシンヌクレオチドの3’位のリン酸基と、HO−(CH2)m−SH(mは6)で表される化合物の水酸基とがリン酸エステル結合により結合したものである。
(III)タグ捕捉手段を固定化したメンブレンの作製
タグ捕捉手段として、下記の配列番号44で表されるオリゴヌクレオチドプローブを含む溶液を、メルクミリポア社製ニトロセルロースメンブレン(Hi−Flow180)に、ディスペンサーを用いて、展開方向と直交する幅1mmのライン状に塗布した。その後40℃で30分間乾燥させることでタグ捕捉手段を備えたメンブレンとした。
(IV)ラテラルフロー型核酸検出デバイスの作製
作製したラテラルフロー型核酸検出デバイスは、図4の模式図に示される検出デバイスに準拠して作製した。
(V)PCR
上記(I)に記載の、タグが付加されたプライマーセット2を用い、表5に示す各株のゲノムDNAを鋳型として用いた以外は実施例1と同様の条件によりPCRを行った。
(VI)核酸クロマトグラフィー検出系を用いた検出1
上記条件でのPCR後の反応液を、ラテラルフロー型核酸検出デバイス10に適用して、増幅産物の検出を試みた。具体的には、前記デバイス10上のサンプルパッド3にPCR後の反応液5μLを添加し、さらに80μLの展開溶液(界面活性剤を配合したクエン酸緩衝液)を添加することで、反応液を展開した。室温で10分後、メンブレン1上のライン状に固定化されたタグ捕捉手段を含む部分6の着色の有無を目視で確認した。着色が確認できた場合に「+」、確認できなかった場合に「−」とした。
(VII)核酸クロマトグラフィー検出系を用いた検出2
上記(I)に記載の、タグが付加されたプライマーセット2を用い、表4に示す各株のゲノムDNAを鋳型として用いた以外は実施例1と同様の条件によりPCRを行った。
[実施例4]
M.kansasii(Type I)から抽出したゲノムDNAを鋳型として使用し、表2に示すプライマーセット4(MKS−40f(配列番号22)及びMKS−40r(配列番号23))、プライマーセット5(MKS−41f(配列番号24)及びMKS−41r(配列番号25))、プライマーセット6(MKS−42f(配列番号26)及びMKS−42r(配列番号27))又はプライマーセット7(MKS−43f(配列番号28)及びMKS−43r(配列番号29))をプライマーセットとして使用した以外は、実施例1と同様の条件でPCRを行い、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動法により確認した。どのプライマーセットを用いた場合も、標的サイズの増幅産物の存在を確認することができた。
[実施例5]
M.kansasii(Type II)から抽出したゲノムDNAを鋳型として使用し、表2に示す、プライマーセット6又はプライマーセット7をプライマーセットとして使用した以外は、実施例1と同様の条件でPCRを行い、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動法により確認した。どのプライマーセットを用いた場合も、標的サイズの増幅産物の存在を確認することができた。
Claims (15)
- マイコバクテリウム・カンサシイのゲノムDNAにおける、配列番号1、9、11、13、15、2、10、12、14又は16に示す第1塩基配列或いは第1塩基配列に相補的な第2塩基配列の全体又は一部分を含む標的領域の、5’末端の部分塩基配列である塩基配列Aと同一又は相同な塩基配列A’を3’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第1プライマーと、
前記標的領域の3’末端の部分塩基配列である塩基配列Bの相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列B’を3’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第2プライマーと
を含む、プライマーセット。 - 塩基配列A及び塩基配列Bが、それぞれ、配列番号17、18、19、20又は21に示す第4塩基配列或いは第4塩基配列に相補的な第5塩基配列に含まれる、連続した8塩基以上の部分塩基配列である、請求項1に記載のプライマーセット。
- 第1プライマーが
(2f)配列番号3、5又は7に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列2faに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列2fbを3’末端に含む40塩基以下のポリヌクレオチド
を含み、
第2プライマーが
(2r)配列番号4、6又は8に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列2raに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列2rbを3’末端に含む40塩基以下のポリヌクレオチド
を含む
請求項1又は2に記載のプライマーセット。 - 第1プライマーが
(1f)配列番号22、24、26、28、30、32、34又は36に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列1faに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列1fbを3’末端に含む40塩基以下のポリヌクレオチド
を含み、
第2プライマーが
(1r)配列番号23、25、27、29、31、33、35又は37に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列1raに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列1rbを3’末端に含む40塩基以下のポリヌクレオチド
を含む
請求項1又は2に記載のプライマーセット。 - 第1プライマー及び第2プライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のプライマーセット。
- 配列番号1、9、11、13、15、2、10、12、14又は16に示す第1塩基配列或いは第1塩基配列に相補的な第2塩基配列の部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むプローブ。
- 前記ポリヌクレオチドが、
(2p)配列番号38、39又は40に示す塩基配列又はその相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列2paに含まれる連続した8塩基以上の塩基配列2pbを含むポリヌクレオチド
である、請求項6に記載のプローブ。 - 標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部、及び/又は、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、請求項6又は7に記載のプローブ。
- 前記ポリヌクレオチドの5’末端に連結されたレポーター蛍光色素、及び、3’末端に連結されたクエンチャー色素を更に含む、請求項6又は7に記載のプローブ。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のプライマーセットを含む、マイコバクテリウム・カンサシイ及び/又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出するためのキット。
- 請求項5に記載のプライマーセットを含み、且つ、
前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体を更に含む、請求項10に記載のキット。 - 請求項6〜9のいずれか1項に記載のプローブを含む、マイコバクテリウム・カンサシイ及び/又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出するためのキット。
- 試料中のマイコバクテリウム・カンサシイ及び/又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出する方法であって、
試料中の、配列番号1、9、11、13、15、2、10、12、14又は16に示す第1塩基配列、第1塩基配列に相補的な第2塩基配列、或いは、第1塩基配列又は第2塩基配列における任意のTがUに置換された第3塩基配列を含むポリヌクレオチドを検出すること
を含む方法。 - 試料中のポリヌクレオチドを鋳型とし、請求項1〜5のいずれか1項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、及び、
核酸増幅反応により増幅したポリヌクレオチド断片を検出すること
を含む、請求項13に記載の方法。 - 試料中のポリヌクレオチド、又は、試料中のポリヌクレオチドを鋳型とし核酸増幅反応を行い増幅したポリヌクレオチド断片と、請求項6〜9のいずれか1項に記載のプローブとを、ハイブリダイズ可能な条件下でインキュベートすること、及び、
前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチド断片と、前記プローブとのハイブリダイゼーションを検出すること
を含む、請求項13に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017007871 | 2017-01-19 | ||
JP2017007871 | 2017-01-19 | ||
PCT/JP2018/001325 WO2018135560A1 (ja) | 2017-01-19 | 2018-01-18 | マイコバクテリウム・カンサシイを検出するためのプライマーセット、プローブ、キット及び方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2018135560A1 true JPWO2018135560A1 (ja) | 2019-11-07 |
JP7125060B2 JP7125060B2 (ja) | 2022-08-24 |
Family
ID=62909160
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018562417A Active JP7125060B2 (ja) | 2017-01-19 | 2018-01-18 | マイコバクテリウム・カンサシイを検出するためのプライマーセット、プローブ、キット及び方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP3572509B1 (ja) |
JP (1) | JP7125060B2 (ja) |
CN (1) | CN110475863B (ja) |
WO (1) | WO2018135560A1 (ja) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0630796A (ja) * | 1992-05-26 | 1994-02-08 | Becton Dickinson & Co | マイコバクテリアプローブ |
JPH1057098A (ja) * | 1996-06-14 | 1998-03-03 | Becton Dickinson & Co | ミコバクテリウム・カンサシイの種特異的検出 |
JPH11155589A (ja) * | 1997-09-25 | 1999-06-15 | Becton Dickinson & Co | Mycobacterium kansasiiの検出に潜在的に有効なDNA領域の同定 |
JP2001128679A (ja) * | 1999-11-02 | 2001-05-15 | Marine Biotechnol Inst Co Ltd | Dnaジャイレース遺伝子中に存在する特徴的な塩基配列を用いた遅発育性マイコバクテリアの同定法及び特異的検出法 |
WO2006121134A1 (ja) * | 2005-05-13 | 2006-11-16 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・カンサシ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・カンサシの検出方法 |
JP2009039103A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-02-26 | Toyobo Co Ltd | 抗酸菌属細菌の検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01155589A (ja) | 1987-12-11 | 1989-06-19 | Hitachi Ltd | 半導体記憶装置 |
US5518884A (en) * | 1994-02-28 | 1996-05-21 | Becton, Dickinson And Company | Nucleic acid sequences specific for mycbacterium kansasii |
US5747259A (en) * | 1996-07-17 | 1998-05-05 | Becton, Dickinson And Company | Materials and methods for species-specific detection of mycobacterium kansasii nucleic acids |
AU744325B2 (en) * | 1997-01-29 | 2002-02-21 | Lionex Gmbh | Test kit for tuberculosis diagnosis or the like |
JP4905130B2 (ja) * | 2004-04-26 | 2012-03-28 | 和光純薬工業株式会社 | 結核菌検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたヒト型結核菌の検出方法 |
EP2179041A4 (en) * | 2007-06-22 | 2010-12-22 | Ibis Biosciences Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR IDENTIFYING SPECIFIC CHARACTERISTICS OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS |
CN102573896B (zh) * | 2009-05-13 | 2016-05-11 | 因波特医疗股份有限公司 | 结核分枝杆菌免疫优势抗原的组合物和方法 |
WO2012070618A1 (ja) | 2010-11-24 | 2012-05-31 | 株式会社カネカ | 増幅核酸検出方法及び検出デバイス |
CN105755016B (zh) * | 2014-12-19 | 2019-10-01 | 上海交通大学 | 嗜铁素合成基因簇及其应用 |
JP6436538B2 (ja) | 2015-06-16 | 2018-12-12 | 国立研究開発法人物質・材料研究機構 | ε−Ga2O3単結晶、ε−Ga2O3の製造方法、および、それを用いた半導体素子 |
-
2018
- 2018-01-18 CN CN201880019552.3A patent/CN110475863B/zh active Active
- 2018-01-18 JP JP2018562417A patent/JP7125060B2/ja active Active
- 2018-01-18 WO PCT/JP2018/001325 patent/WO2018135560A1/ja unknown
- 2018-01-18 EP EP18741479.2A patent/EP3572509B1/en active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0630796A (ja) * | 1992-05-26 | 1994-02-08 | Becton Dickinson & Co | マイコバクテリアプローブ |
JPH1057098A (ja) * | 1996-06-14 | 1998-03-03 | Becton Dickinson & Co | ミコバクテリウム・カンサシイの種特異的検出 |
JPH11155589A (ja) * | 1997-09-25 | 1999-06-15 | Becton Dickinson & Co | Mycobacterium kansasiiの検出に潜在的に有効なDNA領域の同定 |
JP2001128679A (ja) * | 1999-11-02 | 2001-05-15 | Marine Biotechnol Inst Co Ltd | Dnaジャイレース遺伝子中に存在する特徴的な塩基配列を用いた遅発育性マイコバクテリアの同定法及び特異的検出法 |
WO2006121134A1 (ja) * | 2005-05-13 | 2006-11-16 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・カンサシ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・カンサシの検出方法 |
JP2009039103A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-02-26 | Toyobo Co Ltd | 抗酸菌属細菌の検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
GENOME ANNOUNCEMENTS (2016) VOL.4, NO.3, E00456-16, PP.1-2, JPN6018013729, ISSN: 0004672631 * |
日本臨床微生物学雑誌 (2010) VOL.20, NO.2, PP.125-129(21-25), JPN6018013728, ISSN: 0004672630 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3572509A4 (en) | 2020-08-26 |
CN110475863A (zh) | 2019-11-19 |
CN110475863B (zh) | 2023-10-13 |
EP3572509B1 (en) | 2023-09-20 |
EP3572509A1 (en) | 2019-11-27 |
JP7125060B2 (ja) | 2022-08-24 |
WO2018135560A1 (ja) | 2018-07-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6408447B2 (ja) | Lamp産物の均質リアルタイム検出のための配列特異的方法 | |
JP5811086B2 (ja) | クラミジア・トラコマティス検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミジア・トラコマティスの検出方法 | |
JP5254016B2 (ja) | 結核の診断のための核酸標的としてのrd9およびis6110の使用、ならびにマルチプレックス−コンプライアントis6110およびrd9標的の提供 | |
JP5156726B2 (ja) | ハイブリダイゼーションアッセイを使用する真正細菌群の検出、同定および区別 | |
JP5210634B2 (ja) | スペーサー領域を使用するセラチア(Serratia)種の検出、同定および鑑別 | |
JP4241929B2 (ja) | Mycobacterium Kansasiiを検出するための組成物および方法 | |
JP3048340B2 (ja) | Micobacterium kansasii核酸の種特異的検出に関する材料および方法 | |
US20040110129A1 (en) | Multiplex hybridization system for identification of pathogenic mycobacterium and method of use | |
JP2000511777A (ja) | クラミジア・ニューモニエ検出用核酸プライマーおよびプローブ | |
WO2018135560A1 (ja) | マイコバクテリウム・カンサシイを検出するためのプライマーセット、プローブ、キット及び方法 | |
JP7391321B2 (ja) | アクネ菌のdnaタイプの判別用オリゴヌクレオチドセット、キット及びアクネ菌のdnaタイプの判別方法 | |
KR19990022595A (ko) | 나이세리아 종에 대한 핵산 프로브 및 증폭 올리고뉴클레오티드 | |
JP4766878B2 (ja) | ハイブリダイゼーションアッセイを使用する真正細菌群の検出、同定および識別 | |
EP2971083B1 (en) | Detection of neisseria gonorrhoeaes | |
WO2021201206A1 (ja) | マイコバクテロイデス・アブセッサス・コンプレックスに属する抗酸菌のerm(41)遺伝子の一塩基変異を判別する方法、その方法に用いるプライマーセット及びプローブ | |
JP2010536343A (ja) | 薬剤耐性菌検出方法 | |
JP4441259B2 (ja) | グラム陽性菌の検出方法 | |
JP2021159023A (ja) | マイコバクテロイデス・アブセッサス亜種を検出するためのプライマーセット、キット及び方法 | |
US7749696B2 (en) | Method and kit for the specific detection of M. tuberculosis | |
EP1233076A2 (en) | Differential diagnosis for mycobacterial and pseudomonas species using species-specific upstream p34 gene region probes | |
JP2017158523A (ja) | リステリア・モノサイトゲネスを検出するためのプライマーセット、キット及び方法 | |
KR20230095302A (ko) | 조류 클라미디아균 감별 동정용 실시간 유전자 진단법 | |
JP2013055947A (ja) | 結核の診断のための核酸標的としてのrd9およびis6110の使用、ならびにマルチプレックス−コンプライアントis6110およびrd9標的の提供 | |
JPH06133799A (ja) | ヒトヘルペスウイルス6型(hhv−6)dnaの検出及びサブタイプ識別方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210105 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210105 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220104 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220307 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220705 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220802 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7125060 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |