CN110475863A - 用于检测堪萨斯分枝杆菌的引物组、探针、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测堪萨斯分枝杆菌的引物组、探针、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于物种特异性地检测堪萨斯分枝杆菌的新方式。本发明的引物组包含第1引物和第2引物，所述第1引物包含多核苷酸，所述多核苷酸在3’末端包含与碱基序列A相同或同源的碱基序列A’，所述碱基序列A是堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中的靶点区域的5’末端的部分碱基序列，所述靶点区域包含序列号1、9、11、13、15、2、10、12、14或16所示的第1碱基序列或与第1碱基序列互补的第2碱基序列的全部或一部分，所述第2引物包含多核苷酸，所述多核苷酸在3’末端包含与碱基序列B的互补碱基序列相同或同源的碱基序列B’，所述碱基序列B是所述靶点区域的3’末端的部分碱基序列。

Description

用于检测堪萨斯分枝杆菌的引物组、探针、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及用于对来自堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)的多核苷酸进行扩增的引物组。
本发明涉及能够与来自堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸进行特异性杂交的探针。
本发明涉及用于对来自堪萨斯分枝杆菌和/或堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸进行检测的试剂盒。
本发明涉及对来自堪萨斯分枝杆菌和/或堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸进行检测的方法。
背景技术
分枝杆菌(Mycobacterium)是抗酸性、非运动性的革兰氏阳性杆菌。分枝杆菌大致分为结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex)和非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacteria；NTM)这两种。
近年来，NTM导致的传染病正在世界范围增加。NTM是指分枝杆菌当中除了结核分枝杆菌复合群和特殊营养缺陷菌以外的菌群的总称，日本也已经报告了30种类以上的菌种所导致的传染病(NTM症)。
作为NTM病的病原菌，鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium complex(MAC))最多(约7成)，其次是Mycobacterium kansasii(堪萨斯分枝杆菌，M.kansasii)(约1～2成)。
堪萨斯分枝杆菌根据hsp65RPA分析分类为7种类型(亚型)。I型大多从呼吸系统疾病患者分离，II型从HIV患者分离。其它的III～VII型也显示出病原性。
堪萨斯分枝杆菌与胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri,M.gastri)在遗传上是近缘(非专利文献1)。两者的16S rRNA基因的序列100％一致(非专利文献2)。
目前，分枝杆菌症通过进行抗酸染色和培养并接着进行生化学检测(生成过氧化氢酶、脲酶活性、Tween水解、硝酸盐还原、光致变色性(photochromic)等)来诊断。
作为除培养法、生化学检测以外的分枝杆菌症病原菌的判断方法，有如下报告。
在非专利文献3中，Huang ZH.等报告了使用对堪萨斯分枝杆菌特异性的DNA探针的方法。
在非专利文献4中，Rogall T.等报告了利用以16S rRNA作为靶点的PCR的鉴定方法。
专利文献1公开了堪萨斯分枝杆菌特有的序列，并且公开了通过以该序列作为靶点的探针或PCR扩增检测堪萨斯分枝杆菌。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平11-155589号公报非专利文献
非专利文献1：Kim H.et.al,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.2005,55,1649-1656
非专利文献2：日本临床微生物学杂志,vol.20,No.2,2010,125-129
非专利文献3：J.Clin.Microbiol.,1991Oct；29(10):2125-2129
非专利文献4：J.Gen.Microbiol.,1990Sep；136(9):1915-20.
非专利文献5：Genome Announc.2016Jun2；4(3).pii:e00456-16.doi:10.1128/genomeA.00456-16.
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，为了检测、鉴定堪萨斯分枝杆菌，已知进行培养并进行生化学检测的方法，该方法具有步骤复杂的问题。特别是作为用于鉴定堪萨斯分枝杆菌的指标，已知有光致变色能力，光致变色能力的确定需要单纯培养，花费时间，其性质容易发生变化，可靠性低，因此作为堪萨斯分枝杆菌的鉴定指标未必是理想的。
另一方面，如上所述，着眼于堪萨斯分枝杆菌所具有的核酸的碱基序列，作为通过使用了DNA探针的杂交、PCR法来检测堪萨斯分枝杆菌的方法，报告了非专利文献3、4、专利文献1等中记载的方法。
但是，非专利文献3中公开的DNA探针存在以下问题：不仅是堪萨斯分枝杆菌的核酸，而且胃分枝杆菌的核酸均是交叉杂交的，遗传上很远的堪萨斯分枝杆菌的类型未进行杂交，无法进行检测。
非专利文献4中记载的方法是利用以16S rRNA作为靶点的PCR进行的鉴定方法，如上所述，由于堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌的16S rRNA基因的序列是相同的，因此难以将堪萨斯分枝杆菌与胃分枝杆菌区别检测出来。
另外，专利文献1的实施例3中显示了如下实验结果：在专利文献1中记载的堪萨斯分枝杆菌的检测方法中，不仅是堪萨斯分枝杆菌，而且胃分枝杆菌也进行交叉杂交。
因此，本发明的目的在于提供一种用于物种特异性地检测堪萨斯分枝杆菌的新方法。这里，“物种特异性地检测堪萨斯分枝杆菌”通常是指不检测胃分枝杆菌等近缘种，而检测各种类型的堪萨斯分枝杆菌。
解决课题的方法
本发明公开以下的发明作为解决上述课题的方法。
(1)一种引物组，其包含第1引物和第2引物，
所述第1引物包含多核苷酸，所述多核苷酸在3’末端包含与碱基序列A相同或同源的碱基序列A’，所述碱基序列A是堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中的靶点区域的5’末端的部分碱基序列，所述靶点区域包含序列号1、9、11、13、15、2、10、12、14或16所示的第1碱基序列或与第1碱基序列互补的第2碱基序列的全部或一部分，
所述第2引物包含多核苷酸，所述多核苷酸在3’末端包含与碱基序列B的互补碱基序列相同或同源的碱基序列B’，所述碱基序列B是所述靶点区域的3’末端的部分碱基序列。
(2)根据(1)所述的引物组，其中，碱基序列A及碱基序列B分别是连续的8碱基以上的部分碱基序列，且包含于序列号17、18、19、20或21所示的第4碱基序列、或与第4碱基序列互补的第5碱基序列。
(3)根据(1)或(2)所述的引物组，其中，
第1引物包含(2f)在3’末端包含碱基序列2fb的40碱基以下的多核苷酸，所述碱基序列2fb是与序列号3、5或7所示的碱基序列相同或同源的碱基序列2fa中包含的连续的8碱基以上的碱基序列，
第2引物包含(2r)在3’末端包含碱基序列2rb的40碱基以下的多核苷酸，所述碱基序列2rb是与序列号4、6或8所示的碱基序列相同或同源的碱基序列2ra中包含的连续的8碱基以上的碱基序列。
(4)根据(1)或(2)所述的引物组，其中，
第1引物包含(1f)在3’末端包含碱基序列1fb的40碱基以下的多核苷酸，所述碱基序列1fb是与序列号22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列相同或同源的碱基序列1fa中包含的连续的8碱基以上的碱基序列，
第2引物包含(1r)在3’末端包含碱基序列1rb的40碱基以下的多核苷酸，所述碱基序列1rb是与序列号23、25、27、29、31、33、35或37所示的碱基序列相同或同源的碱基序列1ra中包含的连续的8碱基以上的碱基序列。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的引物组，其中，
第1引物及第2引物中的一者还包含标识部，所述标识部是能够与标识物质结合的标签或标识物质，另一者还包含结合部，所述结合部是能够与固相载体结合的标签。
(6)一种探针，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与第1碱基序列或第2碱基序列的部分碱基序列相同或同源的碱基序列，所述第1碱基序列是序列号1、9、11、13、15、2、10、12、14或16所示的碱基序列，所述第2碱基序列与第1碱基序列互补。
(7)根据(6)所述的探针，其中，
所述多核苷酸是(2p)包含碱基序列2pb的多核苷酸，所述碱基序列2pb是与序列号38、39或40所示的碱基序列或其互补碱基序列相同或同源的碱基序列2pa中包含的连续的8碱基以上的碱基序列。
(8)根据(6)或(7)所述的探针，其还包含标识部和/或结合部，
所述标识部是能够与标识物质结合的标签或标识物质，所述结合部是能够与固相载体结合的标签。
(9)根据(6)或(7)所述的探针，其还包含连接于所述多核苷酸的5’末端的报告荧光色素、及连接于3’末端的淬灭剂色素。
(10)用于检测堪萨斯分枝杆菌和/或来自堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸的试剂盒，其包含(1)～(5)中任一项所述的引物组。
(11)根据(10)所述的试剂盒，其包含(5)中记载的引物组、且还包含固相载体，所述固相载体至少在一部分包含能够与所述结合部结合的部分。
(12)用于检测堪萨斯分枝杆菌和/或来自堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸的试剂盒，其包含(6)～(9)中任一项所述的探针。
(13)一种检测试样中的堪萨斯分枝杆菌和/或来自堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸的方法，该方法包括：
对试样中的包含第1碱基序列、第2碱基序列、或第3碱基序列的多核苷酸进行检测，所述第1碱基序列是序列号1、9、11、13、15、2、10、12、14或16所示的碱基序列，所述第2碱基序列与第1碱基序列互补，所述第3碱基序列是第1碱基序列或第2碱基序列中的任意T被取代为U的碱基序列。
(14)根据(13)所述的方法，该方法包括：
以试样中的多核苷酸作为模板，使用(1)～(5)中任一项所述的引物组进行核酸扩增反应；以及
对通过核酸扩增反应扩增得到的多核苷酸片段进行检测。
(15)根据(13)所述的方法，该方法包括：
在能够杂交的条件下，将试样中的多核苷酸、或者以试样中的多核苷酸作为模板进行核酸扩增反应而扩增得到的多核苷酸片段、与(6)～(9)中任一项所述的探针进行温育；以及
对所述多核苷酸或所述多核苷酸片段与所述探针的杂交进行检测。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2017-007871号的公开内容。
发明的效果
根据本发明提供的堪萨斯分枝杆菌的检测方法，能够降低因漏检堪萨斯分枝杆菌而导致的假阴性、及因错误鉴定为胃分枝杆菌而导致的假阳性的可能性，可以提高堪萨斯分枝杆菌的鉴定的精度。
附图说明
图1-1是示出堪萨斯分枝杆菌的各类型及其它分枝杆菌的基因组DNA的特异性区域1附近的比较结果。
图1-2是图1-1的继续。
图2-1是示出堪萨斯分枝杆菌的各类型及其它分枝杆菌的基因组DNA的特异性区域2附近的比较结果。
图2-2是图2-1的继续。
图2-3是图2-2的继续。
图3是示出通过琼脂糖电泳法对实施例1中得到的PCR反应液进行分析而得到的结果的照片。
图4是示出横向流动型核酸检测设备10的示意图。1：固相载体；2：结合垫(conjugate pad、标识物质保持部)；3：样品垫(反应体系容纳部)；4：吸收垫；5：基材；6：固相载体1中包含标签捕获手段的部分。
具体实施方式
以下，对本发明详细进行说明。
＜1.堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA＞
2016年公开的非专利文献5中公开了堪萨斯分枝杆菌的类型(或亚型)I、II、III、IV、V的基因组序列草案。
非专利文献5中公开的收录于GenBank的基因组序列草案如下所示。
表1
菌株 类型 GenBank保藏编号(版本)
1010001495 I LWCL00000000(LWCL00000000.1)
1010001469 II LWCM00000000(LWCM00000000.1)
1010001468 III LWCJ00000000(LWCJ00000000.1)
1010001458 IV LWCI00000000(LWCI00000000.1)
1010001454 V LWCH00000000(LWCH00000000.1)
1010001493 V LWCK00000000(LWCK00000000.1)
本发明人等使用该公开信息，对各类型堪萨斯分枝杆菌中保守性高、且与其它分枝杆菌不同的基因组DNA中的区域进行了探索。其结果是，在SigF基因的上游和下游分别发现了堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中的保守性高、且胃分枝杆菌的基因组DNA中不存在同源性高的序列的区域。在以下的说明中，将SigF基因的上游侧的上述区域设为“特异性区域1”，将下游侧的上述区域设为“特异性区域2”。
将I型堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA(GenBank保藏编号LWCL00000000)中的特异性区域1的碱基序列示于序列号1，将特异性区域2的碱基序列示于序列号2。序列号17示出了I型堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中包含特异性区域1及特异性区域2的部分的部分碱基序列。序列号17的第1520位的g至第1852位的g相当于特异性区域1，第3532位的t至4006位的g相当于特异性区域2。
将II型堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA(GenBank保藏编号LWCM00000000)中的特异性区域1的碱基序列示于序列号9，将特异性区域2的碱基序列示于序列号10。序列号18示出了II型堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中包含特异性区域1及特异性区域2的部分的部分碱基序列。序列号18的第1541位的g至第1878位的g相当于特异性区域1，第3565位的t至第4040位的g相当于特异性区域2。
将III型堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA(GenBank保藏编号LWCJ00000000)中的特异性区域1的碱基序列示于序列号11，将特异性区域2的碱基序列示于序列号12。序列号19示出了III型堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中包含特异性区域1及特异性区域2的部分的部分碱基序列。序列号19的第1545位的g至第1882位的g相当于特异性区域1，第3570位的c至第4035位的g相当于特异性区域2。
将IV型堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA(GenBank保藏编号LWCI00000000)中的特异性区域1的碱基序列示于序列号13，将特异性区域2的碱基序列示于序列号14。序列号20示出了IV型堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中包含特异性区域1及特异性区域2的部分的部分碱基序列。序列号20的第1552位的t至第1891位的g相当于特异性区域1，第3571位的t至第4047位的g相当于特异性区域2。
将V型堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA(GenBank保藏编号LWCH00000000)中的特异性区域1的碱基序列示于序列号15，将特异性区域2的碱基序列示于序列号16。序列号21示出了V型堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中包含特异性区域1及特异性区域2的部分的部分碱基序列。序列号21的第1551位的g至第1889位的g相当于特异性区域1，第3578位的t至第4053位的g相当于特异性区域2。
另外，分别将各类型的堪萨斯分枝杆菌与胃分枝杆菌、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)的基因组DNA的特异性区域1附近的比较结果示于图1(包括图1-1及图1-2)，将特异性区域2附近的比较结果示于图2(包括图2-1、图2-2及图2-3)。
本发明人等发现，通过使用来自基因组DNA的多核苷酸中的特异性区域1或特异性区域2作为指标，可以检测各类型的堪萨斯分枝杆菌而不检测胃分枝杆菌等近缘种，从而完成了本发明。
＜2.用语＞
在本发明中，“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。在RNA中，可以将胸腺嘧啶(T)替换为尿嘧啶(U)。作为多核苷酸，也可以使用将任意位置的T取代成U而合成的包含U的DNA、将任意位置的U取代成T而合成的包含T的RNA。多核苷酸可以部分包含肌苷(I)等修饰核苷酸。
多核苷酸可以以单链的形式存在，也可以以双链的形式存在。在多核苷酸以双链的形式存在的情况下，只要至少一条链是具有以下限定的给定特征的多核苷酸即可。
多核苷酸的制造方法没有特别限定，可以利用多核苷酸合成装置来制造，也可以利用委托合成服务来制造。
在本发明中，在所谓的“与碱基序列X同源的碱基序列Y”、或“碱基序列X与碱基序列Y同源”时，只要是为了使由碱基序列X的互补序列组成的多核苷酸、和由碱基序列Y组成的多核苷酸在核酸扩增反应的退火条件下进行杂交形成稳定的双链而能够形成足够的氢键的组合即可，碱基序列X与碱基序列Y可以部分不同。例如，由碱基序列X的互补序列组成的多核苷酸和由碱基序列Y组成的多核苷酸可以在10个核苷酸中存在1个错配、在20个核苷酸中存在1个错配、或者在30个核苷酸中存在1个错配等，可以存在若干错配。代表性地，在所谓的与碱基序列X“同源”的碱基序列Y时，是指碱基序列X和碱基序列Y满足以下的任意关系。
(A)碱基序列Y是碱基序列X中缺失、取代、添加和/或插入了1个或多个碱基的碱基序列。
(B)碱基序列Y是与碱基序列X具有70％以上同一性的碱基序列。
(C)由碱基序列Y组成的多核苷酸可以和由与序列号X互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下进行杂交。
(D)碱基序列X和碱基序列Y中的一者的任意位置的胸腺嘧啶(T)被取代为另一者中的尿嘧啶(T)。
在上述(A)中，“1个或多个”优选为1～5个，更优选为1～4个，更优选为1～3个，特别优选为1个或2个，最优选为1个。
在上述(B)中，同一性的值表示使用运算多个碱基序列间的同一性的软件(例如，FASTA、DNASIS及BLAST)在默认设定下计算出的值。碱基序列的同一性的值通过以下方式计算：在以一致度达到最大的方式对一对碱基序列进行比对时，计算出一致的碱基的数量，并计算出该一致的碱基的数量相对于进行了比较的碱基序列的总碱基数的比例。这里，在存在空位的情况下，上述的总碱基数是将1个空位计数为1个碱基的碱基数。对于同一性的确定方法的详细情况，可以参照例如Altschul et al,Nuc.Acids.Res.25,3389-3402,1977及Altschul et al,J.Mol.Biol.215,403-410,1990。
在上述(B)中，同一性更优选为80％以上、更优选为90％以上、更优选为95％以上、更优选为96％以上、更优选为97％以上、更优选为98％以上、更优选为99％以上的同一性。
在上述(C)中，“严格条件”是指形成所谓的特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件，可以参照例如Green and Sambrook,Molecular Cloning,4th Ed(2012),ColdSpring Harbor Laboratory Press而适当确定。具体而言，可以通过Southern杂交(Southern hybridization)时的温度、溶液中含有的盐浓度、以及Southern杂交的清洗工序时的温度、溶液中含有的盐浓度来设定严格条件。更具体而言，作为严格条件，例如，在杂交工序中，钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，温度为40～68℃、优选为40～65℃。更具体而言，杂交可以在1～7×SSC、0.02～3％SDS、温度40℃～60℃下进行。另外，可以在杂交之后进行清洗工序，清洗工序可以在例如0.1～2×SSC、0.1～0.3％SDS、温度50～65℃下进行。
＜3.引物组＞
本发明涉及一种引物组，其包含第1引物和第2引物，
所述第1引物包含多核苷酸，所述多核苷酸在3’末端包含与碱基序列A相同或同源的碱基序列A’，所述碱基序列A是堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中的靶点区域的5’末端的部分碱基序列，所述靶点区域包含序列号1、9、11、13、15、2、10、12、14或16所示的第1碱基序列或与第1碱基序列互补的第2碱基序列的全部或一部分，
所述第2引物包含多核苷酸，所述多核苷酸在3’末端包含与碱基序列B的互补碱基序列相同或同源的碱基序列B’，所述碱基序列B是所述靶点区域的3’末端的部分碱基序列。
堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA如上所述。
“第1碱基序列”相当于基因组DNA上的特异性区域1或特异性区域2的碱基序列。“第2碱基序列”相当于特异性区域1或特异性区域2的碱基序列的互补碱基序列。
本发明的引物组设计为能够在核酸扩增反应中对堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中包含第1碱基序列或第2碱基序列的全部或一部分的区域(称为“靶点区域”)进行扩增。
靶点区域可以是基因组DNA中的仅由第1碱基序列或第2碱基序列的全部或其一部分组成的区域，也可以是基因组DNA中的由第1碱基序列或第2碱基序列的全部或其一部分和与其邻接的其它部分组成的连续区域。上述其它部分可以位于基因组DNA中的第1碱基序列或第2碱基序列的上游(5’末端)侧，也可以位于下游(3’末端)侧，还可以包含位于上游的部分和位于下游的部分这两者。例如，当靶点区域的上游侧端位于与第1碱基序列或第2碱基序列的上游侧邻接的部分、且靶点区域的下游侧端位于与第1碱基序列或第2碱基序列的下游侧邻接的部分时，靶点区域是基因组DNA的包含第1碱基序列或第2碱基序列的全部、与其上游侧邻接的部分、以及与其下游侧邻接的部分的连续区域。
例如，利用后述的引物组1扩增的靶点区域为仅由基因组DNA中的特异性区域2的一部分组成的连续区域，在I型堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中是序列号17的第3719位至第3885位的176碱基的区域(及该区域的互补链)。利用后述的引物组2扩增的靶点区域为仅由基因组DNA中的特异性区域2的一部分组成的连续区域，在I型堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中是序列号17的第3596位至第3690位的95碱基的区域(及该区域的互补链)。利用后述的引物组3扩增的靶点区域为由基因组DNA中的特异性区域2的一部分和与该部分的下游侧邻接的其它部分组成的连续区域，在I型堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中是序列号17的第3900位至第4016位的117碱基的区域(及该区域的互补链)。
靶点区域可以是包含特异性区域1的全部或一部分和特异性区域2的全部或一部分这两者的基因组DNA上的区域。
靶点区域的长度没有特别限定。为了提高检测精度，优选靶点区域包含第1碱基序列或第2碱基序列的优选20碱基以上、更优选30碱基以上、更优选40碱基以上、更优选50碱基以上、更优选60碱基以上的连续的部分。作为靶点区域的全部长度，例如可以为40碱基以上、优选为50碱基以上、更优选为60碱基以上、更优选为70碱基以上，长度的上限没有特别限定，通常为1000碱基以下或500碱基以下。
本发明的引物组具备的第1引物包含多核苷酸，所述多核苷酸在3’末端包含与碱基序列A相同或同源的碱基序列A’，所述碱基序列A为堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中的靶点区域的5’末端的部分碱基序列。
碱基序列A是靶点序列的“5’末端的部分碱基序列”，具体而言，是在从靶点序列的5’末端的碱基连续至下游侧的部分的部分碱基序列。碱基序列A的长度例如可以为8碱基以上、优选为10碱基以上、更优选为12碱基以上、更优选为15碱基以上，代表性地可以为40碱基以下、30碱基以下或25碱基以下。
对于碱基序列A而言，在堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中，特别是优选为特异性区域1和2、以及与它们邻接的区域的部分碱基序列，特别优选为序列号17、18、19、20或21所示的第4碱基序列或与第4碱基序列互补的第5碱基序列中包含的连续8碱基以上的部分碱基序列。上述部分碱基序列更优选为以下序列：由序列号17、18、19、20或21中的特异性区域1、和与特异性区域1的上游邻接的100碱基以下、优选为50碱基以下、更优选为10碱基以下的区域、和与特异性区域1的下游邻接的100碱基以下、优选为50碱基以下、更优选为10碱基以下的区域组成的碱基序列或其互补的碱基序列中包含的连续8碱基以上的部分碱基序列；或者，由序列号17、18、19、20或21中的特异性区域2、和与特异性区域2的上游邻接的100碱基以下、优选为50碱基以下、更优选为10碱基以下的区域、和与特异性区域2的下游邻接的100碱基以下、优选为50碱基以下、更优选为10碱基以下的区域组成的碱基序列或其互补的碱基序列中包含的连续8碱基以上的部分碱基序列，特别优选为由序列号17、18、19、20或21中的特异性区域1组成的碱基序列或其互补的碱基序列中包含的连续8碱基以上的部分碱基序列、或者由序列号17、18、19、20或21中的特异性区域2组成的碱基序列或其互补的碱基序列中包含的连续8碱基以上的部分碱基序列。
第1引物中的多核苷酸可以设计为在3’末端包含与碱基序列A相同或同源的碱基序列A’。对于“同源”，如上所述。第1引物中的多核苷酸可以在3’末端包含碱基序列A’，碱基序列A’的5’末端侧可以进一步添加有其它碱基序列。第1引物中的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为8碱基以上、优选为10碱基以上、更优选为12碱基以上、更优选为15碱基以上，代表性地可以为40碱基以下、30碱基以下或25碱基以下。
本发明的引物组具备的第2引物包含多核苷酸，所述多核苷酸在3’末端包含与碱基序列B的互补碱基序列相同或同源的碱基序列B’，所述碱基序列B是堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中的靶点区域的3’末端的部分碱基序列。
碱基序列B是靶点序列的“3’末端的部分碱基序列”，具体而言，是在从靶点序列的3’末端的碱基连续至上游侧的部分的部分碱基序列。碱基序列B的长度例如可以为8碱基以上、优选为10碱基以上、更优选为12碱基以上、更优选为15碱基以上，代表性地可以为40碱基以下、30碱基以下或25碱基以下。
对于碱基序列B而言，在堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中，特别是优选为特异性区域1和2、以及与它们邻接的区域的部分碱基序列，特别优选为序列号17、18、19、20或21所示的第4碱基序列或与第4碱基序列互补的第5碱基序列中包含的连续8碱基以上的部分碱基序列。上述部分碱基序列的优选范围如上述关于碱基序列A的说明所述。
需要说明的是，碱基序列B可以设定为其5’末端碱基位于靶点区域中比碱基序列A的5’末端碱基更靠下游侧，优选碱基序列B设定为其5’末端碱基位于靶点区域中比碱基序列A的3’末端碱基更靠下游侧。
第2引物中的多核苷酸可以设计为在3’末端包含与碱基序列B的互补碱基序列相同或同源的碱基序列B’。对于“同源”，如上所述。第2引物中的多核苷酸可以在3’末端包含碱基序列B’，也可以在碱基序列B’的5’末端侧进一步添加有其它碱基序列。第2引物中的多核苷酸的全长没有特别限定，例如可以为8碱基以上、优选为10碱基以上、更优选为12碱基以上、更优选为15碱基以上，代表性地可以为40碱基以下、30碱基以下或25碱基以下。
第1引物和第2引物的组合没有特别限定，可以进行组合以便能够将基因组DNA的靶点区域作为多核苷酸片段进行扩增。
在本发明中，作为用于将堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中的靶点区域作为多核苷酸片段进行扩增的引物组的优选具体例子，所述靶点区域包含特异性区域2、即序列号2、10、12、14或16所示的第1碱基序列或与第1碱基序列互补的第2碱基序列的一部分，可以示例出如下引物组，其中，
第1引物是包含(2f)在3’末端包含碱基序列2fb的40碱基以下的多核苷酸的引物，所述碱基序列2fb是与序列号3、5或7所示的碱基序列相同或同源的碱基序列2fa中包含的连续的8碱基以上的碱基序列，
第2引物是包含(2r)在3’末端包含碱基序列2rb的40碱基以下的多核苷酸的引物，所述碱基序列2rb是与序列号4、6或8所示的碱基序列相同或同源的碱基序列2ra中包含的连续的8碱基以上的碱基序列。
序列号3相当于序列号17的第3710位～第3729位(图2-1中以KAN-1f表示)。
序列号5相当于序列号17的第3596位～第3615位(图2-1中以KAN-2f表示)。
序列号7相当于序列号17的第3900位～第3919位(图2-2中以KAN-3f表示)。
序列号4相当于序列号17的第3866位～第3885位的互补碱基序列(图2-2中以KAN-1r表示)。
序列号6相当于序列号17的第3671位～第3690位的互补碱基序列(图2-1中以KAN-2r表示)。
序列号8相当于序列号17的第3997位～第4016位的互补碱基序列(图2-3中以KAN-3r表示)。
在上述(2f)中，碱基序列2fa与序列号3、5或7的碱基序列相同或同源，即，满足上述(A)、(B)、(C)或(D)的关系(序列号3、5或7的碱基序列相当于碱基序列X，碱基序列2fa相当于碱基序列Y)。
在碱基序列2fa和序列号3、5或7的碱基序列满足上述(A)的关系的情况下，更优选碱基序列2fa为序列号3、5或7的碱基序列中从5’末端及3’末端的一者或两者总计缺失了1个或多个碱基的序列，特别优选为序列号3、5或7的碱基序列中仅从5’末端缺失了1个或多个碱基的序列。另外，在碱基序列2fa和序列号3、5或7的碱基序列满足上述(A)的关系的情况下，更优选碱基序列2fa为序列号3、5或7的碱基序列中在5’末端及3’末端的一者或两者总计添加了1个或多个碱基的序列，特别优选为序列号17的碱基序列的部分碱基序列，其是由序列号3、5或7的碱基序列、和在序列号3、5或7的碱基序列的5’末端及3’末端的一者或两者添加的总计1个或多个碱基组成的上述部分碱基序列。
碱基序列2fa和序列号3、5或7的碱基序列满足上述(A)的关系时的其它优选方式例如为以下的方式。如上所述，序列号3、5及7的碱基序列分别为I型堪萨斯分枝杆菌的DNA中序列号17的碱基序列中的部分碱基序列。另一方面，堪萨斯分枝杆菌的其它类型的DNA包含与序列号17对应的、序列号18、19、20或21所示的碱基序列，且在其中存在与序列号3、5或7的碱基序列对应的部分碱基序列。因此，在以使特异性区域2的碱基序列的一致度达到最大的方式将序列号18、19、20或21所示的碱基序列与序列号17所示的碱基序列进行比对时，将序列号18、19、20或21所示的碱基序列中与序列号3、5及7的碱基序列分别对应的部分碱基序列设为部分碱基序列3’、5’及7’。在部分碱基序列3’、5’或7’分别是序列号3、5或7所示的碱基序列中缺失、取代、添加和/或插入了1个或多个碱基的包含突变的碱基序列的情况下，可以将序列号3、5或7所示的碱基序列中导入了上述突变(缺失、取代、添加和/或插入)中的至少1个的碱基序列设为碱基序列2fa，更优选将部分碱基序列3’、5’或7’设为碱基序列2fa。
在上述(2f)中，碱基序列2fa特别优选为与序列号3、5或7的碱基序列相同。
在上述(2f)中，碱基序列2fb是碱基序列2fa中含有的连续的8碱基以上、优选为10碱基以上、更优选为12碱基以上、更优选为15碱基以上的碱基序列，可以与碱基序列2fa相同，也可以为碱基序列2fa的部分碱基序列。碱基序列2fb优选为包含碱基序列2fa中的3’末端的碱基的连续碱基序列。
在上述(2f)中，碱基序列2fb特别优选为与碱基序列2fa相同。
上述(2f)的多核苷酸可以在3’末端包含碱基序列2fb，也可以在碱基序列2fb的5’末端侧进一步添加有其它碱基序列。上述(2f)的多核苷酸为40碱基以下、优选为35碱基以下、更优选为30碱基以下、更优选为25碱基以下、特别优选为22碱基以下的多核苷酸。
上述(2f)的多核苷酸特别优选由碱基序列2fb组成。
在上述(2r)中，碱基序列2ra为与序列号4、6或8的碱基序列相同或同源，即，满足上述(A)、(B)、(C)或(D)的关系(序列号4、6或8的碱基序列相当于碱基序列X，碱基序列2ra相当于碱基序列Y)。
在碱基序列2ra和序列号4、6或8的碱基序列满足上述(A)的关系的情况下，更优选碱基序列2ra为序列号4、6或8的碱基序列中从5’末端及3’末端中的一者或两者总计缺失了1个或多个碱基的序列，特别优选为序列号4、6或8的碱基序列中仅从5’末端缺失了1个或多个碱基的序列。另外，在碱基序列2ra和序列号4、6或8的碱基序列满足上述(A)的关系的情况下，更优选碱基序列2ra为序列号4、6或8的碱基序列中在5’末端及3’末端的一者或两者总计添加了1个或多个碱基的序列，特别优选为序列号17的碱基序列的互补碱基序列的部分碱基序列，其是由序列号4、6或8的碱基序列、和在序列号4、6或8的碱基序列的5’末端及3’末端一者或两者添加的总计1个或多个碱基组成的上述部分碱基序列。
碱基序列2ra和序列号4、6或8的碱基序列满足上述(A)的关系时的其它优选方式例如为以下的方式。在以特异性区域2的互补碱基序列的一致度达到最大的方式将序列号18、19、20或21所示的碱基序列的互补碱基序列与序列号17所示的碱基序列的互补碱基序列进行比对时，将序列号18、19、20或21所示的碱基序列的互补碱基序列中与序列号4、6及8的碱基序列分别对应的部分碱基序列设为部分碱基序列4’、6’及8’。在部分碱基序列4’、6’或8’分别是序列号4、6或8所示的碱基序列中缺失、取代、添加和/或插入了1个或多个碱基的包含突变的碱基序列的情况下，可以将序列号4、6或8所示的碱基序列中导入了上述突变(缺失、取代、添加和/或插入)中的至少1个的碱基序列设为碱基序列2ra，更优选将部分碱基序列4’、6’或8’设为碱基序列2ra。
在上述(2r)中，碱基序列2ra特别优选为与序列号4、6或8的碱基序列相同。
在上述(2r)中，碱基序列2rb是碱基序列2ra中含有的连续的8碱基以上、优选为10碱基以上、更优选为12碱基以上、更优选为15碱基以上的碱基序列，可以与碱基序列2ra相同，也可以为碱基序列2ra的部分碱基序列。碱基序列2rb优选为包含碱基序列2ra中的3’末端的碱基的连续碱基序列。
在上述(2r)中，碱基序列2rb特别优选为与碱基序列2ra相同。
上述(2r)的多核苷酸可以在3’末端包含碱基序列2rb，也可以在碱基序列2rb的5’末端侧进一步添加有其它碱基序列。上述(2r)的多核苷酸为40碱基以下、优选为35碱基以下、更优选为30碱基以下、更优选为25碱基以下、特别优选为22碱基以下的多核苷酸。
上述(2r)的多核苷酸特别优选由碱基序列2rb组成。
包含上述(2f)的多核苷酸的第1引物和包含上述(2r)的多核苷酸的第2引物的组合没有特别限定，可以进行组合以便能够将基因组DNA的靶点区域作为多核苷酸片段进行扩增，作为具体例子，可以列举以下的组合。
在上述(2f)中的“序列号3、5或7所示的碱基序列”为“序列号3所示的碱基序列”的情况下，上述(2r)中的“序列号4、6或8所示的碱基序列”为“序列号4或8所示的碱基序列”，优选为“序列号4所示的碱基序列”。特别优选为引物组1，所述引物组1是上述(2f)的多核苷酸为由序列号3所示的碱基序列组成的多核苷酸(KAN-1f)、且上述(2r)的多核苷酸为由序列号4所示的碱基序列组成的多核苷酸(KAN-1r)的组合。
在上述(2f)中的“序列号3、5或7所示的碱基序列”为“序列号5所示的碱基序列”的情况下，上述(2r)中的“序列号4、6或8所示的碱基序列”可以是任一个，优选为“序列号6所示的碱基序列”。特别优选为引物组2，所述引物组2是上述(2f)的多核苷酸为由序列号5所示的碱基序列组成的多核苷酸(KAN-2f)、且上述(2r)的多核苷酸为由序列号6所示的碱基序列组成的多核苷酸(KAN-2r)的组合。
在上述(2f)中的“序列号3、5或7所示的碱基序列”为“序列号7所示的碱基序列”的情况下，上述(2r)中的“序列号4、6或8所示的碱基序列”为“序列号8所示的碱基序列”。特别优选为引物组3，所述引物组3是上述(2f)的多核苷酸为由序列号7所示的碱基序列组成的多核苷酸(KAN-3f)、且上述(2r)的多核苷酸为由序列号8所示的碱基序列组成的多核苷酸(KAN-3r)的组合。
在本发明中，作为用于将堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中的靶点区域作为多核苷酸片段进行扩增的引物组的优选具体例子，所述靶点区域包含特异性区域1、即序列号1、9、11、13或15所示的第1碱基序列或与第1碱基序列互补的第2碱基序列的一部分，可以示例出如下引物组，其中，
第1引物包含(1f)在3’末端包含碱基序列1fb的40碱基以下的多核苷酸，所述碱基序列1fb是与序列号22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列相同或同源的碱基序列1fa中包含的连续的8碱基以上的碱基序列，
第2引物包含(1r)在3’末端包含碱基序列1rb的40碱基以下的多核苷酸，所述碱基序列1rb是与序列号23、25、27、29、31、33、35或37所示的碱基序列相同或同源的碱基序列1ra中包含的连续的8碱基以上的碱基序列。
序列号22相当于序列号17的第1544位～第1563位。
序列号24相当于序列号17的第1549位～第1568位。
序列号26相当于序列号17的第1541位～第1561位。
序列号28相当于序列号17的第1682位～第1701位。
序列号30相当于序列号17的第1538位～第1556位。
序列号32相当于序列号17的第1538位～第1557位。
序列号34相当于序列号17的第1683位～第1702位。
序列号36相当于序列号17的第1724位～第1742位。
序列号23相当于序列号17的第1826位～第1845位的互补碱基序列。
序列号25相当于序列号17的第1825位～第1844位的互补碱基序列。
序列号27相当于序列号17的第1682位～第1700位的互补碱基序列。
序列号29相当于序列号17的第1824位～第1842位的互补碱基序列。
序列号31相当于序列号17的第1682位～第1701位的互补碱基序列。
序列号33相当于序列号17的第1589位～第1607位的互补碱基序列。
序列号35相当于序列号17的第1823位～第1842位的互补碱基序列。
序列号37相当于序列号17的第1824位～第1844位的互补碱基序列。
在上述(1f)中，碱基序列1fa与序列号22、24、26、28、30、32、34或36的碱基序列相同或同源，即，满足上述(A)、(B)、(C)或(D)的关系(序列号22、24、26、28、30、32、34或36的碱基序列相当于碱基序列X，碱基序列1fa相当于碱基序列Y)。
在碱基序列1fa和序列号22、24、26、28、30、32、34或36的碱基序列满足上述(A)的关系的情况下，更优选碱基序列1fa为序列号22、24、26、28、30、32、34或36的碱基序列中从5’末端及3’末端中的一者或两者总计缺失了1个或多个碱基的序列，特别优选为序列号22、24、26、28、30、32、34或36的碱基序列中仅从5’末端缺失了1个或多个碱基的序列。另外，在碱基序列1fa和序列号22、24、26、28、30、32、34或36的碱基序列满足上述(A)的关系的情况下，更优选碱基序列1fa为序列号22、24、26、28、30、32、34或36的碱基序列中在5’末端及3’末端的一者或两者总计添加了1个或多个碱基的序列，特别优选为序列号17的碱基序列的部分碱基序列，其是由序列号22、24、26、28、30、32、34或36的碱基序列、和在序列号22、24、26、28、30、32、34或36的碱基序列的5’末端及3’末端一者或两者添加的总计1个或多个碱基组成的上述部分碱基序列。
在碱基序列1fa和序列号22、24、26、28、30、32、34或36的碱基序列满足上述(A)的关系时的其它优选方式例如为以下的方式。在以特异性区域1的碱基序列的一致度达到最大的方式将序列号18、19、20或21所示的碱基序列与序列号17所示的碱基序列进行比对时，将序列号18、19、20或21所示的碱基序列中与序列号22、24、26、28、30、32、34及36的碱基序列分别对应的部分碱基序列设为部分碱基序列22’、24’、26’、28’、30’、32’、34’及36’。在部分碱基序列22’、24’、26’、28’、30’、32’、34’或36’分别是序列号22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列中缺失、取代、添加和/或插入了1个或多个碱基的包含突变的碱基序列的情况下，可以将序列号22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列中导入了上述突变(缺失、取代、添加和/或插入)中的至少1个的碱基序列设为碱基序列1fa，更优选将部分碱基序列22’、24’、26’、28’、30’、32’、34’或36’设为碱基序列1fa。
在上述(1f)中，碱基序列1fa特别优选为与序列号22、24、26、28、30、32、34或36的碱基序列相同。
在上述(1f)中，碱基序列1fb是碱基序列1fa中含有的连续的8碱基以上、优选为10碱基以上、更优选为12碱基以上、更优选为15碱基以上的碱基序列，可以与碱基序列1fa相同，也可以为碱基序列1fa的部分碱基序列。碱基序列1fb优选为包含碱基序列1fa中的3’末端的碱基的连续的碱基序列。
在上述(1f)中，碱基序列1fb特别优选为与碱基序列1fa相同。
上述(1f)的多核苷酸可以在3’末端包含碱基序列1fb，也可以在碱基序列1fb的5’末端侧进一步添加有其它碱基序列。上述(1f)的多核苷酸为40碱基以下、优选为35碱基以下、更优选为30碱基以下、更优选为25碱基以下、特别优选为22碱基以下的多核苷酸。
上述(1f)的多核苷酸特别优选由碱基序列1fb组成。
在上述(1r)中，碱基序列1ra为与序列号23、25、27、29、31、33、35或37的碱基序列相同或同源，即，满足上述(A)、(B)、(C)或(D)的关系(序列号23、25、27、29、31、33、35或37的碱基序列相当于碱基序列X，碱基序列1ra相当于碱基序列Y)。
在碱基序列1ra和序列号23、25、27、29、31、33、35或37的碱基序列满足上述(A)的关系的情况下，更优选碱基序列1ra为序列号23、25、27、29、31、33、35或37的碱基序列中从5’末端及3’末端中的一者或两者总计缺失了1个或多个碱基的序列，特别优选为序列号23、25、27、29、31、33、35或37的碱基序列中仅从5’末端缺失了1个或多个碱基的序列。另外，在碱基序列1ra和序列号23、25、27、29、31、33、35或37的碱基序列满足上述(A)的关系的情况下，更优选碱基序列1ra为序列号23、25、27、29、31、33、35或37的碱基序列中在5’末端及3’末端的一者或两者总计添加了1个或多个碱基的序列，特别优选为序列号17的碱基序列的互补碱基序列的部分碱基序列，其是由序列号23、25、27、29、31、33、35或37的碱基序列、和在序列号23、25、27、29、31、33、35或37的碱基序列的5’末端及3’末端一者或两者添加的总计1个或多个碱基组成的上述部分碱基序列。
碱基序列1ra和序列号23、25、27、29、31、33、35或37的碱基序列满足上述(A)的关系时的其它优选方式例如为以下的方式。在以特异性区域1的互补碱基序列的一致度达到最大的方式将序列号18、19、20或21所示的碱基序列的互补碱基序列与序列号17所示的碱基序列的互补碱基序列进行比对时，将序列号18、19、20或21所示的碱基序列的互补碱基序列中与序列号23、25、27、29、31、33、35及37的碱基序列分别对应的部分碱基序列设为部分碱基序列23’、25’、27’、29’、31’、33’、35’及37’。在部分碱基序列23’、25’、27’、29’、31’、33’、35’或37’分别是序列号23、25、27、29、31、33、35或37所示的碱基序列中缺失、取代、添加和/或插入了1个或多个碱基的包含突变的碱基序列的情况下，可以将序列号23、25、27、29、31、33、35或37所示的碱基序列中导入了上述突变(缺失、取代、添加和/或插入)中的至少1个的碱基序列设为碱基序列1ra，更优选将部分碱基序列23’、25’、27’、29’、31’、33’、35’或37’设为碱基序列1ra。
在上述(1r)中，碱基序列1ra特别优选为与序列号23、25、27、29、31、33、35或37的碱基序列相同。
在上述(1r)中，碱基序列1rb是碱基序列1ra中含有的连续的8碱基以上、优选为10碱基以上、更优选为12碱基以上、更优选为15碱基以上的碱基序列，可以与碱基序列1ra相同，也可以为碱基序列1ra的部分碱基序列。碱基序列1rb优选为包含碱基序列1ra中的3’末端的碱基的连续碱基序列。
在上述(1r)中，碱基序列1rb特别优选为与碱基序列1ra相同。
上述(1r)的多核苷酸可以在3’末端包含碱基序列1rb，也可以在碱基序列1rb的5’末端侧进一步添加有其它碱基序列。上述(1r)的多核苷酸为40碱基以下、优选为35碱基以下、更优选为30碱基以下、更优选为25碱基以下、特别优选为22碱基以下的多核苷酸。
上述(1r)的多核苷酸特别优选由碱基序列1rb组成。
包含上述(1f)的多核苷酸的第1引物和包含上述(1r)的多核苷酸的第2引物的组合没有特别限定，可以进行组合以便能够将基因组DNA的靶点区域作为多核苷酸片段进行扩增，作为具体例子，可以列举以下的组合。
在上述(1f)中的“序列号22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列”为“序列号22所示的碱基序列”的情况下，上述(1r)中的“序列号23、25、27、29、31、33、35或37所示的碱基序列”可以是任一个，优选为“序列号23所示的碱基序列”。特别优选为引物组4，所述引物组4是上述(1f)的多核苷酸为由序列号22所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-40f)、且上述(1r)的多核苷酸为由序列号23所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-40r)的组合。
在上述(1f)中的“序列号22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列”为“序列号24所示的碱基序列”的情况下，上述(1r)中的“序列号23、25、27、29、31、33、35或37所示的碱基序列”可以是任一个，优选为“序列号25所示的碱基序列”。特别优选为引物组5，所述引物组5是上述(1f)的多核苷酸为由序列号24所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-41f)、且上述(1r)的多核苷酸为由序列号25所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-41r)的组合。
在上述(1f)中的“序列号22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列”为“序列号26所示的碱基序列”的情况下，上述(1r)中的“序列号23、25、27、29、31、33、35或37所示的碱基序列”可以是任一个，优选为“序列号27所示的碱基序列”。特别优选为引物组6，所述引物组6是上述(1f)的多核苷酸为由序列号26所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-42f)、且上述(1r)的多核苷酸为由序列号27所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-42r)的组合。
在上述(1f)中的“序列号22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列”为“序列号28所示的碱基序列”的情况下，上述(1r)中的“序列号23、25、27、29、31、33、35或37所示的碱基序列”为“序列号23、25、29、35或37所示的碱基序列”，优选为“序列号29所示的碱基序列”。特别优选为引物组7，所述引物组7是上述(1f)的多核苷酸为由序列号28所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-43f)、且上述(1r)的多核苷酸为由序列号29所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-43r)的组合。
在上述(1f)中的“序列号22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列”为“序列号30所示的碱基序列”的情况下，上述(1r)中的“序列号23、25、27、29、31、33、35或37所示的碱基序列”可以是任一个，优选为“序列号31所示的碱基序列”。特别优选为引物组8，所述引物组8是上述(1f)的多核苷酸为由序列号30所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-44f)、且上述(1r)的多核苷酸为由序列号31所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-44r)的组合。
在上述(1f)中的“序列号22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列”为“序列号32所示的碱基序列”的情况下，上述(1r)中的“序列号23、25、27、29、31、33、35或37所示的碱基序列”可以是任一个，优选为“序列号33所示的碱基序列”。特别优选为引物组9，所述引物组9是上述(1f)的多核苷酸为由序列号32所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-45f)、且上述(1r)的多核苷酸为由序列号33所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-45r)的组合。
在上述(1f)中的“序列号22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列”为“序列号34所示的碱基序列”的情况下，上述(1r)中的“序列号23、25、27、29、31、33、35或37所示的碱基序列”为“序列号23、25、29、35或37所示的碱基序列”，优选为“序列号35所示的碱基序列”。特别优选为引物组10，所述引物组10是上述(1f)的多核苷酸为由序列号34所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-46f)、且上述(1r)的多核苷酸为由序列号35所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-46r)的组合。
在上述(1f)中的“序列号22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列”为“序列号36所示的碱基序列”的情况下，上述(1r)中的“序列号23、25、27、29、31、33、35或37所示的碱基序列”为“序列号23、25、29、35或37所示的碱基序列”，优选为“序列号37所示的碱基序列”。特别优选为引物组11，所述引物组11是上述(1f)的多核苷酸为由序列号36所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-47f)、且上述(1r)的多核苷酸为由序列号37所示的碱基序列组成的多核苷酸(MKS-47r)的组合。
表2
第1引物可以仅由上述多核苷酸组成，也可以进一步包含后述的标识部或结合部。上述多核苷酸和标识部或结合部可以通过后述的适当的间隔物(spacer)而化学连接。在第1引物中，标识部及结合部中的一者与上述多核苷酸连接的位置只要是不妨害上述多核苷酸与包含靶点区域的多核苷酸或其互补链的退火及核酸扩增反应中的延伸的位置即可，没有特别限定，优选为上述多核苷酸的5’末端。
第2引物可以仅由上述多核苷酸组成，也可以进一步包含后述的标识部或结合部。上述多核苷酸和标识部或结合部可以通过后述的适当的间隔物而化学连接。在第2引物中，标识部及结合部中的一者与上述多核苷酸连接的位置只要是不妨害上述多核苷酸与包含靶点区域的多核苷酸或其互补链的退火及核酸扩增反应中的延伸的位置即可，没有特别限定，优选为上述多核苷酸的5’末端。
在第1引物及第2引物中的至少一者包含标识部的情况下，由于可以在使用其的核酸扩增反应中得到包含标识部的扩增产物，因此易于检测扩增产物。
在第1引物及第2引物中的至少一者包含结合部的情况下，由于可以在使用其的核酸扩增反应中得到包含结合部的扩增产物，因此能够将扩增产物固定于固相载体，易于检测扩增产物。
更优选第1引物及第2引物中的一者进一步包含标识部，另一者进一步包含结合部。由于可以在使用了该方式的引物对的核酸扩增反应中得到包含标识部和结合部的双链的扩增产物，因此易于进行基于核酸色谱(nucleic acid chromatography)的检测。以下，对该方式进行说明。
(本发明的引物组的优选方式)
(标识部)
标识部是能够与标识物质结合的标签或标识物质中的任一种，优选为能够与标识物质结合可能的标签。在本说明书中，有时将能够与标识物质结合的标签称为标识用标签。在标识部为标识用标签的情况下，可以通过使核酸扩增反应的扩增产物与标识物质接触来标记在扩增产物的一端包含的标签。在标识部为标识物质的情况下，可以得到一端包含标识物质的扩增产物作为核酸扩增反应的扩增产物。
标识物质只要是能够检测出扩增产物的物质即可，没有特别限定，优选为能够肉眼检测出扩增产物的物质。作为这样的标识物质，可以列举：着色粒子、色素、酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶等)等，优选为着色粒子。“着色粒子”可以列举：金属(例如，金、银、铜、铂等)粒子、金属棒、着色的胶乳粒子、包含色素的二氧化硅纳米粒子等，但并不限定于此。标识物质的大小只要不妨害将扩增产物捕获至后述的固相载体即可。标识物质优选为检测时显色良好的物质，可以适当选择比后述的固相载体、具备固相载体的核酸检测设备的各种多孔构件的孔径更小的尺寸。例如，标识物质的大小可以设为约500nm以下、优选为约0.1nm～250nm、更优选为约1nm～100nm的粒径。作为色素，也可以使用荧光色素(荧光素、花青苷等)等，在该情况下，优选照射各荧光色素的激发波长光进行检测。
可以用作标识部的标识用标签只要能够与标识物质结合即可，可以根据标识物质的结构适当选择，没有特别限定，例如，可以利用核酸(DNA、RNA等)、蛋白质、肽、或其它化合物(例如，生物素、异硫氰酸荧光素(FITC)、异羟洋地黄毒苷配基(DIG)等低分子化合物)、或者包含它们的组合的物质。作为标识用标签的一个优选方式，包含多核苷酸、或由多核苷酸组成。可以包含于标识用标签的该多核苷酸只要不对利用本发明的引物组进行的核酸扩增反应造成实质性妨害即可，没有特别限定，可以使用碱基数例如为5～50、优选为10～35的多核苷酸，更优选可以使用包含(或者由)序列号41或42所示的碱基序列或其部分碱基序列或它们的互补碱基序列(组成)的多核苷酸。作为标识用标签的另一个优选方式，由生物素、FITC、DIG等低分子化合物组成。
在标识部为上述的标识用标签的情况下，标识物质与标识用标签的结合可以是直接结合，也可以是间接结合，结合方式可以根据待利用的标识物质与标识用标签的组合而适当选择合适的方式。例如，在标识用标签包含多核苷酸的情况下，可以通过将标识物质结合于能够与该多核苷酸杂交的多核苷酸(例如，包含与该多核苷酸的碱基序列互补的序列的多核苷酸)、并使两者多核苷酸杂交，从而将标识物质与标识用标签间接结合。标识物质与多核苷酸的结合可以通过肽、蛋白质、核酸等进行，也可以通过适当的官能团进行。杂交的条件只要是能够发生杂交的条件即可，没有特别限定，例如，可以通过在20℃～40℃下、含有10mM～50mM的磷酸的缓冲液(pH6～7)中发生反应而进行。为了提高杂交效率，可以在缓冲液中进一步含有氯化钠等盐。
另外，在标识用标签为低分子化合物的情况下，可以通过连接于与其特异性结合的蛋白质(例如，与生物素结合的亲和素、与FITC结合的蛋白质)、抗体(例如，抗DIG抗体)、适体(aptamer)等结合性物质的标识物质进行标记。在该情况下，标识用标签与结合性物质可以使用各种中性附近的缓冲液进行结合。
可以通过任意方式将标识部(标识用标签或标识物质)与第1引物中包含的多核苷酸或第2引物中包含的多核苷酸结合，可以直接或间接地结合。其中，在标识部中至少与上述多核苷酸连接的部分由多核苷酸组成的情况下，上述多核苷酸和标识部通过能够抑制或停止DNA聚合酶反应进行的间隔物而结合，以便不会因核酸扩增反应而使该部分和上述多核苷酸一起形成双链。作为这样的“间隔物”，只要是能够抑制或停止DNA聚合酶反应进行、防止标识部的双链化的间隔物即可，可以列举例如：具有牢固的发夹结构、假结结构的核酸序列、L型核酸、肽核酸(PNA)、交联化核酸(Bridged Nucleic Acid(BNA)或Locked NucleicAcid(LNA))、荧光素、Cy3、Cy5、包含下述式I所示的偶氮苯结构的二价基团、脂肪链(亚烷基链或聚氧化烯链)、包含5’-5’键、3’-3’键这样的倒位序列(inverted array)结构的二价基团等，但并不限定于此。
化学式1
在通过式I所示的二价基团将2个多核苷酸分子连接的情况下，该二价基团的一端的磷酸基团是指一个多核苷酸分子的3’末端或5’末端的核苷酸的磷酸基团，另一端的氧原子与其它的多核苷酸分子的3’末端或5’末端的核苷酸的磷酸基团形成磷酸酯键。
作为脂肪链的间隔物，可以举出例如以下的式(II)所示的间隔物。
－O－CmH2m－O－ 式(II)
(式中，一端的氧原子表示一个多核苷酸分子的3’末端或5’末端的磷酸二酯键的氧原子，另一端的氧原子表示另一多核苷酸分子的3’末端或5’末端的磷酸二酯键的氧原子，m表示1以上且40以下的整数。H任选被取代基取代。)
在式(II)中，m优选为2以上且36以下，更优选为3以上且16以下。式(II)中的H任选被取代基取代，作为取代基，代表性地可以列举：烷基、烷氧基、羟基等。作为取代基的烷基及烷氧基的碳原子数优选为1～8，更优选为1～4。另外，在具有2个以上取代基的情况下，取代基可以相同，也可以不同。另外，优选不具有取代基。
另外，作为其它间隔物，可以举出以下的式(III)所示的间隔物。
－(OCnH2n)L－O－ 式(III)
(式中，一端的氧原子表示一个多核苷酸分子的3’末端或5’末端的磷酸二酯键的氧原子，另一端的氧原子表示另一多核苷酸分子的3’末端或5’末端的磷酸二酯键的氧原子，n表示2以上且4以下的整数，L表示1以上的整数，且(n+1)×L为40以下的整数。H任选被取代基取代。)
在式(III)中，(n+1)×L优选为2以上且36以下，更优选为3以上且16以下。式(III)中的H的取代基可以采用与式(II)中的取代基相同的取代基。作为其它的脂肪链间隔物，可以举出例如以下的二价基团。
化学式2
在通过这些二价基团将2个多核苷酸分子连接的情况下，各二价基团的一端的磷酸基团是指一个多核苷酸分子的3’末端或5’末端的核苷酸的磷酸基团，另一端的氧原子与其它的多核苷酸分子的5’末端或3’末端的核苷酸的磷酸基团形成磷酸酯键。
(结合部及固相载体)
结合部是能够与后述的固相载体结合的标签。在本说明书中，有时将能够与固相载体结合的标签称为固定化用标签。
可用作结合部的固定化用标签只要能够与固相载体结合即可，可以根据固相载体的结构而适当选择，没有特别限定，例如，可以利用多核苷酸(DNA、RNA等)、蛋白质、肽、或其它化合物(例如，低分子化合物)、或者包含它们的组合的物质。固定化用标签优选包含多核苷酸、或由多核苷酸组成。可以包含于固定化用标签的该多核苷酸只要不对利用本发明的引物组进行的核酸扩增反应造成实质性妨害即可，没有特别限定，可以使用碱基数例如为5～50、优选为10～35的多核苷酸，更优选可以使用包含(或者由)序列号41或42所示的碱基序列或其部分碱基序列或它们的互补碱基序列(组成)的多核苷酸。
固相载体没有特别限定，可以利用由树脂、金属、多糖类、矿物等制成的载体，可以制成膜、薄膜、无纺布、板、凝胶等形状。优选固相载体具有多孔结构，以便能够展开溶液中的扩增产物、标识物质。在本发明中，作为可以利用的固相载体，可以列举例如：滤纸、硝酸纤维素膜、聚醚砜膜、尼龙膜、干燥的各种凝胶(硅胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、明胶凝胶)、有机硅、玻璃、塑料等。固相载体的大小及形态可以适当选择适于各种操作、检测的大小及形态。
固相载体只要以能够将至少一部分的部分与固定化用标签结合的方式构成即可，更优选为以能够仅将一部分的部分与固定化用标签结合的方式构成。通过以能够仅将固相载体的特定部分与固定化用标签结合的方式构成，可以仅限定于上述部分而检测捕获至固相载体的扩增产物，因此能够容易地判断阳性或阴性。
固相载体与固定化用标签的结合可以是直接结合，也可以是间接结合，结合方式可以根据待利用的固相载体与固定化用标签的组合而适当选择合适的方式。例如，在固定化用标签包含多核苷酸的情况下，可以通过将能够与该多核苷酸杂交的多核苷酸(例如，包含与该多核苷酸的碱基序列互补的序列的多核苷酸)固定于固相载体制成标签捕获手段、并使两者多核苷酸杂交，从而将固相载体与固定化用标签间接结合。将多核苷酸固定于固相载体可以通过肽、蛋白质、核酸等进行，也可以通过适当的官能团进行。杂交的条件可以通过与标识用标签和标识物质的结合相关的上述条件来进行。在将多核苷酸固定于固相载体的情况下，通过限定于特定部分进行固定化，可以仅限定于给定部分而检测捕获到的扩增产物，因此能够容易地判断阳性或阴性。
结合部(固定化用标签)与第1引物中包含的多核苷酸或第2引物中包含的多核苷酸可以通过任意方式结合，可以直接或间接地结合。其中，在固定化用标签中至少与上述多核苷酸连接的部分由核酸组成的情况下，上述多核苷酸和固定化用标签通过能够抑制或停止DNA聚合酶反应进行的间隔物而结合，以便不会因核酸扩增反应而使该部分和上述多核苷酸一起形成双链。设置于结合部和多核苷酸之间的间隔物的具体例子与设置于标识部和多核苷酸之间的间隔物相关的上述例子相同。
＜4.探针＞
另外，本发明涉及一种探针，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与第1碱基序列或第2碱基序列的部分碱基序列相同或同源的碱基序列，所述第1碱基序列是序列号1、9、11、13、15、2、10、12、14或16所示的碱基序列，所述第2碱基序列与第1碱基序列互补。
本发明的探针可以在严格条件下与包含第1碱基序列或第2碱基序列或第3碱基序列的多核苷酸进行杂交，所述第3碱基序列是第1碱基序列或第2碱基序列中的任意T被取代为U的碱基序列。因此，本发明的探针可以使用核酸杂交法(例如，Southern杂交)、实时PCR法(例如，TaqManTM法、Molecular Beacon法)等。
本发明的探针中的多核苷酸包含与第1碱基序列或第2碱基序列的部分碱基序列(以下，称为“部分碱基序列P”)相同或同源的碱基序列。
上述的部分碱基序列P是第1碱基序列或第2碱基序列中的连续部分的碱基序列，只要具有为了保持特异性所需要的碱基数即可，其碱基数没有特别限定，是第1碱基序列或第2碱基序列中的连续的优选8碱基以上、10碱基以上、更优选15碱基以上、更优选20碱基以上的部分碱基序列。部分碱基序列P的碱基数的上限没有特别限定，例如，可以是第1碱基序列或第2碱基序列中的连续的400碱基以下、300碱基以下或200碱基以下的部分碱基序列。本发明的探针中的多核苷酸不需要仅由与部分碱基序列P相同或同源的碱基序列(以下，称为“碱基序列Q”)组成，可以在碱基序列Q的5’末端侧及3’末端侧的一者或两者添加有其它碱基序列。碱基序列Q特别优选与部分碱基序列P相同。
本发明的探针中的多核苷酸的总碱基数没有特别限定，可以为8碱基以上、10碱基以上、更优选为15碱基以上、更优选为20碱基以上，优选为400碱基以下、300碱基以下或200碱基以下。在将本发明的探针用于实时PCR法的情况下，多核苷酸优选为50碱基以下，更优选为40碱基以下或35碱基以下。
作为本发明的探针中能够在严格条件下与包含特异性区域2的碱基序列的多核苷酸进行杂交的多核苷酸的具体例子，所述特异性区域2的碱基序列具体为序列号2、10、12、14或16所示的第1碱基序列或第2碱基序列或第3碱基序列，所述第3碱基序列是第1碱基序列或第2碱基序列中的任意T被取代为U的碱基序列，可以举出以下多核苷酸：
(2p)包含碱基序列2pb的多核苷酸，所述碱基序列2pb是与序列号38、39或40所示的碱基序列或其互补碱基序列相同或同源的碱基序列2pa中包含的连续的8碱基以上的碱基序列。
序列号38相当于序列号2的第113位～第139位、序列号17的第3644位～第3670位。
序列号39相当于序列号2的第262位～第292位、序列号17的第3793位～第3823位。
序列号40相当于序列号2的第435位～第464位、序列号17的第3966位～第3995位。
在上述(2p)中，碱基序列2pa与序列号38、39或40所示的碱基序列或其互补碱基序列相同或同源，即，满足上述(A)、(B)、(C)或(D)的关系(序列号38、39或40所示的碱基序列或其互补碱基序列相当于碱基序列X，碱基序列2pa相当于碱基序列Y)。
在碱基序列2pa和序列号38、39或40所示的碱基序列或其互补碱基序列满足上述(A)的关系的情况下，更优选碱基序列2pa为序列号38、39或40所示的碱基序列或其互补碱基序列中从5’末端及3’末端中的一者或两者总计缺失了1个或多个碱基的序列。另外，在碱基序列2pa和序列号38、39或40所示的碱基序列或其互补碱基序列满足上述(A)的关系的情况下，更优选碱基序列2pa为序列号38、39或40所示的碱基序列或其互补碱基序列中在5’末端及3’末端的一者或两者总计添加了1个或多个碱基的序列，特别优选为序列号17的碱基序列或其互补碱基序列的部分碱基序列，其是由序列号38、39或40所示的碱基序列或其互补碱基序列、和在序列号38、39或40所示的碱基序列或其互补碱基序列的5’末端及3’末端一者或两者添加的总计1个或多个碱基组成的上述部分碱基序列。
碱基序列2pa和序列号38、39或40的碱基序列满足上述(A)的关系时的其它优选方式例如为以下的方式。在以使特异性区域2的碱基序列的一致度达到最大的方式将序列号18、19、20或21所示的碱基序列与序列号17所示的碱基序列进行比对时，将序列号18、19、20或21所示的碱基序列中与序列号38、39及40的碱基序列分别对应的部分碱基序列设为部分碱基序列38’、39’及40’。在部分碱基序列38’、39’或40’分别是序列号38、39或40所示的碱基序列中缺失、取代、添加和/或插入了1个或多个碱基的包含突变的碱基序列的情况下，可以将序列号38、39或40所示的碱基序列中导入了上述突变(缺失、取代、添加和/或插入)中的至少1个的碱基序列或其互补碱基序列设为碱基序列2pa，更优选将部分碱基序列38’、39’或40’或其互补碱基序列设为碱基序列2pa。
在上述(2p)中，碱基序列2pa特别优选为与序列号38、39或40所示的碱基序列或其互补碱基序列相同。
在上述(2p)中，碱基序列2pb是碱基序列2pa中含有的连续的8碱基以上、优选为10碱基以上、更优选为12碱基以上、更优选为15碱基以上、更优选为20碱基以上、更优选为25碱基以上的碱基序列，可以与碱基序列2pa相同，也可以为碱基序列2pa的部分碱基序列。碱基序列2pb优选为包含碱基序列2pa中的3’末端的碱基的连续碱基序列。
在上述(2p)中，碱基序列2pb特别优选为与碱基序列2pa相同。
上述(2p)的多核苷酸可以包含碱基序列2pb，也可以在碱基序列2pb的3’末端侧和/或5’末端侧进一步添加有其它碱基序列。上述(2p)的多核苷酸的总碱基数没有特别限定，优选为100碱基以下或50碱基以下，更优选为40碱基以下或35碱基以下。
上述(2p)的多核苷酸特别优选由碱基序列2pb组成。
作为上述(2p)的多核苷酸的具体例子，可以举出由序列号38、39或40所示的碱基序列或其互补碱基序列组成的多核苷酸。
本发明的探针可以在上述的多核苷酸进一步添加有标识部，所述标识部是能够与标识物质结合的标签或标识物质。这样的标识部的具体例子如与引物相关的上述例子所述。包含标识部的本发明的探针与包含第1碱基序列、第2碱基序列或第3碱基序列的多核苷酸杂交而生成的复合体易于以标识部作为指标来进行检测。
另外，本发明的探针可以在上述的多核苷酸进一步添加有结合部，所述结合部是能够与固相载体结合的标签。这样的结合部的具体例子如与引物相关的上述例子所述。包含结合部的本发明的探针与包含第1碱基序列、第2碱基序列或第3碱基序列的多核苷酸杂交而生成的复合体可以通过结合部而固定于固相载体，复合体易于检测及分离。
包含结合部的本发明的探针可以以通过结合部预先固定于固相载体的状态提供。固定于固相载体的本发明的探针可以捕获包含第1碱基序列、第2碱基序列或第3碱基序列的多核苷酸。
在将本发明的探针用于实时PCR法的情况下，优选用在扩增产物的实时检测中通常使用的标识物质进行标记。例如，在多核苷酸的5’末端连接报告荧光物质，在3’末端连接淬灭剂色素。作为报告荧光物质，可以示例出：羧基荧光素(FAM)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)等。作为淬灭剂色素，可以示例出：羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等荧光物质、BlackHole Quencher色素(BHQ)、4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)等非荧光物质等。
作为用于实时PCR法使用的本发明的探针的具体例子，可以示例出在5’末端连接有报告荧光物质、且在3’末端连接有淬灭剂色素的包含上述(2p)的多核苷酸的探针。包含上述(2p)中“序列号38、39或40所示的碱基序列”为“序列号38所示的碱基序列”的多核苷酸的实时PCR法用探针优选用于在利用引物组2进行的PCR中实时检测扩增产物。包含上述(2p)中“序列号38、39或40所示的碱基序列”为“序列号39所示的碱基序列”的多核苷酸的实时PCR法用探针优选用于在利用引物组1进行的PCR中实时检测扩增产物。包含上述(2p)中“序列号38、39或40所示的碱基序列”为“序列号40所示的碱基序列”的多核苷酸的实时PCR法用探针优选用于在利用引物组3进行的PCR中实时检测扩增产物。
＜5.检测方法＞
另外，本发明涉及一种检测试样中的堪萨斯分枝杆菌和/或来自堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸的方法，该方法包括：
对试样中的包含第1碱基序列、第2碱基序列、或第3碱基序列的多核苷酸进行检测，所述第1碱基序列是序列号1、9、11、13、15、2、10、12、14或16所示的碱基序列，所述第2碱基序列与第1碱基序列互补，所述第3碱基序列是第1碱基序列或第2碱基序列中的任意T被取代为U的碱基序列。
如上所述，第1碱基序列、第2碱基序列或第3碱基序列是特异性包含于来自堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸的序列，以该序列作为指标，可以物种特异性地检测出堪萨斯分枝杆菌和/或来自堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸。
这里，检测包含第1碱基序列、第2碱基序列或第3碱基序列的多核苷酸不需要检测试样中的多核苷酸包含全部的第1碱基序列、第2碱基序列或第3碱基序列，只要检测出第1碱基序列、第2碱基序列或第3碱基序列中含有的特征性部分就足够了。
作为本发明中作为对象的试样，只要是可能含有堪萨斯分枝杆菌和/或来自堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸的试样即可，可以列举例如包含动物植物等生物体的一部分(器官、组织、细胞等)、粪便、体液(血液、唾液、尿、痰、淋巴液等)、饮料食品、微生物培养物、PCR产物等的试样。
想要检测的多核苷酸可以是天然存在的多核苷酸，也可以是由天然存在的多核苷酸人工制备的多核苷酸。作为这样的多核苷酸，可以列举例如：基因组DNA、从该基因组DNA转录的mRNA、由该mRNA制备的cDNA、将这些多核苷酸扩增而得到的扩增产物等，特别优选为基因组DNA或其扩增产物。基因组DNA、mRNA、cDNA等各用语也包含其片段。想要检测的多核苷酸可以以双链的形态存在于试样中。
作为检测试样中的包含第1碱基序列、第2碱基序列或第3碱基序列的多核苷酸的方法，具体可以举出使用本发明的引物组的方法和使用本发明的探针的方法。以下，对各方式进行说明。
＜5.1.使用本发明的引物组的检测方法＞
本发明的检测方法的一个方式包括以下工序：
工序1，以试样中的多核苷酸作为模板，使用本发明的引物组进行核酸扩增反应；以及
工序2，对通过核酸扩增反应扩增的多核苷酸片段进行检测。
工序1中用作模板的多核苷酸代表性地为DNA。该多核苷酸可以是从试样中提取并纯化的形式，也可以是从试样中提取并粗纯化的形式。或者，如果是细胞、组织的一部分等以较高浓度含有多核苷酸的试样，也可以将试样本体直接包含于核酸扩增反应。
工序1中的核酸扩增反应可以按照通常的PCR法进行。即，在假定存在包含第1碱基序列、第2碱基序列或第3碱基序列的多核苷酸而使用本发明的引物组进行PCR的情况下，可以在能够扩增给定的靶点区域的片段的PCR条件下进行。
PCR中使用的DNA聚合酶可以是耐热性的DNA聚合酶，没有特别限定。在本发明中，可以利用市售的DNA聚合酶，例如，可以优选利用TaKaRa Ex Taq(注册商标)等。另外，温度、时间、缓冲液的组成等可以根据待使用的DNA聚合酶、各引物的浓度等而适当选择。
由于可以期待抑制形成引物二聚体的效果，因此热启动PCR法是有用的。热启动PCR法可以使用TaKaRa Ex Taq(注册商标)Hot Start Version(Takara Bio)等市售的热启动PCR用试剂来进行。另外，也可以使用TaKaRa Taq HS PCR Kit,UNG plus(注册商标)，通过使用该试剂盒，也可以期待抑制核酸扩增产物的携带污染(carryover contamination)的效果。
PCR法的循环数优选为25循环以上，更优选为30循环以上。循环数的上限没有特别限定，通常为60循环以下，优选为50循环以下。
PCR法的反应体系中开始时的引物浓度没有特别限定，可以根据作为模板的多核苷酸等而适当调整。作为反应体系中反应开始时的优选引物浓度，可以举出第1引物及第2引物分别为0.05μM以上、1.0μM以下的浓度。在低于0.05μM的情况下，存在检测灵敏度降低而使作为基准的检测灵敏度降低的可能性。另外，引物浓度的上限没有特别限定，优选为1.0μM。
在工序1中，试样中含有包含第1碱基序列、第2碱基序列或第3碱基序列的多核苷酸的情况下，生成包含给定靶点区域的多核苷酸片段作为扩增产物。
在工序2中，对通过工序1中的核酸扩增反应扩增得到的多核苷酸片段进行检测。工序2中的检测没有特别限定，例如，可以示例出：在工序1结束后，通过凝胶电泳对核酸扩增反应的反应液进行分级，确认有无相当于包含给定靶点区域的多核苷酸片段的尺寸的条带的方法；使对包含给定靶点区域的多核苷酸片段进行了特异性标记的多核苷酸探针、与核酸扩增反应的反应液或其产物杂交，并检测复合体的方法。
另外，工序2的一个方式为如下方式：在多核苷酸的5’末端连接有报告荧光物质、3’末端连接有淬灭剂色素的本发明的探针的存在下进行工序1的核酸扩增反应，对包含给定靶点区域的多核苷酸片段进行扩增，将此时产生的荧光作为指标，检测多核苷酸片段。
另外，在本发明的引物组的第1引物及第2引物中的一者进一步包含作为能够与标识物质结合的标签或标识物质的标识部、且另一者进一步包含作为能够与固相载体结合的标签的结合部的情况下，可以进行使用了以下的固相载体的检测工序作为工序2。
＜5.1.1.使用了固相载体的检测工序＞
在该检测工序中，使上述工序1中的核酸扩增反应的产物与至少一部分包含能够与结合部结合的部分的固相载体接触，以标识部作为指标，检测固相载体的上述部分的扩增产物。
在标识部为上述标识用标签的情况下，可以进一步进行使标识物质与标识用标签结合的标识工序。标识工序的详细情况在后面说明。在标识部为上述的标识物质的情况下，不需要标识工序。在检测工序中，“以标识部作为指标”是指，在标识部为标识用标签的情况下，以经过标识工序结合的标识物质作为指标来检测扩增产物，在标识部为标识物质的情况下，以该标识物质作为指标来检测扩增产物。
核酸扩增反应的产物是指，可能包含扩增产物的核酸扩增反应的反应液、由该反应液进一步将扩增产物高浓度化而得到的试样等。
固相载体的详细情况如上所述。
上述产物和能够与固相载体的结合部结合的部分的接触可以根据固相载体与结合部的组合在下述条件下进行，所述条件(例如，杂交的条件、或pH5～9左右的缓冲液条件)适当调节为在上述产物中包含扩增产物时扩增产物的结合部与上述部分结合的条件。
扩增产物的检测可以通过对与捕获至固相载体的扩增产物结合的上述标识物质进行检测、优选进行肉眼观察检测来进行。在存在扩增产物的情况下，可以检测捕获/结合于固相载体的扩增产物的标识物质。以有无该检测作为指标，可以判断核酸扩增反应的反应体系中有无扩增产物(包含靶点区域的多核苷酸片段)，并且可以判断试样中有无堪萨斯分枝杆菌和/或来自堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸。
＜5.1.2.标识工序＞
标识工序是在本发明的引物组中包含的上述标识部为上述的标识用标签的情况下进行的工序，通过使核酸扩增反应的产物与标识物质接触、使标识用标签与标识物质结合来进行。标识工序可以在使核酸扩增反应的产物与固相载体接触之前进行，也可以在接触之后进行，还可以在接触的同时进行。
标识物质与上述产物的接触可以根据标识物质与标识用标签的组合在下述条件下进行，所述条件(例如，上述的杂交的条件、或pH5～9左右的缓冲液条件)适当调节为在上述产物中包含扩增产物时标识物质与扩增产物的标识用标签结合的条件。
＜5.1.3.检测设备＞
上述的检测工序及标识工序可以使用利用核酸色谱的核酸检测设备来进行。通过利用该核酸检测设备，可以检测/判断核酸扩增反应的反应体系中有无扩增产物(包含靶点区域的多核苷酸片段)而不需要特殊的装置，能够简便且迅速地得到结果。
核酸检测设备可以利用公知的核酸检测设备(WO2012/070618)，所述公知的核酸检测设备用于检测通过核酸色谱法标记的核酸扩增产物。
图4示出了本发明中可使用的核酸检测设备的一个实施方式的示意图，但核酸检测设备并不限定于本实施方式。需要说明的是，在以下的说明中，赋予各构件的符号与图4中示出的符号相对应。
图4的核酸检测设备10以在基材5上将作为用于容纳核酸扩增反应的反应体系的反应体系容纳部的样品垫3、保持标识物质的结合垫2、多孔固相载体1、及吸收垫4相互依次接触的方式配置而形成，所述多孔固相载体1在一部分包含能够与扩增产物中包含的结合部结合的部分6。固相载体1的部分6是将用于捕获扩增产物的物质(捕获物质)(例如，上述低聚核苷酸等)限制性地配置/固定化的部分。虽然未图示，但固相载体1的表面可以被膜包覆。样品垫3、结合垫2、固相载体1及吸收垫4可以由能够用作上述固相载体的具有多孔结构的构件构成。它们可以由同一构件构成，也可以由不同的构件构成。基材5只要是能够支撑配置在其上的各种构件、且易于操作核酸检测设备的基材即可，可以利用由例如树脂、金属、矿物等制成的基材。在将标识物质混合于展开溶液中的情况、标识部为标识物质的情况下，可以省略结合垫2。
将通过工序1得到的核酸扩增反应的反应体系添加于样品垫3。可以直接添加上述反应体系，也可以与适当的展开溶液(例如，磷酸缓冲液、Tris缓冲液、Good’s缓冲液、SSC缓冲液)一起添加。根据需要，展开溶液中可以进一步含有表面活性剂、盐、蛋白质、核酸等。添加于样品垫3的上述反应体系利用毛细管现象沿图4中的箭头所示的方向从上游向下游展开。
另外，作为其它的方式，可以通过将该核酸检测设备放入保持有核酸扩增反应的产物和/或展开溶液的容器(例如，PCR管、微量离心管(Eppendorf tube)、96孔板等)、并使样品垫3浸渍于核酸扩增反应的产物和/或展开溶液的方法进行展开。在该情况下，为了将样品垫3放入保持有核酸扩增反应的产物和/或展开溶液的容器，样品垫3的宽度优选设为2.0～10.0mm，更优选设为2.0～5.0mm。
在上述标识部为标识用标签的实施方式中，反应体系中的扩增产物通过保持了标识物质的结合垫2时，与标识物质接触，通过标识用标签利用标识物质进行标记。
接着，在反应体系中的扩增产物通过固相载体1，与固定在部分6的捕获物质接触，通过固定化用标签捕获/结合于固相载体1。
在试样中存在靶点核酸的情况下，在部分6检测与捕获/结合于包含捕获物质的固相载体1的部分6的扩增产物结合的标识物质。标识物质可以通过肉眼观察确认，因标识物质而使部分6显色。将有无该标识物质的检测(显色)作为指标，可以判断试样中有无靶点核酸。
＜5.2.使用本发明的探针的检测方法＞
本发明的检测方法的另一方式包括以下的工序：
工序3，在能够杂交的条件下，将试样中的多核苷酸、或者以试样中的多核苷酸作为模板进行核酸扩增反应而扩增得到的多核苷酸片段、与本发明的探针进行温育；以及
工序4，对上述多核苷酸或上述多核苷酸片段与上述探针的杂交进行检测。
在工序3中，以试样中的多核苷酸作为模板进行核酸扩增反应而扩增得到的多核苷酸片段优选为使用了本发明的引物组的上述工序1的核酸扩增反应的扩增产物，但并不限定于此，也可以是使用了其它引物组的核酸扩增反应的扩增产物。
工序3中的“能够杂交的条件”是指形成所谓的特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件，例如，可以参照Green and Sambrook,Molecular Cloning,4thEd(2012),ColdSpring Harbor Laboratory Press而适当确定。具体可以示例出上述＜2.用语＞中与关于(C)说明的“严格条件”相同的条件。
在工序4中，对上述多核苷酸或上述多核苷酸片段与上述探针的杂交进行检测的方法没有没有特别限定。
例如，在本发明的探针具有上述标识部的情况下，从工序3的温育后的反应混合物除去未反应的探针，可以用来自标识部的标识作为指标检测上述多核苷酸或上述多核苷酸片段与上述探针的复合体。在标识部为标识用标签的情况下，可以根据需要进行添加标识物质的标识工序。
另外，在本发明的探针具有上述结合部的情况下，可以在将上述多核苷酸或上述多核苷酸片段与上述探针的复合体通过结合部固定于固相载体后，通过适当方式检测固相载体上的上述复合体。包含结合部的本发明的探针可以以通过结合部预先固定于固相载体的状态提供。
＜6.试剂盒＞
另外，本发明涉及用于检测堪萨斯分枝杆菌和/或来自堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸的试剂盒，其包含本发明的引物组和/或本发明的探针。
该试剂盒可以用于本发明的检测方法。
本发明的试剂盒中可以进一步包含用于核酸扩增反应的各种试剂(例如，DNA聚合酶、核酸扩增反应用缓冲液、dNTPs等)、用于温育的各种试剂(温育用缓冲液)等。
在本发明的引物组和/或本发明的探针具有上述结合部的情况下，本发明的试剂盒可以进一步包含固相载体，所述固相载体在至少一部分包含能够与上述结合部结合的部分。作为固相载体的具体例子，特别优选为上述的检测设备。
本发明的引物组和/或本发明的探针包含上述的标识部，在标识部为标识用标签的情况下，本发明的试剂盒优选进一步包含用于标记标识用标签的标识物质。
实施例
基于以下的实验结果对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于此。
[实施例1]
(1)引物的设计
在堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)的特异性区域2内，使用引物设计用的Web工具Primer BLAST设计了用于PCR扩增检测的引物组1～3。各引物的设计位置如图2-1、2-2及2-3所示。将引物组1～3的正向引物、反向引物的碱基序列示于以下。
表3
(2)PCR
使用上述的引物组1～3，按照TaKaRa TaqHS perfect Mix的手册制备了下述的PCR用反应液。
表4
5μM正向引物溶液 1μL
5μM反向引物溶液 1μL
2x TaKaRa TaqHS perfect Mix 10μL
提取模板DNA溶液 1μL
无菌水 7μL
模板使用了I型堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii type I)ATCC12478株、I型堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii type I)临床分离株、IV型堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii type VI)临床分离株、II型堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii type II)临床分离株、胃分枝杆菌(M.gastri)ATCC15754株的基因组DNA。由各微生物株制备基因组DNA按照以下步骤进行：在Myco Broth(极东制药)中将各菌株培养至108cfu/ml以上，使用Kaneka简易DNA提取试剂盒ver.2(Kaneka)按照该产品的实验方案从培养液10μl中提取出DNA。将其作为提取模板DNA溶液。
作为阴性对照，除了使用1μL灭菌蒸馏水来代替上述模板DNA溶液以外，制备了相同组成的PCR反应液。
5μM正向引物溶液及5μM反向引物溶液是将给定的引物溶解于灭菌蒸馏水中达到5μM浓度而得到的溶液。
将PCR反应液置于热循环仪(Bioer Technology公司、LifeEco)，在94℃下反应1分钟后，重复35次94℃-5秒钟/60℃-10秒钟/72℃-15秒钟的循环，进行了PCR。
(3)电泳
通过使用了2％琼脂糖凝胶的电泳法对上述(2)得到的PCR后的反应液5μL进行分离。接着，用溴化乙锭染色后，照射紫外线对条带进行了检测。
将结果示于图3。
所有的引物组仅在以堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)作为模板时可以观察到目标尺寸的扩增产物，能够检测包括I型(type I)、II型(type II)及IV型(type VI)的全部堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)。另外确认了，在以胃分枝杆菌(M.gastri)作为模板的情况下，由于未观察到扩增产物，因此可以识别堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)和胃分枝杆菌(M.gastri)。
[实施例2]
使用从结核分枝杆菌复合群4种(结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、牛分支杆菌卡介苗株(M.bovis BCG)、田鼠分枝杆菌(M.microti))及非结核分枝杆菌(堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、胃分枝杆菌(M.gastri)等)38种、普通细菌1种(星状诺卡氏菌，Nocardia asteroides)中提取出的基因组DNA作为模板，并使用引物组2作为引物组，除此以外，在与实施例1相同的条件下进行PCR，通过琼脂糖凝胶电泳法确认了有无扩增产物。将结果示于下表。
表5
在使用了引物组2的PCR中，仅在以堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)的基因组DNA作为模板时产生扩增产物，而在除堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)以外的分枝杆菌、以及与分枝杆菌近缘的普通细菌星状诺卡氏菌(N.asteroides)的情况下未确认到PCR扩增。
由此表明，本发明的方法对于堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)的物种特异性检测是非常有效的。
[实施例3]
构建了核酸色谱检测体系，所述核酸色谱检测体系能够检测使用了引物组2的PCR的扩增产物。确认了可以使用该检测体系检测堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)的临床分离株。
(I)引物的结构
通过包含抑制聚合酶反应的偶氮苯结构的上述式I所示的二价基团，将由以下的正向引物用标签序列组成的DNA连接至实施例1中记载的引物组2的正向引物(KAN-2f)的5’末端。此时，包含上述式I所示的偶氮苯结构的二价基团的5’端与由正向引物用标签序列组成的DNA的3’末端核苷酸的磷酸基团形成磷酸酯键，该二价基团的3’端磷酸基团与上述正向引物的引物部分的5’末端核苷酸的脱氧核糖的5’位羟基形成磷酸酯键。
5’-GACAACGGAGACAGAGCCAA-3’(序列号41)
通过包含抑制聚合酶反应的偶氮苯结构的上述式I所示的二价基团，将由以下的反向引物用标签序列组成的DNA连接至实施例1中记载的引物组2的反向引物(KAN-2r)的5’末端。此时，包含上述式I所示的偶氮苯结构的二价基团的一端的氧原子与由反向引物用标签序列组成的DNA的3’末端核苷酸的磷酸基团形成磷酸酯键，该二价基团的另一端的磷酸基团与上述反向引物的引物部分的5’末端核苷酸的脱氧核糖的5’位羟基形成磷酸酯键。
5’-ATGCTACCGTATGCCCAGTG-3’(序列号42)
(II)低聚核苷酸结合金胶体的制备
将Gold Colloid(40nm，9.0×1010(粒子数/ml)、British Biocell International公司制造)与下述的序列号43所示的含巯基低聚核苷酸混合，在50℃下温育16小时。以6000rpm离心分离15分钟，除去上清，添加0.05M氯化钠、5mM磷酸缓冲液(pH7)并进行混和，然后，再次在50℃下温育40小时。
在温育后，进行离心(6000rpm、15分钟)，除去上清，添加了5mM磷酸缓冲液(pH7)。再次进行了该缓冲液置换。
将制备的金胶体溶液均匀地添加至玻璃纤维制的垫，然后，用真空干燥机进行干燥，制成结合垫。
(含巯基低聚核苷酸)：5’-TTGGCTCTGTCTCCGTTGTC-SH-3’(序列号43)序列号43所示的含巯基低聚核苷酸通过磷酸酯键将3’末端的胞嘧啶核苷酸的3’位磷酸基团与HO-(CH2)m-SH(m为6)所示的化合物的羟基键合在一起。
(III)固定有标签捕获手段的膜的制备
使用分配器将包含下述序列号44所示的低聚核苷酸探针的溶液在MerckMillipore公司制造的硝酸纤维素膜(Hi-Flow180)上涂布成与展开方向正交的宽度1mm的线状，作为标签捕获手段。然后，通过在40℃下干燥30分钟，制成了具备标签捕获手段的膜。
(低聚核苷酸探针)：5’-CACTGGGCATACGGTAGCAT-3’(序列号44)
(IV)横向流动型核酸检测设备的制备
按照图4的示意图所示的检测设备制作了制成的横向流动型核酸检测设备。
即，将作为基材5的聚丙烯制背板(Lohmann公司)、作为结合垫2的上述(II)中制作的结合垫、在部分6具备作为捕获装置的上述(III)中制作的标签捕获手段的膜(固相载体)1、作为样品垫3的玻璃纤维制的样品垫、作为吸收垫4的纤维素制的吸收垫分别如图4所示相互重叠贴合，制作了横向流动型核酸检测设备10。
(V)PCR
除了使用了上述(I)中记载的添加了标签的引物组2、并且使用了表5所示的各菌株的基因组DNA作为模板以外，通过与实施例1相同的条件进行了PCR。
需要说明的是，各菌株的类型通过使用了hsp65RPA分析的通常方法来判断。
(VI)使用了核酸色谱检测体系的检测1
将上述条件下的PCR后的反应液用于横向流动型核酸检测设备10，尝试了扩增产物的检测。具体而言，将PCR后的反应液5μL添加于上述设备10上的样品垫3，进一步添加80μL的展开溶液(配合有表面活性剂的柠檬酸缓冲液)，由此展开反应液。在室温下10分钟后，通过肉眼观察包含固定成膜1上的线状的标签捕获手段的部分6有无着色来进行确认。在确认到着色的情况下，表示为“+”，在未确认到着色的情况下，表示为“－”。
将结果示于下表。
该结果可以确认，能够检测包括I型(type I)、II型(type II)、III型(type III)及IV型(type IV)的全部堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)。
需要说明的是，除了使用了从表5所示的堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)的各菌株提取出的基因组DNA作为模板、并且使用了引物组2作为引物组以外，在与实施例1相同的条件下进行PCR，通过琼脂糖凝胶电泳法确认了有无扩增产物，结果是，在全部菌株中确认到目标尺寸的扩增产物的存在。
(VII)使用了核酸色谱检测体系的检测2
除了使用了上述(I)所述的添加有标签的引物组2、并且使用了表4所示的各菌株的基因组DNA作为模板以外，通过与实施例1相同的条件进行了PCR。
接着，通过与上述(VI)相同的步骤将PCR后的反应液用于横向流动型核酸检测设备10，通过肉眼观察包含固定成膜1上的线状的标签捕获手段的部分6有无着色来进行确认，尝试了扩增产物的检测。
其结果是，仅在以堪萨斯分枝杆菌(I型)(M.kansasii(Type I))ATCC12478的基因组DNA作为模板的情况下，检测到着色(+)，在以表4所示的其它菌株的基因组DNA作为模板的情况下，未检测到着色(－)。
[实施例4]
使用了从堪萨斯分枝杆菌(I型)(M.kansasii(Type I))提取出的基因组DNA作为模板、并使用了表2所示的引物组4(MKS-40f(序列号22)及MKS-40r(序列号23))、引物组5(MKS-41f(序列号24)及MKS-41r(序列号25))、引物组6(MKS-42f(序列号26)及MKS-42r(序列号27))或引物组7(MKS-43f(序列号28)及MKS-43r(序列号29))作为引物组，除此以外，在与实施例1相同的条件下进行PCR，通过琼脂糖凝胶电泳法确认了有无扩增产物。在使用任何引物组时，均可以确认靶点尺寸的扩增产物的存在。
[实施例5]
使用了从堪萨斯分枝杆菌(II型)(M.kansasii(Type II))提取出的基因组DNA作为模板、并使用了表2所示的引物组6或引物组7作为引物组，除此以外，在与实施例1相同的条件下进行PCR，通过琼脂糖凝胶电泳法确认了有无扩增产物。在使用任何引物组时，均可以确认靶点尺寸的扩增产物的存在。
工业实用性
本发明的引物组、探针、方法及试剂盒对于准确地检测堪萨斯分枝杆菌是有用的。
本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请通过直接引用而引入本说明书中。
序列表
<110> 株式会社钟化(Kaneka Corporation)
极东制药工业株式会社(Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.)
<120> 用于检测堪萨斯分枝杆菌的引物组、探针、试剂盒及方法
<130> B170074
<150> JP 2017-007871
<151> 2017-01-19
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 333
<212> DNA
<213> I型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type I）
<400> 1
gccatcccgc aagtccggtc gctgacgagt gagaacgagg aggagccatg ggggatacct 60
accgcgaccc cgtcgaccac ctgcatacga cgcgtccgct ggccggtgag tcactgatcg 120
acgtgctgca ctggcccggg tatctgctgg tggtggccgg ggttatcggc ggtgtcggat 180
ctcttgccgc cttcggtacc gggcatgact cccagggcat ggtcgccggt gtcgcagcgc 240
tcgtggtcac ggtggccggg ctggtgtggc tggccgtcga gcaccggcgg gtgcgccgaa 300
tcgccgaacg gtggtatgcc gaacatcccg agg 333
<210> 2
<211> 475
<212> DNA
<213> I型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type I）
<400> 2
tcgccgtcgg gggcgccgtt caccgggttc accggctcca tgaccggcag cgcgccgtcg 60
ggatcgcaaa tctcgagtaa ccgcgacaca gcccggctcg gcaccagcgc ccaccggatg 120
tctgccgccg agcagaccac gttgattcgg tgaagagcgg aaaacccggc agtaccaatg 180
aattccaggt ggcgtaggtc cagggtcagc caccggcaag accgcacgca ctgctgcacg 240
tatccggtga gctgatcggc attggcggcg tcgagctcac cttccacggt gatcacgccg 300
gccgacggcc catagctggc agtgaagtca gcggttccgc atttctgcca ggattggatc 360
acagacaatc gtggactcca tccatcgagc gtttgttgct gtcgaccacg ccgcgtctgc 420
gcgggaccgc tatacaggga gtttgccttc ctggcgaccc tgacgcactg acagg 475
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 3
tgaattccag gtggcgtagg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 4
atcctggcag aaatgcggaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 5
cgcaaatctc gagtaaccgc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 6
cgctcttcac cgaatcaacg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 7
tcgtggactc catccatcga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 8
ggagctacgt cctgtcagtg 20
<210> 9
<211> 338
<212> DNA
<213> II型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type II）
<400> 9
gccatcgtgt cccgcgagtc cggccgctga cgagtgagaa cgaggaggaa ccatggggga 60
cacctaccac gaccccgtcg accacctgca tacgacgcgg ccgctggccg gcgagtcact 120
gatcgacgtg ctgcactggc ccgggtacct gctggtggtg gccggggtta tcggcggtgt 180
cgggtctctt gccgccttcg gcaccgggca tcactcccag ggcatggtcg ccggtgtcgc 240
ggcgctcgtg gtcacggtgg ccgggctggt gtggctggcc gtggagcacc ggcgggtgcg 300
ccgaatcgcc gagcggtggt atgccgaaca cccggagg 338
<210> 10
<211> 476
<212> DNA
<213> II型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type II）
<400> 10
tcgccgtcgg gggcgccgtt cacccggttc accggctcca tgaccggcag cgcgccgtcg 60
ggatcgcaaa tttccagtaa ccgcgatacg gcccggctcg gcaccatcgc ccactgggtg 120
tcggccgccg agcagaccac gttgattcgg tgaagagcgg aaaacccggc agtcccaata 180
aattccagac gccgtaggtc cagggtcagc caccggcagt acttcacgca ttgctggacg 240
tatccggcga gatggtcggc gttggcggcg tcgagctcac cttctacggt gaccacgccg 300
gacgacgaac catagctggc ggtgaagtca gcggttccgc atttctgcca ggattggatc 360
acagacaatc gtggactcca tccatcgaac attctttggt gtcgaccacg tcgagtgtgc 420
gctgcgccgc ttaagcaggg aatttgcctc cctcgcgacc ctgacgcact gacagg 476
<210> 11
<211> 338
<212> DNA
<213> III型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type III）
<400> 11
gccatccggt cccgcgagtc cgatcgctga cgagtgagaa cgaggaggag ccatggggga 60
cacctaccgc gaccccgtcg accacctgca tacgacgcgg ccgctggccg gcgagtcgct 120
gatcgacgtg ctgcactggc ccgggtacct gctggtggtg gccggggtta tcggcggtgt 180
cggatctctt gccgccttcg gcaccgggca tgactcccag ggcatggtcg ccggcgtcgc 240
ggcgctcgtg gtcacggtgg ccgggctggt gtggctggcc gtcgagcatc ggcgggtgcg 300
tcgaatcgcc gagcggtggt atgccgaaca tcccgagg 338
<210> 12
<211> 466
<212> DNA
<213> III型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type III）
<400> 12
ccgccgtcgg gggtgtcgtt caccggctcc atgaccggca gcgcgccgtc gggatcgcaa 60
atctccagta accgcgacac ggcccggctc ggcaccatcg cccactgggt gtccgccgcc 120
gaacagacca cgttgattcg gtgaagagcg gaaaacccgg cagtcccaat aaattccaga 180
cgccgtaggt ccagggtcag ccaccggcaa taccttgcgc actgctggac gtatccggcg 240
agctgatcgg cgttggcggc gtcgagctca ccctctacgg tgaccacgcc ggccgacgga 300
cgatagctgg cagtgaagtc agcggttccg catttctgcc aggattggat cacagacaat 360
cgtggactcc atccatcgag catgtgttgc tgtcgaccac gtcgcgtctg cagcgggccg 420
ttatgcaggg agtttgcctc cctggcgacc ctgacgcagt gacagg 466
<210> 13
<211> 340
<212> DNA
<213> IV型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type IV）
<400> 13
tccacatcct gtcccgtgag tcccgtcgct gacgagagag aacgaggagg agccatgggg 60
gacacctacc gcgaccccgt cgaccacctg catacgacgc ggccgctggc cggcgagtca 120
ctgatcgacg tgctgcactg gcctgggtac ctgttggtgg tggcgggggt gatcggtggt 180
gtcggatctc ttgctgcctt cggcaccggc catcacgtcg aaggcatggt cgccggcgtc 240
gcggcgctcg tcgtcacggt ggccgggctg gtgtggctgg ccgtcgagca ccggcgggta 300
cgcaggatcg ccgagcggtg gtacgccgaa caccccgagg 340
<210> 14
<211> 477
<212> DNA
<213> IV型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type IV）
<400> 14
tcgccgtcgg gggcgccgtt taccgggttc accggctcca tgaccggcag cgcgccgtcg 60
ggatcgcaaa tctccagtaa ccgcgacacg gcccggctcg gcaccatcgc ccactgggtg 120
tccgccgccg agcagaccac gttgattcgg tgaagggcgg aaaacccggc agtgccaatg 180
aattccagac gccgtaggtc caggatcagc caccggcaag acctcacgca ctgctggacg 240
tatccggcca gctgatcggc attggcggcg tcgagctcac cttctacggt gatcacgccg 300
gccgacggcc catagctggc agtgaagtca gcggttccgc atttctgcca ggattggatc 360
acagacaatc gtggactcca tccatcgaac attcgttggt gtcgaccacg tcgagtgtgc 420
gctgcgtcgc tttacgcagg gagtttgcct ccctcgcgac cctgacgcac tgacagg 477
<210> 15
<211> 339
<212> DNA
<213> V型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type V)
<400> 15
gccatcctgt cccgcgagtc cggccgctga cgagtgagaa cgaggaggag ccatggggga 60
cacctaccgc gaccccgtcg accacctgca tacgacgcgg ccgctggccg gcgagtcact 120
gatcgacgtg ctgcactggc cccgggtatc tgctggtggt ggccggggtt atcggcggtg 180
tcggatctct tgccgccttc ggcaccgggc ataactccca gggcatggtc gccggtgtcg 240
cggcgctcgt ggtcacggtg gccgggctgg tgtggctggc cgccgagcac cggcgggtgc 300
gccgaatcgc cgagcggtgg tatgcggaac accccgagg 339
<210> 16
<211> 476
<212> DNA
<213> V型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type V)
<400> 16
tcgccgtcgg gggcaccgtt caccgggttc accggctcca tgaccggcag cgcgccgtcg 60
ggatcgcaaa tctccagtaa ccgcgacacg gcccggctcg gcaccatcgc ccactgggtg 120
tccgccgccg agcagaccac gttgattcgg tgaagagcgg aaaacccggc agtcccaata 180
aattccaggc gccgtaggtc cagggtcagc caccggcaat acctcacgca ctgctggacg 240
tatccggcga gctgatcggc gttggcggcg tcgagctcac cttctacggt gaccacgccg 300
gccgacggac catagctggc agtgaagtca gcggttccgc atttctgcca ggattggatc 360
acagacaatc gtggactcca tccatcgaac attcgttggt gtcgaccacg tcgagtgtgc 420
gctgtgcggc ttacgcaggg agtttgcctc cctcgcgacc ctgacgcact gacagg 476
<210> 17
<211> 5001
<212> DNA
<213> I型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type I）
<400> 17
ggcgatggct cgcttcgtcg agaccttcgt cagggtgttg ggcgacccgg agctgccgca 60
tctgttcttc gtcgagggcg gcgctttggc ggtggagaac gccctcaagg tcgcattcga 120
ctggaagagc cgccacaacc aggcgcgcgg catcgatccg gcgctcggca cccgggtgct 180
gcacttgagc ggggcatttc acggccgcag cggctatacc ctgtcgctga ccaacaccaa 240
acccgttacg gtggcccgct ttccgaaatt cgactggccg cgcatcgagg caccctatat 300
ccgaccccga gccgacatgg atgcgctgga aaccgaggcg ctgcggcagg cccgcgcggc 360
attcgaggcg cacccccatg acatcgcctg tttcatcgcc gagccgatcc agggagaagg 420
cggcgaccgt cacttccggc ccgagttctt cgtggcgatg cgccagttgt gtgacgaaca 480
cgatgcgctg ctgattttcg acgaggtgca gaccggctgt gggctcacgg gaaccccttg 540
ggcctaccag caattgggtg tggcgcccga tgtcgtcgcc ttcggcaaga agacgcaggt 600
gtgcgggatg atggcgggcc gccgagtcga cgagatcacc gacaacgtgt tcgcggtcaa 660
gtcgcggctc aactcgacgt ggggcggaaa cctggtcgac atggtgcggg cccgccgcat 720
cctggaggtg atcgaaggcg aagggctatt cgaacatgcg gcccgccagg gccgccacct 780
gcgcgcccgg ctcgacgagc ttgcccagga gttcccgggc ctggttctgc atccgcgcgg 840
ccgggggctg atgtgtgcct tcagcctgcc gaccaccgcg gaccgtgacg acgtgatccg 900
ccggttgtgg caacgcgggg tgatcgtgct gccggcgggt gacgacgggg tgcgcttccg 960
tccggcgttg accgtcacgc gcgccgagat cgacgccgcg atcgccggtg tacgtgccgc 1020
attgacggct gtgacctagt cggaccgggt gcaccgttta cctgggctga ccgcggggta 1080
tggaaacgtt gtactccgcg aacgcgggat tggggttcag gaatgcagaa gacacgcgag 1140
cggtcacccg gtgaccgatt aggacaggac gacgccgagg ttcgcgccgc catccggttc 1200
gcagtcctgg ccgcggccgc cggtgtgggt tttgtcatca tggcggcctt gtgggtcagc 1260
acgtgcggtg gcgcgggatt ggacacggtg gcctgtggcc cgccggagcg gaccctgctg 1320
gccttcggcg gcccgctgat tctgttggcc ggtgggatct gggccttcat ccgcacctat 1380
caggtgtggc gagcacgcgg tacctggtgg ggatggcacg gtgccggatg gttcttgttg 1440
acgctgatgg tggtggccgt gtccatgggc gtgcctccca tcgccggccc ggcactggcg 1500
gttagttggc tctgatcccg ccatcccgca agtccggtcg ctgacgagtg agaacgagga 1560
ggagccatgg gggataccta ccgcgacccc gtcgaccacc tgcatacgac gcgtccgctg 1620
gccggtgagt cactgatcga cgtgctgcac tggcccgggt atctgctggt ggtggccggg 1680
gttatcggcg gtgtcggatc tcttgccgcc ttcggtaccg ggcatgactc ccagggcatg 1740
gtcgccggtg tcgcagcgct cgtggtcacg gtggccgggc tggtgtggct ggccgtcgag 1800
caccggcggg tgcgccgaat cgccgaacgg tggtatgccg aacatcccga ggtaccgcgc 1860
caacggctgg ccagctagca gctccggctg gcgcctcacc gcaaaacccg gcggcggttt 1920
tgttttaccg gtggcgccga cggggtatca ggtgtgaacc atgacgagta ctggctttgc 1980
cgcgtcggca ctgtcacccc atcatcgggg acaggatcac gaaggcaccg acatagattg 2040
ctgcagcgac cgcgatcaaa accaccaagg tgatcccggc aatcaccgcg atgcgccgga 2100
gccggcgcgt ccggattgtg tcggtcgcgt ccgcctcgtc catggctggt tgaatacccg 2160
gtggcgacca tgaccaaccg gttagaacgc gcggcccaaa acgggcctcc ggaaggcgat 2220
cggaaaggga ccgaaatcga cagccaaatc gggacccaaa tcagtagtag tagtgtcggt 2280
caaaaattgc cgggaggcca catgagcgat gccgacgcgc gtcccaacag gcaccaacgc 2340
ggcgagcgcg ccgtcgagct gaaagttgct gcgcgcttgg agaatctggc gatcctgcgc 2400
accctggtcg gcgccatcgg caccttcgag gacttggatt tcgacgcggt cgccgacctg 2460
agactggcgg tcgacgaagt gtgtacccgg ctgatccgtt ccgccacacc gaacgcgacc 2520
ttgacgctgg tggtcgaccc gcacgacgac gaactcgtgg tggaggcgtc cgcgatgtgc 2580
gacacccacg acgtcgtggc accgggcagc ttcagctggc atgtcctgac gtcgctggcc 2640
gacgacgtcc agactttcca cgacggtcgc atgcccgacg ccgccggcag tgtgttcggc 2700
attgtgttga cggcccgacg ggcggcctct ggcaggtgac gccgcgtgct gccggcggtt 2760
ctgcttcacg gccgaacgaa tacgccgatg tcccggagat gtttcgtgag ttggccggtt 2820
ttgaccccga ctcaccggat ttccagcgcc accgcgacaa gatcgtggag cgctgcctac 2880
cgctggccga tcacatcgcc cggcggttcg agggacgcgg cgaaccccgc gacgacctga 2940
ttcaggtcgc ccgggtcgga ttggtcaacg cggtagtccg cttcgacgtc gagaccgggt 3000
cggatttcgt ctcgttcgcc gtgcccacca tcatggggga agtccggcgg cacttccggg 3060
acaacagttg gtcagtcaag gttcctcgcc ggctgaagga actgcacctg cggttgggca 3120
ccgccaccgc cgagttgtcg cagcggctcg gcagggcgcc caccgctacc gaactcgccg 3180
ccgaactcgg tatggaccgc ggcgaggtcg tcgaagggct ggtggcgggc agctcttaca 3240
acacgctgtc gatcgacagc ggtggtggta acgaagacga cgacgcgcgt gccatcgcgg 3300
acaccctcgg cgacatggat gccggcctgg accggataga agatcgcgag tcgcttcgcc 3360
cgctgctcga ggcgctgccc gagcgcgagc gaacggtgtt gatcctgagg tttttcgagt 3420
cgatgacgca gacccagatc gccgagcggg tcggcatctc ccagatgcac gtgtcccggc 3480
tgctggccaa gtcgctagcg cggctccgcg accagctcga gtaggcgcag gtcgccgtcg 3540
ggggcgccgt tcaccgggtt caccggctcc atgaccggca gcgcgccgtc gggatcgcaa 3600
atctcgagta accgcgacac agcccggctc ggcaccagcg cccaccggat gtctgccgcc 3660
gagcagacca cgttgattcg gtgaagagcg gaaaacccgg cagtaccaat gaattccagg 3720
tggcgtaggt ccagggtcag ccaccggcaa gaccgcacgc actgctgcac gtatccggtg 3780
agctgatcgg cattggcggc gtcgagctca ccttccacgg tgatcacgcc ggccgacggc 3840
ccatagctgg cagtgaagtc agcggttccg catttctgcc aggattggat cacagacaat 3900
cgtggactcc atccatcgag cgtttgttgc tgtcgaccac gccgcgtctg cgcgggaccg 3960
ctatacaggg agtttgcctt cctggcgacc ctgacgcact gacaggacgt agctccgggc 4020
ggctgtgaac tcaacctgtt tcgaggctac ccggcgggtg ccggggcgac aacgttctcc 4080
gatctgactc agagaatcgc tggtcagacg gggtttggct cggtgatcgg ctacttgatc 4140
tcggcgagca ccgtgccctg cgtgatggct gccccggcct cgaccgccag gccggtgatg 4200
acgccgtcct tgtgggcggt gaccgggttt tccatcttca tcgcctcaag gaccaccaca 4260
agatcgccgg tgacgacttc ttgtccttct tcgacagcga ccttcaccac ggtgccctgc 4320
atgggtgcgg tcaccgcgtc gccggaggct gccgcgccgc tgtgggcgcc gcgcttgcgc 4380
ggcttgggct tgcgccggat gacgccgacc gggtcgcagc cgccgccgcc ggacagcgcc 4440
aggtcggcgg gcagtgacac ctcgacccgt cgaccgtcga cctcgacgac caccttctgc 4500
cgcggccggg cgtcttcctc gtcgctgggc tcgccggcgg tgaagggttc gacggtgttg 4560
ttccactcgg tctcgatcca acgggtgtgc accgagaagc cgtcctggtc gccgatgaac 4620
gccgggtcgg ccaccaccgc ccggtggaag gggatgacgg tggccagacc ctccacctcg 4680
aattcgtcca gcgcgcgacg cgcgcgggcc agcgcctcgg cgcggtcggc gccgtggacg 4740
atcagcttgg ccagcatcga gtcgaactgg ccgccgatca ccgagccggt ctccacgccg 4800
gaatccagcc ggacgcccgg gccgctgggc gggtggaatt tggtcaccgg tccgggcgcg 4860
ggcaagaatc cgcgcccggc gtcctcgccg ttgatccgga actcgatggc gtgcccgcgg 4920
ggggtggggt cctcggtgat gtccagcttt tcgccgttgg cgatcttgaa ctgctgcagc 4980
accaagtcga taccggcggt t 5001
<210> 18
<211> 5034
<212> DNA
<213> II型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type II）
<400> 18
ggcgatggcg cgcttcgtcg agaccttcgt cagggtgttg ggcgacccgg cgctgccgca 60
tctgttcttc gtcgagggcg gcgctttggc ggtggagaac gccctcaagg tcgcattcga 120
ctggaaaagc cgccacaacc aggcccgcgg catcgatccg gcgctgggca cccgggtgct 180
gcacttgagc ggcgcatttc acggccgcag cggctacacc ctgtcgctca ccaacaccaa 240
acccgtcacc gtggcccgct tcccgaaatt cgactggccg cgcatcgacg cgccccatat 300
ccggccgggg ttaaccgagt cggccatggc tgcgctggag gccgaggcgc tgcggcaggc 360
ccgcgcggca ttcgaggcgc acccccacga catcgcctgt ttcatcgccg agccgatcca 420
gggagaaggc ggcgaccgcc acttccgggc cgagttcttc gcggcgatgc ggcagttgtg 480
tgacgaacac gacgcgctgc tgatatttga cgaggtgcag accggctgtg gaatcaccgg 540
aaccccttgg gcttaccagc aattggccgt ggcgcccgat gtcgtggcct tcggcaagaa 600
gacgcaggtc tgtggggtga tggcaggccg ccgcgtcgac gaggtcaccg acaacgtgtt 660
cgcggtcaag tcgcggctca actcgacgtg gggcggaagc ctggtcgaca tggtgcgggc 720
ccgccgcatc ctggaggtga tcgaaaacga cggactcttc gaacatgcgg cccggcaggg 780
ccgacacctg cgcgcccggc tcgacgagct tgcccaggag ttcccgggcc tggtactgga 840
tccgcgcggg cgggggctga tgtgtgcctt cagcctgccg accaccgcgg accgtgacga 900
cgtgatccgc cagttgtggc aacgcgcggt gatcgtgctg ccggccggtg acgacggggt 960
gcgtttccgt ccggccttga ccgtcacgcg cgccgagatc gatgccgcga tcgccggtgt 1020
acgtgccgca ttgacggctg tgacgtagtc ggacctggtc ggacctggtc gcaccgtttg 1080
cctgggctga gcgcggggta tggaaacgtt gtactccgcg aacgcgggat tggggttttc 1140
aggatgcaga agacacgcga acggtcaccc ggtgaccgac taggacaaga cgacgccgag 1200
gttcgcgccg ccatccggtt cgcagtcctg gccgccggcg ctggtgcggg gtttgtcatc 1260
atggcggcct tgtgggtcag cacgtgcggc ggcgcggccg tggacacggt ggcctgtggc 1320
ccgccggagc ggaccctgct ggccttcggc ggcccgctga ttctgttggc cggtggcatc 1380
tgggccttca tccgcaccta tcaggtgtgg cgagcccgcg gtacctggtg gggatggcac 1440
ggtgccggat ggttcttgtt gacgctgatg gtggtggccg tgtccatggg cgtgcctccc 1500
atcgccggcc cggcactggc ggttagttgg ctctgacccc gccatcgtgt cccgcgagtc 1560
cggccgctga cgagtgagaa cgaggaggaa ccatggggga cacctaccac gaccccgtcg 1620
accacctgca tacgacgcgg ccgctggccg gcgagtcact gatcgacgtg ctgcactggc 1680
ccgggtacct gctggtggtg gccggggtta tcggcggtgt cgggtctctt gccgccttcg 1740
gcaccgggca tcactcccag ggcatggtcg ccggtgtcgc ggcgctcgtg gtcacggtgg 1800
ccgggctggt gtggctggcc gtggagcacc ggcgggtgcg ccgaatcgcc gagcggtggt 1860
atgccgaaca cccggaggta ccgcgccaac ggctggccag ctagcggctt ccagtgccgg 1920
ttgacgccgc gccacaaaac cgggcgacgg ttttgtttta ccggtggcgt cgacggggta 1980
tcaggtgtga accatgacga gtactggctt tgccgcgtcg gcgctgtcac cccatcatcg 2040
gggacagaat cacgaaggca ccgacataga ttgctgctgc gaccgcgatg aaaaccacca 2100
aggtgatcac ggcgatcacg gcgacgcgcc ggagccggcg cgtccggatt gtgtcggtcc 2160
cgtccgcctc gtccatggct ggttgaatac ccggtggcgg ccatgaccaa ccggttagaa 2220
cgcgcggccc aaaacgggcc tccgggaggc gatcggaaag ggaccgaaat cgacagtcaa 2280
ctcgggaccc aaatcagtag tagtagtgtc ggtcaaaaat tgccgggagg ccacatgagc 2340
gatgccgatg cgcgtcccaa caggcaccaa cgcggcgagc gcgccgtcga gctgaaggtt 2400
gctgcgcgct tggagaattt ggcgatcctg cgcaccctgg tcggcgccat cggcaccttc 2460
gaggacttgg atttcgacgc ggtcgccgac ctgagactgg cggtcgacga agtgtgtacc 2520
cggctgatcc gttccgccac accgaacgcg accttgacgc tggtggtcga cccgcgcgac 2580
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<210> 19
<211> 5031
<212> DNA
<213> III型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type III）
<400> 19
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<210> 20
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<212> DNA
<213> IV型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type IV）
<400> 20
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<212> DNA
<213> V型堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii type V）
<400> 21
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tctgttcttc gtcgaaggcg gcgctttggc ggtggagaac gccctcaagg tcgcattcga 120
ctggaaaagc cgccacaacc aggcgcgcgg catcgatccg gcgctgggca cccgggtgct 180
gcacttgagc ggggcatttc acggccgcag cggctacacc ctgtcgctca ccagcaccaa 240
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tgccgtcaag tcgcggctca actcgacgtg gggcggaaac ctggtcgaca tggtgcgggc 720
ccggcgcatc ctggaggtga tcgaaaacga cgggctcttc gaacatgcgg cccggcaggg 780
ccaccacctg cgcgcccggc tcgacgagct tgcccaggag ttcccgggcc tggttctgga 840
tccgcgcggc cgggggctga tgtgtgcctt cagcctgccg accaccgcgg accgtgacga 900
cgtgatccgc cggttgtggc aacgcgcggt gatcgtgctg ccggccggtg acgacggggt 960
gcgcttccgt ccggcgttga ccgtcacgcg cgccgagatc gatgccgcga tcgccggtgt 1020
acgtgccgca ttgacggctg tgagacggct gtgacctagt cggacctagt cggacctagt 1080
cgcaccgttt acctgggctg accgcggggt atggaaacgt tgtactccgc gaacgcggga 1140
tttggggttc aggatgcaga aggcacgcga acgatcaccc ggtgaccgat tgggacagga 1200
cgacgccgag gttcgcgccg ccgtccggtt cgcagtcctg gccgccggcg ctggtgtggg 1260
gtttgtcatc atggcggcct tgtgggtcag cacgtgcggc ggcgcggccg tggacacggt 1320
ggcctgtggc ccaccggagc ggaccctgct ggccttcggc ggcccgctga tcctgttggc 1380
cggtggaatc tgggccttca tccgcaccta tcaggtgtgg cgcgcccgcg gtacctggtg 1440
gggatggcac ggcgccggat ggttcttgtt gacgctgatg gtggtggctg tgtccatggg 1500
cgtgcctccc atcgccggcc cggcactggc ggttagttgg ctctgacccc gccatcctgt 1560
cccgcgagtc cggccgctga cgagtgagaa cgaggaggag ccatggggga cacctaccgc 1620
gaccccgtcg accacctgca tacgacgcgg ccgctggccg gcgagtcact gatcgacgtg 1680
ctgcactggc cccgggtatc tgctggtggt ggccggggtt atcggcggtg tcggatctct 1740
tgccgccttc ggcaccgggc ataactccca gggcatggtc gccggtgtcg cggcgctcgt 1800
ggtcacggtg gccgggctgg tgtggctggc cgccgagcac cggcgggtgc gccgaatcgc 1860
cgagcggtgg tatgcggaac accccgaggt accgcgccaa cggctggcca gctagcagct 1920
tccggtgccg gctggcgcct cactgcaaaa aaccgggcga cggttttgtt ttacgggtgg 1980
cgccgacggg gtatcagttg tgaaccatga cgagtacggg ctttgccgcg tcggcgccgt 2040
caccccatca tcggggacag aatcacgaag gccccgacat agatcgctgc agcgatcgcg 2100
atcaacacca ccaaggtgat cccggcgatc accgcgatgc gccggagccg gcgcgtccgg 2160
attgtgtcgg tcacgtccgc ctcgtccatg gctggttgaa tacccggtgg cggccatgac 2220
caaccggtta gagcgcgcgg cccaaaacgg gcctccggga ggcgatcgga aagggaccga 2280
aatcgacagc caaatcggga cccaaatcag tagtagtagt gtcggtcaaa aattgccggg 2340
aggccacatg agcgatgccg acgcgcgtcc caacaggcac caacgcggcg accgcgccgt 2400
cgagctgaac gttgctgcgc gcttggagaa tctggcgatc ctgcgtaccc tggtcggcgc 2460
catcggcacc ttcgaagact tggatttcga cgcggtcgcc gacctgagac tggccgtcga 2520
cgaagtgtgt acccggctta tccgttccgc cacaccgaac gcgaccttga cgctggtggt 2580
cgacccgcgc gacgacgaac tcgtggtgga ggcgtccgcg atgtgcgaca cccacgacgt 2640
cgtggcaccg ggcagcttca gctggcatgt cctgacgtcg ctggccgacg acgtccagac 2700
tttccacgac ggtcgcatgc ccgacgccgc cggcagtgtg ttcggcattg tgttgacggc 2760
ccgacgggcg gccgctggca ggtgacgccg cgtgctgccg gcggttctgc ttcacggccc 2820
aacgaatacg ccgatgtccc ggagatgttt cgtgagttgg ccggttttga ccccgactca 2880
ccggatttcc agcgccaccg cgacaacatc gtggagcgct gcctgccgct ggccgatcac 2940
atcgcccggc ggttcgaggg acgcggcgaa ccccgcgacg acctgattca ggtcgcccgg 3000
gtcggactgg tcaacgcggt agtccgcttc gacgtcgaga ccgggtcgga cttcgtctcg 3060
ttcgccgtgc ccaccatcat gggggaagtc cggcggcact tccgggacaa cagttggtca 3120
gtcaaggttc ctcgccggct gaaggaacta cacctgcggt tgggcaccgc caccgccgag 3180
ttgtcgcagc ggctcggcag ggcacccacc gcaaccgaac ttgccgccga actcggtatg 3240
gaccgcggcg aggtcgtcga agggctggtg gcgggcagct cttacaacac actgtccatc 3300
gacagcggtg gtggtaacga agacgacgac gcccgtgcca tcgcggacac cctcggcgac 3360
atcgacgccg gcctggaccg gatcgaagat cgcgagtcgc tacgcccgtt gctcgaggcg 3420
ctgcccgagc gcgagcgaac ggtcttgatc ctcaggtttt tcgagtcgat gacgcagacc 3480
cagatcgccg agcgggtcgg catctcccag atgcacgtgt cccggctgct cgccaagtcg 3540
ctagcgcggc tccgcgacca gctcgagtag gcgcagatcg ccgtcggggg caccgttcac 3600
cgggttcacc ggctccatga ccggcagcgc gccgtcggga tcgcaaatct ccagtaaccg 3660
cgacacggcc cggctcggca ccatcgccca ctgggtgtcc gccgccgagc agaccacgtt 3720
gattcggtga agagcggaaa acccggcagt cccaataaat tccaggcgcc gtaggtccag 3780
ggtcagccac cggcaatacc tcacgcactg ctggacgtat ccggcgagct gatcggcgtt 3840
ggcggcgtcg agctcacctt ctacggtgac cacgccggcc gacggaccat agctggcagt 3900
gaagtcagcg gttccgcatt tctgccagga ttggatcaca gacaatcgtg gactccatcc 3960
atcgaacatt cgttggtgtc gaccacgtcg agtgtgcgct gtgcggctta cgcagggagt 4020
ttgcctccct cgcgaccctg acgcactgac aggacgtggc tccgggcggc tgtgaactca 4080
acctgttttg aggctacccg gcgggtgccg gggcgacaac gttctccgat ccgactcaga 4140
gaatcgctgg tcaggcaggg gttggcgcgg tgagcggcta cttgatctcg gccagcaccg 4200
ttccctgggt gatggcggcc ccggcttcga ccgccagccc ggtgatgacg ccgtccttat 4260
gcgcggtgac cgggttctcc atcttcatcg cctccaggac gaccacgagg tcgcccgtcg 4320
ccacttcctg cccttcttcg accgcgacct tcaccacggt gccctgcatg ggcgcggtaa 4380
cggcgtcgcc ggaggctgcc gcaccgctgt gggcgccacg cttgcgcggc ttgggcttgc 4440
gccggataac accgaccggg tcgcacccgc cgccgccgga cagtgcgagg tcggccggca 4500
gtgacacctc gacccggcgg ccgtcgacct cgacgaccac cttctgccgc ggccgggcgt 4560
cctcttcgtc gctcggctcg ctgccggtga agggttcgac ggtgttgttc cactcggtct 4620
cgatccagcg ggtgtgcacc gagaagccgt gctcgtcgcc gatgaatgcc gggtcggaca 4680
ccaccgcccg gtggaagggg atcaccgtcg ccagaccctc gacttcgaat tcggccagcg 4740
cgcggcgggc gcgggccagc gcctcggcac ggtcggcgcc gtgaacgatc agcttggcca 4800
gcatcgagtc gaactggccg ccaatcaccg agccggtctc gacgccggag tccatacgga 4860
cgcccgggcc cgcgggcggg tggaacttgg tcaccgggcc gggcgcgggc aggaagcccc 4920
gcccggcgtc ctcgccgttg atccggaact cgatggcgtg cccgcgcggg gtggggtcct 4980
cggtgatgtc gagcttgtcg ccgttggcga tcttgaactg ctgcagtacc aagtcgatgc 5040
cggcggtt 5048
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 22
acgagtgaga acgaggagga 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 23
atgttcggca taccaccgtt 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 24
tgagaacgag gaggagccat 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 25
tgttcggcat accaccgttc 20
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 26
ctgacgagtg agaacgagga g 21
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 27
gatccgacac cgccgataa 19
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 28
ttatcggcgg tgtcggatct 20
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 29
ttcggcatac caccgttcg 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 30
tcgctgacga gtgagaacg 19
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 31
gagatccgac accgccgata 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 32
tcgctgacga gtgagaacga 20
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 33
gtatgcaggt ggtcgacgg 19
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 34
tatcggcggt gtcggatctc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 35
gttcggcata ccaccgttcg 20
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 36
atgactccca gggcatggt 19
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 37
gatgttcggc ataccaccgt t 21
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 38
accggatgtc tgccgccgag cagacca 27
<210> 39
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 39
ttggcggcgt cgagctcacc ttccacggtg a 31
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探针
<400> 40
cagggagttt gccttcctgg cgaccctgac 30
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 标签
<400> 41
gacaacggag acagagccaa 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 标签
<400> 42
atgctaccgt atgcccagtg 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 标签
<400> 43
ttggctctgt ctccgttgtc 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 标签
<400> 44
cactgggcat acggtagcat 20

Claims (15)

1.一种引物组，其包含第1引物和第2引物，
所述第1引物包含多核苷酸，所述多核苷酸在3’末端包含与碱基序列A相同或同源的碱基序列A’，所述碱基序列A是堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA中的靶点区域的5’末端的部分碱基序列，所述靶点区域包含序列号1、9、11、13、15、2、10、12、14或16所示的第1碱基序列或与第1碱基序列互补的第2碱基序列的全部或一部分，
所述第2引物包含多核苷酸，所述多核苷酸在3’末端包含与碱基序列B的互补碱基序列相同或同源的碱基序列B’，所述碱基序列B是所述靶点区域的3’末端的部分碱基序列。
2.根据权利要求1所述的引物组，其中，碱基序列A及碱基序列B分别是连续的8碱基以上的部分碱基序列，且包含于序列号17、18、19、20或21所示的第4碱基序列、或与第4碱基序列互补的第5碱基序列。
3.根据权利要求1或2所述的引物组，其中，
第1引物包含(2f)在3’末端包含碱基序列2fb的40碱基以下的多核苷酸，所述碱基序列2fb是与序列号3、5或7所示的碱基序列相同或同源的碱基序列2fa中包含的连续的8碱基以上的碱基序列，
第2引物包含(2r)在3’末端包含碱基序列2rb的40碱基以下的多核苷酸，所述碱基序列2rb是与序列号4、6或8所示的碱基序列相同或同源的碱基序列2ra中包含的连续的8碱基以上的碱基序列。
4.根据权利要求1或2所述的引物组，其中，
第1引物包含(1f)在3’末端包含碱基序列1fb的40碱基以下的多核苷酸，所述碱基序列1fb是与序列号22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列相同或同源的碱基序列1fa中包含的连续的8碱基以上的碱基序列，
第2引物包含(1r)在3’末端包含碱基序列1rb的40碱基以下的多核苷酸，所述碱基序列1rb是与序列号23、25、27、29、31、33、35或37所示的碱基序列相同或同源的碱基序列1ra中包含的连续的8碱基以上的碱基序列。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的引物组，其中，
第1引物及第2引物中的一者还包含标识部，所述标识部是能够与标识物质结合的标签或标识物质，另一者还包含结合部，所述结合部是能够与固相载体结合的标签。
6.一种探针，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与第1碱基序列或第2碱基序列的部分碱基序列相同或同源的碱基序列，所述第1碱基序列是序列号1、9、11、13、15、2、10、12、14或16所示的碱基序列，所述第2碱基序列与第1碱基序列互补。
7.根据权利要求6所述的探针，其中，
所述多核苷酸是(2p)包含碱基序列2pb的多核苷酸，所述碱基序列2pb是与序列号38、39或40所示的碱基序列或其互补碱基序列相同或同源的碱基序列2pa中包含的连续的8碱基以上的碱基序列。
8.根据权利要求6或7所述的探针，其还包含标识部和/或结合部，
所述标识部是能够与标识物质结合的标签或标识物质，所述结合部是能够与固相载体结合的标签。
9.根据权利要求6或7所述的探针，其还包含连接于所述多核苷酸的5’末端的报告荧光色素、及连接于3’末端的淬灭剂色素。
10.用于检测堪萨斯分枝杆菌和/或来自堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸的试剂盒，其包含权利要求1～5中任一项所述的引物组。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其包含权利要求5所述的引物组、且还包含固相载体，所述固相载体至少在一部分包含能够与所述结合部结合的部分。
12.用于检测堪萨斯分枝杆菌和/或来自堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸的试剂盒，其包含权利要求6～9中任一项所述的探针。
13.一种检测试样中的堪萨斯分枝杆菌和/或来自堪萨斯分枝杆菌的多核苷酸的方法，该方法包括：
对试样中的包含第1碱基序列、第2碱基序列、或第3碱基序列的多核苷酸进行检测，所述第1碱基序列是序列号1、9、11、13、15、2、10、12、14或16所示的碱基序列，所述第2碱基序列与第1碱基序列互补，所述第3碱基序列是第1碱基序列或第2碱基序列中的任意T被取代为U的碱基序列。
14.根据权利要求13所述的方法，该方法包括：
以试样中的多核苷酸作为模板，使用权利要求1～5中任一项所述的引物组进行核酸扩增反应；以及
对通过核酸扩增反应扩增得到的多核苷酸片段进行检测。
15.根据权利要求13所述的方法，该方法包括：
在能够杂交的条件下，将试样中的多核苷酸、或者以试样中的多核苷酸作为模板进行核酸扩增反应而扩增得到的多核苷酸片段、与权利要求6～9中任一项所述的探针进行温育；以及
对所述多核苷酸或所述多核苷酸片段与所述探针的杂交进行检测。
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