JPH08510920A

JPH08510920A - Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを検出するための核酸プローブ

Info

Publication number: JPH08510920A
Application number: JP7519677A
Authority: JP
Inventors: シャー，ジョツナ
Original assignee: アモコ・コーポレーション
Priority date: 1994-01-21
Filing date: 1995-01-19
Publication date: 1996-11-19
Also published as: DE69527328D1; EP0690929B1; US5582978A; EP0690929A4; DE69527328T2; EP0690929A1; WO1995020055A1

Abstract

(57)【要約】ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにハイブリダイズする核酸およびこれらの核酸を用いて試料中のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの存在を検出する方法が記載される。図は、いくつかのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種の１６ＳｒＲＮＡの１６２から２１４および２３６から２８８の領域のヌクレオチド配列の図示である。

Description

【発明の詳細な説明】 HAEMOPHILUS INFLUENZAEを検出するための核酸プローブ本発明はHaemophilus influenzae菌種に属する細菌の検出に関する。発明の背景 Haemophilus属は、例えばBergey's Manual of Systematic Bacteriology（P.H .A．Sneath，ed.，1984，pp.558-569，Williams & Wilkins）において、その名前で分類されている細菌を含んでいる。Haemophilus属の細菌は、小型ないし中型のグラム陰性球杆菌もしくは杆菌であり、一般に幅が１μmより小さく、そして長さは様々で糸もしくはフィラメント状を形成し、顕著な多形性を示す。この細菌は、ヒトおよび種々の動物の粘膜の真正寄生体として存在する。多くの種、特に重要なことにHaemophilus influenzae、において皮膜IIカプセル）が存在し、そこで病因論的役割を果たす。大多数のHaemophilus influenzae株は、幾つかの生物化学的特徴に基づいて６種の生物学的亜種（biovar）（I-VI）のいずれかに帰属させることができ、そして皮膜のポリサッカライドに基づいて６種の血清学的亜種（serovar）（A-F）が見いだされている。さらに、Haemophilus aegypt iusは、Haemophilus influenzaeと同じ種であることが知られており（Casin et al.，Ann．Microbiol．（Paris）137B:155-163，1986）、そしてH．influenzae のもう一つの生物学的亜種であると考えられている（Bergey's Manual of Deter minative Biology，Hoft et al.，eds.，p.195，Williams & Wilkins）。 Haemophilus influenzaeタイプｂは、髄膜炎、喉頭蓋炎、関節炎、および幼児および小児にのみ生じる蜂巣炎などの侵襲性疾患の主要原因である。アメリカ合衆国においては、侵襲性Haemophilus influenzaeタイプｂ関連疾患の年間発症率は、５歳以下の小児100,000人当たり67〜129例であり、ヘモフィルス髄膜炎の年間発症率は小児100,000人当たり19〜69例である（Broom C.V.，Pediatry Infect Dis 779-782，1987）。Haemophilus influenzaeの生物学的亜種aegyptiusは、主に結膜炎の原因であり、そして或る株はブラジル紫斑熱（Brazillian purpuri c fever：BPF）の原因であり、これは10歳以下の小児の重篤な侵襲性疾患である（Brenner et al.，J．Clin，Microbiol．26:1524-1534，1988）。 H．influenzaeの迅速且つ正確な診断は、この病原体による種々の病気を治療するために重要である。しかしながら、既知の多くの診断方法は迅速でないか、または比較的特異性が低い。Haemophilus influenzaeの診断は、従来ミクロバクテリア法で行われていた。一般に、Haemophilusのコロニーは、７％炭酸ガス含有湿潤空気下37℃の条件で、選択チョコレート７％ウマ血液寒天プレート上でインキュベートしたとき、一夜経過後に出現する。Haemophilusのコロニーを、種および血清学的タイプの特定のため、グラム染色モルホロジー、オキシダーゼ反応、溶血活性、ポルフィリン試験、および成長因子ＸおよびＶの要求性などの生化学試験に付する。これらの技術は時間を要するため、多数の迅速血清学的方法が近年可能になった。その大多数は抗体を基礎とする試験方法であるが、多くは Haemophilus influenzaeの存在の決定的同定のために十分な特異性を有していない。したがって、本発明の目的は、採取した材料中に普通に存在する他の細菌または真菌の存在下に、試料中のHaemophilus influenzaeを特異的に同定することを可能ならしめる核酸プローブを提供することである。そのようなプローブは、 Haemophilus influenzae関連疾患の正確で迅速な診断を可能にし、従来の微生物学的技術に付随する多くの問題を避けるために、多くの安価な、使用しやすいアッセイシステムに使用できる。発明の概要一つの観点において、本発明は約１０ないし７０ヌクレオチドを含む単離された核酸に関し、この核酸は、通常のハイブリダイゼーション条件下で、Haemophi lus lnfluenzaeの16S rRNAまたはrDNAのヌクレオチド位置１８２〜１９３または２５２〜２７８で区切られる（bound）領域と、あるいはHaemophilus influenza eの23S rRNAまたはrDNAのヌクレオチド位置３４３〜３５６で区切られる領域と安定なハイブリダイゼーション二本鎖を形成する（Ｅ．ｃｏｌｉの番号付けシステムによる）。核酸の長さは、好ましくは２０ないし６０ヌクレオチド、最も好ましくは２５ないし５５ヌクレオチドであり、そして非Haemophilus生物のrRNA またはrDNAに比べてHaemophilus influenzaeのrRNAまたはrDNAに優先的にハイブリダイズすることができる。最も好ましくは、本発明の核酸は、非H．influenza e生物のrRNAまたはrDNAに比べてH．influenzaeのrRNAまたはrDNAに優先的にハイブリダイズすることができる。この観点の好ましい態様においては、本発明の核酸は、通常のハイブリダイゼーション条件下において、プローブ1546（配列番号:１）、プローブ1984（配列番号:５）、またはこれらのプローブのいずれかと相補的なヌクレオチド配列と、安定なハイブリダイゼーション二本鎖を形成する。本発明の核酸は、プローブ 1546（配列番号:１）またはプローブ1984（配列番号:５）と相同もしくは相補的な、好ましくは少なくとも１０、そしてより好ましくは少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含んでいる。もっとも好ましくは、本発明の核酸はプローブ15 46（配列番号:１）またはプローブ1984（配列番号:５）であるか、またはこれらのプローブのいずれかと相補的な核酸である。さらに、核酸は修飾および変更可能であり、したがって、本発明はプローブ1546（配列番号:１）またはプローブ1 984（配列番号:５）内の任意の１０、好ましくは任意の２０連続ヌクレオチドの少なくとも９０％に相補的もしくは相同であり、且つこれらの特定のプローブのハイブリダイゼーション特異性を有する核酸をも包含することを、当業者は容易に認識するであろう。本発明の他の観点においては、少なくとも二つの単離された核酸からなるセットに関し、ここで各核酸は１０ないし７０ヌクレオチドを有し、通常のハイブリダイゼーション条件下で、Haemophilus influenzaeの16S rRNAまたはrDNAのヌクレオチド位置１８２〜１９３または２５２〜２７８で区切られる領域と、あるいはHaemophilus influenzaeの23S rRNAまたはrDNAのヌクレオチド位置３０５または３１４または３４３〜３５６で区切られる領域と安定なハイブリダイゼーション二本鎖を形成する。該セットの各核酸の長さは、好ましくは２０ないし６０ヌクレオチドであり、最も好ましくは２５ないし５５ヌクレオチドである。セット内の核酸の一方が、非Haemophilus influenzae生物のrRNAまたはrDNAとも、通常のハイブリダイゼーション条件下で安定な二本鎖を形成する場合は、そのセットの第二の核酸は同じハイブリダイゼーション条件下で同じ非Haemophilus influe nzae生物のrRNAまたはrDNAと安定なハイブリダイゼーション二本鎖を形成しない。本発明のこの観点の好ましい態様においては、核酸のセットは、非Haemophilu s influenzae生物のrRNAまたはrDNAに比べてHaemophilus influenzaeのrRNAまたはrDNAに対して優先的にハイブリダイゼーションすることができる少なくとも一本の核酸を含む。最も好ましくは、セットの核酸の少なくとも一つは、実質上、プローブ1546（配列番号:１）、1547（配列番号:２）、1839（配列番号:３）、1 840（配列番号:４）、1984（配列番号:５）、23HI（配列番号:６）により規定される核酸配列、またはこれらのプローブのいずれかと相補的な核酸配列からなる。特に好ましいセットは、プローブ1546（配列番号:１）と1547（配列番号:２）；および1984（配列番号:５）と23HI（配列番号:６）を含むものである。さらに、当業者は、プローブ1546（配列番号:１）、1547（配列番号:２）、1839（配列番号:３）、1840（配列番号:４）、1984（配列番号:５）、23HI（配列番号:６）およびそれらに相補的な配列は、修飾および変更が可能であることを容易に認識するであろう。したがって、本発明の核酸のセットは、プローブ1546（配列番号 :１）、1547（配列番号:２）、1839（配列番号:３）、1840（配列番号:４）、19 84（配列番号:５）または23HI（配列番号:６）内の任意の１０、好ましくは任意の２０連続ヌクレオチドの少なくとも９０％と相補的もしくは相同であり、且つこれら特定のプローブのハイブリダイゼーション特異性を有する一つもしくはそれ以上の核酸を含むことができる。本発明はまた、試料中のHaemophilus influenzaeの存在を検出する方法にも関する。本発明の方法は、試料を本発明の核酸の少なくとも一つと、該核酸とHaem ophilus influenzaeのrRNAまたはrDNA（もし存在すれば）との間に核酸二本鎖が形成される通常のハイブリダイゼーション条件下で接触させ、次いで、この接触させた試料をモニターして核酸二本鎖の存在を検出し、二本鎖の存在を試料中に Haemophilus influenzaeが存在する指標とすることを含んでいる。二本鎖の検出は二本鎖分子を同定するための任意の標準的方法によってよい。好ましくは、本発明の核酸、またはHaemophilus influenzaeのrRNAまたはrDNAのいずれかを検出可能な化学成分で標識するが、そのような標識成分の非限定的例は、放射性アイソトープ、酵素、蛍光剤、沈着剤、および色素である。好ましい態様の一つでは、本発明の方法は、試料を、各々がHaemophilusinflu enzaeのrRNAまたはrDNAとハイブリダイゼーションすることが可能な少なくとも二つの核酸のセットと接触させることを含む。好ましいプローブのセットは、プローブ1546（配列番号:１）と1547（配列番号:２）；および1984（配列番号:５）と23HI（配列番号:６）を含むものである。当業者は、本発明の組成物を組み合わせて、Haemophilus influenzaeの検出用キットとすることが可能であることを容易に認識するであろう。典型的には、そのようなキットは本発明の核酸を含む試薬類と説明書および、Haemophilus infl uenzaeのアッセイの一部に用いるために適当なパッケージを含むであろう。本明細書で用いる「単離された核酸」という用語は、該核酸が由来する生物の天然に存在するゲノム中で直接両側に連続する核酸の両者とは直接つながっていない（即ち、共有結合していない）、核酸セグメントもしくはフラグメントを意味する。したがって、この用語は、例えばベクター（例えば、自己複製可能なウイルスまたはプラスミド）中に組み込まれた核酸、または他の核酸から独立して分離した分子として存在する核酸、例えば化学的手段または制限エンドヌクレアーゼ処理によって製造された核酸を包含する。本明細書中で、特定のヌクレオチド配列についての「実質的に−−−からなる」とは、当該特定の配列および、当該核酸配列がH．influenzaeのrRNAの特定領域と安定なハイブリダイゼーション二本鎖を形成することを妨げないように数ヌクレオチド（例えば２〜１０ヌクレオチド）当該配列に付加または除去したこと以外は当該第一の配列と同一である他の配列を意味する。本明細書中で、核酸に関して「相同」という場合は、二つの核酸の間のヌクレオチド配列の類似性を示す。ヌクレオチド配列が他の配列と同一なら、二つの配列は100％相同である。二つの核酸の間の相同性は、配列内の特定の位置で一致するヌクレオチド数の直接的関数であり、例えば二つの核酸の半数の位置が同じなら、それらの配列は50％相同である。したがって、「実質的に相同」とは、他方の配列と同一ではないがそれと同じハイブリダイゼーション特性を保持するに十分な同一性を維持しているヌクレオチド配列を意味する。「相補的（complementary）」という用語は、２本の核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡが、塩基対を形成してハイブリダイゼーション二重鎖または複合鎖と称される二本鎖の領域を生成することができる一連の連続したヌクレオチドを含んでいることを意味する。二重鎖は、ＲＮＡまたはＤＮＡ鎖上のヌクレオチドの配置のために、核酸の間に形成される；一定の塩基は相互に引き合って結合し、水素結合およびη−スタッキング（stacking）相互作用を通して塩基対を形成する。このようにして、ＤＮＡまたはＲＮＡの一方の鎖のアデニンは、向き合う相補的ＤＮＡ鎖中のチアミン、または向き合う相補的ＲＮＡ鎖中のウラシルと対になる。ＤＮＡまたはＲＮＡの一方の鎖中のグアニンは、向き合う相補鎖中のシトシンと対を形成する。そのようなハイブリダイゼーション二重鎖の形成は、条件（厳しさ（stringen cy）と称されることも多い）の調整によって非常に特異的に行うことができ、この条件下においては、二本鎖が実質的に若しくは完全に相補的である特定の配列の一定数のヌクレオチドを含まない場合には、２つの核酸間のハイブリダイゼーションが、安定な二重鎖、例えば所定の厳しさの条件下で二本鎖の領域を保持する二重鎖を形成しないように、上記のハイブリダイゼーションは行われる。したがって、本明細書中で使用される「優先的にハイブリダイズする」という語句は、通常のハイブリダイゼーション条件下で、第２の核酸（即ち、Haemophilus in fluenzae ｒＤＮＡまたはｒＲＮＡ）と結合して、この第２の核酸とともに安定な二重鎖を形成し、かつ、同一の通常のハイブリダイゼーション条件下で、本明細書中で記載するような他の核酸分子と安定な二重鎖を形成しない核酸のことを意味する。他に定義がなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術における当業者によって通常理解されるものと同一の意味を有する。本明細書中で言及される全ての文献は引用文献として本明細書中に取り込まれる。好ましい方法および材料の実施例を以下に記載する。本明細書中に記載した方法および材料と同等または均等であるものを本発明の実施または試験において使用することができることは当業者の理解するところであるから、これらの実施例は例示的なものにすぎず、限定することを意図するものではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかであろう。図面最初に図面について簡単に説明する。図１は、試験した複数の種からの１６ＳＲＮＡの領域１６２から２１４および２３６から２８８のヌクレオチド配列の記載である。H．influT＝H．influenz ae型の株；H．influA＝H．influenzaeＡ型；H．influG＝H．influenzaeＧ型；H ．aegyT＝H．aegyptius型の株；A．actY4＝A．actinomycemcomitans。プローブ１５４６、１８３９、１８４０、および１５４７も記載されている。ＲＮＡ配列は５’から３’に記述される。プローブ配列は３’から５’に記述される。コア領域は★によって境界をつけた。図２は、試験した複数の種からの２３ＳＲＮＡの領域２８０から３３５および３３５から３７２のヌクレオチド配列の記載である。H．influF＝H．influenz aeＥ型の株；H．；H．aegyT＝H．aegyptius型の株；H．pleur＝H．pleuropneumo ；H．parain＝H．parainfluenzaおよびA．actyno＝A．actinomycetemcomitans。プローブ２３ＨＩおよび１９８４も記載されている。ＲＮＡ配列は５’から３’ に記述される。プローブ配列は３’から５’に記述される。コア領域は★によって境界をつけた。詳細な説明細菌のリボソームは３つの異なるＲＮＡ分子を含み、これらは、少なくともEs cherichia coliでは、５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡおよび２３ＳｒＲＮＡと称されている。真核生物では、一般的には５Ｓ、１８Ｓ、２８Ｓおよび５．８Ｓと称される４つの異なるｒＲＮＡ種が存在している。これらの名称は、歴史的には、それらの沈降速度によって測定したＲＮＡ分子の大きさに関連する。しかしながら、実際には、リボソームＲＮＡ分子は生物間において大きさが実質的に変化している。それにも拘わらず、５Ｓ、１６Ｓ、および２３ＳｒＲＮＡは、Haemophilusを含む任意の細菌における相同ＲＮＡ分子のための一般的名称として通常使用されており、この慣習を本明細書中でも続ける。本発明のプローブは Haemophilus influenzaeの１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡ分子の特定の領域を標的としており、生物試料においてこの病原を検出するのに有用である。Ｉ．Haemophilus influenzae ｒＲＮＡ遺伝子のユニーク（unique）領域の同定本発明の核酸プローブは、Haemophilus influenzae ｒＲＮＡおよびｒＤＮＡの領域を、系統発生学的観察に基づく進化的に近い類縁からのｒＲＮＡおよびｒＤＮＡと比較することによって開発された。潜在的に核酸ハイブリダイゼーションプローブのための有用な標的部位となりうるHaemophilus influenzae ｒＲＮＡの領域を同定する第１段階として、Haemo philus influenzae、複数の他の種のHaemophilus、およびHaemophilusの近い類縁の１６ＳｒＲＮＡの完全ヌクレオチド配列を得て、そして複数の血清学的亜種のHaemophilus influenzae、他の種のHaemophilus、およびActinobacillus ac tinomycetecomitansからの“３００領域”（GutellおよびFox、１９８８、Nucle ic Acid Research，16 r175-r269）を通る２３ＳｒＲＮＡｓの部分配列決定を行った。ヌクレオチド配列は、ｒＲＮＡｓを特定する遺伝子をクローニング（Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Cold Spring Harbo r Laboratory，New York，pp545）して、配列決定（MaxamおよびGilbert，1977 ，P.N.A.S.，USA 74：560-564；Sanger et al.，1977，P.N.A.S.，USA 74：5463 -5467）することによって、および／または逆転写酵素を使用してｒＲＮＡ自体を直接配列決定（Lane et al.，1985，P.N.A.S.，USA 82：6955-6959）することにより、標準の実験室操作法によって決定した。次いで、Haemophilus influenzae ｒＲＮＡヌクレオチド配列を、他の入手可能なｒＲＮＡヌクレオチド配列、特に他の種のHaemophilusおよびActinobacillu s actinomycetemcomitansと比較した。本明細書中においては、Escherichia col i １６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡ配列を、問題のHaemophilus ｒＲＮＡｓ中の特定の相同領域を同定するための便宜的な基準として使用した。異なる血清型（serotypes）のHaemophilus influenzaeおよび他のHaemophilus の配列の比較により、異なる血清型のHaemophilus influenzaeにおいて、そして Haemophilus influenzaeとHaemophilus influenzae以外のものとの間で、そして Haemophilus influenzaeとHaemophilus以外の細菌との間で異なる配列の複数の領域の存在が明らかになった（図１および２）。II．プローブの作成統計的に特異性を得て、安定したハイブリダイゼーション生成物を得るためには、核酸プローブ中に少なくとも１０個のヌクレオチドが必要である。２５００ヌクレオチドまでの、より長い核酸がプローブとして提案されている。しかしながら、ミスマッチ配列を決定し優先的なハイブリダイゼーションを行うために、反応パラメーターを容易に調節し制御できるためには、現在のところ最大２５０ヌクレオチドが核酸プローブとしてほぼ最長の限界である。最大２５０ヌクレオチドはまた、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を生成するための現在最も使用されている合成法の最長限界でもある。好ましくは、有用なプローブは２０から７０の間のヌクレオチドを有する。Haemophilus influenzaeの血清学的亜種Ａ，Ｂ，およびＧまたはこれらの３つの型の全ての配列の相補配列に様々に対応する標的領域に対し、多くのプローブが設計された。 Haemophilus influenzaeに優先的にハイブリダイズする、長さ２８−４２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブを設計した。これらは、以下のように設計された：１）Haemophilus influenzaeまたはHaemophilusを他の細菌から区別するのに有用なヌクレオチド配列の相違を最大限利用する２）標的ｒＲＮＡ内の局部的な、およびプローブ相互間の両者の自己相補性の影響を最小限にする３）通常のハイブリダイゼーション条件下において、他の種に対するのと比較して、Haemophilus influenzae ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに対する特異的なハイブリダイゼーションを最大にするために、約１０から２５ヌクレオチドの”コア領域”を含む。特に、各プローブのコア領域のヌクレオチド配列は、他の種のｒＲＮＡとは最大数のヌクレオチドミスマッチを有する一方、プローブがHaemophilus influen zae ｒＲＮＡとハイブリダイズできるために充分な相補性を保持するように設計される。「ヌクレオチドミスマッチ」とは、プローブ中のヌクレオチドの位置が、通常は相補的な標的ＲＮＡまたはＤＮＡ中の対応する位置のヌクレオチドと塩基対を形成しないヌクレオチドで占められていることを意味する。ミスマッチの好ましいタイプとしては、ウラシル対ウラシル、アデニン対アデニン、グアニン対グアニン、シトシン対シトシンおよびチミン対チミンを含むが、アデニン対シトシン、ウラシル対シトシンおよびチミン対シトシンもまた使用できる。一本鎖プローブは、３８０−Ｂ合成機（Applied Biosystems，Foster City，C A）によるβ−シアノエチルホスホアミダイト化学を用いて調製した。リン酸基およびヌクレオチド塩基の脱保護は標準的な方法を用いて行い、オリゴヌクレオチドの粗混合物を逆相ＨＰＬＣによって精製した。このプローブ選択戦略により、試料中のHaemophilus influenzae細菌を同定するのに有用なプローブが多数得られた。プローブ１５４６（配列番号：１）、１５４７（配列番号：２）、１８３９（配列番号：３）および１８４０（配列番号：４）は１６ＳｒＲＮＡ配列から設計し、プローブ１９８４（配列番号：５）および２３ＨＩ（配列番号：６）は２３ＳｒＲＮＡ配列から設計した。プローブの配列を以下に示す。１６ＳｒＲＮＡ−標的プローブ：２３ＳｒＲＮＡ−標的プローブ： III．ハイブリダイゼーション条件一般にハイブリダイゼーション条件は、核酸二重鎖の塩基組成並びに２つの核酸の間のミスペアーのレベルおよび幾何学によって決定される。通常調節される反応パラメーターには、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度およびタイプ、存在する変性剤のタイプおよび濃度、並びにハイブリダイゼーションの温度が含まれる。一般に、ハイブリダイゼーションの条件がより厳しくなると、安定なハイブリッドを形成するためにはより長いプローブの方が好ましい。自然の結果として、ハイブリダイゼーションの行われる条件の厳しさは（例えば、行われる分析のタイプに基づいて）、採用される好ましいプローブのある種の特質を規定するであろう。当業者はこのような関係をよく理解しており、容易に操作できる（例えば、Ausebel et al．Current Protocols in Molecular Bi ology，John Wiley & sons，New York，1989 を参照のこと）。例えば、ある特定のプローブの適切なハイブリダイゼーション条件は、所望の二重鎖分子の融解温度（Ｔ_m）を基にして決定することができる。任意のＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴ_mは、Mein KothとWahlの等式：Ｔ_m＝81.5℃＋16.6(logM)＋0.41(%GC)−0.61(%form)−500／2 で概算でき、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについてはCaseyとDavidsonの等式：Ｔ_m=79.8℃＋18.5(logM)＋0.58(%GC)−11.8(%GC)²−0.56(%form)−820／2 ［式中、Ｍは一価陽イオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセントであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセントであり、Ｌは塩基対中のハイブリッド二重鎖の長さである］で概算できる。一般に、開示される特異的プローブについての通常のハイブリダイゼーション条件は、４２℃と６８℃の間の温度でプローブと標的配列との間の塩基対合を促進する高塩濃度でのハイブリダイゼーションを意味する。よく知られているように、特定のプローブの特異性はハイブリダイゼーション後の洗浄によって規定される。本発明の場合には、典型的には６０℃〜６８℃、ハイブリダイゼーション工程で使用する濃度の１０〜３０倍低いイオン濃度で洗浄を行う。上述した核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションの挙動は、使用するアッセイフォーマットにかなりの程度依存する。逆に、アッセイフォーマットが特定核酸のための最適な設計の特徴を規定するのである。例えば、本明細書に記載する特定のオリゴヌクレオチドの長さは、ドットブロットアッセイで使用するために最適化されたが、その他の標準的ハイブリダイゼーションアッセイでも使用できる。最適のプローブの長さが選択するハイブリダイゼーション条件の厳しさの関数であることは当業者によく知られたことであり、したがってプローブが本明細書で定義する「コア領域」と実質的に相同または相補的な配列を含む限り、これらの条件に応じてこれらのプローブの長さを変更しうる。また、２以上の核酸プローブからなるセットの場合には、すべてのプローブが、これらが用いられるいかなる特定のフォーマットにおいても矛盾しないように挙動することが望ましい。したがって、特定の核酸プローブの正確な長さは、使用しようとする特定の用途をある程度反映する。ＩＶ．プローブ挙動のハイブリダイゼーション分析配列を比較することにより、本発明の核酸プローブがHaemophilus influenzae またはその他のHaemophilus種、あるいはこれら両方を特異的に検出し、その他の細菌は検出しないという点で、種々の有用なハイブリダイゼーション特性を示すことが示唆された。プローブの包括性（inclusivity）挙動と同様に重要なのはその排他性（exclusivity）挙動、すなわちHaemophilus以外の細菌に対する反応性である。代表的Haemophilus influenzaeおよびHaemophilus以外の細菌に対する各種プローブの挙動をドットブロット法を用いるハイブリダイゼーション分析により測定した。本発明の個々のプローブの各々に対するハイブリダイゼーションデータを表１および表２に示すが、個々のプローブの合計であるハイブリダイゼーション挙動を示す有用なプローブの組み合わせ（セット）もこれらのデータから明瞭に予測されることに注意されたい。実施例１：プローブハイブリダイゼーション挙動のドットブロット分析公知の方法によるドットブロット分析では、標的ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡまたは標的核酸集団を、容易に入手できる市販されているこの目的用のニトロセルロース、ナイロン、またはその他の誘導化膜上に固定することを含む。ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをこのようなフィルター上に容易に固定し、次に本発明の核酸プローブと各種条件（すなわち厳しさ）でハイブリダイゼーションについて試験する。制御された条件下では、その核酸配列が標的配列と高い相補性をもつプローブは、低い相補性をもつプローブよりも高レベルのハイブリダイゼーションを示すであろう。精製ＲＮＡ０．１μｇ（Lane et al.，1985，P.N.A.S.，USA 82:6955-6959）、または記載の各生物由来の細胞をニトロセルロースフィルターにスポットした。オリゴヌクレオチドプローブを標準法を用いて放射性³²Ｐで末端標識した。ｒＲＮＡ標的へのハイブリダイゼーションを６０℃において１４〜１６時間行い（０．９ＭＮａＣｌ、０．１２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、６ｍＭＥＤＴＡ、０．１ＭＫＰＯ₄、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸、０．００２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ、および０．００２％ポリビニルピロリジンを含むハイブリダイゼーション溶液中）、次いで未結合プローブを除去するためにハイブリダイゼーション後の洗浄を６０℃で１５分、３回（０．０３ＭＮａＣｌ、０．００４ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．２ｍＭＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳ中）行ったところ、これは高レベルのプローブ特異性を生じるのに十分厳しいことが判明した。上述のハイブリダイゼーションと洗浄に次いで、ハイブリダイゼーションフィルターをＸ線フィルムに２枚の増感スクリーンとともに一晩露光し、シグナル強度を既知量の標的物質（ＲＮＡ）の対照スポットと比較して目視で評価した。４つの正記号（＋＋＋＋）で表すシグナルは高レベルのハイブリダイゼーションを示し、これを標準として用いた。この標準または対照レベルと比較して、２つの正記号（＋＋）はかなりのレベルのハイブリダイゼーションを示し、１つの正記号（＋）はわずかに検出できるレベルであり、負記号（−）はハイブリダイゼーションが検出されないことを示す。表１は、ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイにおけるHaemophilu s influenzaeの種々の血清型およびaegyptiusの生物学的亜種からの代表的サンプリングに対する好ましいプローブの包括性挙動を例示する。精製ＲＮＡまたは細胞を試験した。表１において「サイトドット（Ｃｙｔｏ−ｄｏｔｓ）」とは、ニトロセルロース上で標準的なＮａＯＨ処理により溶菌し、トリス緩衝液ｐＨ７．４で中和した細胞である。表２は、ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイにおける、好ましいプローブの、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ以外の細菌の代表的サンプリングに対する排他的挙動を例示する。これらのデータは、１６ＳｒＲＮＡ配列から誘導されるプローブについて、プローブ１５４６がHaemophilus influenza Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥ型に特異的にハイブリダイズし、試験したその他の株のいずれともハイブリダイズしないことを示す。プローブ１５４７は、すべてのHaemophilus influenza細菌並びにその他の幾つかのHaemophilusの種（Haemophilus aphrophilus，Haemophilus avium,Ha emophilus parainfluenzaの幾つかの単離物、およびHaemophilus segnis）にハイブリダイズする。プローブ１５４７は、Haemophilus属以外の菌（A.actinomyc etemcomitans，A.seminis，A.equli，A.suis,およびPasteurella種）にもハイブリダイズする。プローブ１８３９は、Haemophilus influenza Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｆ型およびA.actinomycetemcomitansにハイブリダイズする。更に、これらのデータは、２３ＳｒＲＮＡ配列から誘導されるプローブについて、プローブ１９８４は高度に特異的であり、専ら血清型Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，ＥおよびＦ並びにHaemophilus aegyptiusに対してのみ特異性があることを示す。これとは対照的に、プローブ２３Ｈ１は試料中の２３ＳｒＲＮＡの一般的な検出のためのプローブとして設計された。実施例２：二重プローブ液体ハイブリダイゼーションアッセイ本発明のプローブまたはその誘導物は種々のハイブリダイゼーションフォーマットに顕著な価値を有する。このようなフォーマットの一つは、二重プローブ・サンドイッチ型ハイブリダイゼーションアッセイフォーマット（例えば、米国特許第５，１４７，７７８号明細書に記載されているホモポリマー捕獲、二重プローブ、液体ハイブリダイゼーションフォーマット：本特許明細書を参照として本明細書に含める）であり、本実施例で使用する。一般に、このような用途では、オリゴヌクレオチドプローブを、その３′末端で修飾して、デオキシアデノシン（ｄＡ）残基の領域（約２０〜２００の残基の長さ）を含ませる。これは、（液体ハイブリダイゼーションに続いて）試料から標的ｒＲＮＡを、この目的に合わせてポリ−デオキシチミジン（ｄＴ）を用いて適当に誘導化した固体支持体（例えば、ビーズ、プラスチック表面、フイルター等）上に「捕獲」するのに使用し得る。第二のプローブは検出用プローブとして用い、これは標識（例えば、³²Ｐ、フルオレセイン、ビオチン等）により誘導化される。一般原則として、検出用プローブはオリゴヌクレオチド又はより長いＤＮＡ若しくはＲＮＡプローブでありうる。好ましくは、各プローブは目標の隣接領域に結合する。次いで、試料中の標的核酸の存在の検出は、固体表面上への検出用プローブの捕獲により示される。これは、標的核酸が試料中に存在する場合にのみ起こり得る。好適な捕獲用プローブの例は１５４６（配列番号：１）および１９８４（配列番号：５）である。好適な検出用プローブは１５４７および２３ＨＩである。好ましくは、プローブ１５４６（配列番号：１）をプローブ１５４７（配列番号：２）と共に使用し、プローブ１９８４（配列番号：５）をプローブ２３ＨＩ（配列番号：６）と共に使用する。その他の実施態様本発明の記述をHaemophilus influenzaeのｒＲＮＡ検出に言及して行ってきたが、本明細書に記載されるプローブおよび当該プローブに相補的なプローブはまた、１）リボソーム遺伝子のＰＣＲ増幅；２）ｒＲＮＡを特定する遺伝子（ＤＮＡ）の検出、および３）酵素Ｑ−ベータ・レプリカーゼにより増幅され得るＭＤＶ−１類似のｒＲＮＡへの組み入れにも有用であることが容易に了解され、従って、このようなプローブは既述したプローブと均等であるとみなすべきであり、本発明および請求の範囲の精神と範囲内に包含されるべきである。このように、好適な実施態様を例証し記載してきたが、本発明を変動および修正をすることができ、したがって、記載した厳密な詳細に制限されるべきでなく、以下の請求の範囲の記載内に入るような変更を包含すべきであることが了解される。

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に、通常のハイブリダイゼーション条件下でＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのヌクレオチド位置１８２から１９３または２５２から２７８で区切られる領域、またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ２３ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのヌクレオチド位置３４３から３５６で区切られる領域と安定なハイブリダイゼーション二重鎖を形成するが、同一のハイブリダイゼーション条件下でＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ以外の生物のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのいずれの領域とも安定なハイブリダイゼーション二重鎖を形成しない配列の、１０から７０ヌクレオチドからなる単離された核酸。２．実質的に、通常のハイブリダイゼーション条件下でＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのヌクレオチド位置１８２から１９３で区切られる領域、またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ２３ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのヌクレオチド位置３４３から３５６で区切られる領域と安定なハイブリダイゼーション二重鎖を形成するが、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ以外の生物のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのいずれの領域とも安定なハイブリダイゼーション二重鎖を形成しない配列の、１０から７０ヌクレオチドからなる単離された核酸。３．前記核酸が、通常のハイブリダイゼーション条件下で、プローブ１５４６（配列番号１）、プローブ１９８４（配列番号５）または前記番号のプローブの１つに相補的なヌクレオチド配列と安定なハイブリダイゼーション二重鎖を形成する、請求項２記載の核酸。４．前記核酸が、プローブ１５４６（配列番号１）、プローブ１９８４（配列番号５）または前記番号のプローブの１つに相補的な核酸である、請求項２記載の核酸。５．少なくとも２つの核酸を含む単離された核酸のセットであって、該核酸のそれぞれは１０から７０ヌクレオチド長であり、通常のハイブリダイゼーション条件下でＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのヌクレオチド位置１８２から１９３または２５２から２７８で区切られる領域、またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ２３ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのヌクレオチド位置３０５から３１４または３４３から３５６で区切られる領域と安定なハイブリダイゼーション二重鎖を形成することを特徴とする核酸。６．該核酸の１つが、通常のハイブリダイゼーション条件下で、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ以外の生物のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡとも安定なハイブリダイゼーション二重鎖を形成し、該核酸の第２のものが、同一のハイブリダイゼーション条件下で、前記Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ以外の生物のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡと安定なハイブリダイゼーション二重鎖を形成しない、請求項５記載の核酸のセット。７．少なくとも１つの請求項１記載の核酸を含む、請求項５記載のセット。８．少なくとも１つの請求項２記載の核酸を含む、請求項５記載のセット。９．少なくとも１つの請求項３記載の核酸を含む、請求項５記載のセット。１０．プローブ１５４６（配列番号１）および１５４７（配列番号２）を含む、請求項５記載のセット。１１．プローブ１９８４（配列番号５）および２３ＨＩ（配列番号６）を含む、請求項５記載のセット。１２．試料中のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの存在を検出する方法であって、ａ）試料を、少なくとも１つの請求項１記載の核酸と、前記核酸および存在する場合にはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの間のハイブリダイゼーション二重鎖の形成が可能でありかつ前記核酸がＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ以外の生物と安定な核酸二重鎖を形成させない通常のハイブリダイゼーション条件下で接触させ；そしてｂ）前記核酸と接触した試料をモニターして、前記二重鎖の存在を検出し、ここで前記二重鎖の存在は試料中のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの存在の指標となる、ことを含む方法。１３．前記核酸が、通常のハイブリダイゼーション条件下で、プローブ１５４６（配列番号１）、プローブ１９８４（配列番号５）または前記番号のプローブの１つに相補的な核酸と安定なハイブリダイゼーション二重鎖を形成する、請求項１２記載の方法。１４．前記核酸が、プローブ１５４６（配列番号１）、プローブ１９８４（配列番号５）または前記番号のプローブの１つに相補的な核酸である、請求項１２記載の方法。１５．試料中のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの存在を検出する方法であって、ａ）試料を、請求項５記載の核酸のセットと、前記核酸のそれぞれおよび存在する場合にはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの間のハイブリダイゼーション二重鎖の形成が可能である通常のハイブリダイゼーション条件下で接触させ；そしてｂ）前記二重鎖の存在について前記核酸のセットと接触した試料をモニターし、ここで前記二重鎖の存在は試料中のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの存在の指標となる、ことを含む方法。１６．前記セットが、プローブ１５４６（配列番号１）および１５４７（配列番号２）を含む、請求項１５記載の方法。１７．前記セットが、プローブ１９８４（配列番号５）および２３ＨＩ（配列番号６）を含む、請求項１５記載の方法。１８．請求項１記載の核酸を含む、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの存在を検出するためのキット。１９．請求項５記載の核酸のセットを含む、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの存在を検出するためのキット。