JPH11155589A

JPH11155589A - Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａｓｉｉの検出に潜在的に有効なＤＮＡ領域の同定

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Publication number: JPH11155589A
Application number: JP10267503A
Authority: JP
Inventors: James M Harris; ジェイムズ・エム・ハリス; Qimin You; キミン・ユー
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1997-09-25
Filing date: 1998-09-22
Publication date: 1999-06-15
Anticipated expiration: 2018-09-22
Also published as: JP4332240B2; CA2244937C; US6291176B1; EP0905259A1; US6013510A; CA2244937A1

Abstract

(57)【要約】【課題】微生物を検出及び／又は同定する方法及び核
酸配列に関し、特に、核酸の増殖及び核酸のハイブリッ
ド形成を用いたＭ・カンサシ(Mycobacterium kansasii)
を検出及び／又は同定する方法及び核酸配列を提供する
事である。【解決手段】本発明は、（ａ）マイコバクテリア・カ
ンサシのＫＡＴＳ２配列における少なくとも１０個の連
続的なヌクレオチドを含有する核酸プローブをマイコバ
クテリア・カンサシ核酸とハイブリダイズさせるステッ
プと、（ｂ）上記核酸プローブと前記マイコバクテリア
・カンサシ核酸とのハイブリダイゼーションを検出する
ステップとを含むマイコバクテリア・カンサシの検出方
法と、マイコバクテリア・カンサシのＫＡＴＳ２配列を
含有する分離されたＤＮＡまたはマイコバクテリア・カ
ンサシ核酸の検出用キットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は微生物を検出及び／
又は同定する方法及び核酸配列に関し、特に、核酸の増
殖及び核酸のハイブリッド形成を用いたＭ・カンサシ(M
ycobacterium kansasii)を検出及び／又は同定する方法
及び核酸配列に関する。

【０００２】

【従来の技術】マイコバクテリアは、抗酸性及び非運動
性のグラム陽性細菌の一属である。この属には、マイコ
バクテリウム・アフリカウム(Mycobacterium africanu
m)、Ｍ・アビウム(M.avium)、Ｍ・ボビス(M.bovis)、Ｍ
・ボビス−ＢＣＧ(M.bovis−BCG)、Ｍ・チェロナエ(M.
chelonae)、M. fortuitum、M. gordonae、M. intracell
ulare、M. kansasii（Ｍ・カンサシ）、M. leprae、M.
microti、M.scrofulaceum、M. paratuberculosis、M. t
uberculosisと言った多くの菌種を含む。これらのマイ
コバクテリアの一部は人及び動物のいずれにとっても病
原性であり、特にM. tuberculosisとM. leprae、M.bovi
s、である。その他のマイコバクテリア種は、一般的な
病原菌ではないが、しかし、免疫システムが損なわれた
人、例えば、ＡＩＤＳ患者にとっては日和見感染性を示
す。例えば、Ｍ・カンサシとM.avium、M. intracellula
reが、免疫システムが抑制され又は損なわれた人に対し
過酷な肺の病気を引き起こす原因となる。実際に、１９
５３年以降始めて、マイコバクテリアのよる感染ケース
の記録がアメリカで増加していて、その多くのケースは
エイズの流行と関係している。

【０００３】一般の実験室的マイコバクテリアの特定は
抗酸染色法及び有機体の培養に基づいて、生化学の分析
法に従って行う。マイコバクテリアの低成長及び長い一
生の結果、一般な技術をもって正確な実験室的マイコバ
クテリアの分析には約６週間がかかることになる。例え
ば、バックテックシステム（ＢＡＣＴＥＣ^TM（BectonDi
ckinson Microbiology Systems、通称ＭＤ））のような
自動培養システムでは、マイコバクテリアの同定時間を
１〜２週間に短縮できる。それにも関わらず、正確なマ
イコバクテリアの分析にかかる時間を１週間以内に、好
ましくは１日に、短縮するという技術上の要求が存在す
る。

【０００４】核酸塩基同定の分析方法、例えばサザンハ
イブリッド法では通常結果を出すには１日かからない。
マイコバクテリア同定のためのＰＣＲ塩基法は感度が高
く、通常数時間で結果を出せる。しかしながら、マイコ
バクテリアを同定するのに核酸塩基同定法を用いると、
通常ではいくつの欠点を伴う。これらの方法の多くは高
価であり、また、わずか数種のマイコバクテリアにしか
利用できなく、しかも、一回のサンプルテストでは一種
の菌しか決定できない。その上、核酸塩基同定法は、特
定のマイコバクテリウム属あるいはマイコバクテリアの
特定の種に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
又はプリマーの発生が要求する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】一般に実験室でのマイ
コバクテリア種Ｍ・カンサシの同定は、その成長の特性
及び生化学的テスト法による。Ｍ・カンサシの生化学上
の性質は、カタラーゼの産物、ウレアーゼ活性、TWEEN
？加水分解、硝酸還元、そして光発色性（すなわち、細
菌が光に露呈されると色素を生産する性質）を含む。い
くつか他のマイコバクテリア種もＭ・カンサシと同様な
生物化学的特性を示し、そして、Ｍ・カンサシの決定的
な同定は通常その発色性に依存していうる。通常、発色
性による決定には問題があり、それは純粋な有機培養を
要求し、また、その特性が変りやすく、主観的であり、
及びそれを確実に決定することが困難だからである。

【０００６】従来からのＭ・カンサシ分析法に付随する
問題を防止するために、種特異的ハイブリッド形成ある
いはＭ・カンサシ特異的なオリゴヌクレオチドプライマ
ーによる核酸増殖を用いる核酸塩基同定方法の開発が試
みられている。ホアンら(Z. H. Huang)は、Ｍ・カンサ
シのゲノムライブラリからＤＮＡプローブ（pMK1-9）を
公表している(J. Clin. Microbiol. 29, 2125 (199
1))。このＤＮＡプローブ（pMK1-9）は、Ｍ・カンサシ
のＤＮＡとの相補的ハイブリッドを形成できるが、他の
種のマイコバクテリアとも同様にハイブリッドを形成で
きる。更に、このプローブは遺伝子上明確なＭ・カンサ
シ種のサブグループの検出に失敗した。ホアンらは、pM
K1-9のヌクレオチド配列のみならず、どの遺伝子から検
出して同定したことも公表していない。

【０００７】B.C.ロスら(B.C.Ross)がＭ・カンサシの同
定にpMK1-9プローブ及びＭ・カンサシのｒＲＮＡ遺伝子
と特異的にハイブリッド結合する市販のＤＮＡプローブ
(ACCUPROBE^TM, GenProbe, San Diego,カリフォルニア
州)を用いることに注目した(J.Clin. Microbiol. 30, 2
930 (1992))。ロスらはpMK1-9プローブ及び市販のＤＮ
Ａプローブ(ACCU−PROBE^TM)のいずれとも相当数のＭ・
カンサシ株種を検出できなかったことを報告している。
トラトリら(Tortoli et al.)も同様にＭ・カンサシを検
出に市販のＤＮＡプローブ(ACCU−PROBE^TM)を用いる効
力を評価した(Eur.J Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1
3, 264 (1994))。その研究者らはACCU−PROBE^TMが１０
０％種特異的であり、他のマイコバクテリア種に対する
クロス反応を示さないが、実験中では、Ｍ・カンサシ株
の中の７３％しか検出することができず、それがいくつ
かの株の中での遺伝的な多様性の結果である可能性を見
いだした。

【０００８】Ｍ．ヤンら(M. Yang et al. )がＭ・カン
サシ特異的なＤＮＡハイブリッド形成プローブ(p6123)
をＭ・カンサシの臨床分離体から精製することができた
(J.Clin. Microbiol. 31, 2769 (1993))。このプローブ
(p6123)は実験に用いたすべてのＭ・カンサシ株に対し
てハイブリッド結合ができ、ロスらのＤＮＡプローブ
（pMK1-9）に反応しなかったサブグループをも含む。ス
ピアース（Spears）に与えられた米国特許第5,500,341
号は、p6123プローブから精製したＭ・カンサシ特異的
増殖プライマーを開示している。

【０００９】Ｂ．ボディングハウスら(B.Boddinghaus e
t al.)は、特異的に増殖し、マイコバクテリアＤＮＡに
ハイブリッド結合する、１６ＳのｒＲＮＡから精製分離
したマイコバクテリア属特異的オリゴヌクレオチドを開
示している(J. Clin. Microbiol. 28, 1751 (1990))。
Ｔ．ロガルら(T. Rogall et al.)は、１６ＳのｒＲＮＡ
遺伝子の一部のＰＣＲ増殖法とそれに続く直接の配列決
定により多様なマイコバクテリア種を識別した(J. Gen.
Microbiol. 136, 1915 (1990))。しかしながら、Ｍ・
カンサシとM.gastri（Ｍ・ガストリ）とは表現型上異な
る特性を有しても、それらの１６ＳのｒＲＮＡ遺伝子配
列が全く同じであるため、この方法ではＭ・カンサシを
Ｍ・ガストリから分離して識別することができなかっ
た。

【００１０】ヒューズら(Hughes et al.)は、１６Ｓの
ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法で増殖して制限酵素解析ある
いは直接サイクル配列法のいずれかにより、多様なマイ
コバクテリア種を識別した(J. Clin. Microbiol. 31, 3
216 (1993))。ヒューズらもまたこの方法ではＭ・カン
サシとＭ・ガストリとを区別することができないことを
発見した。キルシェナら(Kirschner et al.)も同様な結
果を報告している(J.Clin. Microbiol. 31, 2882 (199
3))。キルシェナらは、また光発色性テストを用いた特
徴な方法を核酸配列法に補ってやれば、Ｍ・カンサシと
Ｍ・ガストリとが分別することができることを報告して
いる。

【００１１】Ｍ．バネチョートら(M. Vaneechoutte et
al.)は、１６ＳのｒＲＮＡのＰＣＲ増殖法と増殖物の制
限分析法と併用することによって、Ｍ・カンサシを含め
た特異的なマイコバクテリア種を識別する方法を提供し
ている(J. Clin. Microbiol.31, 2061 (1993))。このテ
クニックによりＭ・カンサシの陽性同定に要する時間を
一日以内に押さえることができた。Ｍ．バネチョートら
は、このテクニックをもってＭ・ガストリの同定の可否
及びＭ・カンサシとＭ・ガストリとの分別の可否につき
なんの評価も示さなかった。よって、技術上において迅
速な、正確かつ好感度なＭ・カンサシを同定する方法に
対する要請が存在している。

【００１２】

【課題を解決する手段】本発明は、ハイブリッド結合及
び増殖アッセイによってＭ・カンサシ核酸の識別に用い
ることができる、Ｍ・カンサシゲノムの新しい同定フラ
グメントを提供する。第一態様では、本発明は以下の
（ａ）及び（ｂ）で構成するマイコバクテリウム・カン
サシを識別する方法を提供する。即ち、（ａ）核酸プロ
ーブに、特に、マイコバクテリウム・カンサシのＫＡＴ
Ｓ２配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含有
する核酸プローブにマイコバクテリウム・カンサシの核
酸をハイブリッド結合させ、及び、（ｂ）核酸プローブ
とマイコバクテリウム・カンサシの核酸とのハイブリダ
イゼーションを識別する。

【００１３】第二態様では、本発明は、（ａ）核酸プロ
ーブに、特に、マイコバクテリウム・カンサシのＫＡＴ
Ｓ２配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含有
する核酸プローブにマイコバクテリウム・カンサシの核
酸をハイブリッド結合させることと、（ｂ）核酸プロー
ブとマイコバクテリウム・カンサシの核酸とのハイブリ
ダイゼーションを識別することとを含んでいる種特異的
なマイコバクテリウム・カンサシを識別する方法を提供
する。

【００１４】第三態様では、本発明は、（ａ）バインド
するターゲットを含む増殖プライマーに、特に、マイコ
バクテリウム・カンサシのＫＡＴＳ２配列の少なくとも
１０個の連続ヌクレオチドを含有する配列に結合するタ
ーゲットを含む増殖プライマーにマイコバクテリウム・
カンサシの核酸をハイブリッド結合させることと、
（ｂ）マイコバクテリウム・カンサシの核酸を増殖する
ことと、（ｃ）増殖したマイコバクテリウム・カンサシ
の核酸を識別することとを含んでなるマイコバクテリウ
ム・カンサシを識別する方法を提供する。

【００１５】第四態様では、本発明は、（ａ）バインド
するターゲットを含む増殖プライマーに、特に、マイコ
バクテリウム・カンサシのＫＡＴＳ２配列の少なくとも
１０個の連続ヌクレオチドを含有する配列にバインドす
るターゲットを含む増殖プライマーにマイコバクテリウ
ム・カンサシの核酸をハイブリッド結合させることと、
（ｂ）マイコバクテリウム・カンサシの核酸を増殖する
ことと、（ｃ）増殖したマイコバクテリウム・カンサシ
の核酸を識別することとを含んでなる種特異的なマイコ
バクテリウム・カンサシを識別する方法を提供する。

【００１６】第五態様では、本発明は単離したマイコバ
クテリウム・カンサシのＫＡＴＳ２配列を含有するＤＮ
Ａを開示する。本発明は更に、ストリンジェントな条件
下、特に６０℃で０．３Ｍの塩化ナトリウム、０．０３
Ｍクエンナトリウム、０．１％のＳＤＳの洗浄ストリン
ジェンシーという条件下で、非マイコバクテリウムカン
サシ核酸とハイブリッドを形成しないオリゴヌクレオチ
ド、特に、マイコバクテリウム・カンサシのＫＡＴＳ２
配列における少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含
有するオリゴヌクレオチドを提供する。

【００１７】第六態様では、本発明は（ａ）本発明と一
致する新規なオリゴヌクレオチド、及び、（ｂ）マイコ
バクテリウムカンサシの核酸を検出するための方法に用
いるオリゴヌクレオチドで構成するマイコバクテリウム
・カンサシを識別するキットを提供する。更に、本発明
は、マイコバクテリウム・カンサシ核酸の種特異的な検
出用キットも開示している。本発明の以上及びその他の
態様は、以下の本発明の記載において更に詳しく述べ
る。

【００１８】本願において提示したヌクレオチド配列
は、左から右に５'から３'までの直鎖のみである。ま
た、本願発明においてのヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ−
ＩＵＢ生化学命名委員会の推奨された方式で表され、３
７Ｃ．Ｆ．Ｒ§１．８２２と確立した慣用名に一致す
る。

【００１９】遺伝子工学におけるクローン遺伝子の使用
と生産、組み替え型ＤＮＡ、ベクター、トランスフォー
ム宿主細胞、選択可能なマーカー、タンパク質、タンパ
ク質のフラグメントは当業者にとって常識なものであ
る。例えば、ベルら(Bell et al.)の米国特許第４，７
６１，３７１号の第６列第３行目から第９列の第６５行
目、クラークら(Clark et al.)の米国特許第４，８７
７，７２９号の４列第３８行目から第７列第６行目、シ
ェリングら(Schilling et al.)の米国特許４，９１２，
０３８号の第３列第２６行目から第１４列の第１２行
目、ワルナーら(Wallner et al.)の米国特許４，８７
９，２２４号の第６列第８行目から第８列の第５９行目
を参考にする。ここに引用したすべての米国特許がこれ
らの全体のままで本明細書の一部をなすものとして組み
込まれているものとする。

【００２０】本願発明に開示した、数多くの典型的又は
非典型的なＭ・カンサシ株からのＭ・カンサシＤＮＡの
ある部分の配列を“ＫＡＴＳ２"と呼ぶ。このＫＡＴＳ
２断片では典型的と非典型的なＭ・カンサシ株の間に配
列の高度な同一性を示している。本願に開示したいくつ
かのＫＡＴＳ２配列がＭ・カンサシの診断及び検出用の
方法を提供する。例えば、これらの配列を用いて、伝統
的なサザンあるいはドットブロットハイブリダイゼーシ
ョン用のハイブリダイゼーションプローブを設計し、あ
るいは、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Rea
ction (PCR)）、リガーゼ連鎖反応（Ligase Chain Reac
tion (LCR)）、ストランド置換増幅（Strand Displacem
ent Amplification (SDA)）、好熱性のストランド置換
増幅（Strand thermophilic Displacement Amplificati
on (tSDA)）用の増幅プライマーを設計することができ
る。

【００２１】本願に開示したＫＡＴＳ２配列は、配列番
号４と配列番号１０から配列番号１７として提供された
配列、及びそれらの補体を含む。典型的又は非典型的な
Ｍ・カンサシ株のいずれからのＫＡＴＳ２配列、特にこ
こに開示されたもの以外の配列も本願発明の一態様であ
る。更に、別の態様として、本願発明のＫＡＴＳ２配列
は、増幅産物（即ち、アンプリコン（amplicons））
や、Ｅ１Ｃ（配列番号５）とＥ３（配列番号９）のよう
な増幅プライマーを用いてテンプレートとしたＭ・カン
サシ核酸の増幅の結果物を含む。Ｍ・カンサシ株のいず
れからのＫＡＴＳ２配列、特にここに開示されたもの以
外の配列は、ここに与えられた配列番号４と配列番号１
０から配列番号１７の配列を有するＭ・カンサシのＫＡ
ＴＳ２部位の範囲内に見いだされた連続なＤＮＡセグメ
ントと一般には少なくとも７５％以上の相同性（そし
て、８０％、８５％、９０％あるいは９５％の相同性）
を保有し、また、以下に定義する高度にストリンジェン
トなの条件下で、Ｍ・カンサシ核酸とハイブリッド結合
できうる。

【００２２】本願発明のＫＡＴＳ２配列は、高度にスト
リンジェントな条件下でＭ・カンサシ核酸とハイブリッ
ド結合し、ここに特に開示したＫＡＴＳ２配列、特にこ
こに配列番号４と配列番号１０から配列番号１７の配列
として開示したＫＡＴＳ２配列と実質上相同である配列
を含む。この定義は自然な対立性的なＫＡＴＳ２配列中
の変異体を包含するものである。ここにおいて使用する
意味でヌクレオチド配列が「実質上の相同」であると
は、少なくとも７５％以上、特に８０％、８５％、９０
％あるいは９５％の相同性であることが好ましい。

【００２３】相同性のＤＮＡ配列とここで示すＤＮＡ配
列とのハイブリッド結合させるための高度にストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者によく
知られている。例えば、このような配列とここに開示し
たＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、２５％ホルム
アミド、5X SSC、5Xデンハート液、１００μｇ／ミリリ
ットルのＤＮＡ一本鎖、及び５％のデキストラン硫酸、
そして４２℃で１５分間２５％ホルムアミド、5X SSCの
洗浄で達成することができ、そして約６０％の相同性の
配列のハイブリダイゼーション許容される。よりストリ
ンジェントな条件は、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍ
のクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳによる６０
℃、さらには７０℃までの洗浄のストリンジェンシーに
よって与えられる。サムブルークらの分子クーロニング
の実験室マニュアル(SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLON
ING, A LABORATORY MANUAL (2d ed. 1989))を参照す
る。一般に、ここに開示するＫＡＴＳ２配列の調節的な
要素にハイブリッド結合するＫＡＴＳ２配列は少なくと
も７５％、８０％、８５％、９０％あるいは９５％ま
で、またはそれ以上の相同性を保有する。

【００２４】核酸ハイブリダイゼーションプローブは、
本願発明の一態様である。ここに用いる、“プローブ"
という用語はターゲットヌクレオチド配列とハイブリダ
イズして、その検出に有用なオリゴヌクレオチドを指
す。プライマーとは異なって、プローブはポリメラーゼ
によって延長されない。プローブは時に検出可能なラベ
ルと結合してターゲット配列とハイブリダイズした時に
それ自身の検出と捕捉を可能にして、ターゲット配列の
検出を可能にする。ここにいうハイブリダイゼーション
プローブの“ターゲット配列"とは、プローブが特定的
にバインドする核酸配列を意味する。

【００２５】ここに開示したプローブはＭ・カンサシの
核酸とハイブリダイズする。具体的には、本発明のプロ
ーブは、上記で定義したストリンジェントなな条件下、
本願で開示したＫＡＴＳ２配列の連続なヌクレオチドと
ハイブリダイズする。本発明のプローブは、本発明で開
示したＫＡＴＳ２配列を含有する連続的なヌクレオチ
ド、特に、配列番号４と配列番号１０から配列番号１７
の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％あ
るいは９５％まで、またはその以上の相同性を有する。
本発明の実施例によれば、このプローブはここで与えら
れた配列番号５から配列番号９及びそれらの相補的配列
を有する。ハイブリダイズするには核酸の完全な相同性
を要求しないが、本発明で特定して開示したプローブ配
列に対して、本発明で開示したＭ・カンサシプローブの
機能の喪失しないプローブ配列と実質的な相同性を保持
する程度に修飾を行うことがこの技術分野における当業
者にとっては明白である。相同性なあるいは部分的相同
性な核酸配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジ
ェンシーを増やすあるいは減らすによってハイブリダイ
ゼーション条件を調整して完成されることがこの技術分
野では周知である。

【００２６】核酸ハイブリダイゼーションプローブは適
当な長さであってよい。プローブの長さは特別な上限も
下限も設けていないが、ターゲットのＫＡＴＳ２核酸と
ハイブリダイズし、プローブとして有効な機能（例え
ば、検出を容易にする）を有するプローブの長さと同様
であればよい。少なくとも１０個の連続的な、上記で定
義したＭ・カンサシ配列のヌクレオチドを包含するプロ
ーブが本発明の具現化の一選択である。本発明のプロー
ブの長さは、５０、４０、３０、２０、１５あるいは１
０個、更にもっと短いヌクレオチドであっても構わな
い。同様に、プローブの長さは、２０、４０、５０、６
０、７５、１００あるいは２００個、更にもっと長いヌ
クレオチドであってもよい。プローブの長さの上限は選
択した特定なＫＡＴＳ２配列の長さである。例えば、Ｍ
・カンサシ株７１１のＫＡＴＳ２核酸に由来するプロー
ブ（図３の配列番号１１を参照）の長さは、３０９個の
ヌクレオチドである。しかしながら、便宜上一般的に、
プローブは１０〜２００個のヌクレオチドであり、特に
１２〜１００個のヌクレオチドが、更に１５〜１００ヌ
クレオチドが、もっとも１５〜７５個のヌクレオチドが
好ましい。

【００２７】本発明の好適な態様では、ヌクレオチドプ
ローブは上記したストリンジェントな条件下（例えば、
６０℃で、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸
ナトリウム、０．１％ＳＤＳの洗浄ストリンジェンシ
ー）ではマイコバクテリア以外のすべての属からの核酸
とハイブリダイズしないが、するとしても、マイコバク
テリア核酸をハイブリダイズして検出するプローブを用
いて同じ条件下で、非マイコバクテリアのハイブリダイ
ゼーションあるいは検出することが非現実であるように
無視できる程度のものである。本発明の更なる態様とし
て、このプローブはストリンジェントな条件下ではマイ
コバクテリア属のＭ・カンサシ及びＭ・ガストリ以外の
すべての核酸とハイブリダイズしないが、するとして
も、Ｍ・カンサシ及びＭ・ガストリ核酸をハイブリダイ
ズして検出するプローブを用いて同じ条件下で、非Ｍ・
カンサシ及び非Ｍ・ガストリのハイブリダイゼーション
あるいは検出することが非現実であるほど無視できる程
度のものである。本発明のさらなる態様として、このプ
ローブはストリンジェントな条件下ではＭ・ガストリ核
酸とハイブリダイズしないが、するとしても、Ｍ・カン
サシ核酸をハイブリダイズして検出するプローブを用い
て同じ条件下で、Ｍ・ガストリのハイブリダイゼーショ
ンあるいは検出することが非現実であるほど無視できる
程度のものである。本発明のもっとさらなる態様とし
て、このプローブは種特異性である。つまり、このプロ
ーブは、ストリンジェントな条件下ではＭ・カンサシか
らの核酸としかハイブリダイズすることができなく、ほ
かのマイコバクテリアあるいは非マイコバクテリア種か
らの核酸とハイブリダイズすることができないが、でき
るとしても、プローブがＭ・カンサシからの核酸とハイ
ブリダイズして検出する条件と同じくして、非マイコバ
クテリア種の核酸のハイブリダイゼーションあるいは検
出することが非現実であるほど無視できる程度のもので
ある。

【００２８】本発明の一つの態様は上述のような核酸プ
ローブを用いたＭ・カンサシの検出用方法である。本発
明のこの実施態様では、核酸プローブがＭ・カンサシと
ハイブリダイズし、そして、このプローブとＭ・カンサ
シ核酸との間のハイブリダイゼーションが検出される。
ハイブリダイゼーションがこの分野において周知ないず
れかの適当な方法で実施することができる。一般には、
ハイブリダイゼーションは高度なストリンジェンシーの
条件下で形成される。ハイブリダイゼーション条件を変
更して、ハイブリダイゼーションの程度の増加若しくは
減少、つまりハイブリダイゼーション特異性のレベル及
び非特異性結合のバックグランドレベルを変更できるこ
とは、分野の当業者にとっては明白である（例えば、ハ
イブリダイゼーションあるいは溶出液の塩濃度又は温度
を変更する）。

【００２９】同様に、プローブとＭ・カンサシ核酸間の
ハイブリダイゼーションの検出はこの分野の周知の方法
によって成し遂げることができる。このプローブにはプ
ローブとＭ・カンサシ核酸間のハイブリダイゼーション
を示す検出可能なラベルを含ませることが可能である。
このプローブの検出可能なラベル（標識）とは直接又は
間接的に検出されうる部分のことである。直接的な検出
ラベルの場合、プローブが放射線同位元素で修飾され、
オートラジオグラフィーで検出される。また、プローブ
が蛍光標識され、この分野における周知な蛍光検出法に
より、検出される。更に、プローブが自己検出可能な補
助的な試薬要求するラベルによって標識することによっ
て間接的に検出され得る。具体的な間接標識する方法
は、化学発光剤、識別のできる反応物を生じる酵素、及
び、ラベルされた特殊的にパートナーと結合（例えばハ
プテンがラベルされた抗体との結合）によって検出され
うるリガンド（例えば、ハプテン、抗体あるいは抗原）
の使用を含む。リガンドラベルがオリゴヌクレオチドプ
ローブ（即ち、キャプチャプローブ）固相キャプチャに
有用である。典型的なラベルは、例えば、ビオチン（ラ
ベルされたアビジンあるいはストレプトアビジンと結合
することにより検出可能性物質）と、西洋わさびペルオ
キシダーあるいはアルカリホスファターゼ（酵素基質の
添加により検出可能性物質）のような酵素を含む。ヌク
レオチドを標識する方法はこの分野において周知であ
る。

【００３０】本発明の好ましい実施態様は、種特異性な
核酸プローブを用いたＭ・カンサシを検出する方法であ
る。“Ｍ・カンサシ検出の種特異性な方法"によると
は、上述したようにプローブがＭ・カンサシ核酸とハイ
ブリダイズすると同様な条件下では、このプローブが非
Ｍ・カンサシ核酸とハイブリダイズしない上、それを検
出できないと言う意味合いである。特に、上述したよう
にプローブがＭ・カンサシ核酸とハイブリダイズするの
と同様な条件下では、このプローブがＭ・ガストリから
の核酸とハイブリダイズせず、そしてそれを検出できな
いが、ハイブリダイゼーションから見分けのできる程度
の最小限にＭ・カンサシ核酸とハイブリダイズする。更
に、上述したようにプローブがＭ・カンサシ核酸とハイ
ブリダイズすると同様な条件下では、このプローブは、
例えば、Rhodococcus rhodochrousandNocardia asteroi
des のようなＭ・カンサシと近い関係を有する別菌種
からの核酸ともハイブリダイズしない、あるいはそれら
を検出しない。別の態様として、“種特異性"の用語は
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、あるい
は、微生物の種類、又は、実質なオリゴヌクレオチドハ
イブリダイゼーションを伴わない関連種類のグループの
検出、あるいは、同じ属の他の菌種、又は、異なる属の
菌種の検出に適用する。特に、ここに使用された核酸プ
ローブを用いたＭ・カンサシの検出の種特異性方法は、
このプローブがストリンジェントな条件下でＭ・カンサ
シとハイブリダイズし、そして、それを検出することで
あり、このプローブがストリンジェントな条件下では、
特に、非マイコバクテリア種からの核酸、他の非マイコ
バクテリア種からの核酸、及び、例えば、Rhodococcus
rhodochrous andNocardia asteroides のようなＭ・カ
ンサシと近い関係を有する別菌種からの核酸のような非
Ｍ・カンサシ核酸とハイブリダイズしない上、それを検
出できないことであることを指す。

【００３１】本発明の他の態様は増幅プライマーであ
る。増幅プライマーは、標的配列とのハイブリダイゼー
ション後のオリゴヌクレオチドの延長により、あるい
は、標的配列とのハイブリダイゼーションと同時に隣接
する複数のオリゴヌクレオチドの結合により、標的配列
を増幅するためのオリゴヌクレオチドである。増幅反応
過程で得られる標的配列のコピーは“増幅産物"、“ア
ンプリマー(amplimers)"或いは“アンプリコン(amplico
ns)"と称される。延長産物とは、プライマーのハイブリ
ダイゼーション及びテンプレートとしての標的配列を用
いてポリメラーゼによるプライマーの延長によって合成
された標的配列のコピーをいう。

【００３２】ここにいう増幅プライマーの“標的配列"
とは、増幅プライマーと特異的に結合そして増幅する核
酸配列である。これらは増幅されるオリジナルな核酸配
列及びそれに相補的な第２のストランド、そして、増幅
反応過程において生成されたオリジナルな標的配列のコ
ピーのいずれかの一本鎖を含む。

【００３３】ＳＤＡ増幅プライマーは、標的結合配列、
制限エンドヌクレアーゼ及び末端配列を含む。この標的
結合配列はＳＤＡ増幅プライマーの３'末端にある。標
的配列の３'末端にハイブリダイズする。一般には、Ｓ
ＤＡ増幅プライマーの全長は約２０〜７５ヌクレオチド
であり、好ましいのが、２５〜５０ヌクレオチドであ
る。標的結合配列が特異的に増幅プライマーとのハイブ
リダイゼーションを寄与する。制限エンドヌクレアーゼ
用認識部位は標的結合配列の５'である。認識部位がヘ
ミ修飾(hemimodified)された時に、ＤＮＡ複合体の一本
鎖にニックを生じさせるための認識部位がG. Walkerら
によりProc. Nat'l Acad. Sci. USA89, 392(1992)、Nuc
l. Acids. Res.20, 1691 (1992)において紹介されてい
る。増幅プライマーの末端部位は制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位の５'側のヌクレオチドに含有される。ＳＤ
Ａの中で増幅プライマーの残りの部分が置換され、ニッ
クが生成された時、この末端と制限エンドヌクレアーゼ
認識部位の領域がポリメラーゼリプライミング（reprim
ing）部位として機能する。この端末のポリメラーゼリ
プライミング機能がＳＤＡ反応を維持し、そして、シン
グル標的分子からの複数のアンプリマーの合成を許容す
る。この末端部位はほとんどの場合では短い。その長さ
及び配列が、通常では決められていて、またこの末端部
位の安定なハイブリダイゼーションを形成させるように
選択及び修飾されていて、そして増幅プライマーにニッ
クが生じた後、標的に対する制限エンドヌクレアーゼの
認識部位の部分を以外に残される部分がほとんどない。
そこで、この末端部位通常では、標的結合配列或いは他
のプライマーのいずれかとハイブリダイズする配列が含
有しないという一つの考えがある。

【００３４】本願発明で開示したＫＡＴＳ２配列は制限
エンドヌクレアーゼBsoB1の認識部位を内部に含有す
る。図１及び図２により、BsoB1は一般的に好熱性のＳ
ＤＡ法(tSDA)用の制限ヌクレアーゼとして用いられる。
ＳＤＡ法或いはｔＳＤＡ法によるＫＡＴＳ２遺伝子の増
幅は、ＳＤＡ法において機能が一致するHincII,HindII,
Nci I, とFnu4H1、或いはｔＳＤＡ法において機能が一
致するBsrI,BstNI, BsmAIとBslIのような制限エンドヌ
クレアーゼを用いて成し遂げることができる。このよう
な制限エンドヌクレアーゼがこの分野の当業者にとって
は周知のものである。このことがG. WalkerらのProc. N
at'l. Acad. Sci. USA89, 392 (1992)ページ394と米国
特許第5,455,166号、及びヨーロッパー特許公報第 0 68
4 315 A1号を参照することで裏付けられる。特に、その
認識部位が好熱性制限エンドヌクレアーゼのためである
場合には、ｔＳＤＡ法が使用されることによって、より
高い増幅の特異性及び有効性が得られる。更に、この増
幅プライマーはＫＡＴＳ２配列内のBsoB1のの５'或いは
３' の両方とも直接に結合することにより標的配列と結
合ができ、よって、BsoB1の認識部位が増幅されない。
例えば、ＫＡＴＳ２配列の内在するBsoB1部位から３'末
端までの２５０塩基断片を、ＳＤＡ法或いはｔＳＤＡ法
により増幅することができる。図１の配列番号４を参
照。

【００３５】ここに、用いられる「パンバープライマ
ー」("bumper primer")或いは「外的プライマー」("ext
ernal primer")は、ＳＤＡ法或いはｔＳＤＡ法による増
幅反応中にプライマー延長産物を置換するために使用さ
れるプライマーである。このパンバープライマーは、増
幅プライマーの結合する標的配列の上流配列にハイブリ
ダイズし、パンバープライマーの延長鎖が下流にある増
幅プライマー及びその延長鎖を置換してしまう。Ｍ・カ
ンサシ或いはマイコバクテリア属にとって、ＳＤＡ法或
いはｔＳＤＡ法により増幅反応に使用されるパンバープ
ライマーが特異であることが常に必要とされるわけでは
ない。このパンバープライマーは、増幅プライマーから
上流の標的にハイブリダイズすることにより、パンバー
プライマーが延長され、それが増幅プライマー及びその
延長鎖を置換することしか要求されていない。従ってパ
ンバープライマーの配列は、あまり重要ではなく、パン
バープライマーが延長したとき増幅プライマーの延長鎖
を置換できるほど、増幅プライマーの結合部位に十分に
近い上流のどのような標的配列に由来するものであって
もよい。

【００３６】パンバープライマー配列が特異な標的配列
とハイブリダイズする限り、時にあるパンバープライマ
ー配列のミスマッチあるいはいくつかの非標的配列との
クロス−ハイブリダイゼーションは、一般に増幅効率に
は悪影響を与えない。本願発明の一実施例として、この
パンバープライマーはＫＡＴＳ２の少なくとも１０個の
連続配列或いはその補体である部分を含有するが、それ
は一般的に上記したプローブとサイズ上似ている。この
場合におけるパンバープライマーは増幅プライマー或い
はプローブの結合配列の標的として使用される。

【００３７】標的末端に特異の配列を要求しない（即
ち、ＰＣＲとＬＣＲ）増幅方法のため、通常では、この
増幅プライマーを標的と実質上結合できる配列のみで構
成することができる。増幅プライマーの中に特殊な配列
を要求する（即ち、自己持続性配列複製(Self-Sustaine
d Sequence Replication)用のＲＮＡポリメラーゼプロ
モータ(3SR; J. C. GuatelliらProc Natl. Acad. Sci.
USA87, 1874-78 (1990)）、核酸配列を基準とする増幅
（(NASBA; van der Vliet et al., J. General Microbi
ol.139, 2423-29 (1993)）、あるいは、転写に基づいた
増幅(transcription based amplification)（D. Y. Kwo
h et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA86, 1173-77
(1989)）のようなＳＤＡのほかの増幅方法用に、これら
の特異性配列が、標的結合配列のハイブリダイゼーショ
ンの特異性を変動することなくオリゴヌクレオチドの調
整のための通常の方法を用いて標的結合配列をリンクす
ることができる。

【００３８】従って、この分野の当業者にとっては、本
願発明のプライマーおよびプローブは、多くの場合、構
造上類似または同一である。プライマーとプローブとい
う用語は、オリゴヌクレオチドの機能を意味してうる。
オリゴヌクレオチドが標的配列とハイブリダイズし、そ
の標的配列を捕捉して検出できるならば、そのオリゴヌ
クレオチドがプローブとしての機能を有する。更に、同
じオリゴヌクレオチドが上記のように増幅に用いられる
ならば、そのオリゴヌクレオチドはプライマーとしての
機能も有する。

【００３９】本願発明におけるオリゴヌクレオチドプロ
ーブまたは増幅プライマーを調整するための適切な塩基
は、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル及びチミ
ンのような自然界に存在するヌクレオチド塩基、並びに
８−オキソーグアニン、６−メルカプトグアニン、４−
アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシエチ
ル）ウリジン、２'−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボ
キシメチルアミノ−メチル−２チオリジン（5-carboxym
ethylamino-methyl-2-thioridine）、５−カルボキシメ
チルアミノ−メチル−ウリジン、ジヒドロウリジン、
２'−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β，Ｄ−ガラクト
シルクエオシン（queosine）、２'−Ｏ−メチルグアノ
シン、イノシン、６Ｎ−イソペンテニルアデノシン、１
−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１
−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジ
メチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチル
グアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジ
ン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、
５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノ
メチル−２−チオウリジン、β，Ｄ−マンノシルクエオ
シン（β-D-mannosylqueosine）、５−メトキシカルボ
ニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチ
ルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９
−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６
−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−β−
Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチル−カ
ルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−
メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ウェブト
シキシン（wybutoxosine）、プソイドウリジン、クエオ
シン（queosine）、２−チオシチジン、５−メチル−２
−チオウリジン、２−チオウリジン、５−メチルウリジ
ン、（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イ
ル）カルバモイル）トレオニン、２'−Ｏ−メチル−５
−メチルウリジン、２'−Ｏ−メチルウリジン、ウェブ
トシン（wybutosine）、および３−（３−アミノ−３−
カルボキシプロピル）ウリジンのような自然界に存在し
ないあるいは「合成」されたヌクレオチド塩基から選択
することができる。いずれのオリゴヌクレオチドバック
ボーン、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ＲＮＡよりＤＮＡの方が好ま
しいが）、炭素環類のような修飾された糖、及びフッ素
化とメチル化のように２'置換基を含有する糖などを使
用することができる。このオリゴヌクレオチドでは、そ
の中に少なくとも一またはすべての内部ヌクレオチド架
橋リン酸塩残基が、メチルホスホン酸塩(methyl phosph
onates)、メチルホスホノチオ酸塩類(methyl phosphono
thioates)、ホスホロモルフォリン酸塩類(phosphoromor
pholidates)、ホスホロピペラジン酸塩(phosphoropiper
azidates)、ホスホラミダイト(phosphoramidates)（た
とえば、内在するヌクレオチドのりん酸基がすべてがこ
こ記載したように修飾される）のように修飾されたリン
酸塩類である。このオリゴヌクレオチドは、P. Nielsen
らがScience254, 1497-1500 (1991)で開示したように
「ペプチド核酸」でありうる。オリゴヌクレオチドプロ
ーブが、標的ＤＮＡ分子の配列の一部と結合できる部位
を少なくとも配列の一部として所有するすることが唯一
の要件である。

【００４０】本願発明に開示した増幅プライマーは、Ｍ
・カンサシ核酸とハイブリダイズする。一般的には、こ
のような配列が前記したようなストリンジェントな条件
下で、本発明で開示したＫＡＴＳ２配列の連続なヌクレ
オチドとハイブリダイズする。換言すれば、本発明のプ
ライマーは、ここで開示したＫＡＴＳ２配列に含まれ
る、特に配列番号４と配列番号１０から配列番号１７の
連続的なヌクレオチドに対して少なくとも７５％、８０
％、８５％、９０％あるいは９５％以上の相同性を保有
するものである。更なる本願発明の態様として、プライ
マーが本発明で開示した配列番号５から配列番号９、お
よびそれらの相補体のようなヌクレオチド配列を有す
る。核酸はハイブリダイズするのに完全な相同性を要求
しないので、この分野の当業者にとっては、本発明で特
に開示したプライマー配列は、Ｍ・カンサシの増幅プラ
イマーとしての機能を失わない程度に本発明で開示した
プライマー配列の実質的な相同性を保って修飾されうる
ことが明白である。ストリンジェンシーを増加あるいは
減少することで、ハイブリダイゼーションの条件を調整
することにより、相同または部分的に相同の核酸配列の
ハイブリダイゼーションが形成され得ることが当業者に
とって周知である（たとえば、ハイブリダイゼーション
の温度あるいは緩衝液の塩濃度を調整する）。

【００４１】増幅プライマーは適合した長さであれば、
任意である。それには特別の長短の限度は設けていな
く、標的ＫＡＳＴ２ＤＮＡとハイブリダイズし、有効に
増幅プライマーとして機能するプライマーの長さあれば
よい。本願発明の一態様として、前記のように、このプ
ライマーがＭ・カンサシのＫＡＴＳ２配列の少なくとも
１０個の連続ヌクレオチドを含有する。このプライマー
を50、40、30、20、15、あるいは10ヌクレオチド以下ま
で短くすることができる。同様に、このプライマーを2
0、 40、 50、 60、 75、100あるいは200以上に長くす
ることができる。

【００４２】本願発明の一態様として、このプライマー
はマイコバクテリア属中のいずれ他の属からの核酸と
も、前記したようなストリンジェントな条件下（例え
ば、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリ
ウム、０．１％のＳＤＳで、６０℃の洗浄ストリンジェ
ンシー）ではハイブリダイズ及び増幅が行われず、ま
た、増幅プライマーがマイコバクテリアからの核酸とハ
イブリダイズし、それを増幅及び検出する条件と同じ条
件下で、非マイコバクテリアのハイブリダイゼーショ
ン、増幅あるいは検出することが非現実であるように無
視できる程度のものである。本発明の更の態様として、
この増幅プライマーはストリンジェントな条件下ではマ
イコバクテリア属のＭ・カンサシ及びＭ・ガストリ以外
のすべて株の核酸とハイブリダイズ及び増幅しないが、
するとしても、Ｍ・カンサシ及びＭ・ガストリ核酸をハ
イブリダイズして、増幅及び検出する増幅プライマーを
用いて同じ条件下で、非Ｍ・カンサシ及び非Ｍ・ガスト
リのハイブリダイゼーション、増幅あるいは検出するこ
とが非現実であるほど無視できる程度のものである。本
発明のさらなる態様として、この増幅プライマーはスト
リンジェントな条件下ではＭ・ガストリ核酸とハイブリ
ダイズして増幅及び検出しないが、するとしても、Ｍ・
カンサシ核酸をハイブリダイズして増幅及び検出する増
幅プライマーを用いて同じ条件下で、Ｍ・ガストリのハ
イブリダイゼーション、増幅あるいは検出することが非
現実であるほど無視できる程度のものである。本発明の
もっとさらなる態様として、この増幅プライマーは種特
異性がある。つまり、これはストリンジェントな条件下
ではＭ・カンサシからの核酸としかハイブリダイズして
増幅することができなく、ほかのマイコバクテリアある
いは非マイコバクテリア種からの核酸とハイブリダイズ
して増幅することができないが、できるとしても、プロ
ーブがＭ・カンサシからの核酸とハイブリダイズして増
幅及び検出する条件と同じくして、非マイコバクテリア
種の核酸のハイブリダイゼーション、増幅あるいは検出
することが非現実であるほど無視できる程度のものであ
る。

【００４３】本発明の一つの態様は、標的バインド配列
を含有する増幅プライマーをＭ・カンサシ核酸とハイブ
リダイズすること、Ｍ・カンサシを増幅すること、増幅
されたＭ・カンサシを検出することとによりＭ・カンサ
シを検出する方法である。本発明の具体的態様として、
例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のように、増幅
がハイブリダイズされた増幅プライマーを延長すること
により達成され、そして、増幅産物あるいはアンプリコ
ンを得る。更に、別の具体的態様として、二つの増幅プ
ライマーがＭ・カンサシの核酸にハイブリダイズして延
長されていく。増幅反応はＰＣＲ、ＳＤＡ、ｔＳＤＡ法
に限らない延長反応を含むことを必要とする。

【００４４】増幅反応で使用する本願発明のプライマー
は、G. Walkerらが (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89,
392 (1992)、Nucl. Acids. Res.20, 1691 (1992))にお
いて開示しているように、チミンを取り込める。また、
それらが全体または一部的にＴＴＰの変わりに２'−デ
オキシウリジン−５'−三リン酸にすることにより、反
応中において、例えば、ヨーロッパ特許公報第0 624 64
3号にあるように、試薬、ピペット由来及び実験室での
以前の増幅反応から持ち越された増幅産物との交差混入
を減少することができる。デオキシウリジン（ｄＵ）が
増幅産物に取り込まれ、そして、それがウリジンＤＮＡ
グリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理で切除され得る。
これら基本なサイトが後の増幅反応において、混入する
増幅産物を増幅不可能にする。ＵＤＧが後の増幅を行う
前にＵＤＧ阻害剤より失活されることで、新たに形成さ
れた増幅産物からｄＵの切除を防止することができる。

【００４５】本願発明の別の態様において、増幅はＭ・
カンサシ核酸を２以上の増幅プライマーとハイブリダイ
ズし、それらのそれぞれの標的配列とハイブリダイズす
る時これらのプライマーが互いに隣接しているようにす
ることにより達成され、そしてハイブリダイズした増幅
プライマーを結合して、より長い増幅産物を生産する。

【００４６】増幅されたＭ・カンサシ核酸の存在を測定
することにより、Ｍ・カンサシ及びＭ・カンサシ核酸の
存在が検出される。増幅産物は、前記のようにラベルさ
れたプローブとハイブリダイゼーションにより検出する
ことができる。プローブが増幅の検出に使用された場
合、プローブは増幅プライマー間に横たわっている配列
とハイブリダイズするように選択される。ＬＣＲ法で増
幅を実施する場合に、両方のプライマーと重複し、そし
て結合していないプライマーを検出しないプローブが使
用され得る。また、増幅産物は、例えば、電気泳動法と
それに続くエチジウムブロミド染色で核酸種を可視化す
るといった方法で、それらの特徴的大きさにより検出さ
れる。これがＬＣＲ法のための増幅産物を検出する好ま
しい方法である。さらに、標識された増幅プライマーが
用いられる。更にまた、G. WalkerらがProc. Nat'l Aca
d. Sci. USA 89, 392 (1992); Nucl. Acids. Res.20,
1691 (1992)で記載したように、標識された増幅プライ
マー又は内部プローブが増幅産物の検出のために標的配
列（検出プライマー）の上に延長されるようにする。

【００４７】特殊な増幅産物を検出として使用される検
出方法の例は、米国特許第5,470,723号の記載のよう
に、ビオチンで標識したキャプチャプローブ（capture
probe）及び酵素結合検出プローブを用いることにより
増幅産物が検出される化学発光の方法を含む。標的配列
のアッセイ領域（即ち、２つ増幅プライマーの結合部位
の間）の異なる部位を２つプローブとハイブリダイゼー
ションした後、その結合体がストレプトアビジンがコー
ティングされたマイクロタイターのプレートに捕捉さ
れ、そして、化学発光のシグナルが展開されて発光検出
器により認識される。また、ヨーロッパ特許公報第0 67
8 582号の記載のように、シグナルプライマーが増幅反
応に含まれると増幅産物の検出を促進される。この方法
により、標識したセカンダリ増幅産物が標的増幅に依存
して増幅過程で生産され、そして結合したラベルの手段
により標的増幅表示として検出されうる。

【００４８】増幅プライマーを用いるＭ・カンサシの検
出の種特異的な方法は本願発明の一好ましい態様であ
る。“Ｍ・カンサシを検出する種特異的な方法"による
とは、前記のようにＭ・カンサシからの核酸とハイブリ
ダイズして増幅及び検出する条件と同じくして、前記の
ように増幅プライマーが非Ｍ・カンサシの核酸のハイブ
リダイゼーション、増幅あるいは検出しないことを意味
する。また、前記のようにＭ・カンサシ核酸とハイブリ
ダイズして増幅及び検出する条件と同じくして、増幅プ
ライマーがＭ・ガストリの核酸のハイブリダイゼーショ
ン、増幅あるいは検出しない。更に、上述したように増
幅プライマーがＭ・カンサシ核酸とハイブリダイズして
増幅及び検出する条件と同じくして、増幅プライマー
は、例えば、Rhodococcus rhodochrousやNocardia aste
roides のようなＭ・カンサシと近い関係を有する別菌
種からの核酸ともハイブリダイゼーション、増幅あるい
はそれらを検出しない。

【００４９】換言すれば、“種特異性"の用語は、微生
物の一種類あるいは関連のある種のグループをオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションし、それらを増幅
し、検出するが、異なる属の菌種あるいは同属の異なる
菌種において実質なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ
ーション、増幅、あるいは、検出ができないことを指す
（意味する）。特に、ここに使用された核酸増幅プライ
マーを用いたＭ・カンサシの検出の種特異的方法は、こ
の増幅プライマーがストリンジェントな条件下でＭ・カ
ンサシとハイブリダイズして増幅し、そしてそれを検出
するが、この増幅プライマーがストリンジェントな条件
下では、特に、非マイコバクテリア種からの核酸、他の
非マイコバクテリア種からの核酸、例えば、Rhodococcu
s rhodochrousやNocardia asteroidesのようなＭ・カン
サシと近い関係を有する菌種からの核酸、及びＭ・ガス
トリからの核酸のような非Ｍ・カンサシ核酸とハイブリ
ダイズや増幅せず、そしてそれを検出できないことを指
す。

【００５０】本願発明は、上に記載したような核酸プロ
ーブ、増幅プライマー、特に一組の増幅プライマーを含
んでなるＭ・カンサシ核酸を検出するためのキットをも
提供している。上に記載したような種特異的方法、Ｍ・
カンサシの検出用のプローブと増幅プライマーが好まし
い。このキットは更に、上に記載したような、増幅プラ
イマー又はオリゴヌクレオチド核酸を用いてＭ・カンサ
シ核酸を検出するための手段を含むことができる。好ま
しくは、Ｍ・カンサシのＫＡＴＳ２配列の少なくとも１
０個の連続ヌクレオチド、特に好ましいのは５０以下の
ヌクレオチドを含有してなるオリゴヌクレオチドプロー
ブあるいは増幅プライマーである。別の一態様として、
上に記載したように増幅プライマーは、標的結合配列に
加えて標的核酸の増幅用の配列を含む。このキットは更
に、ハイブリダイゼーションと増幅方法を遂行するため
の他のコンポーネント及び試薬（例えば、サザンハイブ
リダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーシ
ョン、ＰＣＲ、ＳＤＡ等及びその同類の方法）を含有で
きる。一実施例として、本願発明に従って、このキット
は少なくとも一対の増幅プライマーを含有することがで
きる。ハイブリダイゼーションを検出するには、ハイブ
リダイゼーション溶媒が２５％のホルムアミド、5X SS
C、 5Xのデンハート溶液、１００〓g/ml一本鎖ＤＮＡ、
そして、５％デキストラン硫酸塩、あるいはプローブハ
イブリダイゼーション用に有用な周知な試薬等をも含有
することができる。これに関しては、SAMBROOKらの「分
子クローニング、実験室マニュアル」（ MOLECULAR CLO
NING, A LABORATORY MANUAL ）(2d ed. 1989)を参照す
る。特に、一つ以上の周知な核酸増幅方法の使用に適切
な試薬をＭ・カンサシＫＡＴＳ２増幅プライマーに含ま
せることが可能である。このキットの複数のコンポーネ
ントを通常の容器の一緒にパッケージングすることがで
き、そして一般的にここに開示された方法の特殊な態様
を実施するため説明書をも含有する。上に記載したよう
に、検出方法用のコンポーネントには、例えば、第二の
プローブ、及び／又は標識検出を行うための試薬と手段
（例えば、放射能標識、酵素基質、抗体等）を任意にこ
のキットに追加することができる。

【００５１】本願発明に開示された方法、プローブ、増
幅プライマー及びキットはいずれのマイコバクテリアの
含まれると思われるようなサンプル中のＭ・カンサシを
検出するのに有用である。このサンプルは単離された核
酸、単離された微生物からなり、それらは臨床的なサン
プルであってもよい。一般的には、臨床的なサンプル
は、生物学的な液体あるいは組織の形（即ち、痰、気管
支の洗浄水、胃の洗浄水、血液、ミルク、リンパ液、皮
膚、あるいは軟組織）で提供される。人あるいは人でな
い動物のいずれにも感染するマイコバクテリアのよう
に、本願発明は人と動物（獣医）の診断手法に応用で
き、そして、サンプルは何れのソースからも獲得され得
る。

【００５２】

【実施例】以下の実施例は本願発明を例証するために提
示されるが、本願発明はこれらに限定されるものではな
い。ここに、使用される“ｍｌ"はミリリットルを、
“μｌ"はマイクロリットルを、“μＭ"はマイクロモル
を、“ｍＭ"はミリモルを、“ｍｇ"はミリグラムを、
“ｎｍ"はナノグラムを、“ｍｉｎ"は分を、“ｓｅｃ"
は秒を、そして、“ｗ／ｖ"は重量／体積を意味する。

【００５３】実施例１Ｍ・カンサシ特異的なＤＮＡフラグメント（ＫＡＴＳ
２）の単離典型的な（TMC1201）と非典型的（LCD724）なＭ・カン
サシ、及び非Ｍ・カンサシ株のM. tuberculosis (H37R
v)とM. avium (CDC33)とM. intracellulare (ATCC 1395
0)からの増幅産物のディファレンシャルディスプレイを
作成するには、任意にプライムされたポリメラーゼ連鎖
反応（ＡＰ−ＰＣＲ）が有用であった。AP-PCR用のプラ
イマーは5'-CGTCATGCTGAAGTCCCT-3'（配列番号１）であ
った。増幅反応が、１０ｍＭトリス−塩酸、５０ｍＭ塩
化カリウム、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、０．００
０１％（ｗ/ｖ）ゼラチン、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、
３．５μＭの各３２Ｐ標識されたプライマー、２．５ユ
ニットのTaqＤＮＡポリメラーゼ、及びテンプレートと
して各微生物からの１ngのゲノムのＤＮＡを含有するｐ
H８．３の５０マイクロリットル溶液で行われた。ＡＰ
−ＰＣＲ法がPerkinElmer Cetus温度サイクル（モデル
４８０）を用いて実施された。９５℃で３分間標的ＤＮ
Ａを変性させた後、９４℃で１分間、３７℃で２分間、
７２℃で２分間の増幅サイクルを４０回繰り返して増幅
が達成された。最後の増幅サイクルが完了後、サンプル
は７分間７２℃に加熱され、そして、４℃で一晩放置さ
れた。増幅産物が８％の変性アクリルアミドゲル（１０
０W）を用いた電気泳動により単離され、可視化され、
そしてオートラジオグラフィーにかけられた。

【００５４】一つの特異的なバンドが、典型的なまたは
非典型的なＭ・カンサシ株の双方に存在し、テストされ
たあらゆる非Ｍ・カンサシ株には存在しないことがわか
った。そのバンドを“ＫＡＴＳ２"と命名した。このＫ
ＡＴＳ２バンドがゲルから切除され、そして、そのＤＮ
Ａがアクリルアミドのスライスを１００マイクロリット
ルの蒸留した無菌な水で１５分間煮沸した後にＤＮＡの
エタノール沈殿より抽出された。抽出された５マイクロ
リットルのＤＮＡが、配列番号１を有するプライマーを
用いてＡＰ−ＰＣＲ法でＫＡＴＳ２バンドを再増幅する
のに用いられた。それが、上文の記載と同様に、９４℃
で１分、６０℃で２分、７２℃で２分のような増幅サイ
クルを３５回繰り返して反応が行われる。

【００５５】実施例２ＫＡＴＳ２Ｍ・カンサシＰＣＲ産物のクローニング再増幅された５０ｎｇのＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメント
は、製造者に提供された手順にしたがって、pCRII (イ
ンビトロゲン社製の製品、Carlsbad, カリフォルニア
州)にてクローニングされた。ONE SHOT？バクテリア細
胞(インビトロゲン社製の製品、Carlsbad, カリフォル
ニア州) がpCRII-KATS2ベクタにより形質転換されてい
た。形質転換バクテリアコロニーが白く、アンピシリン
／Ｘゲル（４０ｍｇ／ミリリットル）を含有する寒天に
成長することにより選ばれた。陽性なコロニーが採取さ
れ、２５ミリリットルのＬＢ培地に一晩３７℃で増幅さ
れた。プラスミドＤＮＡが、業者のインストラクション
に従って商業的に入手可能なプラスミド精製キット(Qia
gen Plasmid Midi Kit-25, Catalog # 12143; Qiagen,S
anta Clarita,カリフォルニア州)により分離された。単
離されたプラスミドＤＮＡの中のＫＡＴＳ２フラグメン
トの存在が、各陽性コロニーからのプラスミドをEcoRI
で切断したことによって立証された。EcoRIでの切断の
後、１％のアガロースゲルの電気泳動による分離で陽性
コロニーが適当な大きさのＤＮＡ挿入断片を含有したこ
とを確認したものである。

【００５６】実施例３ＫＡＴＳ２フラグメントを用いたサザンブロットハイブ
リダイゼーション M・カンサシからの核酸とＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメン
トとの特異的なハイブリダイゼーションが調べられた。
ＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメントが多くのＭ・カンサシ及
び非Ｍ・カンサシマイコバクテリアからのゲノムＤＮＡ
とハイブリダイズする。マイコバクテリア及び非マイコ
バクテリアの多くの菌種から７５０ｎｇのゲノムＤＮＡ
が変性され、ZETA-PROBE？のGT膜（Bio-Rad社製の製
品）の上にドットブロッティングにより固定された。Ｋ
ＡＴＳ２ＤＮＡフラグメントを含有するｐＣＲＩＩベク
タがEcoRIで切断され、ＫＡＴＳ２を含有する小さいな
ＤＮＡフラグメントが電気泳動により精製され、そして
ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット(Random Pr
imed DNA Labeling Kit) (Boehringer-Mannheim社製の
製品)を用いて３２Ｐで放射能標識された。３２Ｐ−Ｋ
ＡＴＳ２ＤＮＡフラグメントが、２Ｘハイブリダイゼー
ション溶媒(Gibco-BRL社製の製品)に多くのマイコバク
テリア及び非マイコバクテリアからのゲノムＤＮＡドッ
トブロットとハイブリダイズされ、そして６５℃で１８
時間培養された。ブロットが室温で２ＸＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳで洗浄され、そして、放射能標識のバックグラ
ンドレベルが十分に減少されるまで６５℃の０．１％の
ＳＤＳで洗浄された。その後にブロットが蒸留水で濯が
れ、分子ダイナミックホスホイメージシステム (Molecu
lar Dynamics World Headquarters、Sunnyvale社製の製
品、カリフォルニア州)を使って２時間露出された。露
出が分子ダイナミックス（Molecular Dynamics） (Sunn
yvale社製の製品, カリフォルニア州)より提供されたイ
メージクアント（ImageQuant V1.1）というソフトで、
そのホスホイメージシステムを使用して解析された。そ
のデータを表１にまとめた。ＫＡＴＳ２は、テストした
典型的あるいは非典型的なＭ・カンサシ株の両方の６種
類すべてとハイブリダイズした。また、１７種類の非Ｍ
・カンサシマイコバクテリア及び非マイコバクテリアの
すべてとハイブリダイズできなかったが、ただ、Ｍ・ガ
ストリがＫＡＴＳ２プローブと弱いクロス反応性を示し
た。

【００５７】

【表１】

【００５８】実施例４ＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメントの配列決定ｐＣＲＩＩベクタ中でクーロンされたＫＡＴＳ２ＤＮＡ
フラグメントがＴ７及びＳＰ６プライマー(Invitrogen
社製の製品、 T7 primer: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-
3'、配列番号２、SP6 primer: 5'-ATTTAGGTGACACTATA-
3',配列番号３)を使用して配列決定された。この配列情
報はＰＣＲでＫＡＴＳ２を増幅するのに使用するプライ
マーをデザインするのに有用である。Perkin Elmer Cet
us Model 480PCR machinにおいてABI Prism DNA Sequen
cing Kit (Perkin Elmer社製の製品)がＫＡＳＴ２の配
列決定サイクルに使用された。増幅サイクルが、９６℃
で３０秒、５０℃で１５秒、６０℃で4分を一サイクル
として、２５回行われた。その増幅産物が後に４℃で保
存された。その結果ＰＣＲの産物がApplied Biosystem
s, Inc. (Foster City社製の製品、カリフォルニア州)
により提供された手順に従って精製され、また、業者の
ガイドラインによりApplied Biosystems 373 DNA Seque
ncerで行った。

【００５９】ＫＡＴＳ２が図１（配列番号４）に示すよ
うな、独特な配列を有することが発見された。現在のGE
NEWORKS？データベースに寄託されたマイコバクテリア
配列がＫＡＴＳ２配列でスクリーンされたが、一致する
ものは同定されていなかった。BsoB1エンドヌクレアー
ゼのための制限部位がＫＡＴＳ２配列内に局在する。Ｋ
ＡＴＳ２特異なプライマーが、最初の配列決定結果を確
認するために、ＤＮＡ鎖の両方の５'と３'の双方からの
クローニングされたＫＡＴＳ２フラグメントを完全に再
配列決定に有用であった。これらのＫＡＴＳ２プライマ
ーは、E1C(5'-GTTGGCGTGGAGCTGTCT-3'、配列番号５)、I
4 (5'-TCCCTGGCTGCTCTTGAT-3'、配列番号６)、I5 (5'-A
TCAAGAGCAGCCAGGGA-3'、配列番号７)、I2 (5'-ACAACGTG
ATGAGGCAGAC-3'、配列番号８)、及び、E3 (5'-GGTGGAGA
TGGAGATGTT-3'、配列番号９)のように命名された。各プ
ライマーのための相補的なＫＡＴＳ２標的配列が図１に
示されている。プライマーI５、I2とE3が図１に示した
ＫＡＴＳ２ＤＮＡフラグメントに対する鎖と相補性を有
する。

【００６０】実施例５クロス反応性の研究テンプレートとして、Ｍ・カンサシ、多くのマイコバク
テリアと非マイコバクテリアの菌種からのゲノムＤＮＡ
を使用するＰＣＲ増幅用にＫＡＴＳ２ＰＣＲプライマー
セットＥ１Ｃ／Ｅ３が選択された。ＰＣＲ反応が、２０
ｎｇのＤＮＡテンプレート、０．２５ｍＭずつのdATP、
dTTP、dCTP、及びdGTP、1.5 mMのMg²⁺、 0.5〓Mのプラ
イマーE1C、0.5 〓Mのプライマー E3、 2.5ユニットのT
aq ポリメラーゼ、インビトロゲン社製のWax Beadを含
有する、全部で５０マクロリットルのインビトロゲン社
製のＰＣＲバッファー（60 mM トリス塩酸、15 mM (NH
4)2SO4、pH 8.5）において実施された。テンプレートＤ
ＮＡが９５℃で2分変性され、そして、９４℃で１分、
５４℃で２分、７２℃で2分を一サイクルとして３０回
の増幅サイクルにより増幅が行われた。そして、増幅産
物が４℃で一晩保存された。

【００６１】ＫＡＴＳ２プライマーによる増幅が、各Ｐ
ＣＲ増幅反応混合液１０マイクロリットルを取り出しア
ガロースゲルにおいて増幅産物の存在を判定するため
に、検出された。その結果を下の表２にまとめた。ＫＡ
ＴＳ２プライマーにより、テストした典型的と非典型的
の両方の１１種Ｍ・カンサシの株からのＤＮＡを増幅で
きた。但し、テストした１３種の非マイコバクテリア株
のうち、Ｍ・ガストリのみが陽性の結果を示した。

【００６２】

【表２】

【００６３】実施例６Ｍ・カンサシ株及びＭ・ガストリからのＰＣＲ産物間の
ＫＡＴＳ２配列の相同性ＫＡＴＳ２プライマーセットにより増幅した配列の一致
の程度を判定するために、実施例５から得たＰＣＲ増幅
産物を、業者のインストラクションに従ってQiagen's Q
iaex II キットを用いて精製した。各精製された増幅さ
れたＤＮＡフラグメントが、実施例４のように、複数の
プライマー（E1C、E3、I2、I4とI5）を用いて、サイク
ル配列決定用のテンプレートとして使用された。典型的
と非典型的なＭ・カンサシ株からのＫＡＴＳ２配列がそ
れぞれ図１（配列番号4）と図２（配列番号１０）に示
されている。

【００６４】増幅されたＰＣＲ産物（配列番号4と配列
番号１０から配列番号17）から入手した配列が図３のよ
うに整列され、典型的と非典型的なＭ・カンサシＫＡＴ
Ｓ２配列から一致する配列（配列番号１８）を導き出し
た。高いレベルの相同性（９１．６％）が典型的と非典
型的なＭ・カンサシ株間に存在し、但し、予想通りＫＡ
ＴＳ２プライマーで増幅されたＭ・ガストリフラグメン
ト（配列番号２０）とＭ・カンサシの部位間では実質な
同一（８６．１％）が認められた（図4）

【００６５】実施例７Ｍ・カンサシとハイブリダイゼーションするが、Ｍ・ガ
ストリとはクロス反応しないＫＡＴＳ２の反応結果図４の配列情報を、ＤＮＡ増幅とＤＮＡハイブリダイゼ
ーション反応の中にＭ・カンサシをＭ・ガストリから区
別する、Ｍ・カンサシに特異的なオリゴヌクレオチドを
生産するに使用する。Ｍ・カンサシとＭ・ガストリのＫ
ＡＴＳ２の９１から１００、１２０から１４０、そして
２５０から２７５のヌクレオチドの領域にある配列が高
いレベルの相違を示している。これらの領域が、高度に
ストリンジェントな条件（即ち、６０℃で、０．３Ｍの
塩化ナトリウム、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、０．
１％ＳＤＳの洗浄ストリンジェンシー）下でクロスハイ
ブリダイズを行わないオリゴヌクレオチドをデザインす
るのに使用される。Ｍ・カンサシに特異的なオリゴヌク
レオチドが、実施例３に記載のような条件下でハイブリ
ダイゼーションプローブとして、あるいは、実施例５に
記載のような条件下で増幅プライマーとして利用され、
Ｍ・カンサシを検出するが、Ｍ・ガストリ核酸とは実質
上ハイブリダイズ、増幅、検出しない。

【００６６】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> Harris, James M. You, Qimin <120> Identification of a DNA Region Potentially U
seful forthe Detection of Mycobacterium kansasii <130> P98852 <140> JP 1998-267503 <141> 1998-09-22 <150> US 08/937,580 <151> 1997-09-25 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 cgtcatgctg aagtccct 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 taatacgact cactataggg 20 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 atttaggtga cactata 17 <210> 4 <211> 309 <212> DNA <213> Mycobacterium kansasii <400> 4 tcaggtcatg gtcgccacag gcgatgcggc ccagccatgc gtcggccatc gacgggtcgg 60 cgtcggtggc ggcgacgaac tcgggtaacg cggccgctgg tccctggctg ctcttgaccg 120 ccatagctcg atcgaaatgc ctacgggcag tgagcaaatc acccatcgta tccaccatcc 180 tcgacagcgt ggtggtattc gtcccgaaag tgggacgtcc gcctcatgac gttgtgccgc 240 aacgttgatc gagtcactgt gtagcaatcg acatggtgac gggttcgagg ctgacgtaac 300 ggttctcgg 309 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 gttggcgtgg agctgtct 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 tccctggctg ctcttgat 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 atcaagagca gccaggga 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 acaacgtgat gaggcagac 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 9 ggtggagatg gagatgtt 18 <210> 10 <211> 309 <212> DNA <213> Mycobacterium kansasii <400> 10 tcaggtcatg gtcgccacag gcgatgcggc ccagccatgc gtcagccatc gacgggtcgg 60 cgtcggtggc ggcgacgaac tcgggtaacg cgggttctgg tccctggctg ctcttgatcg 120 ccatcgctcg atcgaaatgc ctacgggcag tgagcaaatc agccattgta tccaccatcc 180 tggacagcgt ggcggtaatc gttccgcaac ggggaagtct gcctcatcac gttgtggcgc 240 aacgttgatc gagtcacttc gtagcaatcg acatggtgac cggctcgaga ctgacgtaac 300 gattttcgg 309 <210> 11 <211> 309 <212> DNA <213> Mycobacterium kansasii <400> 11 tcaggtcatg gtcgccacag gcgatgcggc ccagccatgc gtcggccatc gacgggtcgg 60 cgtcggtggc ggcgacgaac tcgggtaacg cggccgctgg tccctggctg ctcttgaccg 120 ccatagctcg atcgaaatgc ctacgggcag tgagcaaatc acccatcgta tccaccatcc 180 tcgacagcgt ggtggtattc gtcccgaaag tgggacgtcc gcctcatgac gttgtgccgc 240 aacgttgatc gagtcactgt gtagcaatcg acatggtgac gggttcgagg ctgacgtaac 300 ggttctcgg 309 <210> 12 <211> 309 <212> DNA <213> Mycobacterium kansasii <400> 12 tcaggtcatg gtcgccacag gcgatgcggc ccagccatgc gtcggccatc gacgggtcgg 60 cgtcggtggc ggcgacgaac tcgggtaacg cggccgctgg tccctggctg ctcttgaccg 120 ccatagctcg atcgaaatgc ctacgggcag tgagcaaatc acccatcgta tccaccatcc 180 tcgacagcgt ggtggtattc gtcccgaaag tgggacgtcc gcctcatgac gttgtgccgc 240 aacgttgatc gagtcactgt gtagcaatcg acatggtgac gggttcgagg ctgacgtaac 300 ggttctcgg 309 <210> 13 <211> 309 <212> DNA <213> Mycobacterium kansasii <400> 13 tcaggtcatg gtcgccacag gcgatgcggc ccagccatgc gtcggccatc gacgggtcgg 60 cgtcggtggc ggcgacgaac tcgggtaacg cggccgctgg tccctggctg ctcttgaccg 120 ccatagctcg atcgaaatgc ctacgggcag tgagcaaatc acccatcgta tccaccatcc 180 tcgacagcgt ggtggtattc gtcccgaaag tgggacgtcc gcctcatgac gttgtgccgc 240 aacgttgatc gagtcactgt gtagcaatcg acatggtgac gggttcgagg ctgacgtaac 300 ggttctcgg 309 <210> 14 <211> 309 <212> DNA <213> Mycobacterium kansasii <400> 14 tcaggtcatg gtcgccacag gcgatgcggc ccagccatgc gtcggccatc gacgggtcgg 60 cgtcggtggc ggcgacgaac tcgggtaacg cggccgctgg tccctggctg ctcttgaccg 120 ccatagctcg atcgaaatgc ctacgggcag tgagcaaatc acccatcgta tccaccatcc 180 tcgacagcgt ggtggtattc gtcccgaaag tgggacgtcc gcctcatgac gttgtgccgc 240 aacgttgatc gagtcactgt gtagcaatcg acatggtgac gggttcgagg ctgacgtaac 300ggt
tctcgg 309 <210> 15 <211> 309 <212> DNA <213> Mycobacterium kansasii <400> 15 tcaggtcatg gtcgccacag gcgatgcggc ccagccatgc gtcggccatc gacgggtcgg 60 cgtcggtggc ggcgacgaac tcgggtaacg cggccgctgg tccctggctg ctcttgaccg 120 ccatagctcg atcgaaatgc ctacgggcag tgagcaaatc acccatcgta tccaccatcc 180 tcgacagcgt ggtggtattc gtcccgaaag tgggacgtcc gcctcatgac gttgtgccgc 240 aacgttgatc gagtcactgt gtagcaatcg acatggtgac gggttcgagg ctgacgtaac 300 ggttctcgg 309 <210> 16 <211> 309 <212> DNA <213> Mycobacterium kansasii/Strain 11792 <400> 16 tcaggtcatg gtcgccacag gcgatgcggc ccagccatgc gtcagccatc gacgggtcgg 60cgt
cggtggc ggcgacgaac tcgggtaacg cgggttctgg tccctggctg ctcttgatcg 120 ccatcgctcg atcgaaatgc ctacgggcag tgagcaaatc agccattgta tccaccatcc 180 tggacagcgt ggcggtaatc gttccgcaac ggggaagtct gcctcatcac gttgtggcgc 240 aacgttgatc gagtcacttc gtagcaatcg acatggtgac cggctcgaga ctgacgtaac 300 gattttcgg 309 <210> 17 <211> 309 <212> DNA <213> Mycobacterium kansasii/Strain 8246 <400> 17 tcaggtcatg gtcgccacag gcgatgcggc ccagccatgc gtcagccatc gacgggtcgg 60 cgtcggtggc ggcgacgaac tcgggtaacg cgggttctgg tccctggctg ctcttgatcg 120 ccatcgctcg atcgaaatgc ctacgggcag tgagcaaatc agccattgta tccaccatcc 180 tggacagcgt ggcggtaatc gttccgcaac ggggaagtct gcctcatcac gttgtggcgc 240 aacgttgatc gagtcacttc gtagcaatcg acatggtgac cggctcgaga ctgacgtaac 300 gattttcgg 309 <210> 18 <211> 309 <212> DNA <213> Mycobacterium kansasii <400> 18 tcaggtcatg gtcgccacag gcgatgcggc ccagccatgc gtcrgccatc gacgggtcgg 60 cgtcggtggc ggcgacgaac tcgggtaacg cggsykctgg tccctggctg ctcttgaycg 120 ccatmgctcg atcgaaatgc ctacgggcag tgagcaaatc asccatygta tccaccatcc 180 tsgacagcgt ggyggtawtc gtyccgmaas kgggamgtcy gcctcatsac gttgtgscgc 240aac
gttgatc gagtcactky gtagcaatcg acatggtgac sggytcgagr ctgacgtaac 300 grttytcgg 309 <210> 19 <211> 311 <212> DNA <213> Mycobacterium gastri and Mycobacterium kansa
sii <400> 19 tcaggttcrt ggttcgccac aggcgatgcg gcccagccat gcgtcrgcca tcgacgggtc 60 ggcgtcggtg gcggcgacga actcgggtaa cgcgksykct ggtcccwggc tgctcytgay 120 cgccatmsck cgrtcgaaat gcctacgggc agtgagcaaa tcasccatyg tatccaccat 180 cctsgacrgc gtggyggtrh tcgtyccgvm wskgsgamgy cygcctcats acgttgtgsc 240 gcaacgttga tcgagtcact kygyagcaat cgacatsgtg acsggytcga grctgacgta 300 acgrttytcg g 311 <210> 20 <211> 311 <212> DNA <213> Mycobacterium gastri <400> 20 tcaggttcgt ggttcgccac aggcgatgcg gcccagccat gcgtcagcca tcgacgggtc 60 ggcgtcggtg gcggcgacga actcgggtaa cgcgtccgct ggtcccaggc tgctcctgat 120 cgccatcccg cggtcgaaat gcctacgggc agtgagcaaa tcacccattg tatccaccat 180 cctcgacggc gtggcggtgc tcgtcccggc tgtgcgaagc ccgcctcatc acgttgtgcc 240 gcaacgttga tcgagtcact gcgcagcaat cgacatcgtg accggctcga ggctgacgta 300acg
gttctcg g 311

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の典型的なＭ・カンサシ株のＤＮＡゲノ
ムから、ＡＰ−ＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ二本鎖ＫＡＴ
Ｓ２ＤＮＡフラグメント（株１２０１配列番号４）中の
一本鎖の配列を表す図である。その配列が５'から３'の
方向に示されている。ＢｓｏＢ１認識部位（ＣＴＣＧＧ
Ｇ）がイタリックで示されている。ＫＡＴＳ２の特異プ
ライマーの所在部位（EIC：配列番号５、 E3：配列番号
９、I2：配列番号８、I4：配列番号６及びI5：配列番号
７）が指摘されている。E3、I2及びI5のプライマーは示
されたＤＮＡ鎖に対するもう一本ＤＮＡ鎖とハイブリッ
ド結合する。

【図２】本発明の非典型的なＭ・カンサシ株（株１４９
２、配列番号１０）からのＫＡＴＳ２部位一本鎖のＤＮ
Ａ配列を表す図である。ＢｓｏＢ１認識部位（ＣＴＣＧ
ＧＧ）がイタリックで示されている。プライマーは図１
の記載に指摘されたと同様である。

【図３】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株か
らのＫＡＴＳ２配列（配列番号４、配列番号１０から配
列番号１７）をＫＡＴＳ２のコンセンサス配列（先頭配
列、配列番号１８）を得るために整列させたものであ
る。１位から１００位までのヌクレオチドを表す図であ
る。以下図６までが３０９位までを順に並べたものであ
る。

【図４】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株か
らのＫＡＴＳ２配列を整列させて、ＫＡＴＳ２コンセン
サス配列を得るものである。１０１位から２００位まで
のヌクレオチドを表す図である。

【図５】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株か
らのＫＡＴＳ２配列を整列させて、ＫＡＴＳ２コンセン
サス配列を得るものである。２０１位から３００位等ま
でのヌクレオチドを表す図である。

【図６】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株か
らのＫＡＴＳ２配列を整列させて、ＫＡＴＳ２コンセン
サス配列を得るものである。３０１位から３０９位等ま
でのヌクレオチドを表す図である。

【図７】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株か
らのＫＡＴＳ２配列（配列番号４、配列番号１０から配
列番号１７）及びＭ・ガストリのＫＡＴＳ２配列（配列
番号２０）を整列させて、Ｍ・カンサシ株／Ｍ・ガスト
リのＫＡＴＳ２コンセンサス配列（先頭配列、配列番号
１９）を得るものである。１位から９８位、又は１位か
ら１００位までのヌクレオチドを表す図である。以下図
１０までが３０９位、３１１位までを順に並べたもので
ある。

【図８】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株か
らのＫＡＴＳ２配列及びＭ・ガストリのＫＡＴＳ２配列
を整列させて、Ｍ・カンサシ株／Ｍ・ガストリのＫＡＴ
Ｓ２コンセンサス配列を得るものである。９９位から１
９８位、又は１０１位から２００位までのヌクレオチド
を表す図である。

【図９】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株か
らのＫＡＴＳ２配列及びＭ・ガストリのＫＡＴＳ２配列
を整列させて、Ｍ・カンサシ株／Ｍ・ガストリのＫＡＴ
Ｓ２コンセンサス配列を得るものである。１９９位から
２９８位、又は２０１位から３００位までのヌクレオチ
ドを表す図である。

【図１０】本発明の典型的と非典型的なＭ・カンサシ株
からのＫＡＴＳ２配列及びＭ・ガストリのＫＡＴＳ２配
列を整列させて、Ｍ・カンサシ株／Ｍ・ガストリのＫＡ
ＴＳ２コンセンサス配列を得るものである。２９９位か
ら３０９位、又は３０１位から３１１位までのヌクレオ
チドを表す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ＢＥＣＴＯＮＤＲＩＶＥ，ＦＲＡＮＫＬＩＮＬＡＫＥＳ，ＮＥＷＪＥＲＳＥＹ 07417−1880，ＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳＯＦＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者キミン・ユーアメリカ合衆国メリーランド州21093，ルーサーヴィル，キャヴァン・ドライヴ 15

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）マイコバクテリア・カンサシのＫ
ＡＴＳ２配列における少なくとも１０個の連続的なヌク
レオチドを含有する核酸プローブをマイコバクテリア・
カンサシ核酸とハイブリダイズさせるステップと、（ｂ）上記核酸プローブと前記マイコバクテリア・カン
サシ核酸とのハイブリダイゼーションを検出するステッ
プと、を含むマイコバクテリア・カンサシの検出方法。
【請求項２】請求項１に記載されたマイコバクテリア
・カンサシのＫＡＴＳ２配列は、配列番号４から１７の
配列及びそれらの補体からなるグループから選択され
る、請求項１記載の方法。
【請求項３】（ａ）マイコバクテリア・カンサシのＫ
ＡＴＳ２配列における少なくとも１０個の連続的なヌク
レオチドを含有する標的結合配列を含む増幅プライマー
をマイコバクテリア・カンサシ核酸とハイブリダイズさ
せるステップと、（ｂ）上記マイコバクテリア・カンサシ核酸を増幅する
ステップと、（ｃ）増幅したマイコバクテリア・カンサシ核酸を検出
するステップと、を含むマイコバクテリア・カンサシの
検出方法
【請求項４】請求項３に記載されたマイコバクテリア
・カンサシのＫＡＴＳ２配列は、配列番号４から１７の
配列及びそれらの補体からなるグループから選択され
る、請求項３記載の方法。
【請求項５】第一及び第二の増幅プライマーを前記マ
イコバクテリア・カンサシのＫＡＴＳ２核酸とハイブリ
ダイズさせ、上記増幅ステップがハイブリダイズした最
初及び第二の増幅プライマーを結合して増幅産物を生産
することによって行う、請求項３記載の方法。
【請求項６】マイコバクテリア・カンサシのＫＡＴＳ
２配列を含有する分離されたＤＮＡ。
【請求項７】請求項６に記載された分離されたＤＮＡ
の少なくとも１０個の連続的なヌクレオチドを含有する
オリゴヌクレオチド。
【請求項８】請求項７に記載されたマイコバクテリア
・カンサシのＫＡＴＳ２配列は、配列番号４から配列番
号１８の配列及びそれらの補体である部分からなるグル
ープから選択される、請求項７記載のオリゴヌクレオチ
ド。
【請求項９】マイコバクテリア・カンサシのＫＡＴＳ
２配列における少なくとも１０個の連続的なヌクレオチ
ドを含有した分離されたオリゴヌクレオチドであって、
該オリゴヌクレオチドが、６０℃で０．０３Ｍのクエン
酸ナトリウム、０．３Ｍの塩化ナトリウム、０．１％Ｓ
ＤＳの洗浄ストリンジェンシーというストリンジェント
な条件下では、非マイコバクテリア・カンサシ核酸と実
質にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】（ａ）請求項７または９に記載された
オリゴヌクレオチドと、（ｂ）（ａ）記載されたオリゴヌクレオチドを用いて
前記マイコバクテリア・カンサシ核酸を検出するための
手段と、を含んでなるマイコバクテリア・カンサシ核酸
の検出用キット。