JPH07289299A - 核酸増幅の検出 - Google Patents
核酸増幅の検出Info
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- JPH07289299A JPH07289299A JP7092397A JP9239795A JPH07289299A JP H07289299 A JPH07289299 A JP H07289299A JP 7092397 A JP7092397 A JP 7092397A JP 9239795 A JP9239795 A JP 9239795A JP H07289299 A JPH07289299 A JP H07289299A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Abstract
(57)【要約】
【目的】 標的配列の増幅を示し、且つ標的配列の増幅
と組み合わせられる方法であって、鎖置換増幅（ＳＤ
Ａ）反応のプライマー伸長合成産物の検出、固定化また
は位置決めの方法を提供する。 【構成】 プライマー伸長合成産物は標的配列のＳＤＡ
に連続して生成される二次的な標的特異的ＤＮＡ産物で
あり、したがって、リアルタイムの標的配列の増幅の検
出および／または測定に用いられる。一般的には、標的
配列の増幅による干渉なしに二次増幅産物が形成される
場合、これら産物は増幅不可能であり不活性なままＳＤ
Ａ反応において残される。二次増幅産物はそれらの検
出、固定化および位置決めを促進するために特定の特徴
を含むようにデザインまたは修飾されてよい。
と組み合わせられる方法であって、鎖置換増幅（ＳＤ
Ａ）反応のプライマー伸長合成産物の検出、固定化また
は位置決めの方法を提供する。 【構成】 プライマー伸長合成産物は標的配列のＳＤＡ
に連続して生成される二次的な標的特異的ＤＮＡ産物で
あり、したがって、リアルタイムの標的配列の増幅の検
出および／または測定に用いられる。一般的には、標的
配列の増幅による干渉なしに二次増幅産物が形成される
場合、これら産物は増幅不可能であり不活性なままＳＤ
Ａ反応において残される。二次増幅産物はそれらの検
出、固定化および位置決めを促進するために特定の特徴
を含むようにデザインまたは修飾されてよい。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸標的配列の増幅を
検出および測定する方法に関する。
検出および測定する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】インビトロ核酸増幅技術は、少量の核酸の
検出および分析のための有力な手段を提供してきた。そ
のような方法の究極の感度は、感染性および遺伝的疾患
の診断、分析のための遺伝子の単離、および法律上の医
薬としての特定の核酸の検出のためのそれらの開発の企
画に通じてきた。核酸増幅技術は工程における温度要求
性により分類することができる。ポリメラーゼチェイン
リアクション（ＰＣＲ；サイキ（Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ）
ら、１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０−１
３５４）、ライゲーシチェインリアクション（ＬＣＲ；
ウー（Ｄ．Ｙ．Ｗｕ）ら、１９８９ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
４，５６０−５６９；バリンガー（Ｋ．Ｂａｒｒｉｎ
ｇｅｒ）ら、１９９０ Ｇｅｎｅ ８９，１１７−１２
２；バラニー（Ｆ．Ｂａｒａｎｙ）、１９９１ Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，１８
９−１９３）および転写に基づく増幅（コー（Ｄ．Ｙ．
Ｋｗｏｈ）ら、１９８９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３−１１７７）は、
温度の循環を必要とする。対照的に、鎖置換増幅（ＳＤ
Ａ；ウオーカー（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９２
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
９，３９２−３９６およびウオーカー（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌ
ｋｅｒ）ら、１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．
２０，１６９１−１６９６、両文献は引用により本明細
書の一部をなす）、自己維持配列複製（３ＳＲ；グアテ
リ（Ｊ．Ｃ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、１９９０ Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１８
７４−１８７８）およびＱβレプリカーゼシステム（リ
ザルディ（Ｐ．Ｍ．Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、１９８８ Ｂ
ｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１９７−１２０２）
のような方法は恒温反応である。さらに、ＰＣＴ国際公
開９０／１００６４および９１／０３５７３は核酸の恒
温反応のためのバクテリオファージファイ２９の複製オ
リジンの使用を記載する。
検出および分析のための有力な手段を提供してきた。そ
のような方法の究極の感度は、感染性および遺伝的疾患
の診断、分析のための遺伝子の単離、および法律上の医
薬としての特定の核酸の検出のためのそれらの開発の企
画に通じてきた。核酸増幅技術は工程における温度要求
性により分類することができる。ポリメラーゼチェイン
リアクション（ＰＣＲ；サイキ（Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ）
ら、１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０−１
３５４）、ライゲーシチェインリアクション（ＬＣＲ；
ウー（Ｄ．Ｙ．Ｗｕ）ら、１９８９ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
４，５６０−５６９；バリンガー（Ｋ．Ｂａｒｒｉｎ
ｇｅｒ）ら、１９９０ Ｇｅｎｅ ８９，１１７−１２
２；バラニー（Ｆ．Ｂａｒａｎｙ）、１９９１ Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，１８
９−１９３）および転写に基づく増幅（コー（Ｄ．Ｙ．
Ｋｗｏｈ）ら、１９８９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３−１１７７）は、
温度の循環を必要とする。対照的に、鎖置換増幅（ＳＤ
Ａ；ウオーカー（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９２
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
９，３９２−３９６およびウオーカー（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌ
ｋｅｒ）ら、１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．
２０，１６９１−１６９６、両文献は引用により本明細
書の一部をなす）、自己維持配列複製（３ＳＲ；グアテ
リ（Ｊ．Ｃ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、１９９０ Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１８
７４−１８７８）およびＱβレプリカーゼシステム（リ
ザルディ（Ｐ．Ｍ．Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、１９８８ Ｂ
ｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１９７−１２０２）
のような方法は恒温反応である。さらに、ＰＣＴ国際公
開９０／１００６４および９１／０３５７３は核酸の恒
温反応のためのバクテリオファージファイ２９の複製オ
リジンの使用を記載する。
【０００３】核酸増幅の検出および／または測定のため
のさまざまな方法が開発されてきた。ほとんどにおい
て、これらの方法はプライマーに基づくものであり、即
ち、プライマーを標的配列にハイブリダイズさせること
に依存し、幾つかの方法はプライマーの伸長合成を伴
う。ＰＣＲにおけるプライマーに基づく増幅核酸の検出
は、しばしば、増幅反応の間に増幅プライマーを増幅産
物（アンプリコン）に取り込むことに依存する。したが
って、ＰＣＲ増幅プライマーに処理された特徴は増幅産
物に現れ、そして増幅標的配列を検出するかまたは他の
手段による検出のためにアンプリコンを固定化するため
に用いられうる。例えば、シバネン（Ｓｙｖａｎｅｎ）
ら（１９８８ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１６，１１３２７−１１３３８）は、ビオチン化ＰＣ
Ｒ増幅プライマーを用いることによりビオチン含有増幅
産物を生成することを報告している。これらのアンプリ
コンは、次に、蛍光染料または他のリポーター基を含有
する第２プローブにハイブリダイズされうる。ハイブリ
ダイズした複合体は次に、ビオチン含有複合体の親和性
固定化により反応混合物の他の成分から選択的に単離さ
れ、そしてリポーター基の手段により検出される。ラオ
ンギアル（Ｌａｏｎｇｉａｒｕ）ら（１９９１欧州特許
出願第０ ４２０ ２６０号）は、ＰＣＲ増幅産物の検
出のための蛍光染料に結合したビオチン含有ＰＣＲ増幅
プライマーの同様な使用を記載している。プライマー含
有アンプリコンは大きさに基づいて伸長合成されなかっ
たプライマーから分離され、そして複数の増幅が２つの
増幅プライマーセット上の異なる蛍光染料を用いて検出
された。ケンプ（Ｋｅｍｐ）ら（１９８９ Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，２４２３
−２４２７；１９９０ ＰＣＴ特許出願国際公開番号９
０／０６３７４）は、１種の修飾された増幅プライマー
の取り込み、そして検出手段としての第２修飾増幅プラ
イマーの使用による増幅ＤＮＡの取得法を記載してい
る。ケンプの「取得プライマー」は、二本鎖ＤＮＡ結合
性蛋白質ＧＣＮ４のための認識配列の一本鎖形である
５’テイルを含む。ケンプの「検出プライマー」は、
５’末端にビオチンモイエティを含む。増幅された産物
は、取得プライマーを用いた増幅により生じた二本鎖Ｇ
ＣＮ４認識配列へ結合させることにより固定化される。
検出プライマーにより導入されたビオチンモイエティは
アビジン−パーオキシダーゼ複合体に結合されることに
より、固定化ＰＣＲ増幅産物の発色検出を提供する。ワ
ールベルグ（Ｗａｈｌｂｅｒｇ）ら（１９９０ Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，６５
６９−６５７３）は、１つのＰＣＲ増幅プライマーをビ
オチン化して他方に大腸菌ｌａｃオペレーター配列を含
ませる、同様の方法を報告している。二本鎖増幅産物
は、ストレプトアビジンに結合させて、ｌａｃリプレッ
サー−β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質を増幅により生
じた二本鎖ｌａｃオペレーターに結合させることにより
発色により検出される。ワールベルグらの方法は、二本
鎖結合蛋白質よりむしろビオチン−ストレプトアビジン
相互作用が増幅産物の固定化をもたらし、そして二本鎖
結合蛋白質は発色検出を提供する点において、ケンプら
の方法とは異なる。このことは、これら２つの方法が、
２つの増幅プライマー、即ちそれぞれことなる二本鎖結
合蛋白質の認識配列をコードする５’テイルを伴うプラ
イマーにより組み合わせることができた。増幅産物は、
次に、１つの二本鎖結合蛋白質に結合させて他方への結
合を検出することにより固定化できた。バリー（Ｃ．
Ａ．Ｖａｒｙ）（１９９２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ３８，６８７−６９４；１９９２ ＰＣ
Ｔ特許出願国際公開９２／１１３９０）は、他の二本鎖
アンプリコンに取り込まれた場合に第３のオリゴヌクレ
オチドのためのハイブリダイゼーション部位を形成する
５’テイルを含む増幅プライマーの使用を記載してい
る。１つのテイルのハイブリダイゼーションを用いて増
幅産物を取得し、そして他方を用いて、蛍光染料へ結合
させたプローブへのハイブリダイゼーションにより検出
した。
のさまざまな方法が開発されてきた。ほとんどにおい
て、これらの方法はプライマーに基づくものであり、即
ち、プライマーを標的配列にハイブリダイズさせること
に依存し、幾つかの方法はプライマーの伸長合成を伴
う。ＰＣＲにおけるプライマーに基づく増幅核酸の検出
は、しばしば、増幅反応の間に増幅プライマーを増幅産
物（アンプリコン）に取り込むことに依存する。したが
って、ＰＣＲ増幅プライマーに処理された特徴は増幅産
物に現れ、そして増幅標的配列を検出するかまたは他の
手段による検出のためにアンプリコンを固定化するため
に用いられうる。例えば、シバネン（Ｓｙｖａｎｅｎ）
ら（１９８８ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１６，１１３２７−１１３３８）は、ビオチン化ＰＣ
Ｒ増幅プライマーを用いることによりビオチン含有増幅
産物を生成することを報告している。これらのアンプリ
コンは、次に、蛍光染料または他のリポーター基を含有
する第２プローブにハイブリダイズされうる。ハイブリ
ダイズした複合体は次に、ビオチン含有複合体の親和性
固定化により反応混合物の他の成分から選択的に単離さ
れ、そしてリポーター基の手段により検出される。ラオ
ンギアル（Ｌａｏｎｇｉａｒｕ）ら（１９９１欧州特許
出願第０ ４２０ ２６０号）は、ＰＣＲ増幅産物の検
出のための蛍光染料に結合したビオチン含有ＰＣＲ増幅
プライマーの同様な使用を記載している。プライマー含
有アンプリコンは大きさに基づいて伸長合成されなかっ
たプライマーから分離され、そして複数の増幅が２つの
増幅プライマーセット上の異なる蛍光染料を用いて検出
された。ケンプ（Ｋｅｍｐ）ら（１９８９ Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，２４２３
−２４２７；１９９０ ＰＣＴ特許出願国際公開番号９
０／０６３７４）は、１種の修飾された増幅プライマー
の取り込み、そして検出手段としての第２修飾増幅プラ
イマーの使用による増幅ＤＮＡの取得法を記載してい
る。ケンプの「取得プライマー」は、二本鎖ＤＮＡ結合
性蛋白質ＧＣＮ４のための認識配列の一本鎖形である
５’テイルを含む。ケンプの「検出プライマー」は、
５’末端にビオチンモイエティを含む。増幅された産物
は、取得プライマーを用いた増幅により生じた二本鎖Ｇ
ＣＮ４認識配列へ結合させることにより固定化される。
検出プライマーにより導入されたビオチンモイエティは
アビジン−パーオキシダーゼ複合体に結合されることに
より、固定化ＰＣＲ増幅産物の発色検出を提供する。ワ
ールベルグ（Ｗａｈｌｂｅｒｇ）ら（１９９０ Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，６５
６９−６５７３）は、１つのＰＣＲ増幅プライマーをビ
オチン化して他方に大腸菌ｌａｃオペレーター配列を含
ませる、同様の方法を報告している。二本鎖増幅産物
は、ストレプトアビジンに結合させて、ｌａｃリプレッ
サー−β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質を増幅により生
じた二本鎖ｌａｃオペレーターに結合させることにより
発色により検出される。ワールベルグらの方法は、二本
鎖結合蛋白質よりむしろビオチン−ストレプトアビジン
相互作用が増幅産物の固定化をもたらし、そして二本鎖
結合蛋白質は発色検出を提供する点において、ケンプら
の方法とは異なる。このことは、これら２つの方法が、
２つの増幅プライマー、即ちそれぞれことなる二本鎖結
合蛋白質の認識配列をコードする５’テイルを伴うプラ
イマーにより組み合わせることができた。増幅産物は、
次に、１つの二本鎖結合蛋白質に結合させて他方への結
合を検出することにより固定化できた。バリー（Ｃ．
Ａ．Ｖａｒｙ）（１９９２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ３８，６８７−６９４；１９９２ ＰＣ
Ｔ特許出願国際公開９２／１１３９０）は、他の二本鎖
アンプリコンに取り込まれた場合に第３のオリゴヌクレ
オチドのためのハイブリダイゼーション部位を形成する
５’テイルを含む増幅プライマーの使用を記載してい
る。１つのテイルのハイブリダイゼーションを用いて増
幅産物を取得し、そして他方を用いて、蛍光染料へ結合
させたプローブへのハイブリダイゼーションにより検出
した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ＰＣＲ増幅産物を検出
するためのこれらのプライマーに基づく方法のすべて
は、高い感度、即ち１００コピー以下の標的配列の検出
を達成するために２つの増幅反応を必要とする。即ち、
標的配列の第１の増幅は、取得および／または検出のた
めの所望の修飾を取り込んだネステッドプライマーを用
いた第２の増幅へと続く。この様式による２つの連続し
た増幅は、シグナルを発生する修飾プライマーにより誤
って複製開始された非標的ＤＮＡの増幅により生じる許
容不可能なほどの高いバックグラウンドシグナルを避け
るために必要である。従来技術の方法におけるこの特徴
は、これら方法を、時間を浪費し且つ面倒なものにし、
したがって、プライマーに基づく検出法はしばしば、第
２の連続する増幅反応のための要求により埋め合わせら
れる。
するためのこれらのプライマーに基づく方法のすべて
は、高い感度、即ち１００コピー以下の標的配列の検出
を達成するために２つの増幅反応を必要とする。即ち、
標的配列の第１の増幅は、取得および／または検出のた
めの所望の修飾を取り込んだネステッドプライマーを用
いた第２の増幅へと続く。この様式による２つの連続し
た増幅は、シグナルを発生する修飾プライマーにより誤
って複製開始された非標的ＤＮＡの増幅により生じる許
容不可能なほどの高いバックグラウンドシグナルを避け
るために必要である。従来技術の方法におけるこの特徴
は、これら方法を、時間を浪費し且つ面倒なものにし、
したがって、プライマーに基づく検出法はしばしば、第
２の連続する増幅反応のための要求により埋め合わせら
れる。
【０００５】ＤＮＡの非特異的増幅は、ＳＤＡ反応にお
けるプライマーに基づく増幅産物の検出の特定の問題を
示すことが予想されるはずであるが、それは、これらの
増幅が、ＰＣＲに比して誤った複製開始を増加させるよ
うな相対的に低い温度（約３７−４０℃）で実施され、
それにより高いレベルのバックグラウンドシグナルをも
たらすためである。期待に反して、ＳＤＡのプライマー
に基づく検出に関する本発明の方法は、標的配列の増幅
の同時検出のための産物を生成する単一増幅反応のみの
使用にも拘わらず、低いバックグラウンドシグナルのレ
ベルをもたらす。第２増幅産物と増幅標的配列の同時生
成を、本明細書では、リアルタイムプライマー伸長合
成、リアルタイム増幅検出等と呼ぶ。
けるプライマーに基づく増幅産物の検出の特定の問題を
示すことが予想されるはずであるが、それは、これらの
増幅が、ＰＣＲに比して誤った複製開始を増加させるよ
うな相対的に低い温度（約３７−４０℃）で実施され、
それにより高いレベルのバックグラウンドシグナルをも
たらすためである。期待に反して、ＳＤＡのプライマー
に基づく検出に関する本発明の方法は、標的配列の増幅
の同時検出のための産物を生成する単一増幅反応のみの
使用にも拘わらず、低いバックグラウンドシグナルのレ
ベルをもたらす。第２増幅産物と増幅標的配列の同時生
成を、本明細書では、リアルタイムプライマー伸長合
成、リアルタイム増幅検出等と呼ぶ。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、標的配列と連
結した、増幅反応におけるプライマー伸長合成産物の検
出、固定化（取得）または位置決定のための方法および
標的配列の指標および増幅を提供する。プライマー伸長
合成産物は、標的配列のＳＤＡの間に生じる二次的な標
的特異的ＤＮＡ産物であり、したがって、標的配列の増
幅の検出および／または測定に用いられうる。しかしな
がら、該二次的産物は標的配列の対数的増幅の干渉なし
に形成された後は、増幅不可能であり、かつＳＤＡ反応
において不活性のまま残る。該二次的産物をデザインま
たは修飾することにより、その検出、固定化（取得）ま
たは位置決定を容易にするための特徴を含ませることが
できる。本発明の方法は、ＳＤＡ反応のリアルタイムの
監視、特に、標的配列のアンプリコンの検出がさらなる
増幅または操作を干渉するはずである場合に有用であ
る。本発明の方法は、インサイチュのＳＤＡ後に固定さ
れた細胞中の増幅産物の検出、特に、増幅産物の検出ま
たは位置決定を促進するために二次産物が５’テイル配
列を含む場合にも有用である。
結した、増幅反応におけるプライマー伸長合成産物の検
出、固定化（取得）または位置決定のための方法および
標的配列の指標および増幅を提供する。プライマー伸長
合成産物は、標的配列のＳＤＡの間に生じる二次的な標
的特異的ＤＮＡ産物であり、したがって、標的配列の増
幅の検出および／または測定に用いられうる。しかしな
がら、該二次的産物は標的配列の対数的増幅の干渉なし
に形成された後は、増幅不可能であり、かつＳＤＡ反応
において不活性のまま残る。該二次的産物をデザインま
たは修飾することにより、その検出、固定化（取得）ま
たは位置決定を容易にするための特徴を含ませることが
できる。本発明の方法は、ＳＤＡ反応のリアルタイムの
監視、特に、標的配列のアンプリコンの検出がさらなる
増幅または操作を干渉するはずである場合に有用であ
る。本発明の方法は、インサイチュのＳＤＡ後に固定さ
れた細胞中の増幅産物の検出、特に、増幅産物の検出ま
たは位置決定を促進するために二次産物が５’テイル配
列を含む場合にも有用である。
【０００７】本発明は、リアルタイムのプライマー伸長
合成によるＳＤＡ反応の増幅産物の検出、監視、または
位置決定のための方法を提供する。ＳＤＡによる標的配
列の増幅は、標的配列の増幅と密接に関連して生成され
る二次増幅産物を同時に生成することにより検出、監視
または位置決定される。この二次増幅産物は、いかなる
付加的増幅工程または操作を必要とせずに、ＳＤＡ反応
の間に生成される。生成されたならば、二次増幅産物は
反応混合物中で不活性であり、且つ所望の標的配列の正
常なＳＤＡを干渉または阻害しない。この方法は、した
がって、リアルタイムのＳＤＡの監視および標的配列の
増幅の検出、特に、増幅された標的配列の検出自体がさ
らなるアンプリコンの反応または操作を妨害または阻止
する場合に有用である。
合成によるＳＤＡ反応の増幅産物の検出、監視、または
位置決定のための方法を提供する。ＳＤＡによる標的配
列の増幅は、標的配列の増幅と密接に関連して生成され
る二次増幅産物を同時に生成することにより検出、監視
または位置決定される。この二次増幅産物は、いかなる
付加的増幅工程または操作を必要とせずに、ＳＤＡ反応
の間に生成される。生成されたならば、二次増幅産物は
反応混合物中で不活性であり、且つ所望の標的配列の正
常なＳＤＡを干渉または阻害しない。この方法は、した
がって、リアルタイムのＳＤＡの監視および標的配列の
増幅の検出、特に、増幅された標的配列の検出自体がさ
らなるアンプリコンの反応または操作を妨害または阻止
する場合に有用である。
【０００８】本発明は、第２増幅反応に関する要求が除
かれた、プライマーに基づく増幅検出反応を提供する。
該方法は、取得プローブおよび検出プローブと同様なシ
グナルプライマーであって、ＳＤＡ反応において増幅プ
ライマーとして機能しないプライマーを用いる。結果と
して、非標的鋳型上のこれらシグナルプライマーからの
誤った伸長合成により形成されるいかなる伸長合成産物
も次の増幅に混入できない。誤った複製開始自体は比較
的稀であるから、次の工程における誤って複製開始され
た配列の増幅後にのみ検出可能である。そのような次の
工程における増幅がない場合は、本発明の方法のよう
に、バックグラウンドレベルのシグナルの明らかな増加
がないように、増幅開始前にシグナルプライマーを増幅
反応物に加える。このことは、検出工程を著しく単純化
し、ＳＤＡ反応の均一なリアルタイムの分析を可能にす
る。
かれた、プライマーに基づく増幅検出反応を提供する。
該方法は、取得プローブおよび検出プローブと同様なシ
グナルプライマーであって、ＳＤＡ反応において増幅プ
ライマーとして機能しないプライマーを用いる。結果と
して、非標的鋳型上のこれらシグナルプライマーからの
誤った伸長合成により形成されるいかなる伸長合成産物
も次の増幅に混入できない。誤った複製開始自体は比較
的稀であるから、次の工程における誤って複製開始され
た配列の増幅後にのみ検出可能である。そのような次の
工程における増幅がない場合は、本発明の方法のよう
に、バックグラウンドレベルのシグナルの明らかな増加
がないように、増幅開始前にシグナルプライマーを増幅
反応物に加える。このことは、検出工程を著しく単純化
し、ＳＤＡ反応の均一なリアルタイムの分析を可能にす
る。
【０００９】本明細書にて用いられる以下の単語および
熟語を以下のとおり規定する。
熟語を以下のとおり規定する。
【００１０】増幅プライマーは、プライマー伸長合成に
よる標的配列の増幅のためのプライマーである。ＳＤＡ
に関して、増幅プライマーの３’末端（標的結合配列）
は標的の３’末端にハイブリダイズする。増幅プライマ
ーは、その５’末端近傍において制限酵素のための認識
部位を有する。認識部位は、ウオーカーら（１９９２、
ＰＮＡＳ，前記）に記載されるとおり、一方の鎖が修飾
されている場合にＤＮＡ鎖の一方の鎖のみを切断する
（ニッキング）制限酵素のためのものである。一方が修
飾された制限部位とは、制限酵素が認識部位の両方の鎖
を切断するよりむしろプライマー鎖にニックを入れさせ
るような少なくとも一つが誘導されたヌクレオチドを一
方の鎖が含む場合の、制限エンドヌクレアーゼの二本鎖
認識部位である。通常、一方が修飾された認識部位のプ
ライマー鎖は誘導ヌクレオチドを含まず、そして制限エ
ンドヌクレアーゼによりニックを入れられる。別法とし
て、修飾プライマー鎖がニックを入れられる間、未修飾
の標的鎖が切断から保護されるような誘導ヌクレオチド
をプライマー鎖が含めばよい。一方が修飾された認識部
位は、好ましくは、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩ
Ｉ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＡｖａＩ，ＮｃｉＩおよびＦｎｕ
４ＨＩのためのヘミホスホロチオエート化認識部位であ
る。増幅プライマーも、増幅プライマーの標的結合配列
が標的配列にハイブリダイズしたとき、ＤＮＡポリメラ
ーゼにより伸長合成される３’−ＯＨ基を含む。ＳＤＡ
反応の大部分は、標的配列の対数増幅のために増幅プラ
イマーが必須である。
よる標的配列の増幅のためのプライマーである。ＳＤＡ
に関して、増幅プライマーの３’末端（標的結合配列）
は標的の３’末端にハイブリダイズする。増幅プライマ
ーは、その５’末端近傍において制限酵素のための認識
部位を有する。認識部位は、ウオーカーら（１９９２、
ＰＮＡＳ，前記）に記載されるとおり、一方の鎖が修飾
されている場合にＤＮＡ鎖の一方の鎖のみを切断する
（ニッキング）制限酵素のためのものである。一方が修
飾された制限部位とは、制限酵素が認識部位の両方の鎖
を切断するよりむしろプライマー鎖にニックを入れさせ
るような少なくとも一つが誘導されたヌクレオチドを一
方の鎖が含む場合の、制限エンドヌクレアーゼの二本鎖
認識部位である。通常、一方が修飾された認識部位のプ
ライマー鎖は誘導ヌクレオチドを含まず、そして制限エ
ンドヌクレアーゼによりニックを入れられる。別法とし
て、修飾プライマー鎖がニックを入れられる間、未修飾
の標的鎖が切断から保護されるような誘導ヌクレオチド
をプライマー鎖が含めばよい。一方が修飾された認識部
位は、好ましくは、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩ
Ｉ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＡｖａＩ，ＮｃｉＩおよびＦｎｕ
４ＨＩのためのヘミホスホロチオエート化認識部位であ
る。増幅プライマーも、増幅プライマーの標的結合配列
が標的配列にハイブリダイズしたとき、ＤＮＡポリメラ
ーゼにより伸長合成される３’−ＯＨ基を含む。ＳＤＡ
反応の大部分は、標的配列の対数増幅のために増幅プラ
イマーが必須である。
【００１１】伸長合成産物は、プライマーおよびプライ
マー結合部位の下流の標的配列に相補的な新たに合成さ
れた鎖からなる。伸長合成産物は標的配列へのプライマ
ーのハイブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型とし
て用いたポリメラーゼによる伸長合成をもたらす。
マー結合部位の下流の標的配列に相補的な新たに合成さ
れた鎖からなる。伸長合成産物は標的配列へのプライマ
ーのハイブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型とし
て用いたポリメラーゼによる伸長合成をもたらす。
【００１２】バンパープライマーは、バンパープライマ
ーの伸長合成が下流の増幅プライマーおよびその伸長合
成産物を置換するように、増幅プライマーの上流の標的
配列にアニールするプライマーを意味する。バンパープ
ライマーの伸長合成は、増幅プライマーの伸長合成産物
を置換するためのひとつの方法であるが、加熱も適切で
ある。
ーの伸長合成が下流の増幅プライマーおよびその伸長合
成産物を置換するように、増幅プライマーの上流の標的
配列にアニールするプライマーを意味する。バンパープ
ライマーの伸長合成は、増幅プライマーの伸長合成産物
を置換するためのひとつの方法であるが、加熱も適切で
ある。
【００１３】同じ配列とは、同じ相補的なヌクレオチド
配列にハイブリダイズすることを意味する。実質的に同
じ配列とは、同じ部分的に相補的なヌクレオチド配列に
もハイブリダイズするヌクレオチド配列に十分類似性を
有する配列を意味する。
配列にハイブリダイズすることを意味する。実質的に同
じ配列とは、同じ部分的に相補的なヌクレオチド配列に
もハイブリダイズするヌクレオチド配列に十分類似性を
有する配列を意味する。
【００１４】標的または標的配列は、増幅される核酸配
列を意味する。これらは、増幅される元の核酸配列、そ
の相補的第２鎖および増幅反応において生成される元の
配列のコピーのいずれかの鎖を含む。標的配列は、ハイ
ブリダイズした増幅プライマーの伸長合成のための鋳型
も意味しうる。
列を意味する。これらは、増幅される元の核酸配列、そ
の相補的第２鎖および増幅反応において生成される元の
配列のコピーのいずれかの鎖を含む。標的配列は、ハイ
ブリダイズした増幅プライマーの伸長合成のための鋳型
も意味しうる。
【００１５】シグナルプライマーは、増幅プライマーの
伸長合成がシグナルプライマーおよびその伸長合成産物
を置換するように、増幅プライマーの下流の標的配列に
ハイブリダイズするプライマーを意味する。シグナルプ
ライマーは、標的ハイブリダイズにハイブリダイズした
場合に、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長合成されうる
３’−ＯＨ基を有する。シグナルプライマーは、例え
ば、大きさに基づいて二次増幅産物を検出するために未
修飾であってよい。別法としては、シグナルプライマー
はリポーター基または標識、または構造的特徴を含むこ
とによりその伸長合成産物の検出を促してよい。
伸長合成がシグナルプライマーおよびその伸長合成産物
を置換するように、増幅プライマーの下流の標的配列に
ハイブリダイズするプライマーを意味する。シグナルプ
ライマーは、標的ハイブリダイズにハイブリダイズした
場合に、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長合成されうる
３’−ＯＨ基を有する。シグナルプライマーは、例え
ば、大きさに基づいて二次増幅産物を検出するために未
修飾であってよい。別法としては、シグナルプライマー
はリポーター基または標識、または構造的特徴を含むこ
とによりその伸長合成産物の検出を促してよい。
【００１６】増幅産物、増幅された産物またはアンプリ
コンは、増幅プライマーのハイブリダイゼーションおよ
び伸長合成により生成された標的配列のコピーである。
これらの単語は、元の標的配列のコピーを含む一本鎖お
よび二本鎖増幅プライマー伸長合成産物の両者を意味
し、増幅反応の中間生成物を包含する。
コンは、増幅プライマーのハイブリダイゼーションおよ
び伸長合成により生成された標的配列のコピーである。
これらの単語は、元の標的配列のコピーを含む一本鎖お
よび二本鎖増幅プライマー伸長合成産物の両者を意味
し、増幅反応の中間生成物を包含する。
【００１７】二次的増幅産物または二次増幅産物は、シ
グナルプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長
合成により生じた標的配列のコピーを言う。二次的増幅
産物は、増幅された標的配列の内部セグメントを含む。
これらの単語は、シグナルプライマーの一本鎖および二
本鎖伸長合成産物の両者を意味し、最終的に二本鎖の形
態を生じる工程における中間生成物を包含する。増幅産
物とは対照的に、幾つかの二次増幅産物は直鎖状にて増
幅可能であるが、二本鎖二次増幅産物は、通常さらなる
増幅には利用できない。
グナルプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長
合成により生じた標的配列のコピーを言う。二次的増幅
産物は、増幅された標的配列の内部セグメントを含む。
これらの単語は、シグナルプライマーの一本鎖および二
本鎖伸長合成産物の両者を意味し、最終的に二本鎖の形
態を生じる工程における中間生成物を包含する。増幅産
物とは対照的に、幾つかの二次増幅産物は直鎖状にて増
幅可能であるが、二本鎖二次増幅産物は、通常さらなる
増幅には利用できない。
【００１８】本発明の方法において、ＳＤＡのための増
幅プライマーを標的にハイブリダイズさせ、そして一般
的には前記のウオーカーら（１９９３ ＰＮＡＳおよび
Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ）に記載されたとおりに標
的配列を増幅する。これら２つの文献に記載されたとお
り、全ＤＮＡを適切な制限酵素（例えばＨｉｎｃＩＩ）
により制限するか、またはバンパープライマーおよび増
幅プライマーを用いて適切な制限酵素認識部位を標的断
片の末端に生じさせることにより、ＳＤＡのための標的
配列を調製する。標的配列を含む調製された断片は、次
に、記載されたとおりにＳＤＡにより増幅する。しかし
ながら、本発明のＳＤＡ反応は、ＳＤＡ反応により生じ
た増幅産物を検出、監視または位置決定するために用い
られる二次的増幅産物の同時または連続的生成をもたら
す少なくともひとつのシグナルプライマーを含む。二次
的増幅産物はそれらを取得または固定化するための特徴
も含み、それにより、検出、定量またはさらなる操作の
ために単離されうる。二次的増幅産物は反応混合物中に
少なくともひとつのシグナルプライマーを含むことによ
り、ＳＤＡＳ反応において生成される。特定の適用のた
めに、一対のシグナルプライマーを含むことが好まし
い。単一または複数のシグナルプライマーは増幅プライ
マーのハイブリダイゼーション部位の下流の標的配列に
ハイブリダイズする。これらは、増幅プライマーの伸長
合成の様式と同様にポリメラーゼにより伸長合成され
る。シグナルプライマーは、増幅プライマーの伸長合成
がシグナルプライマーの伸長合成産物を置換するよう
に、標的配列中の部位においてハイブリダイズする。シ
グナルプライマーの３’末端は少なくとも標的配列にハ
イブリダイズする配列を含む。完全なシグナルプライマ
ーは、例えば未修飾またはリポーター基、標識または親
和性リガンドの付加により検出されるように化学修飾さ
れた場合に標的配列にハイブリダイズする。別法とし
て、シグナルプライマーの５’末端は、標的配列にハイ
ブリダイズしないが二次増幅産物の検出または取得を促
進する特定のヌクレオチド配列（しばしば構造的特徴を
含む）を含む配列を含む。これらの化学修飾および特定
の配列は、シグナルプライマーがハイブリダイズして鋳
型上を伸長合成されるときに二次増幅産物中に取り込ま
れる。化学修飾の例は、親和性リガンド（例えば、アビ
ジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ハプテン、抗原
および抗体）およびリポーター基（標識、例えば、ラジ
オアイソトープ、蛍光染料、反応して検出可能な反応産
物を生成する酵素および可視染料）を含む。特定のヌク
レオチド配列は、（ｉ）標識オリゴヌクレオチドプロー
ブを二本鎖二次増幅産物にハイブリダイズすることによ
り三重らせんを形成する配列、および（ｉｉ）増幅間に
二本鎖になる場合に二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を結合す
ることができるようになるための二本鎖結合性ための認
識部位（例えば、リプレッサー、制御蛋白質、制限エン
ドヌクレアーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ）を含む。二本鎖
の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をもたらすヌクレオ
チド配列とは、次の制限を用いて特徴的サイズにより認
識されうる二次増幅産物を生じるために、シグナルプラ
イマー中で使用されるための好ましい構造的特徴であ
る。
幅プライマーを標的にハイブリダイズさせ、そして一般
的には前記のウオーカーら（１９９３ ＰＮＡＳおよび
Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ）に記載されたとおりに標
的配列を増幅する。これら２つの文献に記載されたとお
り、全ＤＮＡを適切な制限酵素（例えばＨｉｎｃＩＩ）
により制限するか、またはバンパープライマーおよび増
幅プライマーを用いて適切な制限酵素認識部位を標的断
片の末端に生じさせることにより、ＳＤＡのための標的
配列を調製する。標的配列を含む調製された断片は、次
に、記載されたとおりにＳＤＡにより増幅する。しかし
ながら、本発明のＳＤＡ反応は、ＳＤＡ反応により生じ
た増幅産物を検出、監視または位置決定するために用い
られる二次的増幅産物の同時または連続的生成をもたら
す少なくともひとつのシグナルプライマーを含む。二次
的増幅産物はそれらを取得または固定化するための特徴
も含み、それにより、検出、定量またはさらなる操作の
ために単離されうる。二次的増幅産物は反応混合物中に
少なくともひとつのシグナルプライマーを含むことによ
り、ＳＤＡＳ反応において生成される。特定の適用のた
めに、一対のシグナルプライマーを含むことが好まし
い。単一または複数のシグナルプライマーは増幅プライ
マーのハイブリダイゼーション部位の下流の標的配列に
ハイブリダイズする。これらは、増幅プライマーの伸長
合成の様式と同様にポリメラーゼにより伸長合成され
る。シグナルプライマーは、増幅プライマーの伸長合成
がシグナルプライマーの伸長合成産物を置換するよう
に、標的配列中の部位においてハイブリダイズする。シ
グナルプライマーの３’末端は少なくとも標的配列にハ
イブリダイズする配列を含む。完全なシグナルプライマ
ーは、例えば未修飾またはリポーター基、標識または親
和性リガンドの付加により検出されるように化学修飾さ
れた場合に標的配列にハイブリダイズする。別法とし
て、シグナルプライマーの５’末端は、標的配列にハイ
ブリダイズしないが二次増幅産物の検出または取得を促
進する特定のヌクレオチド配列（しばしば構造的特徴を
含む）を含む配列を含む。これらの化学修飾および特定
の配列は、シグナルプライマーがハイブリダイズして鋳
型上を伸長合成されるときに二次増幅産物中に取り込ま
れる。化学修飾の例は、親和性リガンド（例えば、アビ
ジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ハプテン、抗原
および抗体）およびリポーター基（標識、例えば、ラジ
オアイソトープ、蛍光染料、反応して検出可能な反応産
物を生成する酵素および可視染料）を含む。特定のヌク
レオチド配列は、（ｉ）標識オリゴヌクレオチドプロー
ブを二本鎖二次増幅産物にハイブリダイズすることによ
り三重らせんを形成する配列、および（ｉｉ）増幅間に
二本鎖になる場合に二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を結合す
ることができるようになるための二本鎖結合性ための認
識部位（例えば、リプレッサー、制御蛋白質、制限エン
ドヌクレアーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ）を含む。二本鎖
の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をもたらすヌクレオ
チド配列とは、次の制限を用いて特徴的サイズにより認
識されうる二次増幅産物を生じるために、シグナルプラ
イマー中で使用されるための好ましい構造的特徴であ
る。
【００１９】本発明の方法において、図１および２に示
すように二本鎖標的配列の反対の鎖にハイブリダイズす
る２つのシグナルプライマーを用いる場合、シグナルプ
ライマーの一方は特定のヌクレオチド配列または化学修
飾を含むことにより二次増幅産物の取得または固定化を
促進し、そして他方は取得または固定化された二次増幅
産物の検出のための検出可能なリポーター基または標識
を含む。核酸を検出するための標識およびリポーター基
の使用並びに核酸の取得または固定化のためのリガン
ド、化学修飾および核酸の構造的特徴の使用は、当業界
において公知である。別法として、シグナルプライマー
は未修飾でよく、即ち二次増幅産物の検出または取得を
促進するためのリポーター基、取得基または構造的特徴
を含まなくてよい。二次増幅産物は、次に、大きさに基
づいて、例えば、電気泳動およびエチジウムブロマイド
染色により検出される。これら方法のすべては本発明に
有用であり、当業者であれば、あらゆる特定の増幅分析
システムにおける使用のために適切な方法を日常的に選
択することができる。
すように二本鎖標的配列の反対の鎖にハイブリダイズす
る２つのシグナルプライマーを用いる場合、シグナルプ
ライマーの一方は特定のヌクレオチド配列または化学修
飾を含むことにより二次増幅産物の取得または固定化を
促進し、そして他方は取得または固定化された二次増幅
産物の検出のための検出可能なリポーター基または標識
を含む。核酸を検出するための標識およびリポーター基
の使用並びに核酸の取得または固定化のためのリガン
ド、化学修飾および核酸の構造的特徴の使用は、当業界
において公知である。別法として、シグナルプライマー
は未修飾でよく、即ち二次増幅産物の検出または取得を
促進するためのリポーター基、取得基または構造的特徴
を含まなくてよい。二次増幅産物は、次に、大きさに基
づいて、例えば、電気泳動およびエチジウムブロマイド
染色により検出される。これら方法のすべては本発明に
有用であり、当業者であれば、あらゆる特定の増幅分析
システムにおける使用のために適切な方法を日常的に選
択することができる。
【００２０】本発明の重要な特徴は、シグナルプライマ
ーが、用いられるＳＤＡ反応において増幅プライマーと
して機能しないことである。本発明の方法が機能するこ
とによるあらゆる特定の機構により束縛されることを意
図することなしに、出願人は、プライマーに基づく他の
方法により生じる高いレベルのバックグラウンドシグナ
ルを増大させずに増幅反応混合物にシグナルプライマー
を加えさせることが特徴であると信じる。高いレベルの
バックグラウンドシグナルは、プライマーが増幅プライ
マーとして機能できる場合、非特異的複製開始および誤
って複製開始された非標的ＤＮＡの続く増幅によると信
じられる。したがって本発明は、プライマーに基づいた
検出法のための工程を単純化するが、２つの連続する増
幅反応により高い感度および特性を達成し、第２反応は
内部ネステッド−シグナル発生増幅プライマーを用いて
実施される。
ーが、用いられるＳＤＡ反応において増幅プライマーと
して機能しないことである。本発明の方法が機能するこ
とによるあらゆる特定の機構により束縛されることを意
図することなしに、出願人は、プライマーに基づく他の
方法により生じる高いレベルのバックグラウンドシグナ
ルを増大させずに増幅反応混合物にシグナルプライマー
を加えさせることが特徴であると信じる。高いレベルの
バックグラウンドシグナルは、プライマーが増幅プライ
マーとして機能できる場合、非特異的複製開始および誤
って複製開始された非標的ＤＮＡの続く増幅によると信
じられる。したがって本発明は、プライマーに基づいた
検出法のための工程を単純化するが、２つの連続する増
幅反応により高い感度および特性を達成し、第２反応は
内部ネステッド−シグナル発生増幅プライマーを用いて
実施される。
【００２１】上記のとおり、適切な制限エンドヌクレア
ーゼ認識配列をその末端に有し、且つ標的配列を含む核
酸断片は。ウオーカーら（１９９２ ＰＮＡＳ 前記）
またはウオーカーら（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．前記）のいずれかに記載されたとおりに増幅の
ために調製される。簡単には、図１〜３に例示された本
発明の方法は、標的配列を含む核酸断片を用いて始ま
る。ウオーカーら（１９９２ 前記）に基づいて調製す
るならば、それは、変性された制限二本鎖ＤＮＡを表
す。ウオーカーら（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．前記）に基づいて調製するならば、開示された標
的生成計画に基づいて、適切な制限エンドヌクレアーゼ
認識部位を断片に付加する。バンパープライマー、増幅
プライマーおよびシグナルプライマーはウオーカーら
（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．前記）の標
的生成計画において標的配列にハイブリダイズし、プラ
イマーの各上流における伸長合成により下流のプライマ
ーが置換され、そして同時に増幅可能な標的断片および
二次増幅産物が生成すると信じられる。
ーゼ認識配列をその末端に有し、且つ標的配列を含む核
酸断片は。ウオーカーら（１９９２ ＰＮＡＳ 前記）
またはウオーカーら（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．前記）のいずれかに記載されたとおりに増幅の
ために調製される。簡単には、図１〜３に例示された本
発明の方法は、標的配列を含む核酸断片を用いて始ま
る。ウオーカーら（１９９２ 前記）に基づいて調製す
るならば、それは、変性された制限二本鎖ＤＮＡを表
す。ウオーカーら（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．前記）に基づいて調製するならば、開示された標
的生成計画に基づいて、適切な制限エンドヌクレアーゼ
認識部位を断片に付加する。バンパープライマー、増幅
プライマーおよびシグナルプライマーはウオーカーら
（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．前記）の標
的生成計画において標的配列にハイブリダイズし、プラ
イマーの各上流における伸長合成により下流のプライマ
ーが置換され、そして同時に増幅可能な標的断片および
二次増幅産物が生成すると信じられる。
【００２２】図１および２は、本発明のひとつの態様を
例示するが、１対のシグナルプライマーを用いて、二本
鎖標的配列（５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ／５’−Ｄ’−Ｃ’
−Ｂ’−Ａ’）の増幅を検出する。図１は標的配列の２
つの相補鎖の一方（５’−Ｄ’−Ｃ’−Ｂ’−Ａ’）の
ための本発明の方法を例示する。図１〜３において増幅
プライマーの持ち上がった部分は、ウオーカーら（１９
９２ ＰＮＡＳおよびＮｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．前
記）に記載されたとおり、ニックを入れることが可能な
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示す。長い方の持ち
上がった部分は、完全長の制限エンドヌクレアーゼ認識
部位を示し、そして短い方の持ち上がった部分は部分的
な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示し、通常ニッキ
ングおよび鎖置換の後に生じる。標的配列を含む核酸断
片は、長い核酸のエンドヌクレアーゼによる制限（ウオ
ーカーら、１９９２，ＰＮＡＳ，前記）またはウオーカ
ーら（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．前記）
により記載された標的生成法の何れかにより生成され
る。しかしながら、例示の目的および図解の単純化のた
めに、図１〜３は、標的配列を切断しない制限エンドヌ
クレアーゼにより予め制限された核酸断片上に含まれる
標的配列を用いて始まる。
例示するが、１対のシグナルプライマーを用いて、二本
鎖標的配列（５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ／５’−Ｄ’−Ｃ’
−Ｂ’−Ａ’）の増幅を検出する。図１は標的配列の２
つの相補鎖の一方（５’−Ｄ’−Ｃ’−Ｂ’−Ａ’）の
ための本発明の方法を例示する。図１〜３において増幅
プライマーの持ち上がった部分は、ウオーカーら（１９
９２ ＰＮＡＳおよびＮｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．前
記）に記載されたとおり、ニックを入れることが可能な
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示す。長い方の持ち
上がった部分は、完全長の制限エンドヌクレアーゼ認識
部位を示し、そして短い方の持ち上がった部分は部分的
な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示し、通常ニッキ
ングおよび鎖置換の後に生じる。標的配列を含む核酸断
片は、長い核酸のエンドヌクレアーゼによる制限（ウオ
ーカーら、１９９２，ＰＮＡＳ，前記）またはウオーカ
ーら（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．前記）
により記載された標的生成法の何れかにより生成され
る。しかしながら、例示の目的および図解の単純化のた
めに、図１〜３は、標的配列を切断しない制限エンドヌ
クレアーゼにより予め制限された核酸断片上に含まれる
標的配列を用いて始まる。
【００２３】図１において、シグナルプライマーＲ−Ｂ
はＳＤＡ反応に含まれ、そして該シグナルプライマーの
Ｂ部分がＢ’にハイブリダイズすることにより第１増幅
プライマーの下流の標的配列にハイブリダイズする。Ｒ
−ＢシグナルプライマーのＲ部分はリポーター基または
標識を含むか、または構造的特徴を有することにより、
検出または取得を促進する。上記のとおり、Ｒはハイブ
リダイズしてもしなくてもよいが、シグナルプライマー
の別の機能的特徴を明らかにするためにハイブリダイズ
しないものとして示される。この例示の目的のため、Ｒ
はリポーター基を含むが、上記のとおり他の化学的修飾
または構造的特徴を含んでもよい。増幅プライマーＡお
よびシグナルプライマーＲ−Ｂの両者は、標的配列を鋳
型として用いてＤＮＡポリメラーゼにより伸長合成され
る。シグナルプライマーの伸長合成産物Ｒ−Ｂ−Ｃ−Ｄ
（構造＃１）は、増幅プライマーＡの伸長合成により鋳
型から置換され、そしてひるがえって、第２シグナルプ
ライマーＱ’−Ｃ’および第２増幅プライマーＤ’のハ
イブリダイゼーションおよび伸長合成のための鋳型とし
て機能する。Ｑ’−Ｃ’配列のＣ’部分はＣにハイブリ
ダイズする。第２シグナルプライマーのＱ’部分はＲと
類似しており、そして、例示の目的のために、Ｑ’は二
次増幅産物の取得を促進するための修飾または配列を含
む。Ｑ’−Ｃ’の伸長合成産物は第２増幅プライマーの
伸長合成により置換される。置換されたＱ’−Ｃ’伸長
合成産物（構造＃２）は、次に、Ｒ−Ｂのハイブリダイ
ゼーションおよび伸長合成のための鋳型として機能し、
よって、シグナルプライマーの末端セグメント（Ｒおよ
びＱ’）および標的配列の内部セグメントＢ’−Ｃ’か
らなる、二本鎖の標的特異的二次増幅産物（構造＃３）
をもたらす。二次増幅産物はニッキング可能な制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位を含まないので、ＳＤＡ反応に
おいて増幅不可能であり、また、後の増幅反応において
効果的に不活性のまま残されるが、二次増幅産物の付加
的コピーが標的配列から生成される。
はＳＤＡ反応に含まれ、そして該シグナルプライマーの
Ｂ部分がＢ’にハイブリダイズすることにより第１増幅
プライマーの下流の標的配列にハイブリダイズする。Ｒ
−ＢシグナルプライマーのＲ部分はリポーター基または
標識を含むか、または構造的特徴を有することにより、
検出または取得を促進する。上記のとおり、Ｒはハイブ
リダイズしてもしなくてもよいが、シグナルプライマー
の別の機能的特徴を明らかにするためにハイブリダイズ
しないものとして示される。この例示の目的のため、Ｒ
はリポーター基を含むが、上記のとおり他の化学的修飾
または構造的特徴を含んでもよい。増幅プライマーＡお
よびシグナルプライマーＲ−Ｂの両者は、標的配列を鋳
型として用いてＤＮＡポリメラーゼにより伸長合成され
る。シグナルプライマーの伸長合成産物Ｒ−Ｂ−Ｃ−Ｄ
（構造＃１）は、増幅プライマーＡの伸長合成により鋳
型から置換され、そしてひるがえって、第２シグナルプ
ライマーＱ’−Ｃ’および第２増幅プライマーＤ’のハ
イブリダイゼーションおよび伸長合成のための鋳型とし
て機能する。Ｑ’−Ｃ’配列のＣ’部分はＣにハイブリ
ダイズする。第２シグナルプライマーのＱ’部分はＲと
類似しており、そして、例示の目的のために、Ｑ’は二
次増幅産物の取得を促進するための修飾または配列を含
む。Ｑ’−Ｃ’の伸長合成産物は第２増幅プライマーの
伸長合成により置換される。置換されたＱ’−Ｃ’伸長
合成産物（構造＃２）は、次に、Ｒ−Ｂのハイブリダイ
ゼーションおよび伸長合成のための鋳型として機能し、
よって、シグナルプライマーの末端セグメント（Ｒおよ
びＱ’）および標的配列の内部セグメントＢ’−Ｃ’か
らなる、二本鎖の標的特異的二次増幅産物（構造＃３）
をもたらす。二次増幅産物はニッキング可能な制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位を含まないので、ＳＤＡ反応に
おいて増幅不可能であり、また、後の増幅反応において
効果的に不活性のまま残されるが、二次増幅産物の付加
的コピーが標的配列から生成される。
【００２４】Ｒ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｑ’伸長合成産物の置
換に加えて、第２増幅プライマー（Ｄ’）のハイブリダ
イゼーションおよび伸長合成は、一方の末端にＲ／Ｒ’
配列を、そして他方の末端に一方の鎖のみが修飾された
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む二本鎖断片（構
造＃４）を生じる。この制限エンドヌクレアーゼ認識部
位は、ＳＤＡ反応に存在する制限エンドヌクレアーゼに
よりニックを入れられることが可能である。ＳＤＡ反応
に存在するＤＮＡポリメラーゼは、次に重合を開始して
ニックにおいて置換し、よって、制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位の部分を含む、例示されたＲ’−Ｂ’−Ｃ’
−Ｄ’産物をもたらす。この産物はＲ−Ｂ（構造＃５）
のハイブリダイゼーションおよび伸長合成により二本鎖
とすることができる。連続的に繰り返されるニッキン
グ、重合および置換のサイクルはこの断片を一次的速度
で増幅するが、一般的に一本鎖産物および二本鎖産物の
何れも、取得の促進のための修飾または配列を含むＱ／
Ｑ’部分の不在により検出可能である。Ｑ／Ｑ’とＲ／
Ｒ’の機能が逆（即ち、Ｑ／Ｑ’がリポーター基または
標識を含み、そしてＲ／Ｒ’が取得を促進するための修
飾または配列を含む）になれば、取得されたこれらの産
物はリポーター基または標識の不在により検出できない
はずである。しかしながら、リポーター基が取得とは無
関係に検出可能な場合、例えば、リポーター基が蛍光の
極性により検出可能な蛍光標識（国際公開番号９２／１
８６５０；デブリン（Ｒ．Ｄｅｖｌｉｎ）ら、１９９３
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９，１９３９−１９４３）
か、またはゲル電気泳動およびオートラジオグラフィー
により検出可能なラジオアイソトープである場合、構造
＃５が検出されることは理解すべきである。
換に加えて、第２増幅プライマー（Ｄ’）のハイブリダ
イゼーションおよび伸長合成は、一方の末端にＲ／Ｒ’
配列を、そして他方の末端に一方の鎖のみが修飾された
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む二本鎖断片（構
造＃４）を生じる。この制限エンドヌクレアーゼ認識部
位は、ＳＤＡ反応に存在する制限エンドヌクレアーゼに
よりニックを入れられることが可能である。ＳＤＡ反応
に存在するＤＮＡポリメラーゼは、次に重合を開始して
ニックにおいて置換し、よって、制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位の部分を含む、例示されたＲ’−Ｂ’−Ｃ’
−Ｄ’産物をもたらす。この産物はＲ−Ｂ（構造＃５）
のハイブリダイゼーションおよび伸長合成により二本鎖
とすることができる。連続的に繰り返されるニッキン
グ、重合および置換のサイクルはこの断片を一次的速度
で増幅するが、一般的に一本鎖産物および二本鎖産物の
何れも、取得の促進のための修飾または配列を含むＱ／
Ｑ’部分の不在により検出可能である。Ｑ／Ｑ’とＲ／
Ｒ’の機能が逆（即ち、Ｑ／Ｑ’がリポーター基または
標識を含み、そしてＲ／Ｒ’が取得を促進するための修
飾または配列を含む）になれば、取得されたこれらの産
物はリポーター基または標識の不在により検出できない
はずである。しかしながら、リポーター基が取得とは無
関係に検出可能な場合、例えば、リポーター基が蛍光の
極性により検出可能な蛍光標識（国際公開番号９２／１
８６５０；デブリン（Ｒ．Ｄｅｖｌｉｎ）ら、１９９３
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９，１９３９−１９４３）
か、またはゲル電気泳動およびオートラジオグラフィー
により検出可能なラジオアイソトープである場合、構造
＃５が検出されることは理解すべきである。
【００２５】図１は、Ｒ−Ｂの伸長合成産物の置換に加
えて、標的配列上の第１増幅プライマーが、ＳＤＡによ
る標的配列の増幅に必要な一方の鎖のみ修飾されたニッ
キング可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有する
二本鎖標的配列（構造＃６）を如何にして生成するのか
も示す。これらの反応産物は慣用的ＳＤＡに入り、増幅
される。したがって、二次増幅産物の形成は標的配列の
増幅と密接に関連しており、増幅が起こったか否かを監
視するため並びに標的の増幅の尺度を提供するために有
用である。しかしながら、二次増幅産物の生成と増幅産
物の生成の密接な関係にも拘わらず、標的配列の増幅
は、必須反応成分が過剰に存在していても阻害されな
い。さらに、増幅された標的配列もシグナルプライマー
に結合し、よって、二次増幅産物のさらなるコピーの生
成をもたらす。
えて、標的配列上の第１増幅プライマーが、ＳＤＡによ
る標的配列の増幅に必要な一方の鎖のみ修飾されたニッ
キング可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有する
二本鎖標的配列（構造＃６）を如何にして生成するのか
も示す。これらの反応産物は慣用的ＳＤＡに入り、増幅
される。したがって、二次増幅産物の形成は標的配列の
増幅と密接に関連しており、増幅が起こったか否かを監
視するため並びに標的の増幅の尺度を提供するために有
用である。しかしながら、二次増幅産物の生成と増幅産
物の生成の密接な関係にも拘わらず、標的配列の増幅
は、必須反応成分が過剰に存在していても阻害されな
い。さらに、増幅された標的配列もシグナルプライマー
に結合し、よって、二次増幅産物のさらなるコピーの生
成をもたらす。
【００２６】図２は、二本鎖標的配列（５’−Ａ−Ｂ−
Ｃ−Ｄ）の相補的第２鎖からの二次増幅産物の生成を例
示する。一般的には、相補的第２鎖のための反応工程は
第１鎖の工程と同様である。しかしながら、第２増幅プ
ライマー（Ｄ’）およびシグナルプライマーＣ’−Ｑ’
は最初に相補鎖にハイブリダイズして伸長合成される。
第１増幅プライマー（Ａ）およびシグナルプライマーＲ
−Ｂは、次に、置換されたＣ’−Ｑ’伸長合成産物
（Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｑ’、構造＃７）にハイブリダイ
ズし、そして伸長合成されてＲ−Ｂ−Ｃ−Ｑ（構造＃
８）を生成する。Ｒ−Ｂ−Ｃ−ＱへのＱ’−Ｃ’のハイ
ブリダイズおよび伸長合成は、二本鎖の二次増幅産物
Ｒ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｑ’／Ｒ−Ｂ−Ｃ−Ｑ（構造＃９）
をもたらす。この二次増幅産物は、取得およびリポータ
ー基を必要とするシステムにおいて、構造＃９中の両者
の特徴のために検出されうる。相補鎖のための反応も、
ニッキング、重合および置換により一次的に増幅されう
る反応産物を生成する（構造＃１０）。一般的には、リ
ポーター基または取得基のいずれかの不在のため、この
一次的増幅による一本鎖または二本鎖の何れの反応産物
も検出されない。それらは完全な制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位を欠くためさらに増幅はされない。しかしな
がら、Ｑが取得とは無関係に検出されうるリポーター基
を含めば（例えば、上記蛍光標識またはラジオアイソト
ープ）、構造＃１０および＃１１も検出される。
Ｃ−Ｄ）の相補的第２鎖からの二次増幅産物の生成を例
示する。一般的には、相補的第２鎖のための反応工程は
第１鎖の工程と同様である。しかしながら、第２増幅プ
ライマー（Ｄ’）およびシグナルプライマーＣ’−Ｑ’
は最初に相補鎖にハイブリダイズして伸長合成される。
第１増幅プライマー（Ａ）およびシグナルプライマーＲ
−Ｂは、次に、置換されたＣ’−Ｑ’伸長合成産物
（Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｑ’、構造＃７）にハイブリダイ
ズし、そして伸長合成されてＲ−Ｂ−Ｃ−Ｑ（構造＃
８）を生成する。Ｒ−Ｂ−Ｃ−ＱへのＱ’−Ｃ’のハイ
ブリダイズおよび伸長合成は、二本鎖の二次増幅産物
Ｒ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｑ’／Ｒ−Ｂ−Ｃ−Ｑ（構造＃９）
をもたらす。この二次増幅産物は、取得およびリポータ
ー基を必要とするシステムにおいて、構造＃９中の両者
の特徴のために検出されうる。相補鎖のための反応も、
ニッキング、重合および置換により一次的に増幅されう
る反応産物を生成する（構造＃１０）。一般的には、リ
ポーター基または取得基のいずれかの不在のため、この
一次的増幅による一本鎖または二本鎖の何れの反応産物
も検出されない。それらは完全な制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位を欠くためさらに増幅はされない。しかしな
がら、Ｑが取得とは無関係に検出されうるリポーター基
を含めば（例えば、上記蛍光標識またはラジオアイソト
ープ）、構造＃１０および＃１１も検出される。
【００２７】検出特異性は一般的に、図１および図２に
おけるように２つのシグナルプライマーを用いる場合に
改良されるが、単一のシグナルプライマーも用いられう
る。この方法は、図３に示される。この場合、シグナル
プライマーは取得基またはリポーター基の何れかを含ん
でよく、標的配列自身または増幅プライマーが付加的に
第２の取得基またはリポーター基を提供してよい。別法
としては、取得基およびリポーター基の両方が必要な場
合、シグナルプライマーは、シグナルオリゴヌクレオチ
ドが二本鎖になる場合に限って共に作用する取得基およ
びリポーター基の両方を含む。この構造は、標的配列の
存在が図３に示された複製開始、伸長合成、置換および
複製再開始を誘導する場合に限って形成される。このよ
うな２つの機能を有するプライマーは、さまざまな均一
検出分析、例えば蛍光異方性または蛍光エネルギー移送
のための基礎も形成する。
おけるように２つのシグナルプライマーを用いる場合に
改良されるが、単一のシグナルプライマーも用いられう
る。この方法は、図３に示される。この場合、シグナル
プライマーは取得基またはリポーター基の何れかを含ん
でよく、標的配列自身または増幅プライマーが付加的に
第２の取得基またはリポーター基を提供してよい。別法
としては、取得基およびリポーター基の両方が必要な場
合、シグナルプライマーは、シグナルオリゴヌクレオチ
ドが二本鎖になる場合に限って共に作用する取得基およ
びリポーター基の両方を含む。この構造は、標的配列の
存在が図３に示された複製開始、伸長合成、置換および
複製再開始を誘導する場合に限って形成される。このよ
うな２つの機能を有するプライマーは、さまざまな均一
検出分析、例えば蛍光異方性または蛍光エネルギー移送
のための基礎も形成する。
【００２８】図３にしたがって単一のシグナルプライマ
ーを用いて二次増幅産物を生成するためには、第１増幅
プライマー（Ａ）およびシグナルプライマーＲ−Ｂを一
本鎖標的配列Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｄ’にハイブリダイズ
させる。両プライマーを伸長合成し、そして第１増幅プ
ライマーの伸長合成によりシグナルプライマーＲ−Ｂ
（Ｒ−Ｂ−Ｃ−Ｄ）の伸長合成産物が置換され、よっ
て、構造＃１が生じる。第２シグナルプライマーがない
場合、第２増幅プライマー（Ｄ’）がＲ−Ｂ−Ｃ−Ｄに
ハイブリダイズして伸長合成され、よって、ニッキング
可能な、一方の鎖が修飾された制限エンドヌクレーアゼ
認識部位を伴う構造＃２が生じる。示されたとおり、ニ
ッキング、重合および置換によるこの産物の一次的増幅
は、シグナルプライマーがハイブリダイズしそして伸長
合成されるための断片を生じる。これにより、二本鎖二
次増幅産物の構造＃３が生じる。完全な制限エンドヌク
レーアゼ認識部位を欠くため、この産物は増幅不可能で
あるが、リポーター基または取得基が二本鎖の場合に限
って検出されうる場合はＲ／Ｒ’のために検出される
か、またはリポーター基がそれのみで検出されうる場合
はＲ／Ｒ’のために、検出される。リポーター基の検出
が二本鎖であることを要求しない場合（例えば、蛍光標
識）、構造＃１、＃２および＃３は二次増幅産物として
検出されうる。
ーを用いて二次増幅産物を生成するためには、第１増幅
プライマー（Ａ）およびシグナルプライマーＲ−Ｂを一
本鎖標的配列Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｄ’にハイブリダイズ
させる。両プライマーを伸長合成し、そして第１増幅プ
ライマーの伸長合成によりシグナルプライマーＲ−Ｂ
（Ｒ−Ｂ−Ｃ−Ｄ）の伸長合成産物が置換され、よっ
て、構造＃１が生じる。第２シグナルプライマーがない
場合、第２増幅プライマー（Ｄ’）がＲ−Ｂ−Ｃ−Ｄに
ハイブリダイズして伸長合成され、よって、ニッキング
可能な、一方の鎖が修飾された制限エンドヌクレーアゼ
認識部位を伴う構造＃２が生じる。示されたとおり、ニ
ッキング、重合および置換によるこの産物の一次的増幅
は、シグナルプライマーがハイブリダイズしそして伸長
合成されるための断片を生じる。これにより、二本鎖二
次増幅産物の構造＃３が生じる。完全な制限エンドヌク
レーアゼ認識部位を欠くため、この産物は増幅不可能で
あるが、リポーター基または取得基が二本鎖の場合に限
って検出されうる場合はＲ／Ｒ’のために検出される
か、またはリポーター基がそれのみで検出されうる場合
はＲ／Ｒ’のために、検出される。リポーター基の検出
が二本鎖であることを要求しない場合（例えば、蛍光標
識）、構造＃１、＃２および＃３は二次増幅産物として
検出されうる。
【００２９】
実施例１ 本発明のリアルタイムの増幅検出を、増幅された標的配
列の慣用的な後増幅（ｐｏｓｔ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ）検出と比較した。ミコバクテリウムツベルクロ
シス（Ｍ．ｔｂ）のＩＳ６１１０の配列の断片をウオー
カーらの方法（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．前記）にしたがったＳＤＡ反応において増幅した
が、各６０μｌ反応混合物は０．２μｇのヒト胎盤ＤＮ
Ａおよびさまざまな量のＭ．ｔｂゲノミックＤＮＡを含
んだ。増幅プライマー配列（Ｓ1およびＳ2）およびバン
パープライマー配列（Ｂ1およびＢ2）もウオーカーらの
方法（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．前記）
にしたがった。シグナルプライマーを取り込んだ増幅反
応に関しては、32Ｐ標識シグナルプライマー32Ｐ−ＣＧ
ＴＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＣ（配列番号：１）を最終濃
度６０ｎＭにて増幅前に反応物に加えた。これらの反応
物中で生成される二次増幅産物の長さは３５および５６
ヌクレオチドと予想された。増幅された標的配列の後増
幅検出に関しては、１／１０の反応混合物を用いて、ウ
オーカーらの方法（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．前記）にしたがって、配列番号：１のプライマー
伸長合成による増幅産物を検出したが、伸長合成産物は
３５または５６の長さのヌクレオチドを生じる。
列の慣用的な後増幅（ｐｏｓｔ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ）検出と比較した。ミコバクテリウムツベルクロ
シス（Ｍ．ｔｂ）のＩＳ６１１０の配列の断片をウオー
カーらの方法（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．前記）にしたがったＳＤＡ反応において増幅した
が、各６０μｌ反応混合物は０．２μｇのヒト胎盤ＤＮ
Ａおよびさまざまな量のＭ．ｔｂゲノミックＤＮＡを含
んだ。増幅プライマー配列（Ｓ1およびＳ2）およびバン
パープライマー配列（Ｂ1およびＢ2）もウオーカーらの
方法（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．前記）
にしたがった。シグナルプライマーを取り込んだ増幅反
応に関しては、32Ｐ標識シグナルプライマー32Ｐ−ＣＧ
ＴＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＣ（配列番号：１）を最終濃
度６０ｎＭにて増幅前に反応物に加えた。これらの反応
物中で生成される二次増幅産物の長さは３５および５６
ヌクレオチドと予想された。増幅された標的配列の後増
幅検出に関しては、１／１０の反応混合物を用いて、ウ
オーカーらの方法（１９９２ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．前記）にしたがって、配列番号：１のプライマー
伸長合成による増幅産物を検出したが、伸長合成産物は
３５または５６の長さのヌクレオチドを生じる。
【００３０】増幅は、Ｍ．ｔｂゲノム１から５００，０
００コピーの存在下で２時間３７℃において進行させ
た。増幅を停止した後、各反応物１／１０を変性ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に供した。たった１コピーの
Ｍ．ｔｂゲノムＤＮＡが、本発明のシグナルプライマー
を用いて検出された。また、シグナル強度は標的レベル
の低下に伴って低下したことから、二次増幅産物のレベ
ルは標的配列の増幅の程度を反映することが示された。
シグナルプライマーのリアルタイム伸長合成は、慣用的
後増幅プライマー伸長合成法より数倍低い感度としてゲ
ル上に現れたが、おそらく、32Ｐ標識シグナルプライマ
ーが、ＳＤＡプライマーよりも約１０倍低い濃度でＳＤ
Ａ反応に存在したためであろう。シグナルプライマーが
結合および伸長合成される前にＳＤＡプライマーを標的
配列上で伸長合成すれば、シグナルはまったく生じな
い。即ち、高濃度のシグナルプライマーは、シグナルプ
ライマーのハイブリダイゼーション動力学を改良するこ
とにより方法の感度を増加するべきである。高濃度のシ
グナルプライマーは、したがって、検出のために反応産
物を分離する場合に好ましいが、増幅プライマーの濃度
は慣用的ＳＤＡにおいて使用される濃度と同等に保たれ
る。しかしながら、均一検出法、例えば蛍光異方性のた
めにバックグラウンドを低く保つためには、低濃度のシ
グナルプライマーが好ましい。低濃度のシグナルプライ
マーは、慣用的ＳＤＡにおける慣例より低濃度のポリメ
ラーゼ、およびシグナルプライマーの上流にハイブリダ
イズする増幅プライマーを用いることが好ましい。この
実験は増幅反応混合物中のシグナルプライマーの存在が
顕著なレベルのバックグラウンドシグナルに通じないこ
とも証明する。事実、バックグラウンドシグナルレベル
は、後増幅プライマー伸長合成に比して、リアルタイム
のシグナルプライマー伸長合成により検出されるサンプ
ル中において、低いらしかった。
００コピーの存在下で２時間３７℃において進行させ
た。増幅を停止した後、各反応物１／１０を変性ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に供した。たった１コピーの
Ｍ．ｔｂゲノムＤＮＡが、本発明のシグナルプライマー
を用いて検出された。また、シグナル強度は標的レベル
の低下に伴って低下したことから、二次増幅産物のレベ
ルは標的配列の増幅の程度を反映することが示された。
シグナルプライマーのリアルタイム伸長合成は、慣用的
後増幅プライマー伸長合成法より数倍低い感度としてゲ
ル上に現れたが、おそらく、32Ｐ標識シグナルプライマ
ーが、ＳＤＡプライマーよりも約１０倍低い濃度でＳＤ
Ａ反応に存在したためであろう。シグナルプライマーが
結合および伸長合成される前にＳＤＡプライマーを標的
配列上で伸長合成すれば、シグナルはまったく生じな
い。即ち、高濃度のシグナルプライマーは、シグナルプ
ライマーのハイブリダイゼーション動力学を改良するこ
とにより方法の感度を増加するべきである。高濃度のシ
グナルプライマーは、したがって、検出のために反応産
物を分離する場合に好ましいが、増幅プライマーの濃度
は慣用的ＳＤＡにおいて使用される濃度と同等に保たれ
る。しかしながら、均一検出法、例えば蛍光異方性のた
めにバックグラウンドを低く保つためには、低濃度のシ
グナルプライマーが好ましい。低濃度のシグナルプライ
マーは、慣用的ＳＤＡにおける慣例より低濃度のポリメ
ラーゼ、およびシグナルプライマーの上流にハイブリダ
イズする増幅プライマーを用いることが好ましい。この
実験は増幅反応混合物中のシグナルプライマーの存在が
顕著なレベルのバックグラウンドシグナルに通じないこ
とも証明する。事実、バックグラウンドシグナルレベル
は、後増幅プライマー伸長合成に比して、リアルタイム
のシグナルプライマー伸長合成により検出されるサンプ
ル中において、低いらしかった。
【００３１】実施例２ ＳＤＡ反応は、前記のとおり（ウオーカーら、１９９３
ＰＣＲ法およびその応用 ３）、５０ｍＭ ＫiＰＯ4
（ｐＨ７．５）、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミ
ン、０．５ｍＭ ｄＵＴＰ、０．２ｍＭの各ｄＧＴＰ、
ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰαＳ、７ｍＭ ＭｇＣｌ2、１
１％（ｖ／ｖ）グリセロール、指示された濃度の増幅プ
ライマー、２５ｎＭ バンパープライマー、５０ｎｇ
ヒト胎盤ＤＮＡ、指示された量のエキソヌクレアーゼ欠
損クレノー（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）、１５０ユニットのＨｉｎｃＩＩ（Ｎ
ｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含んだ。反応
は、４１℃において指示された時間実施した。ＳＤＡ反
応は、増幅のためのＩＳ６１１０標的配列を含む、可変
量のＭ．ｔｂのＤＮＡを含んだ。用いられたＳ1増幅プ
ライマー配列、Ｂ1バンパープライマー配列およびＢ2バ
ンパープライマー配列はウオーカーら（１９９２ Ｎｕ
ｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、前記）に記載されていると
おりであった。Ｓ2増幅プライマー（配列番号：２）
は、それら著者により開示された標的結合配列およびＨ
ｉｎｃＩＩ部位を含んだが、５’末端にべつの配列を含
んだ。増幅プライマーはＩＳ６１１０のヌクレオチド番
号９７２−９８４および１０１１−１０２３にハイブリ
ダイズする。バンパープライマーはヌクレオチド番号９
５４−９６６および１０３２−１０４４にハイブリダイ
ズする。二次増幅産物は変性ポリアクリルアミドゲル上
の電気泳動後にオートラジオグラフィーにより可視化さ
れた。
ＰＣＲ法およびその応用 ３）、５０ｍＭ ＫiＰＯ4
（ｐＨ７．５）、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミ
ン、０．５ｍＭ ｄＵＴＰ、０．２ｍＭの各ｄＧＴＰ、
ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰαＳ、７ｍＭ ＭｇＣｌ2、１
１％（ｖ／ｖ）グリセロール、指示された濃度の増幅プ
ライマー、２５ｎＭ バンパープライマー、５０ｎｇ
ヒト胎盤ＤＮＡ、指示された量のエキソヌクレアーゼ欠
損クレノー（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）、１５０ユニットのＨｉｎｃＩＩ（Ｎ
ｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含んだ。反応
は、４１℃において指示された時間実施した。ＳＤＡ反
応は、増幅のためのＩＳ６１１０標的配列を含む、可変
量のＭ．ｔｂのＤＮＡを含んだ。用いられたＳ1増幅プ
ライマー配列、Ｂ1バンパープライマー配列およびＢ2バ
ンパープライマー配列はウオーカーら（１９９２ Ｎｕ
ｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、前記）に記載されていると
おりであった。Ｓ2増幅プライマー（配列番号：２）
は、それら著者により開示された標的結合配列およびＨ
ｉｎｃＩＩ部位を含んだが、５’末端にべつの配列を含
んだ。増幅プライマーはＩＳ６１１０のヌクレオチド番
号９７２−９８４および１０１１−１０２３にハイブリ
ダイズする。バンパープライマーはヌクレオチド番号９
５４−９６６および１０３２−１０４４にハイブリダイ
ズする。二次増幅産物は変性ポリアクリルアミドゲル上
の電気泳動後にオートラジオグラフィーにより可視化さ
れた。
【００３２】ＳＤＡ反応は、０．１ｎＭの５’−32Ｐ標
識シグナルプライマー（配列番号：３）の存在下で３時
間実施した。このシグナルプライマーは２８ヌクレオチ
ドの長さで、増幅プライマーの間においてＩＳ６１１０
標的配列のヌクレオチド番号９８５−１０１２にハイブ
リダイズする。Ｓ1およびＳ2はそれぞれ１８０ｎＭおよ
び３０ｎＭにて存在した。エキソヌクレアーゼ欠損クレ
ノーは０．２５ユニットで用いた。サンプル１−４は、
それぞれ１００，１０，１および０のＭ．ｔｂゲノム分
子を含んだ。ＳＤＡ反応の間、標的配列を鋳型として用
いて、配列番号：３をポリメラーゼにより４４ヌクレオ
チドの長さに伸長合成する。上記のとおり、この鋳型
は、ＳＤＡの間に生成した、置換された増幅標的鎖であ
りうるが、元の標的配列上のバンパープライマー、増幅
プライマーおよびシグナルプライマーの連続的伸長合成
は除去されず、同様に生じることが期待されるはずであ
る。上記４４マーは、上流の増幅プライマー（Ｓ2）の
伸長合成により標的配列から置換された。該４４ナーの
３’末端は第２増幅プライマー（Ｓ1）の３’末端にハ
イブリダイズし、そして二本鎖の６５マーはポリメラー
ゼによる伸長合成により形成される。該４４マーおよび
６５マーの二次増幅産物はＭ．ｔｂ標的配列の存在下に
おいてのみ観察されたことから、シグナルプライマーの
伸長合成および二本鎖形態への変換が示された。
識シグナルプライマー（配列番号：３）の存在下で３時
間実施した。このシグナルプライマーは２８ヌクレオチ
ドの長さで、増幅プライマーの間においてＩＳ６１１０
標的配列のヌクレオチド番号９８５−１０１２にハイブ
リダイズする。Ｓ1およびＳ2はそれぞれ１８０ｎＭおよ
び３０ｎＭにて存在した。エキソヌクレアーゼ欠損クレ
ノーは０．２５ユニットで用いた。サンプル１−４は、
それぞれ１００，１０，１および０のＭ．ｔｂゲノム分
子を含んだ。ＳＤＡ反応の間、標的配列を鋳型として用
いて、配列番号：３をポリメラーゼにより４４ヌクレオ
チドの長さに伸長合成する。上記のとおり、この鋳型
は、ＳＤＡの間に生成した、置換された増幅標的鎖であ
りうるが、元の標的配列上のバンパープライマー、増幅
プライマーおよびシグナルプライマーの連続的伸長合成
は除去されず、同様に生じることが期待されるはずであ
る。上記４４マーは、上流の増幅プライマー（Ｓ2）の
伸長合成により標的配列から置換された。該４４ナーの
３’末端は第２増幅プライマー（Ｓ1）の３’末端にハ
イブリダイズし、そして二本鎖の６５マーはポリメラー
ゼによる伸長合成により形成される。該４４マーおよび
６５マーの二次増幅産物はＭ．ｔｂ標的配列の存在下に
おいてのみ観察されたことから、シグナルプライマーの
伸長合成および二本鎖形態への変換が示された。
【００３３】前記のＳＤＡ反応は１５ヌクレオチドの長
さの32Ｐシグナルプライマー（配列番号：４）の０．１
ｎＭ（サンプル１−３）または１ｎＭ（サンプル４−
６）存在下で繰り返された。このシグナルプライマーは
増幅プライマーの間でＩＳ６１１０のヌクレオチド番号
９９９−１０１３にてハイブリダイズする。Ｓ1および
Ｓ2は５００ｎＭにて用いられた。２ユニットのエキソ
ヌクレアーゼ欠損クレノーを用い、そしてＳＤＡは２時
間実施された。配列番号：４の５’末端の３ヌクレオチ
ドおよび配列番号：２の３’末端の３ヌクレオチド（Ｓ
2増幅プライマー）は同一であり、したがって、同じＩ
Ｓ６１１０結合部位に関して競合する。サンプル１およ
び４は１００００Ｍ．ｔｂゲノム分子を含み、そしてサ
ンプル２および５は１００ゲノム分子を含んだ。サンプ
ル３および６はＭ．ｔｂのＤＮＡを含まなかった。
さの32Ｐシグナルプライマー（配列番号：４）の０．１
ｎＭ（サンプル１−３）または１ｎＭ（サンプル４−
６）存在下で繰り返された。このシグナルプライマーは
増幅プライマーの間でＩＳ６１１０のヌクレオチド番号
９９９−１０１３にてハイブリダイズする。Ｓ1および
Ｓ2は５００ｎＭにて用いられた。２ユニットのエキソ
ヌクレアーゼ欠損クレノーを用い、そしてＳＤＡは２時
間実施された。配列番号：４の５’末端の３ヌクレオチ
ドおよび配列番号：２の３’末端の３ヌクレオチド（Ｓ
2増幅プライマー）は同一であり、したがって、同じＩ
Ｓ６１１０結合部位に関して競合する。サンプル１およ
び４は１００００Ｍ．ｔｂゲノム分子を含み、そしてサ
ンプル２および５は１００ゲノム分子を含んだ。サンプ
ル３および６はＭ．ｔｂのＤＮＡを含まなかった。
【００３４】ＳＤＡ反応の間、４５マーおよび６６マー
の二次産物は、標的配列が増幅される場合に生成され
る。それらはＭ．ｔｂのＤＮＡが存在する場合に限って
観察されたことから、シグナルプライマーの伸長合成お
よび二本鎖形態への変換が示される（サンプル１、２、
４および５）。Ｍ．ｔｂのＤＮＡが不在の場合（サンプ
ル３および６）、放射性標識された産物は観察されなか
った。より敏感な検出は、０．１ｎＭに比して１ｎＭの
濃度のシグナルプライマーを用いた場合に（サンプル４
−６）得られたが、それは、ＳＤＡの間の、シグナルプ
ライマーに関するより好ましいハイブリダイゼーション
動力学およびシグナルプライマー／標的配列ハイブリッ
ドの改良された熱力学的安定性によるらしい。
の二次産物は、標的配列が増幅される場合に生成され
る。それらはＭ．ｔｂのＤＮＡが存在する場合に限って
観察されたことから、シグナルプライマーの伸長合成お
よび二本鎖形態への変換が示される（サンプル１、２、
４および５）。Ｍ．ｔｂのＤＮＡが不在の場合（サンプ
ル３および６）、放射性標識された産物は観察されなか
った。より敏感な検出は、０．１ｎＭに比して１ｎＭの
濃度のシグナルプライマーを用いた場合に（サンプル４
−６）得られたが、それは、ＳＤＡの間の、シグナルプ
ライマーに関するより好ましいハイブリダイゼーション
動力学およびシグナルプライマー／標的配列ハイブリッ
ドの改良された熱力学的安定性によるらしい。
【００３５】ＳＤＡは、４２ヌクレオチドの長さ（配列
番号：５）の５’−32Ｐ標識シグナルプライマー０．１
ｎＭの存在下で繰り返された。該シグナルプライマーの
３’末端の２６ヌクレオチド（標的結合配列）は、増幅
プライマーの間のヌクレオチド番号９８５−１０１０に
てＩＳ６１１０標的配列にハイブリダイズする。標的結
合配列の５’は制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩＩの
認識部位である。Ｓ1およびＳ2は１８０および３０ｎＭ
で存在した。エキソヌクレアーゼ欠損クレノーは０．２
５ユニットで使用され、ＳＤＡは３時間実施された。サ
ンプル１−４は１００、１０、１および０のＭ．ｔｂゲ
ノム分子を含んだ。
番号：５）の５’−32Ｐ標識シグナルプライマー０．１
ｎＭの存在下で繰り返された。該シグナルプライマーの
３’末端の２６ヌクレオチド（標的結合配列）は、増幅
プライマーの間のヌクレオチド番号９８５−１０１０に
てＩＳ６１１０標的配列にハイブリダイズする。標的結
合配列の５’は制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩＩの
認識部位である。Ｓ1およびＳ2は１８０および３０ｎＭ
で存在した。エキソヌクレアーゼ欠損クレノーは０．２
５ユニットで使用され、ＳＤＡは３時間実施された。サ
ンプル１−４は１００、１０、１および０のＭ．ｔｂゲ
ノム分子を含んだ。
【００３６】ＳＤＡ反応の間、シグナルプライマーはポ
リメラーゼにより５８ヌクレオチドの長さまで伸長合成
される。この５８マーは、上流の増幅プライマー（配列
番号：２）の伸長合成により置換される。該５８マーの
３’末端は他の増幅プライマー（Ｓ1）の３’末端にハ
イブリダイズして、ポリメラーゼによる伸長合成により
二本鎖の７９マーを形成する。シグナルプライマーの
５’末端のＨｉｎｃＩＩ認識部位は、この二本鎖の７９
マーの形成によりＨｉｎｃＩＩによる切断が可能にな
る。即ち、二本鎖７９マーにおいては、元のシグナルプ
ライマーからなる鎖およびｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰ
およびｄＡＴＰαＳを用いてポリメラーゼ伸長合成によ
り形成された鎖の両者が切断される。ＨｉｎｃＩＩは、
元の一本鎖形態のシグナルプライマーを切断しない。Ｓ
ＤＡ反応における二本鎖７９マーの切断は、二次増幅産
物として検出可能な５’−32Ｐ標識１３マーを生成す
る。
リメラーゼにより５８ヌクレオチドの長さまで伸長合成
される。この５８マーは、上流の増幅プライマー（配列
番号：２）の伸長合成により置換される。該５８マーの
３’末端は他の増幅プライマー（Ｓ1）の３’末端にハ
イブリダイズして、ポリメラーゼによる伸長合成により
二本鎖の７９マーを形成する。シグナルプライマーの
５’末端のＨｉｎｃＩＩ認識部位は、この二本鎖の７９
マーの形成によりＨｉｎｃＩＩによる切断が可能にな
る。即ち、二本鎖７９マーにおいては、元のシグナルプ
ライマーからなる鎖およびｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰ
およびｄＡＴＰαＳを用いてポリメラーゼ伸長合成によ
り形成された鎖の両者が切断される。ＨｉｎｃＩＩは、
元の一本鎖形態のシグナルプライマーを切断しない。Ｓ
ＤＡ反応における二本鎖７９マーの切断は、二次増幅産
物として検出可能な５’−32Ｐ標識１３マーを生成す
る。
【００３７】５８マーおよび７９マーのプライマー伸長
合成二次増幅産物、および二次産物の切断産物は、Ｍ．
ｔｂのＤＮＡの存在下においてのみ観察されたことから
（サンプル１−３）、シグナルプライマーの伸長合成お
よび二本鎖形態への変換が示される。Ｍ．ｔｂのＤＮＡ
の不在下では、二次増幅産物（伸長合成産物または切断
産物）は観察されなかった。
合成二次増幅産物、および二次産物の切断産物は、Ｍ．
ｔｂのＤＮＡの存在下においてのみ観察されたことから
（サンプル１−３）、シグナルプライマーの伸長合成お
よび二本鎖形態への変換が示される。Ｍ．ｔｂのＤＮＡ
の不在下では、二次増幅産物（伸長合成産物または切断
産物）は観察されなかった。
【００３８】ＳＤＡは、３３ヌクレオチドの長さ（配列
番号：６）の５’−32Ｐ標識シグナルプライマー０．１
ｎＭの存在下で繰り返された。該シグナルプライマーの
３’末端の２６ヌクレオチド（標的結合配列）は、増幅
プライマーの間のヌクレオチド番号９８５−１０１０に
てＩＳ６１１０標的配列にハイブリダイズする。標的結
合配列の５’は制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩの認
識部位である。Ｓ1およびＳ2は、それぞれ１８０および
３０ｎＭで存在した。エキソヌクレアーゼ欠損クレノー
は０．２５ユニットで使用された。ＳＤＡは３時間実施
された。サンプル１−４は１００、１０、１および０の
Ｍ．ｔｂゲノム分子を含んだ。ＳＤＡの後、２０ユニッ
トのＥｃｏＲＩを各ＳＤＡ反応に加え、そしてサンプル
は３０分間３７℃においてインキュベートした。
番号：６）の５’−32Ｐ標識シグナルプライマー０．１
ｎＭの存在下で繰り返された。該シグナルプライマーの
３’末端の２６ヌクレオチド（標的結合配列）は、増幅
プライマーの間のヌクレオチド番号９８５−１０１０に
てＩＳ６１１０標的配列にハイブリダイズする。標的結
合配列の５’は制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩの認
識部位である。Ｓ1およびＳ2は、それぞれ１８０および
３０ｎＭで存在した。エキソヌクレアーゼ欠損クレノー
は０．２５ユニットで使用された。ＳＤＡは３時間実施
された。サンプル１−４は１００、１０、１および０の
Ｍ．ｔｂゲノム分子を含んだ。ＳＤＡの後、２０ユニッ
トのＥｃｏＲＩを各ＳＤＡ反応に加え、そしてサンプル
は３０分間３７℃においてインキュベートした。
【００３９】ＳＤＡ反応の間、シグナルプライマーはポ
リメラーゼにより４９ヌクレオチドの長さまで伸長合成
される。この４９マーは、上流の増幅プライマー（配列
番号：２）の伸長合成により置換される。該４９マーの
３’末端は他の増幅プライマー（Ｓ1）の３’末端にハ
イブリダイズして、ポリメラーゼによる伸長合成により
二本鎖の７０マーを形成する。シグナルプライマーの
５’末端のＥｃｏＲＩ認識部位は、この７０マーの形成
およびＥｃｏＲＩの添加によりＥｃｏＲＩによる切断が
可能になる。該二本鎖７０マーのＥｃｏＲＩ切断は、
５’−32Ｐ標識ジヌクレオチドである切断産物を生成す
る。このジヌクレオチドはオートラジオグラフィーにお
いて二次産物として検出されうる。
リメラーゼにより４９ヌクレオチドの長さまで伸長合成
される。この４９マーは、上流の増幅プライマー（配列
番号：２）の伸長合成により置換される。該４９マーの
３’末端は他の増幅プライマー（Ｓ1）の３’末端にハ
イブリダイズして、ポリメラーゼによる伸長合成により
二本鎖の７０マーを形成する。シグナルプライマーの
５’末端のＥｃｏＲＩ認識部位は、この７０マーの形成
およびＥｃｏＲＩの添加によりＥｃｏＲＩによる切断が
可能になる。該二本鎖７０マーのＥｃｏＲＩ切断は、
５’−32Ｐ標識ジヌクレオチドである切断産物を生成す
る。このジヌクレオチドはオートラジオグラフィーにお
いて二次産物として検出されうる。
【００４０】４９マーおよび７０マーのプライマー伸長
合成産物およびジヌクレオチドの二次増幅産物は、Ｍ．
ｔｂのＤＮＡの存在下においてのみ観察されたことから
（サンプル１−３）、シグナルプライマーの伸長合成お
よび二本鎖形態への変換が示される。Ｍ．ｔｂのＤＮＡ
の不在下では、二次増幅産物（伸長合成産物または切断
産物）は観察されなかった。
合成産物およびジヌクレオチドの二次増幅産物は、Ｍ．
ｔｂのＤＮＡの存在下においてのみ観察されたことから
（サンプル１−３）、シグナルプライマーの伸長合成お
よび二本鎖形態への変換が示される。Ｍ．ｔｂのＤＮＡ
の不在下では、二次増幅産物（伸長合成産物または切断
産物）は観察されなかった。
【００４１】32Ｐ−標識ジヌクレオチド切断産物は液体
シンチレーション計数によっても検出された。ＳＤＡ
は、０．５ｎＭの32Ｐ−標識された配列番号：６の存在
下で繰り返された。それをＳＤＡにおいて使用する前
に、32Ｐ−標識シグナルプライマーは、変性ゲル電気泳
動により、キナーゼ標識反応において用いられたガンマ
32Ｐ−ＡＴＰから分離精製された。Ｓ1およびＳ2は１８
０および３０ｎＭにて存在した。エキソヌクレアーゼ欠
損クレノーは０．２５ユニットで使用された。ＳＤＡは
３時間実施された。サンプル１−７は１０5、１０4、１
０3、１０2、１０、１および０のＭ．ｔｂゲノム分子を
含んだ。ＳＤＡの後、４０ユニットのＥｃｏＲＩを各Ｓ
ＤＡ反応に加え、そしてサンプルは３０分間３７℃にお
いてインキュベートした。
シンチレーション計数によっても検出された。ＳＤＡ
は、０．５ｎＭの32Ｐ−標識された配列番号：６の存在
下で繰り返された。それをＳＤＡにおいて使用する前
に、32Ｐ−標識シグナルプライマーは、変性ゲル電気泳
動により、キナーゼ標識反応において用いられたガンマ
32Ｐ−ＡＴＰから分離精製された。Ｓ1およびＳ2は１８
０および３０ｎＭにて存在した。エキソヌクレアーゼ欠
損クレノーは０．２５ユニットで使用された。ＳＤＡは
３時間実施された。サンプル１−７は１０5、１０4、１
０3、１０2、１０、１および０のＭ．ｔｂゲノム分子を
含んだ。ＳＤＡの後、４０ユニットのＥｃｏＲＩを各Ｓ
ＤＡ反応に加え、そしてサンプルは３０分間３７℃にお
いてインキュベートした。
【００４２】各５０μｌＳＤＡ反応物からの１２．５μ
ｌアリコートを、２０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４），５０ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2で７
５μｌに希釈した。次に、これらサンプル各々をＭＩＣ
ＲＯＣＯＮ−１０ミクロ濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，ＭＡ）にて濾過し、そして濾過物中およびフ
ィルター上の32Ｐ比活性を液体シンチレーション計数に
より検出した。結果を以下に示す。
ｌアリコートを、２０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４），５０ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2で７
５μｌに希釈した。次に、これらサンプル各々をＭＩＣ
ＲＯＣＯＮ−１０ミクロ濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，ＭＡ）にて濾過し、そして濾過物中およびフ
ィルター上の32Ｐ比活性を液体シンチレーション計数に
より検出した。結果を以下に示す。
【００４３】 サンプル 初期のＭ．ｔｂ 濾過物 フィルター ゲノム分子 （ｃｐｍ） （ｃｐｍ） １ １０5 １３，４４９ ４４，８０２ ２ １０4 １２，２９９ ４９，３６６ ３ １０3 ９，００６ ５０，７３９ ４ １０2 ６，６８９ ５２，７１２ ５ １０ ３，１５３ ５７，７３２ ６ １ ２，０７２ ５５，８３５ ７ ０ ２，１２０ ５７，９９５ 二本鎖７０マー伸長合成産物のＥｃｏＲＩ切断により放
出された32Ｐ−ジヌクレオチドはＭＩＣＲＯＣＯＮ−１
０フィルターを通過するには十分小さく、一方、より大
きな初期の32Ｐ−標識３３マーシグナルプライマーおよ
び32Ｐ−標識４９マー伸長合成産物はフィルター上に残
る。この濾過検出法を用いて、ＳＤＡ前に、ＩＳ６１１
０標的配列が１０以下のＭ．ｔｂゲノムを含むサンプル
中で検出できた。
出された32Ｐ−ジヌクレオチドはＭＩＣＲＯＣＯＮ−１
０フィルターを通過するには十分小さく、一方、より大
きな初期の32Ｐ−標識３３マーシグナルプライマーおよ
び32Ｐ−標識４９マー伸長合成産物はフィルター上に残
る。この濾過検出法を用いて、ＳＤＡ前に、ＩＳ６１１
０標的配列が１０以下のＭ．ｔｂゲノムを含むサンプル
中で検出できた。
【００４４】実施例３ 一方が取得のために修飾され、他方が検出促進のために
修飾された２つのシグナルプライマーを用いて、ＳＤＡ
反応において二次増幅産物を生成した。この実験におい
て、一方のシグナルプライマーはその５’末端に付加さ
れた親和性リガンド（Ｑ’：３つのビオチンモイエテ
ィ）を有し、第２のシグナルプライマーはリポーター基
（Ｒ：32Ｐ−含有リン酸基）で５’末端を標識した。即
ち、リポーター基および親和性リガンドの両者（図１お
よび２の構造＃３および＃９のようなもの）を含む二本
鎖二次増幅産物が取得および検出された。この実施例に
おいては、ストレプトアビジンでコートされた磁気性ビ
ーズを用いて、二次増幅産物を取得および検出し、次に
それらをシンチレーション計数により検出した。
修飾された２つのシグナルプライマーを用いて、ＳＤＡ
反応において二次増幅産物を生成した。この実験におい
て、一方のシグナルプライマーはその５’末端に付加さ
れた親和性リガンド（Ｑ’：３つのビオチンモイエテ
ィ）を有し、第２のシグナルプライマーはリポーター基
（Ｒ：32Ｐ−含有リン酸基）で５’末端を標識した。即
ち、リポーター基および親和性リガンドの両者（図１お
よび２の構造＃３および＃９のようなもの）を含む二本
鎖二次増幅産物が取得および検出された。この実施例に
おいては、ストレプトアビジンでコートされた磁気性ビ
ーズを用いて、二次増幅産物を取得および検出し、次に
それらをシンチレーション計数により検出した。
【００４５】ビオチン化シグナルプライマーは以下のと
おりに調製した。標準的ホスホロアミダイト化学を用い
て、配列番号：７のオリゴヌクレオチドをＡｐｐｌｉｅ
ｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社ＤＮＡ合成機モデル３８０Ａ
上で合成した。次に、この機械を用いて、ＢＩＯＴＩＮ
ＯＮホスホロアミダイト（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）によ
る３つの連続的カップリングにより３つのビオチン基を
このオリゴヌクレオチドに付加した。合成後、オリゴヌ
クレオチドは濃縮アンモニアにより処理されて脱保護さ
れ、そして変性ゲル電気泳動により精製された。二次増
幅産物の取得のための親和性リガンドを付加されたビオ
チン化シグナルプライマーは本明細書にて取得シグナル
プライマーと呼ばれ、そしてこの実施例の目的に関し
て、図１および図２のＱ’−Ｃ’シグナルプライマー
（Ｑ’はビオチン）と類似である。
おりに調製した。標準的ホスホロアミダイト化学を用い
て、配列番号：７のオリゴヌクレオチドをＡｐｐｌｉｅ
ｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社ＤＮＡ合成機モデル３８０Ａ
上で合成した。次に、この機械を用いて、ＢＩＯＴＩＮ
ＯＮホスホロアミダイト（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）によ
る３つの連続的カップリングにより３つのビオチン基を
このオリゴヌクレオチドに付加した。合成後、オリゴヌ
クレオチドは濃縮アンモニアにより処理されて脱保護さ
れ、そして変性ゲル電気泳動により精製された。二次増
幅産物の取得のための親和性リガンドを付加されたビオ
チン化シグナルプライマーは本明細書にて取得シグナル
プライマーと呼ばれ、そしてこの実施例の目的に関し
て、図１および図２のＱ’−Ｃ’シグナルプライマー
（Ｑ’はビオチン）と類似である。
【００４６】32Ｐ−標識シグナルプライマーを調製する
ために、配列番号：１および８のオリゴヌクレオチド
を、ウオーカーら（１９９２ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，前記）に記載されたとおりに、放射性リン酸
で標識した。放射性標識されたシグナルプライマーは検
出シグナルプライマーと呼ばれ、そしてこの実施例の目
的に関して、図１および図２のＲ−Ｂシグナルプライマ
ー（Ｒは放射性標識からなる）と類似である。この実験
においては、これら２つの検出シグナルプライマーのひ
とつを取得シグナルプライマーと共に用いて二次増幅産
物を生成した。
ために、配列番号：１および８のオリゴヌクレオチド
を、ウオーカーら（１９９２ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，前記）に記載されたとおりに、放射性リン酸
で標識した。放射性標識されたシグナルプライマーは検
出シグナルプライマーと呼ばれ、そしてこの実施例の目
的に関して、図１および図２のＲ−Ｂシグナルプライマ
ー（Ｒは放射性標識からなる）と類似である。この実験
においては、これら２つの検出シグナルプライマーのひ
とつを取得シグナルプライマーと共に用いて二次増幅産
物を生成した。
【００４７】ＳＤＡは、以下の修飾と共に、本質的には
ウオーカーら（１９９２ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，前記）に記載されたとおりに実施した。増幅プラ
イマーは配列番号：９および１０であった（図１および
図２のＡおよびＤ’に類似する）。これらのプライマー
はＭ．ｔｂのＩＳ６１１０インサーションエレメントの
１０３ヌクレオチド断片（ヌクレオチド番号９４４−１
０４６）を増幅する。各反応物５０μｌは以下の成分を
含んだ：４５ｍＭ ＫiＰＯ4，ｐＨ７．５；６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2；０．１ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ；１２％
ジメチルスルフォキシド；０．５ｍＭ ｄＵＴＰ；０．
２ｍＭ各ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰαＳ；５０
０ｎＭ増幅プライマー；５０ｎＭバンパープライマー
（配列番号：１１および１２）；７５ｎＭ検出シグナル
プライマーおよび取得シグナルプライマー（配列番号１
および７または配列番号８および７）；１００ｎｇヒト
胎盤ＤＮＡ；１５０ユニットＨｉｎｃＩＩ（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；２．５ユニットｅｘ
ｏ-クレノーＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）；３％（ｖ／ｖ）グリセロール（酵素と
共に）；および０または１０5コピーのＭ．ｔｂゲノ
ム。
ウオーカーら（１９９２ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，前記）に記載されたとおりに実施した。増幅プラ
イマーは配列番号：９および１０であった（図１および
図２のＡおよびＤ’に類似する）。これらのプライマー
はＭ．ｔｂのＩＳ６１１０インサーションエレメントの
１０３ヌクレオチド断片（ヌクレオチド番号９４４−１
０４６）を増幅する。各反応物５０μｌは以下の成分を
含んだ：４５ｍＭ ＫiＰＯ4，ｐＨ７．５；６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2；０．１ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ；１２％
ジメチルスルフォキシド；０．５ｍＭ ｄＵＴＰ；０．
２ｍＭ各ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰαＳ；５０
０ｎＭ増幅プライマー；５０ｎＭバンパープライマー
（配列番号：１１および１２）；７５ｎＭ検出シグナル
プライマーおよび取得シグナルプライマー（配列番号１
および７または配列番号８および７）；１００ｎｇヒト
胎盤ＤＮＡ；１５０ユニットＨｉｎｃＩＩ（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；２．５ユニットｅｘ
ｏ-クレノーＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）；３％（ｖ／ｖ）グリセロール（酵素と
共に）；および０または１０5コピーのＭ．ｔｂゲノ
ム。
【００４８】ＭｇＣｌ2、ＨｉｎｃＩＩおよびポリメラ
ーゼ以外のすべての反応成分を混合して、該混合物を９
５℃にて２分間加熱した。次に、サンプルを水浴中で４
０℃にて２分間置き、３μｌの０．１Ｍ ＭｇＣｌ2を
各サンプルに加えてサンプルを混合した。５０ユニット
／μｌのＨｉｎｃＩＩ、０．８３３ユニット／μｌのポ
リメラーゼおよび５０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含
む３μｌの酵素混合物を加えてサンプルを４０℃にて２
時間インキュベートした。
ーゼ以外のすべての反応成分を混合して、該混合物を９
５℃にて２分間加熱した。次に、サンプルを水浴中で４
０℃にて２分間置き、３μｌの０．１Ｍ ＭｇＣｌ2を
各サンプルに加えてサンプルを混合した。５０ユニット
／μｌのＨｉｎｃＩＩ、０．８３３ユニット／μｌのポ
リメラーゼおよび５０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含
む３μｌの酵素混合物を加えてサンプルを４０℃にて２
時間インキュベートした。
【００４９】インキュベート後、各反応混合物の５μｌ
アリコートを変性ゲル電気泳動にて分析した。ゲル上の
検出はＲの存在のみを必要とするので、Ｍ．ｔｂのゲノ
ミックＤＮＡを含むサンプルに関しては５０−１２０ヌ
クレオチドのさまざまな産物が現れた。これらのバンド
はＭ．ｔｂのＤＮＡを欠く場合に存在しなかったことか
ら、この範囲のサイズの反応産物は標的特異的であった
ことが示唆された。図１および図２に記載された反応ス
キムによるシグナルプライマーの既知サイズおよび結合
位置の計算により決定された、この実施例に関して予測
された二次増幅産物は以下の表に示される。図１および
図２から明らかなとおり、構造＃３（変性ゲル上では一
本鎖の形態）はＲを含み、検出可能である。さらに、検
出可能な一本鎖の構造＃３は、構造＃２および検出可能
な一本鎖の構造＃９と同一である。これら二次増幅産物
はしたがって、ゲル上では識別不可能である。構造＃４
および＃５（変性ゲル上ではこれらも一本鎖の形態）
も、Ｒの存在のために検出可能である。
アリコートを変性ゲル電気泳動にて分析した。ゲル上の
検出はＲの存在のみを必要とするので、Ｍ．ｔｂのゲノ
ミックＤＮＡを含むサンプルに関しては５０−１２０ヌ
クレオチドのさまざまな産物が現れた。これらのバンド
はＭ．ｔｂのＤＮＡを欠く場合に存在しなかったことか
ら、この範囲のサイズの反応産物は標的特異的であった
ことが示唆された。図１および図２に記載された反応ス
キムによるシグナルプライマーの既知サイズおよび結合
位置の計算により決定された、この実施例に関して予測
された二次増幅産物は以下の表に示される。図１および
図２から明らかなとおり、構造＃３（変性ゲル上では一
本鎖の形態）はＲを含み、検出可能である。さらに、検
出可能な一本鎖の構造＃３は、構造＃２および検出可能
な一本鎖の構造＃９と同一である。これら二次増幅産物
はしたがって、ゲル上では識別不可能である。構造＃４
および＃５（変性ゲル上ではこれらも一本鎖の形態）
も、Ｒの存在のために検出可能である。
【００５０】
【表１】 予想される二次増幅産物のサイズ （ｎｔ：ヌクレオチド） 構造 32Ｐ−標識シグナルプライマー （図１および図２） 配列番号１ 配列番号：８ ＃３，＃９および＃８ ５２ｎｔ ９２ｎｔ ＃４ ５８ｎｔ ９８ｎｔ ＃５ ７９ｎｔ １１９ｎｔ ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（Ｓｔｒ
ｅｐｔａｖｉｄｉｎＰａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒ
ｔｉｃｌｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｏｄＱｕａｌｉｆ
ｉｅｄ，１ｍｇ／ｍｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、指示書にした
がって１×ＰＢＳで３回洗浄した。各分析に関しては、
５０μｇのビーズを１．５ｍｌエッペンドルフチューブ
中の１８０μｌの１×ＰＢＳに懸濁して２０μｌのＳＤ
Ａ反応混合物と混合した。これらサンプルを室温にて１
０分間、時折撹拌しながらインキュベートした。次に、
磁石を用いてビーズをチューブの一方の側に集めて上清
を捨てた。次に、ビーズを１×ＰＢＳに懸濁し、磁石に
よりチューブの一方の側にビーズを集めて上清を捨てる
ことにより、ビーズを洗浄した。この洗浄工程は３回以
上繰り返され、そしてビーズ上に残る32Ｐ比活性は液体
シンチレーション計数により検出した。結果を以下の表
に示す。
ｅｐｔａｖｉｄｉｎＰａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒ
ｔｉｃｌｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｏｄＱｕａｌｉｆ
ｉｅｄ，１ｍｇ／ｍｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、指示書にした
がって１×ＰＢＳで３回洗浄した。各分析に関しては、
５０μｇのビーズを１．５ｍｌエッペンドルフチューブ
中の１８０μｌの１×ＰＢＳに懸濁して２０μｌのＳＤ
Ａ反応混合物と混合した。これらサンプルを室温にて１
０分間、時折撹拌しながらインキュベートした。次に、
磁石を用いてビーズをチューブの一方の側に集めて上清
を捨てた。次に、ビーズを１×ＰＢＳに懸濁し、磁石に
よりチューブの一方の側にビーズを集めて上清を捨てる
ことにより、ビーズを洗浄した。この洗浄工程は３回以
上繰り返され、そしてビーズ上に残る32Ｐ比活性は液体
シンチレーション計数により検出した。結果を以下の表
に示す。
【００５１】
【表２】 検出シグナルプライマー １０５初期ゲノム分子 ０初期ゲノム分子 配列番号：１ ８０，５４７ｃｐｍ １，０８０ｃｐｍ 配列番号：８ ５４，３８５ｃｐｍ ９６１ｃｐｍ シンチレーションによる計数の前に取られた小アリコー
トのビーズ（１０％）を５０％尿素の存在下で９５℃に
て加熱し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し
た。構造＃３および＃９のみがビオチン修飾および32Ｐ
標識の両者を含み、これらの構造のみがビーズを結合し
て検出されうるはずであるということは予想されたこと
であった。ゲルのオートラジオグラフィーから、構造＃
３および＃９の二次増幅産物が磁気分離工程におけるビ
ーズにより保持された主たる放射活性種を示すことが示
される。しかしながら、構造＃１に相当する少量の放射
活性種もオートラジオグラム上に現れた。検出シグナル
プライマーの伸長合成により生成された構造＃１がＱ’
−Ｃ’取得シグナルプライマーにハイブリダイズした場
合に（シグナルプライマーの伸長合成および構造＃２の
生成前；図１の構造＃１以下の反応工程を参照された
い）、取得されることが可能である。予測された構造＃
３および＃９に加えて少量の構造＃１が明らかに取得お
よび検出されたが、すべての取得および検出された二次
増幅産物は標的特異的であり、そしてＭ．ｔｂのゲノミ
ックＤＮＡを欠くサンプルには現れなかった。
トのビーズ（１０％）を５０％尿素の存在下で９５℃に
て加熱し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し
た。構造＃３および＃９のみがビオチン修飾および32Ｐ
標識の両者を含み、これらの構造のみがビーズを結合し
て検出されうるはずであるということは予想されたこと
であった。ゲルのオートラジオグラフィーから、構造＃
３および＃９の二次増幅産物が磁気分離工程におけるビ
ーズにより保持された主たる放射活性種を示すことが示
される。しかしながら、構造＃１に相当する少量の放射
活性種もオートラジオグラム上に現れた。検出シグナル
プライマーの伸長合成により生成された構造＃１がＱ’
−Ｃ’取得シグナルプライマーにハイブリダイズした場
合に（シグナルプライマーの伸長合成および構造＃２の
生成前；図１の構造＃１以下の反応工程を参照された
い）、取得されることが可能である。予測された構造＃
３および＃９に加えて少量の構造＃１が明らかに取得お
よび検出されたが、すべての取得および検出された二次
増幅産物は標的特異的であり、そしてＭ．ｔｂのゲノミ
ックＤＮＡを欠くサンプルには現れなかった。
【００５２】Ｍ．ｔｂのＤＮＡが存在しない（０初期ゲ
ノム分子）ビーズ上で検出されたバックグラウンド放射
活性は未反応のシグナルプライマーの非特異的結合によ
るらしい。これらサンプルからのビーズの電気泳動分析
から、存在する放射活性物質のみは、オートラジオグラ
ムの一晩の暴露後でさえも検出シグナルプライマーに対
応する極めて薄いバンドであったことが示された。しか
しながら、二次増幅産物は、上記のこれらバックグラウ
ンドレベルのシグナルをはっきりと検出した。
ノム分子）ビーズ上で検出されたバックグラウンド放射
活性は未反応のシグナルプライマーの非特異的結合によ
るらしい。これらサンプルからのビーズの電気泳動分析
から、存在する放射活性物質のみは、オートラジオグラ
ムの一晩の暴露後でさえも検出シグナルプライマーに対
応する極めて薄いバンドであったことが示された。しか
しながら、二次増幅産物は、上記のこれらバックグラウ
ンドレベルのシグナルをはっきりと検出した。
【００５３】
配列番号：１ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 CGTTATCCAC CATAC 15 配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１９．．２４ 他の情報：ＨｉｎｃＩＩ認識部位 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１５．．３７ 他の情報：標的結合配列 配列 GCATTATAGT ACCTGTCTGT TGACACTGAG ATCCCCT 37 配列番号：３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 CTATCCGTAT GGTGGATAAC GTCTTTCA 28 配列番号：４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 CCTATCCGTA TGGTG 15 配列番号：５ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１１．．１６ 他の情報：ＨｉｎｃＩＩ認識部位 配列 GTACGTCTAT GTCAACATCC GTATGGTGGA TAACGTCTTT CA 42 配列番号：６ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 GGAATTCATC CGTATGGTGG ATAACGTCTT TCA 33 配列番号：７ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 TGACAGCATG ATAGAGCGGC ACTGAGATCC CCT 33 配列番号：８ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 TTCATTGGCA CATAAACAGC GGCGTACTCG ACC 33 配列番号：９ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 TTGAATAGTG CCTTACTTGT TGACGCAAGC CATCTG 36 配列番号：１０ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 TTGAAGTAAG GCACTATTGT TGACTCGCTG AACCG 33 配列番号：１１ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 TCCATGGTCC TC 11 配列番号：１２ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 CATAGGAGCT TCC 13
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 CGTTATCCAC CATAC 15 配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１９．．２４ 他の情報：ＨｉｎｃＩＩ認識部位 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１５．．３７ 他の情報：標的結合配列 配列 GCATTATAGT ACCTGTCTGT TGACACTGAG ATCCCCT 37 配列番号：３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 CTATCCGTAT GGTGGATAAC GTCTTTCA 28 配列番号：４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 CCTATCCGTA TGGTG 15 配列番号：５ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１１．．１６ 他の情報：ＨｉｎｃＩＩ認識部位 配列 GTACGTCTAT GTCAACATCC GTATGGTGGA TAACGTCTTT CA 42 配列番号：６ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 GGAATTCATC CGTATGGTGG ATAACGTCTT TCA 33 配列番号：７ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 TGACAGCATG ATAGAGCGGC ACTGAGATCC CCT 33 配列番号：８ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 TTCATTGGCA CATAAACAGC GGCGTACTCG ACC 33 配列番号：９ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 TTGAATAGTG CCTTACTTGT TGACGCAAGC CATCTG 36 配列番号：１０ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 TTGAAGTAAG GCACTATTGT TGACTCGCTG AACCG 33 配列番号：１１ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 TCCATGGTCC TC 11 配列番号：１２ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ミコバクテリウム ツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 CATAGGAGCT TCC 13
【図１】図１は、本発明の方法の工程を示し、２つのシ
グナルプライマーを用いて一本鎖標的配列からの二次増
幅産物の生成を例示する。
グナルプライマーを用いて一本鎖標的配列からの二次増
幅産物の生成を例示する。
【図２】図２は、本発明の方法の工程を示し、元の標的
配列が二本鎖の場合の相補鎖から始まる、図１と類似の
工程を示す。
配列が二本鎖の場合の相補鎖から始まる、図１と類似の
工程を示す。
【図３】図３は、一本鎖シグナルプライマーを用いた二
次産物の生成を例示する。
次産物の生成を例示する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョージ・テランス・ウォーカー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，マウント・ボラ ス・ロード 209
Claims (10)
- 【請求項１】 （ａ）シグナルプライマーを標的配列に
ハイブリダイズさせ、そして第１ＳＤＡ増幅プライマー
をシグナルプライマーの上流にて標的配列にハイブリダ
イズさせ； （ｂ）標的配列上にハイブリダイズしたシグナルプライ
マーを伸長合成してシグナルプライマー伸長合成産物を
生成し、そして第１増幅プライマーがシグナルプライマ
ー伸長合成産物を標的配列から置換するように、標的配
列上にハイブリダイズした第１増幅プライマーを伸長合
成し； （ｃ）第２ＳＤＡ増幅プライマーをシグナルプライマー
伸長合成産物にハイブリダイズさせ、そしてシグナルプ
ライマー伸長合成産物上にハイブリダイズした第２増幅
プライマーを伸長合成することにより、新たに合成され
た鎖および二本鎖の一方の鎖のみが修飾されている制限
エンドヌクレアーゼの認識部位からなる第２増幅プライ
マー伸長合成産物を生成し； （ｄ）一方の鎖のみが修飾されている認識部位にニック
を入れ、そしてＤＮＡポリメラーゼを用いてシグナルプ
ライマー伸長合成産物から新たに合成された鎖を置換
し；そして （ｅ）置換された新たに合成された鎖にシグナルプライ
マーをハイブリダイズさせ、そして二本鎖二次増幅産物
が生成されるようにシグナルプライマーを伸長合成する
工程からなる、鎖置換増幅（ＳＤＡ）における二次増幅
産物および増幅産物を連続して生成する方法であって、
その際、ＳＤＡの反応物は、（ｉ）鎖置換活性および
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメ
ラーゼおよび（ｉｉ）二本鎖の一方の鎖のみが修飾され
た制限エンドヌクレアーゼ認識部位においてニックを入
れる制限エンドヌクレアーゼからなる、前記方法。 - 【請求項２】 化学修飾手段または特定のヌクレオチド
配列をシグナルプライマーに取り込むことにより二次増
幅産物を検出することをさらに含む、請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 親和性リガンド手段またはリポーター基
をシグナルプライマーに取り込むことにより二次増幅産
物を検出する、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質のための認識
部位を含むヌクレオチド配列をシグナルプライマーに取
り込むことにより二次増幅産物を検出する、請求項２記
載の方法。 - 【請求項５】 （ａ）第１シグナルプライマーを二本鎖
標的配列の第１鎖にハイブリダイズさせ、そして第１Ｓ
ＤＡ増幅プライマーを第１シグナルプライマーの上流に
て標的配列の第１鎖にハイブリダイズさせ； （ｂ）標的配列の第１鎖上にハイブリダイズした第１シ
グナルプライマーを伸長合成して第１伸長合成産物を生
成し、そして第１増幅プライマーの伸長合成が第１伸長
合成産物を標的配列から置換するように、標的配列の第
１鎖上にハイブリダイズした第１増幅プライマーを伸長
合成し； （ｃ）第２シグナルプライマーを第１伸長合成産物にハ
イブリダイズさせ、そして第２シグナルプライマーの上
流にて第１伸長合成産物に第２ＳＤＡ増幅プライマーを
ハイブリダイズさせ； （ｄ）第１伸長合成産物上にハイブリダイズしている第
２シグナルプライマーを伸長合成して第２伸長合成産物
を生成し、そして第２増幅プライマーの伸長合成が第２
伸長合成産物を第１伸長合成産物から置換するように、
第１伸長合成産物上にハイブリダイズした第２増幅プラ
イマーを伸長合成し；そして （ｅ）置換された第２伸長合成産物に第１シグナルプラ
イマーをハイブリダイズさせ、そして二本鎖二次増幅産
物が生成されるように、第２伸長合成産物上にハイブリ
ダイズした第１シグナルプライマーを伸長合成する工程
からなる、鎖置換増幅（ＳＤＡ）における二次増幅産物
および増幅産物を連続して生成する方法であって、その
際、ＳＤＡの反応物は、（ｉ）鎖置換活性および５’−
３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ
および（ｉｉ）二本鎖の一方の鎖のみが修飾された制限
エンドヌクレアーゼ認識部位においてニックを入れる制
限エンドヌクレアーゼからなる、前記方法。 - 【請求項６】 第１シグナルプライマーに取り込まれた
リポーター基を用いて二次増幅産物を検出することによ
り第２シグナルプライマーに取り込まれた二次増幅産物
の取得を促進することをさらに含む、請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】 さらに、以下の工程： （ｆ）二本鎖標的配列の第２鎖に第２シグナルプライマ
ーをハイブリダイズさせ、そして第２シグナルプライマ
ーの上流において標的配列の第２鎖に第２増幅プライマ
ーをハイブリダイズさせ； （ｇ）第２鎖にハイブリダイズした第２シグナルプライ
マーを伸長合成させて第３伸長合成産物を生成させ、そ
して第２増幅プライマーの伸長合成が第３伸長合成産物
を標的配列の第２鎖から置換するように、標的配列の第
２鎖上にハイブリダイズした第２増幅プライマーを伸長
合成し； （ｈ）置換された第３伸長合成産物に第１シグナルプラ
イマーをハイブリダイズさせ、そして第１シグナルプラ
イマーの上流において、置換された第３伸長合成産物に
第１増幅プライマーをハイブリダイズさせ； （ｉ）第３伸長合成産物にハイブリダイズした第１シグ
ナルプライマーを伸長合成させて第４伸長合成産物を生
成し、そして第１増幅プライマーの伸長合成が第４伸長
合成産物を第３伸長合成産物から置換するように、第３
伸長合成産物上にハイブリダイズした第１増幅プライマ
ーを伸長合成し；そして （ｊ）置換された第４伸長合成産物に第２シグナルプラ
イマーをハイブリダイズさせ、そして二本鎖二次増幅産
物が生成されるように、第４伸長合成産物上の第２シグ
ナルプライマーを伸長合成することを含む、請求項５記
載の方法。 - 【請求項８】 化学修飾手段または特定のヌクレオチド
配列をシグナルプライマーに取り込むことにより二次増
幅産物を検出することをさらに含む、請求項７記載の方
法。 - 【請求項９】 親和性リガンド手段またはリポーター基
をシグナルプライマーに取り込むことにより二次増幅産
物を検出する、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質のための認
識部位を含むヌクレオチド配列をシグナルプライマーに
取り込むことにより二次増幅産物を検出する、請求項８
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US229281 | 1994-04-18 | ||
| US08/229,281 US5547861A (en) | 1994-04-18 | 1994-04-18 | Detection of nucleic acid amplification |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07289299A true JPH07289299A (ja) | 1995-11-07 |
| JP2674737B2 JP2674737B2 (ja) | 1997-11-12 |
Family
ID=22860539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7092397A Expired - Fee Related JP2674737B2 (ja) | 1994-04-18 | 1995-04-18 | 核酸増幅の検出 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5547861A (ja) |
| EP (1) | EP0678582B1 (ja) |
| JP (1) | JP2674737B2 (ja) |
| KR (1) | KR0145908B1 (ja) |
| AT (1) | ATE220724T1 (ja) |
| AU (1) | AU685903B2 (ja) |
| BR (1) | BR9501582A (ja) |
| CA (1) | CA2145576C (ja) |
| DE (1) | DE69527392T2 (ja) |
| ES (1) | ES2177590T3 (ja) |
| SG (1) | SG34216A1 (ja) |
| TW (1) | TW306977B (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002320487A (ja) * | 2000-07-27 | 2002-11-05 | Becton Dickinson & Co | ボルデテラ・ペルタシスの増幅および検出 |
| JP2002320486A (ja) * | 2000-07-27 | 2002-11-05 | Becton Dickinson & Co | レジオネラ・ニューモフィラの増幅および検出 |
| JP2013509880A (ja) * | 2009-11-05 | 2013-03-21 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | Ｌａｍｐ産物の均質リアルタイム検出のための配列特異的方法 |
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