CN101415843B

CN101415843B - 通过扩增和检测复制酶序列分析sars冠状病毒

Info

Publication number: CN101415843B
Application number: CN200480029048XA
Authority: CN
Inventors: J·娄; J·A·小普赖斯; D·A·尤尔西斯; D·M·伍尔夫; L·M·凯勒; T·J·赫利尔
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2003-09-12
Filing date: 2004-09-13
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2024-09-13
Also published as: CN101415843A; US7521185B2; US7723041B2; WO2005025407A2; CA2538082A1; US20090258340A1; WO2005025407A9; US20080044816A1; EP1662966A2

Abstract

本发明公开了来源于SARS-CoV核酸的、利于检测和/或定量复制酶基因的引物和探针。所公开的序列可以用于各种扩增和非扩增形式中检测SARS-CoV感染。

Description

通过扩增和检测复制酶序列分析SARS冠状病毒

本申请要求2003年9月12日提交的美国临时申请系列号60/502,279的优先权，该临时申请完整地并入此处作为参考。

技术领域

本发明涉及通过扩增和检测复制酶RNA序列分析严重急性呼吸道综合征冠状病毒的存在的方法。

背景技术

严重急性呼吸道综合征(SARS)是最近出现的与感染患者中的非典型肺炎有关的疾病。该疾病非常严重，并且没有已知的治疗方法。SARS的潜伏期一般为2至10天。Sympathkumar等，Mayo Clin.Proc.78：882-890(2003)。SARS的身体表现包括发烧，之后为无痰干咳及呼吸短促。在大约3％至10％的SARS病例中出现因呼吸衰竭导致的死亡。疾病控制和预防中心(CDC)，Morb.Mortal.Wkly.Report.52：357(2003)。

SARS的临床诊断常常是一个缓慢的过程，因为SARS疑似患者的初步诊断检查包括胸部X光片、脉搏血氧定量、血液培养、痰的革兰氏染色和培养、以及针对其它病毒性呼吸道感染的检查。CDC，Guidelines and Recommendations：Interim Guidelines forLaboratory Diagnosis of SARS-CoV Infection，Jul.(2003)。这一困难也反映在如下事实上：两种最常用的诊断程序——检测SARS病毒的血清抗体和在细胞培养中从临床样品分离病毒——常常花费数日或甚至数周来完成。CDC，Guidelines and Recommendations：Interim Guidelines for Laboratory Diagnosis of SARS-CoVInfection，Jul.(2003)。因此，重要的是，需要建立快速的非侵入性SARS检查法以监测和控制该疾病。

在2003年初，一种新的冠状病毒被鉴定为SARS的病原体。Drosten等，N.Engl.J.Med.348：1967-76(2003)。冠状病毒是一组多样的RNA病毒，其在人类和其它动物中引起呼吸道和肠道疾病。它们是最大的RNA病毒，具有大约30,000个核苷酸的基因组。Rota等，Science 300：1394-1399(2003)。SARS-冠状病毒(SARS-CoV)是一种有包膜的、正链RNA病毒。基于序列分析，SARS-CoV是新冠状病毒组中的一个成员(尼多病毒目(Nidovirale)，冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus))。Rota等，同上引文。

复制酶(rep)基因位于接近基因组RNA的5’末端，并且占全基因组的大约70％。与其它病毒蛋白质不同，rep基因产物从基因组RNA翻译产生。复制酶多蛋白经过自催化切割而产生功能性病毒蛋白酶，RNA聚合酶和RNA依赖性解旋酶。rep基因的检测可以作为基因组SARS-CoV RNA存在的指示。Rota等，同上引文。因此，用于检验该病毒核酸存在的测定将允许快速灵敏地检测SARS-CoV。该测定将提供替代血清学检查、直接荧光抗体染色或尿抗原检查的更灵敏方法。

发明内容

一方面，本发明提供包含第一扩增引物和第二扩增引物的寡核苷酸组，其中第一扩增引物选自SEQ ID NO.：2和14，而第二扩增引物选自SEQ ID NO.：3和15。另一方面，第一扩增引物基本上由SEQ IDNO.：2组成，而第二扩增引物基本上由SEQ ID NO.：3组成。在本发明的再一方面，第一扩增引物基本上由SEQ ID NO.：14组成，第二扩增引物基本上由SEQ ID NO.：15组成。

另一方面，本发明提供包含第一扩增引物和第二扩增引物的寡核苷酸组，第一扩增引物选自SEQ ID NO.：2和14的靶结合序列，第二扩增引物选自SEQ ID NO.：3和15的靶结合序列。另一方面，第一扩增引物基本上由SEQ ID NO.：2的靶结合序列组成，第二扩增引物基本上由SEQ ID NO.：3的靶结合序列组成。在本发明的再一方面，第一扩增引物基本上由SEQ ID NO.：14的靶结合序列组成，第二扩增引物基本上由SEQ ID NO.：15的靶结合序列组成。

再一方面，该寡核苷酸组还包含信号引物和报道探针，其中信号引物选自SEQ ID NO.：4，5，16和17的靶结合序列，报道探针选自SEQ ID NO.：8和10。一方面，该信号引物基本上由SEQ ID NO.：4的靶结合序列组成，该报道探针基本上由SEQ ID NO.：8组成。另一方面，该信号引物基本上由SEQ ID NO.：5的靶结合序列组成，该报道探针基本上由SEQ ID NO.：10组成。再一方面，该寡核苷酸组还包含基本上由SEQ ID NO.：11组成的第二报道探针。在再一实施方案中，具有第二报道探针的该寡核苷酸组还包含一个或多个选自SEQ IDNO.：1，12和13的缓冲引物(bumper primer)。

在其它实施方案中，信号引物基本上由SEQ ID NO.：16的靶结合序列组成，报道探针基本上由SEQ ID NO.：8组成。在本发明的另一实施方案中，信号引物基本上由SEQ ID NO.：17的靶结合序列组成，报道探针基本上由SEQ ID NO.：10组成。再一方面，该寡核苷酸组还包含第二信号引物和第二报道探针，该第二信号引物基本上由SEQ IDNO.：17组成，该第二报道探针基本上由SEQ ID NO.：10的杂交序列组成。在再一方面，包含第二信号引物和第二报道探针的该寡核苷酸组还包含一个或多个选自SEQ ID NO.：1，12和13的缓冲引物。

再一方面，SEQ ID NO.：2，3，14和15的靶结合序列包含扩增反应所需的序列。本发明另一实施方案中，所述扩增反应所需的序列包含可以被限制性核酸内切酶切割的限制性核酸内切酶识别位点。在再一实施方案中，扩增反应所需的序列包含被RNA聚合酶识别的启动子。在另一实施方案中，SEQ ID NO.：4，5，8，9，10，11，16和17的杂交序列还包含可以间接地检测的标记物。另一方面，该可间接检测的标记物包含衔接序列。

另一实施方案中，本发明提供包含选自SEQ ID NO.：6，7，18和19的SARS-CoV靶序列的寡核苷酸。

另一实施方案中，本发明提供检测样品中SARS-CoV存在与否的方法，该方法包括：(a)在核酸扩增反应中用多个核酸引物处理样品，其中第一引物选自SEQ ID NO.：2和SEQ ID NO.：14的靶结合序列，第二引物选自SEQ ID NO.：3和SEQ ID NO.：15的靶结合序列；和(b)检测任何扩增的核酸产物，其中检测到该扩增产物指示存在SARS CoV。另一实施方案中，第一引物基本上由SEQ ID NO.：2组成，第二引物基本上由SEQ ID NO.：3组成。另一实施方案中，第一引物基本上由SEQ ID NO.：14组成，第二引物基本上由SEQ ID NO.：15组成。再一实施方案中，步骤(a)包括链置换扩增(SDA)反应。在另一实施方案中，SDA反应利用一个或多个选自SEQ ID NO.：1，12和13的缓冲引物。在另一实施方案中，SDA反应包括耐热链置换扩增(tSDA)反应。在另一实施方案中，tSDA反应是一种均相荧光(homogeneousfluorescent)实时tSDA反应。在再一实施方案中，步骤(b)包括所述扩增的核酸产物与选自SEQ ID NO.：4，5，16和17的信号引物杂交的步骤。

根据再一方面，本发明提供扩增SARS-CoV的靶核酸序列的方法，包括：(a)使该核酸与(i)选自SEQ ID NO.：2和14的靶结合序列的第一扩增引物；和(ii)选自SEQ ID NO.：3和15的靶结合序列的第二扩增引物杂交；和(b)在靶核酸序列上延伸杂交的第一和第二扩增引物，由此扩增该靶核酸序列。根据该方法的再一方面，第一扩增引物基本上由SEQ ID NO.：2的靶结合序列组成，第二扩增引物基本上由SEQ ID NO.：3的靶结合序列组成。根据该方法的再一方面，第一扩增引物基本上由SEQ ID NO.：15的靶结合序列组成，第二扩增引物基本上由SEQ ID NO.：16的靶结合序列组成。

在该方法的另一方面，SEQ ID NO.：2和SEQ ID NO.：3的靶结合序列包含扩增反应所需的序列。在另一实施方案中，该扩增反应所需的序列包含可以被限制性核酸内切酶切割的限制性核酸内切酶识别位点。在另一实施方案中，该扩增反应所需的序列包含RNA聚合酶所识别的启动子。

在本发明的另一方面，SEQ ID NO.：15和SEQ ID NO.：16的靶结合序列包含扩增反应所需的序列。在再一方面，该扩增反应所需的序列包含可以被限制性核酸内切酶切割的限制性核酸内切酶识别位点。在再一实施方案中，该扩增反应所需的序列包含RNA聚合酶所识别的启动子。

在再一方面，该方法还包括通过与信号引物杂交，间接地检测扩增的靶核酸。在另一方面，信号引物选自SEQ ID NO.：4，5，16和17。

根据再一方面，靶核酸序列选自SEQ ID NO.：6，7，18和19。

根据再一方面，本发明提供定量靶样品中SARS-CoV核酸的量的方法，包括步骤：a)将靶样品与已知浓度的SARS-CoV内对照核酸混合；b)在扩增反应中扩增靶核酸和内对照核酸；c)检测扩增的核酸；和d)分析扩增的SARS-CoV靶核酸和内对照核酸的相对量。在另一实施方案中，步骤(b)包括链置换扩增反应。在再一实施方案中，SDA反应包括tSDA反应。在再一方面，所述扩增反应利用一个或多个选自SEQID NO.：4，5，16和17的杂交序列的信号引物和一个或多个选自SEQID NO.：8，9，10和11的杂交序列的报道探针。在再一方面，SEQ IDNO.：4，5，8，9，10，11，16和17的杂交序列包含可间接检测的标记物。在另一实施方案中，该可间接检测的标记物包含衔接序列。

实施本发明的具体方式

本发明方法可通过扩增和检测SARS-CoV rep序列用于分析SARS-CoV的存在。本发明的引物和探针以SARS-CoV复制酶基因的部分为基础。本发明还提供可用于扩增、检测和/或定量rep基因的寡核苷酸。该寡核苷酸可用于所有类型的扩增反应，例如，链置换扩增(SDA)、聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)和QB复制酶介导的扩增。本发明还提供可以足够的特异性和灵敏度用于扩增、检测和/或定量rep基因的寡核苷酸。

本发明方法可用于，例如但不限于，检查从SARS疑似患者获得的临床标本。该标本或测试样品可以从怀疑含有SARS核酸的任何来源收集。对于动物，优选哺乳动物，更优选人类，该测试样品的来源可以包括血液、骨髓、淋巴、硬组织(例如，肝、脾、肾、肺、卵巢等)、痰、粪便、尿、上和下呼吸道标本和其它临床样品。其它来源可包括兽医和环境样品，以及体外培养物。本领域技术人员能够确定可以在SARS-CoV感染诊断中使用的适当临床来源。

定义

为了清楚的目的，提供以下定义，这些定义不应当被认为是限制性的。除非另行指出，本文所用技术和科学术语旨在具有本发明所属领域技术人员通常理解的意义。

“扩增引物”是用于扩增靶序列的寡核苷酸，其中该靶序列通过该寡核苷酸与靶序列杂交后寡核苷酸的延伸得以扩增或通过与靶序列杂交后相邻的多个寡核苷酸的连接得以扩增。扩增引物的至少一部分与靶杂交。该部分称作靶结合序列，其确定引物的靶特异性。除了靶结合序列外，某些扩增方法还需要在扩增引物中存在专门的非靶结合序列。这些专门序列是扩增方法进行所必需的，并且典型地起着将该专门序列添加至靶上的作用。例如，但不限于，SDA中使用的扩增引物包括位于靶结合序列5’的限制性核酸内切酶识别位点，参见美国专利5,455,166和5,270,184，这两份专利并入此处作为参考。NASBA、自动维持序列扩增(3SR)和基于转录的扩增的引物需要与引物的靶结合序列连接的RNA聚合酶启动子。将此专门序列与靶结合序列连接以便在选定的扩增反应中使用，是本领域常规的。相反，在靶的末端不需要专门序列的扩增方法，例如PCR，一般使用仅由靶结合序列组成的扩增引物。

在本文中，术语“引物”和“探针”指寡核苷酸的功能。引物典型地在与靶杂交后通过聚合酶或连接来延伸，而探针可以通过与靶杂交或通过杂交后基于聚合酶的延伸来发挥作用。杂交的寡核苷酸如果用于捕获或检测靶序列则可以起探针的作用，而如果该寡核苷酸用作扩增引物中的靶结合序列，则其可以起引物的作用。因此，可以理解，本文公开的用于扩增、检测或定量SARS-CoV的任何靶结合序列都可以用作杂交探针或用作引物中的靶结合序列以进行检测或扩增，并任选地与所选扩增反应所需或利于检测的专门序列连接。

“缓冲引物”或“外引物”是与扩增引物上游(即，5’端)的靶序列退火的引物，这样该外引物的延伸将置换下游引物和其延伸产物，即，置换包含SDA限制性核酸内切酶识别位点的靶序列拷贝。因此，缓冲引物仅仅由靶结合序列组成，并且设计为可以在扩增引物上游退火并在延伸时置换扩增引物。Walker等在Nuc.Acids Res.，20：1692-1696(1992)中将外引物命名为B₁和B₂。外引物的延伸是置换扩增引物的延伸产物的一种方法，但是在某些情况中加热也可能是适宜的。

“逆转录引物”也仅由靶结合序列组成。其在RNA靶序列的3’端杂交以引发靶的逆转录。逆转录引物的延伸产生包含RNA靶和通过逆转录产生的该RNA靶的cDNA拷贝的异源双链体。使cDNA与RNA链分离(例如，通过加热、RNaseH或链置换)成为单链并可用于扩增。任选地，可以在该cDNA的靶序列3’端杂交第二逆转录引物，以便在扩增前引发第二链的合成。任选地，逆转录引物也可以作为扩增引物或缓冲引物起作用。

术语“靶”和“靶序列”指待扩增、复制或检测的核酸序列(DNA和/或RNA)。这些序列包括待扩增的原始核酸序列和其互补第二链，以及通过扩增或复制该靶序列产生的该原始靶序列的拷贝的任一链。“扩增产物”、“延伸产物”或“扩增子”是包含在扩增或复制靶序列期间产生的该靶序列的拷贝的寡核苷酸或多核苷酸。

术语“聚合酶”指各种在已有核酸模板上催化核酸合成的酶，例如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶。DNA聚合酶从脱氧核糖核苷酸装配DNA，而RNA聚合酶自核糖核苷酸装配RNA。

基于25个SARS-CoV核苷酸序列的比对(alignment)，选择两个区域作为靶序列在复制酶区域的扩增中使用，参见表1和表3所示。

在本发明的一个实施方案中，已经适应性地修改了逆转录酶-链置换扩增(RT-SDA)以用于检测基因组和亚基因组RNA序列中的SARS-CoV复制酶RNA。SDA是等温的(恒定温度)核酸扩增方法。在SDA中，单链延伸产物的置换、引物与延伸产物(或原始靶序列)的退火和引物的随后延伸同时在该反应混合中发生。常规的SDA(在较低温度，通常大约35-45℃进行)描述于G.Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：393-396(1992)和Walker等，Nuc.Acids Res.，同上。通过SDA检测核酸的详细描述参见美国专利5,455,166；5,523,204；和5,916,779，这些专利完整并入此处作为参考。这些专利提供了通过核酸内切酶介导的链置换扩增样品中靶核酸序列(和其互补链)的方法。此外，美国专利5,916,779还适应性地修改了SDA以逆转录扩增RNA靶。

根据本发明，从测试样品提取SARS-CoV靶复制酶RNA。可以通过本领域技术人员已知的任何方法分离该SARS-CoV复制酶RNA。然后在例如RT-SDA方法中扩增该复制酶RNA。RT-SDA可以以一步法或两步法的方式实施。一步法同时产生和扩增SARS-CoV靶序列的cDNA拷贝。

在一个实施方案中，一步RT-SDA法利用设计以允许并入限制性核酸内切酶位点和置换单链cDNA的第一扩增引物和缓冲引物。得到的cDNA随后通过第二扩增引物和任选地一个或多个缓冲引物的退火进行扩增。在另一实施方案中，一步RT-SDA法利用第一反向引物和任选地一个或多个缓冲引物。DNA依赖性DNA聚合酶或逆转录酶允许cDNA扩增产物的延伸。在此一步法的另一实施方案中，逆转录酶用于延伸一个或多个反向引物以及从RNA模板合成cDNA。本领域技术人员将意识到可以在本发明方法中使用的某些常规逆转录酶(即，AMV，MMLV，Superscript II^TM)。

作为一个举例说明性例子，前面描述的一步RT-SDA反应使用SDA扩增引物和缓冲引物。然而，如美国专利5,916,779中所述，逆转录酶能够利用SDA引物或逆转录引物进行链置换。因此，也可以存在逆转录引物，通过逆转录酶用于该反应的逆转录部分。下游逆转录引物作为逆转录引物起作用。上游逆转录引物类似于SDA缓冲引物，因为其延伸可以置换下游逆转录引物的延伸产物(cDNA)。

备选地，RT-SDA可以是两步扩增法，其中在分开的步骤中进行逆转录及之后的SDA。因此，在该反应的第一逆转录步骤中存在逆转录引物。然后将cDNA与RNA模板分开，之后进行第二扩增步骤。加热反应以分开DNA：RNA杂合物，或者通过化学或酶方法分开这两条链。例如，但不限于，可以使用RNA酶H(RNase H)或RNA酶H活性降解RNA链，由此产生DNA单链。此外，可以通过利用缺乏5’→3’活性并能从一条链置换另一链的聚合酶，实现杂合物的分离。SDA引物在反应的第二步中加入，进行SDA扩增以提供可检测的扩增产物。

在此两步法的一个实施方案中，反向引物是SDA引物，RNase H活性是逆转录酶的内源活性。此外，反向引物可以是缓冲引物或随机产生的DNA序列。在本发明的再一实施方案中，两步RT-SDA法使用SDA引物和一个或多个缓冲引物用于逆转录反应。正向引物和扩增及检测所需的其它反应成分，例如SDA酶、脱氧核糖核苷酸、信号引物、探针和缓冲液成分，与RT反应产物混合。

近来研发了耐热型SDA反应(tSDA)，该型反应在较高，但仍恒定的温度下使用热稳定聚合酶和限制性核酸内切酶来实施，参见并入此处作为参考的美国专利5,648,211和5,744,311。该反应基本上如常规SDA一样进行，但替代使用热稳定聚合酶和热稳定限制性核酸内切酶。反应温度调整至适于所选耐热酶的较高温度(典型地，大约45℃至60℃)，并用所选热稳定核酸内切酶的适当限制性核酸内切酶识别/切割位点置换常规的限制性核酸内切酶识别/切割位点。此外，与常规SDA不同，实施者还可以在初次的热变性步骤前将酶包括在反应混合物中，只要这些酶在该温度充分稳定即可。

为了以和原位PCR相当的灵敏度和特异性在悬浮液中、载玻片上或组织中于细胞中原位扩增核酸靶序列，已经对SDA进行了适应性的修改。该方法详细描述于美国专利5,523,204中，该专利并入此处作为参考。由于SDA反应在恒定的较低温度下进行，故SDA比PCR对细胞和组织更为温和。此外，还可以保持优良的标本形态。通过SDA实施的原位扩增与免疫化学技术相容，因此，可以在相同的标本上进行靶序列的扩增和免疫学染色。

可以将基于RNA的内对照并入反应混合物中，与本发明的SARS-CoV靶序列一起扩增。可以设计内对照以验证阴性结果和鉴定潜在的抑制性样品。也可以使用该对照在竞争性试验中实现定量目的，参见Nadeau等，Anal.Biochem.276：177-187(1999)。此外，可以将干的逆转录酶与此处所述SDA法联用。干酶可以提供优于液体酶使用时的改良工作流程(workf low)以及延长的保存期。

表1和表3列出的SDA引物、缓冲引物和信号引物被设计用于根据本发明方法的RT-SDA反应中。加下划线的为结合序列。对于SDA引物，该序列的剩余5’部分包含SDA反应进行所需的限制性核酸内切酶识别位点(RERS)和通用非靶特异性尾序列；而对于信号引物，5’尾包含通用非靶特异性序列，该序列与相应报道探针的相同。易于明了的是，SDA引物也可以作为扩增引物用于替代性扩增试验中。同样明了的是，靶结合序列也可以单独使用，在不需要专门序列或结构的反应(例如PCR)中扩增靶；以及可以用非RT-SDA的其它扩增反应所需的不同专门序列替代以下所示的含有RERS的序列(例如，RNA聚合酶启动子)。当寡核苷酸用于扩增反应中时，SDA引物名中“F”和“R”分别指“正向”和“反向”引物。

表1：用于SARS-CoV试验区域A的引物、探针和序列

引物靶杂交区域以下划线标出。

BsoBI位点以斜体标出。

相对于天然SARS-CoV共有序列，内扩增对照中的突变以小写字母表示。

^*可以用于引发逆转录。

表2：用于SARS-CoV试验A和B的报道探针

与信号引物中的互补序列杂交的区域以下划线表示(见美国专利6,316,200；6,743,582；6,656,680)

斜体为BsoBI位点。

ROX：罗丹明。

FAM：荧光素。

表3：用于SARS-CoV试验区域B的引物、探针和序列

引物靶杂交区域以下划线表示。

BsoBI位点以斜体表示。

^*可以用于引发逆转录

在靶扩增后，根据本发明方法产生的核酸可以利用本领域已知的任何用于检测特异核酸序列的方法进行检测。例如，但不限于，可以使用各种用于SDA的检测方法。在美国专利6,316,200中讨论了用于标记SDA产物的几种方法，该专利完整地并入此处作为参考。例如，但不限于，可以通过与寡核苷酸检测探针的特异杂交，检测扩增产物。检测探针是包括可检测标记物(即，产生可检测信号或能够经过处理以产生可检测信号的部分)的短寡核苷酸。可以通过切口平移、末端标记或在探针的化学合成期间，将标记物掺入该寡核苷酸探针。本领域已知许多可直接和间接检测的标记物可用于寡核苷酸探针。可直接检测的标记物包括那些无需进一步反应使其可检测的标记物，例如，放射性同位素、荧光部分和染料。可间接检测的标记物包括那些必须与其它试剂反应以使其可检测的标记物，例如，能够产生有色反应产物的酶(例如，碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶)、生物素、亲和素、地高辛配基、抗原、半抗原或荧光色素。来自酶标记物的信号一般通过酶与其底物及任何为了产生有色酶反应产物所需的其它试剂反应来生成。生物素(或亲和素)标记物可以通过与标记的亲和素(或标记的生物素)或标记的抗生物素(或标记的抗亲和素)抗体结合来检测。地高辛配基和半抗原标记物通常通过与标记的抗地高辛配基(抗-dig)或抗半抗原抗体特异性结合而检测。一般地，选择检测探针使其与扩增子中位于两个扩增引物的结合位点之间的核苷酸序列杂交。检测探针也可以与扩增引物之任一具有相同的核苷酸序列。通过与检测探针杂交进行体外和原位检测的方法是本领域已知的。

或者，可以通过检测引物的延伸来检测本发明的扩增产物，参见Walker等，Nuc.Acids，Res.，同上。在检测引物延伸方法中，包含可检测标记物的寡核苷酸引物与扩增产物杂交并通过添加聚合酶而得以延伸。为了检测，可以在5’末端标记引物，例如，使用³²P或荧光标记。或者，可以在杂交引物延伸时掺入包含可直接或间接检测的标记物的dNTP类似物。例如，但不限于，引物延伸时可以掺入dig-衍生化的dNTP，然后在延伸后通过与AP抗-dig和适宜的AP底物反应来实施检测。此待延伸的引物可以与扩增引物相同或者其可以是能够与扩增子中位于扩增引物的结合位点之间的核苷酸序列杂交的不同引物。

可检测标记物也可以在靶序列扩增过程中直接地掺入扩增子内。

在本发明的另一实施方案中，通过美国专利6,316,200所述方法检测RT-SDA产物，所述方法利用包含5’衔接序列的未标记的信号引物。报道探针的3’端与该信号引物的5’端的互补序列杂交，产生5’突出端。聚合酶补平此突出端，然后直接或间接地检测该报道探针尾的互补序列的合成，以指示靶的存在。此方法利用荧光能量转移(FET)而不是荧光强度的直接检测来检测杂交。FET允许实时检测SDA产物。

表1至表3中所列的信号引物和报道探针被设计为利用逆转录酶产物实时检测扩增产物。这些引物和探针的结构和用途描述在例如，但不限于，美国专利5,547,861；5,928,869；6,316,200；6,656,680；和6,743,582中，所有这些专利均并入此处作为参考。表1至表3中的杂交序列以下划线表示。报道探针序列的剩余部分形成典型地被标记以利于按照本领域已知的方式检测扩增产物的结构。正如从美国专利5,935,791；5,846,726；5,691,145；5,550,025；和5,593,867中所知，容易明了的是，靶序列也可以单独用于直接杂交(典型地与可检测标记物连接)，以及可以使用其它的直接和间接标记物替代发夹结构(hairpin)，上述专利的内容均并入此处作为参考。

由于靶结合序列赋予引物或探针的靶特异性，故应当理解，以上示例的用作特定反应中的特定成分的靶结合序列也可以以多种其它方式使用以检测SARS-CoV复制酶核酸。例如，但不限于，本发明的靶结合序列可以用作杂交探针，在不经扩增的情况下或作为扩增后的分析试验，直接地检测SARS-CoV。此类杂交方法是本领域熟知的，典型地使用与靶结合序列缔合(associated with)或连接的可检测标记物以利于检测杂交。此外，上述靶结合序列基本上所有都可以用作无需其它专门序列的扩增反应(例如PCR)中的扩增引物或者添加至专门用于3SR、NASBA、基于转录的扩增或任何其它的引物延伸扩增反应的适当序列。为扩增产物的检测，可以按本领域已知的方式标记包含本文所述靶结合序列的扩增引物。或者，可以按照美国专利5,547,861；5,928,869；5,593,867；5,550,025；5,935,791；5,888,739；和5,846,726(所有这些专利并入此处作为参考)所述，将包含所公开的靶结合序列的标记的检测引物与扩增引物联用，以实时均相检测扩增。此类检测引物可以包含可直接或间接检测的序列，该序列最初不与靶杂交，但一旦其与靶杂交并被延伸后则利于对检测引物的检测。例如，该可检测序列可以是形成二级结构的序列、含有限制性位点的序列、或可以通过标记的寡核苷酸(有时称作报道探针)与其互补序列的杂交按照本领域已知的方式被检测的线性序列。或者，可以在扩增后，通过与选自位于所选扩增引物对之间的本文所公开的任何靶结合序列的探针杂交，检测扩增产物。

应当理解，由靶结合序列和任选地所选扩增反应所需的序列或所选检测反应所需的序列组成的本发明寡核苷酸也可以包括充当间隔区、接头、用于标记或结合酶的序列等的某些其它序列。一般已知这些其它序列是在所选反应中为了获得该寡核苷酸的最佳功能而必需的，并且这些其它序列旨在通过术语“由......组成”来包括在内。

本发明也涉及在高严紧杂交条件(即，用于选择性杂交)下与此处所述的核苷酸序列杂交的核酸分子。“严紧条件”指确定第一核酸与第二核酸杂交的温育和洗涤条件(例如，温度、缓冲液浓度)。第一和第二核酸可以完全地(100％)互补，或者可以较不完全互补(即，70％、50％等)。例如，可以使用某些高严紧条件区分完全互补的核酸和那些较小程度互补的核酸。用于核酸杂交的“高严紧条件”、“中等严紧条件”和“低严紧条件”在Current Protocols in MolecularBiology中2.10.1-2.10.16页及6.3.1-6.3.6页(Ausubel，F.M.等，John Wiley & Sons(1998)，其完整地并入作为参考)上进行了解释。

本发明另一方面涉及引入了本发明载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本发明核酸分子可以在细菌细胞、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞中表达。此类适宜的宿主细胞是本领域技术人员已知的。

本发明还涉及包含装有用于本发明中的一种或多种成分的一个或多个容器的包装(pack)或试剂盒。任选地，这些容器可以伴随具有管理药品或生物产品生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的通知，该通知注明获得了有关生产、使用或销售的行政机关的批准。该包装或试剂盒可以是组合物的单次使用形式，或者其可以是多次使用形式。尤其是，试剂可以分开、以任何组合方式混合在一起、或存在于单个瓶中。

提供以下预示性实施例举例说明本发明的某些实施方案，但是这些实施例不旨在限制本发明。

SARS试验系统A实施例：检测SARS-CoV RNA的RT-SDA

以下实施例举例说明本文公开的引物和报道探针在检测来自怀疑被感染的患者的临床样品中的SARS-CoV RNA中的用途。

临床标本例如粪便、咽喉拭子和鼻咽吸出物使用QIAGEN QIAampViral RNA Mini试剂盒根据厂商说明书并加上柱上DNA酶(DNase)处理除去污染DNA，以实施加工。对于粪便标本，包括另一加工前步骤以在上样QIAGEN柱前除去颗粒物。用0.89％盐水1∶10稀释粪便，4,000×g离心20分钟。然后倾析上清液，并通过0.22μm滤器以除去颗粒碎屑。

通过QIAamp柱加工140微升临床样品或粪便滤液，用DNA酶处理柱子以消化和柱基质结合的污染性非特异DNA。洗涤除去DNA酶后，将纯化的RNA洗脱在80ml体积的水中。将30μl洗脱物加至含有干引物、报道探针和核苷酸的引发微量孔(Priming Microwell)中，之后加入20μl含有RNA酶(RNase)抑制剂、AMV-RT酶和扩增内对照序列的RNA转录物的逆转录缓冲液。最终的逆转录反应条件如下：1500μM dC_sTP；dATP、dGTP和dTTP各300μM；5mM乙酸镁；1500nM缓冲引物SarArtB21(SEQ ID NO.：1)；300nM SDA引物SarARP(SEQ IDNO.：3)；1500nM SDA引物SarAFP(SEQ ID NO.：2)；750nM信号引物SarAAd-MPC(SEQ ID NO.：5)；600nM IAC信号引物；1200nM报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：10)；900nM报道探针MPC2F/D(SEQID NO.：11)；1000个IAC转录物拷贝；5％DMSO；5％甘油；43.5mM K_iPO₄；25mM KOH；120mM N-二[羟乙基]甘氨酸；40U RNA酶抑制剂；10U AMV-RT。然后在48℃温育再水化的(rehydrated)微量孔20分钟，之后加入100μl SDA缓冲液并转移至72℃加热块上。同时，含有干SDA酶(Bst聚合酶和BsoBI限制性酶)的扩增微量孔在54℃预热。10分钟温育后，将100μl样品从引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并在BDProbeTec ET读数器中52.5℃温育。最终的SDA反应条件如下：500μM dC_sTP；dATP、dGTP和dTTP各100μM；5.7mM乙酸镁；1500nM缓冲引物SarArtB21(SEQ ID NO.：1)；100nM SDA引物SarARP(SEQID NO.：3)；500nM SDA引物SarAFP(SEQ ID NO.：2)；250nM信号引物SarAAd-MPC(SEQ ID NO.：5)；200nM IAC信号引物；400nM报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：10)；300nM IAC报道探针MPC2F/D(SEQID NO.：11)；12.5％DMSO；1.67％甘油；24.5mM K_iPO₄；82mM KOH；143mMN-二[羟乙基]甘氨酸；12U Bst聚合酶；45U BsoBI限制性酶。

在1小时温育过程中，在BD ProbeTec ET仪的两个光通道中每分钟读取荧光读数，结果以SARS-CoV靶和IAC的PAT得分报告。荧光读数从未达到过预定荧光阈值的反应被定为PAT得分0。对应于MPC D/R报道探针(SEQ ID NO.：10)，产生ROX PAT得分＞0的反应被认为是SARS-CoV阳性；而对应于IAC报道探针MPC2F/D(SEQ ID NO.：11)，产生FAM PAT得分＞0的反应被认为是IAC阳性。FAM和ROX信号均未达到其各自阈值(PAT得分＝0)的那些反应被认为是不确定的。阳性和阴性外对照被包括在每一轮试验中以检验反应性能。

为了通过仪器报告来自患者标本的结果，需要这些对照分别产生阳性和阴性正确结果。

预期结果和结论

来自感染患者、含有足够高于试验检测限的量的SARS-CoV的标本将产生阳性结果(即，ROX PAT得分＞0)。来自未感染患者或来自临床负荷低于该试验的分析灵敏度的患者的标本将产生阴性结果(即，ROXPAT得分＝0)。IAC的扩增失败(即，FAM PAT得分＝0)将说明试剂污染了RNA酶或程序错误。表4总结了可能的结果。

表4：对BD ProbeTec ET SARS-CoV试验的可能结果的总结

SARS试验系统B实施例：检测SARS-CoV RNA的RT-SDA

以下实施例举例说明本文公开的引物和报道探针在检测临床标本中的SARS-CoV RNA中的用途。

临床标本例如粪便样品、咽喉拭子和鼻咽吸出物使用QIAGENQIAamp Viral RNA Mini试剂盒根据厂商说明书并加上柱上DNA酶处理除去污染DNA，以实施加工。对于粪便标本，包括另一加工前步骤以在上样QIAGEN柱前除去颗粒物。用0.89％盐水1∶10稀释粪便，4,000×g离心20分钟。然后倾析上清液，并通过0.22μm滤器以除去颗粒碎屑。

通过QIAamp柱加工140微升样品或粪便滤液，用DNA酶处理柱子以消化和柱基质结合的污染性非特异DNA。洗涤除去DNA酶后，将纯化的RNA洗脱在80μl体积的水中。将30μl洗脱物加至含有干引物、报道探针和核苷酸的引发微量孔中，之后加入20μl含有RNA酶抑制剂、AMV-RT酶和扩增内对照序列的RNA转录物的逆转录缓冲液。最终的逆转录反应条件如下：1500μM dC_sTP；dATP、dGTP和dTTP各300μM；5mM乙酸镁；1500nM缓冲引物SarBrtB19(SEQ ID NO.：13)；1500nM SDA引物SarBRP(SEQ ID NO.：15)；300nM SDA引物SarBFP(SEQ ID NO.：14)；750nM信号引物SarBAd-MPC(SEQ ID NO.：17)；600nM IAC信号引物；1200nM报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：10)；900nM IAC报道探针MPC 2F/D(SEQ ID NO.：11)；1000个IAC转录物拷贝；5％DMSO；5％甘油；43.5mM K_iPO₄；25mM KOH；120mM N-二[羟乙基]甘氨酸；40U RNA酶抑制剂；10U AMV-RT。然后在48℃温育再水化的微量孔20分钟，之后加入100μl SDA缓冲液并转移至72℃加热块上。同时，将含有干SDA酶(Bst聚合酶和BsoBI限制性酶)的扩增微量孔放在52℃。10分钟温育后，将100μl样品从引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并在BD ProbeTec ET读数器中52.5℃温育。最终的SDA反应条件如下：500μM dC_sTP；dATP、dGTP和dTTP各100μM；5.7mM乙酸镁；500nM缓冲引物SarArtB19(SEQ ID NO.：13)；500nM SDA引物SarBRP(SEQ ID NO.：15)；100nM SDA引物SarBFP(SEQID NO.：14)；250nM信号引物SarBAd-MPC(SEQ ID NO.：17)；200nMIAC信号引物；400nM报道探针MPCD/R(SEQ ID NO.：10)；300nM IAC报道探针MPC2F/D(SEQ ID NO.：11)；12.5％DMSO；1.67％甘油；24.5mMK_iPO₄；82mM KOH；143mM N-二[羟乙基]甘氨酸；12U Bst聚合酶；45UBsoBI限制性酶。

在1小时温育过程中，在BD ProbeTec ET仪的两个光通道中每分钟读取荧光读数，结果以SARS-CoV靶和IAC的PAT得分报告。荧光读数从未达到过预定荧光阈值的反应被定为PAT得分0。对应于MPC D/R报道探针(SEQ ID NO.：10)，产生ROX PAT得分＞0的反应被认为是SARS-CoV阳性；而对应于IAC报道探针MPC2F/D(SEQ ID NO.：11)，产生FAM PAT得分＞0的反应被认为是IAC阳性。FAM和ROX信号均未达到其各自阈值(PAT得分＝0)的那些反应被认为是不确定的。阳性和阴性外对照被包括在每一轮试验中以检验反应性能。为了通过仪器报告来自患者标本的结果，需要这些对照分别产生阳性和阴性正确结果。

预期结果和结论

来自感染患者、含有足够高于试验检测限的量的SARS-CoV的标本将产生阳性结果(即，ROX PAT得分＞0)。来自未感染患者或来自临床负荷低于该试验的分析灵敏度的患者的标本将产生阴性结果(即，ROXPAT得分＝0)。I AC的扩增失败(即，FAM PAT得分＝0)将说明试剂污染了RNA酶或程序错误。表5总结了可能的结果。

表5：对BD ProbeTec ET SARS-CoV试验的可能结果的总结

提供以下实验实施例举例说明本发明的某些实施方案，但是这些实施例不旨在限制本发明。

SARS试验系统A实施例

实施例1：使用SARS-CoV特异性引物的DNA扩增

部分A：

使用相应于SARS-CoV株BJ03(GenBank登录号AY278490)17936-18024位核苷酸的靶序列的质粒DNA克隆，证明所公开的引物和探针组合扩增SARS-CoV核酸的能力。使用

dsDNA定量试剂(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)定量线性化的质粒DNA，并用含有7ng/mL鲑精DNA的水稀释至工作浓度。在6个靶水平之每一个下一式四份运行SDA反应，包括含有水代替靶DNA的阴性对照。

简言之，将DNA靶加入SDA缓冲液，在沸水浴中加热5分钟变性。然后将110微升变性的样品加入含有40μL的SDA引物、报道探针和核苷酸的溶液的引发微量孔。室温温育20分钟后，将引发微量孔转移至72℃加热块，同时含有干Bst聚合酶和BsoBI限制性酶的相应扩增微量孔在54℃预热。温育10分钟后，将100μl引发混合物从引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并放置设于52.5℃的BD ProbeTecET读数器中。监测荧光信号1小时，并使用开发用于该仪器的PassesAfter Threshold(PAT)算法分析。(Wolfe DM，Wang SS，ThorntonK，Kuhn AM，Nadeau JG，Hellyer TJ，均相链置换扩增(Homogeneousstrand displacement amplification)，《DNA amplification-currenttechnologies and applications》，Demidov VV和Broude NE(编)，Horizon Bioscience，Wymondham，UK)。PAT分数表示荧光读数达到预定阈值后剩余的仪器通过次数。最终的SDA反应条件如下：50nM基于pUC19的缓冲引物AB(SEQ ID NO.：20)；100nM SDA引物SarARP(SEQID NO.：3)；500nM SDA引物SarAFP(SEQ ID NO.：2)；250nM信号引物SarAAd-TBD16(SEQ IDNO.：4)；500nM报道探针TBD16D/R(SEQID NO.：8)；500μM脱氧胞苷5’-O-(1-硫代三磷酸)，S-异构体(dC_sTP)；dATP，dGTP和dTTP各100μM；12.5％DMSO；25mM K_iPO₄；82mM KOH；143mM N-二[羟乙基]甘氨酸；12U Bst聚合酶；30U BsoBI限制性酶；5mM乙酸镁。

结果和结论

使用少至每反应25拷贝靶质粒获得了阳性结果，而在任何阴性对照中均未观察到假阳性结果(表6)。这些数据说明，所公开的引物和报道探针组合能够以高度分析灵敏度检测SARS-CoV特异性核酸靶序列。

表6：SARS-CoV特异性靶序列的扩增和检测

PAT得分：0＝阴性；＞0＝阳性。

部分B：

进行第二实验说明所公开的引物检测SARS-CoV特异性核酸的分析灵敏度。与前面的实验不同，使用报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：10)以及信号引物SarAAd-MPC(SEQ ID NO.：5)。

简言之，将DNA靶加入SDA缓冲液，在沸水浴中加热5分钟变性。然后将110微升变性的样品加入含有40μL的SDA引物、报道探针和核苷酸的溶液的引发微量孔。室温放置引发微量孔20分钟后，将引发微量孔转移至72℃加热块，同时含有干Bst聚合酶和BsoBI限制性酶的相应扩增微量孔在54℃预热。温育10分钟后，将100μl引发混合物从引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并放置52.5℃的BDProbeTec ET读数器中。监测荧光信号1小时，并使用开发用于该仪器的PAT算法分析。PAT分数表示荧光读数达到预定阈值后剩余的仪器通过次数。最终的SDA反应条件如下：50nM基于pUC19的缓冲引物AB(SEQ ID NO.：20)；100nM SDA引物SarARP(SEQ ID NO.：3)；500nMSDA引物SarAFP(SEQ ID NO.：2)；250nM信号引物SarAAd-MPC(SEQID NO.：5)；500nM报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：10)；500μM dC_sTP；dATP，dGTP和dTTP各100μM；12.5％DMSO；25mM K_iPO₄；82mM KOH；143mM N-二[羟乙基]甘氨酸；12U Bst聚合酶；30U BsoBI限制性酶；5mM乙酸镁。

结果和结论

结果总结在表7中。含有100拷贝质粒DNA的所有反应均为阳性。相反，含有水代替质粒DNA的反应无一产生阳性结果，由此说明所公开的引物和报道探针组合在检测SARS-CoV特异性核酸靶序列中的分析灵敏度和特异性。

表7：使用MPC D/R报道探针扩增和检测SARS-CoV特异性靶序列

PAT得分：0＝阴性；＞0＝阳性。

实施例2：分析的特异性

所公开的引物和探针的分析特异性通过检查一组43种可能存在于呼吸道和/或胃肠道标本中的细菌和真菌进行验证。由于所有这些生物都具有由DNA而非RNA组成的基因组，故在这些反应中不包括逆转录步骤。在含有牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐水(PBS/BSA)中以大约10⁷-10⁸个细胞/ml的浓度制备各生物的悬浮液。每个悬浮液各15μl分别与150μl SDA缓冲液混合，在沸水浴中加热5分钟以裂解生物和变性DNA。冷却至室温后，将110μl变性的样品加入含有40μL的SDA引物、报道探针和核苷酸的溶液的引发微量孔中。在室温孵育引发微量孔20分钟，然后转移至72℃加热块，同时在54℃预热相应的扩增微量孔。10分钟后，将100μl引发混合物从引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并放入设定在52.5℃的BD ProbeTec ET读数器中。监测荧光1小时，并使用开发用于该仪器的PAT算法分析。最终的SDA条件如下：50nM基于pUC19的缓冲引物AB(SEQ ID NO.：20)；100nMSDA引物SarARP(SEQ ID NO.：3)；500nM SDA引物SarAFP(SEQ IDNO.：2)；250nM信号引物SarAAd-TBD16(SEQ ID NO.：4)；500nM报道探针TBD16D/R(SEQ ID NO.：8)；500μM dC_sTP；dATP，dGTP和dTTP各100μM；12.5％DMSO；25mM K_iPO₄；82mM KOH；143mM N-二[羟乙基]甘氨酸；12U Bst聚合酶；30U BsoBI限制性酶；5mM乙酸镁。

结果和结论

结果总结在表8中。除了作为阳性对照运行的SARS-CoV靶序列的质粒克隆，未获得其它阳性结果，由此证明所公开的引物和报道探针检测SARS-CoV的特异性。

表8：用BD ProbeTec ET SARS-CoV试验测试的细菌和真菌组

BD：BD Diagnostics

ATCC：美国典型培养物保藏中心

PAT得分＞0被认为是阳性

SARS试验系统B实施例

实施例1：使用SARS-CoV特异性引物扩增DNA

使用相应于SARS-CoV株BJ03(GenBank登录号AY278490)15068-15138位核苷酸的靶序列的质粒DNA克隆，证明所公开的引物和探针组合扩增SARS-CoV核酸的能力。使用PicoGreen dsDNA定量试剂(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)定量线性化的质粒DNA，并用含有7ng/μL鲑精DNA的水稀释至工作浓度。在3个靶水平之每一个下一式八份运行SDA反应，包括含有水代替靶DNA的阴性对照。

简言之，将DNA靶加入SDA缓冲液，在沸水浴中加热5分钟变性。然后将150微升变性的样品加入含有干SDA引物、报道探针和核苷酸的引发微量孔。室温温育20分钟后，将引发微量孔转移至72℃加热块，同时含有干Bst聚合酶和BsoBI限制性酶的相应扩增微量孔在54℃预热。10分钟后，将100μl引发混合物从引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并放置设于52.5℃的BD ProbeTec ET读数器中。监测荧光信号1小时，并使用开发用于该仪器的PAT算法分析。PAT分数表示荧光读数达到预定阈值后剩余的仪器通过次数。最终的SDA反应条件如下：50nM基于pUC19的缓冲引物AB(SEQ ID NO.：20)；500nM SDA引物SarBRP(SEQ ID NO.：15)；100nM SDA引物SarBFP(SEQID NO.：14)；250nM信号引物SarBAd-MPC(SEQ ID NO.：4)；300nM报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：8)；500mM脱氧胞苷5’-O-(1-硫代三磷酸)，S-异构体(dC_sTP)；dATP，dGTP和dTTP各100μM；12.5％DMSO；25mM K_iPO₄；82mM KOH；143mM N-二[羟乙基]甘氨酸；12U Bst聚合酶；30U BsoBI限制性酶；5mM乙酸镁。

结果和结论

使用少至每反应15拷贝靶质粒获得了阳性结果，而在任何阴性对照中均未观察到假阳性结果(表9)。这些数据说明，所公开的引物和报道探针组合能够以高度分析灵敏度检测SARS-CoV特异性核酸靶序列。

表9：SARS-CoV特异性靶序列的扩增和检测

PAT得分：0＝阴性；＞0＝阳性。

实施例2：分析的特异性

所公开的引物和探针的分析特异性通过检查一组43种可能存在于呼吸道和/或胃肠道标本中的细菌和真菌进行验证。由于所有这些生物都具有由DNA而非RNA组成的基因组，故在这些反应中不包括逆转录步骤。在PBS/BSA中以大约10⁷-10⁸个细胞/ml的浓度制备各生物的悬浮液。每个悬浮液各15μl分别与150μl SDA缓冲液混合，在沸水浴中加热5分钟以裂解生物和变性DNA。冷却至室温后，将110μl变性的样品加入含有40μL的SDA引物、报道探针和核苷酸的溶液的引发微量孔中。在室温放置引发微量孔20分钟，然后转移至72℃加热块，同时在54℃预热相应的扩增微量孔。温育10分钟后，将100μl引发混合物从引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并放入设定在52.5℃的BD ProbeTec ET读数器中。监测荧光1小时，并使用开发用于该仪器的PAT算法分析。最终的SDA条件如下：50nM基于pUC19的缓冲引物AB(SEQ ID NO.：20)；500nM SDA引物SarBRP(SEQ ID NO.：15)；100nM SDA引物SarBFP(SEQ ID NO.：14)；250nM信号引物SarBAd-MPC(SEQ ID NO.：17)；500nM根道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：10)；500mM dC_sTP；dATP，dGTP和dTTP各100μM；12.5％DMSO；25mMKiPO₄；82mM KOH；143mM N-二[羟乙基]甘氨酸；12U Bst聚合酶；30UBsoBI限制性酶；5mM乙酸镁。

结果和结论

如表10所示。除了作为阳性对照的SARS-CoV靶序列的质粒克隆，未获得其它阳性结果。这证明所公开的引物和报道探针检测SARS-CoV的特异性。

表10：用BD ProbeTec ET SARS-Cov试验测试的一组细菌和真菌

*重复测试后阴性；由于实验室污染所致最初结果阳性(PAT得分＝48)

BD：BD Diagnostics

ATCC：美国典型培养物保藏中心

PAT得分＞0被认为是阳性

Claims

1.包含第一扩增引物和第二扩增引物的寡核苷酸组，其对SARS-CoV复制酶核酸具有靶特异性，其中所述寡核苷酸组选自第一扩增引物由SEQ ID NO.：2组成，第二扩增引物由SEQ ID NO.：3组成的第一组，和第一扩增引物由SEQ ID NO.：14组成，第二扩增引物由SEQ ID NO.：15组成的第二组。

2.权利要求1的寡核苷酸组，其中第一扩增引物由SEQ ID NO.：2组成，第二扩增引物由SEQ ID NO.：3组成。

3.权利要求1的寡核苷酸组，其中第一扩增引物由SEQ ID NO.：14组成，第二扩增引物由SEQ ID NO.：15组成。

4.权利要求1的寡核苷酸组，还包含信号引物和报道探针，用于第一寡核苷酸组的信号引物由SEQ ID NO.：4或5组成，用于第二寡核苷酸组的信号引物由SEQ ID NO.：16或17组成，报道探针由SEQ ID NO.：8或10组成。

5.权利要求4的寡核苷酸组，其中信号引物由SEQ ID NO.：4组成，报道探针由SEQ ID NO.：8组成。

6.权利要求4的寡核苷酸组，其中信号引物由SEQ ID NO.：5组成，报道探针由SEQ ID NO.：10组成。

7.权利要求4的寡核苷酸组，其中信号引物由SEQ ID NO.：16组成，报道探针由SEQ ID NO.：8组成。

8.权利要求4的寡核苷酸组，其中信号引物由SEQ ID NO.：17 组成，报道探针由SEQ ID NO.：10组成。

9.权利要求4的寡核苷酸组，还包括一个或多个由SEQ ID NO.：1、12或13组成的缓冲引物。

10.权利要求6的寡核苷酸组，还包括由SEQ ID NO.：11组成的第二报道探针。

11.权利要求10的寡核苷酸组，还包括一个或多个由SEQ ID NO.：1、12或13组成的缓冲引物。

12.权利要求8的寡核苷酸组，还包括第二信号引物和第二报道探针，第二信号引物由SEQ ID NO.：17组成，第二报道探针由SEQ ID NO.：10的杂交序列组成。

13.权利要求12的寡核苷酸组，其中第二寡核苷酸组还包括一个或多个由SEQ ID NO.：1、12或13组成的缓冲引物。

14.权利要求4的寡核苷酸组，其中SEQ ID NO.：4、5、8、10、16和17的杂交序列还包含可间接检测的标记物。

15.权利要求14的寡核苷酸组，其中可间接检测的标记物包括衔接序列。

16.对SARS-CoV复制酶核酸具有靶特异性的多个核酸引物的组在制备用于检测样品中存在或缺乏SARS-CoV的药物中的用途，

所述多个核酸引物的组选自第一核酸引物组和第二核酸引物组，其中第一核酸引物组具有第一引物由SEQ ID NO.：2的靶结合序列以及任选地扩增反应所需的专门序列组成和第二引物由SEQ ID NO.：3 的靶结合序列以及任选地扩增反应所需的专门序列组成；和第二引物组具有第一核酸引物由SEQ ID NO.：14的靶结合序列以及任选地扩增反应所需的专门序列组成和第二引物由SEQ ID NO.：15的靶结合序列以及任选地扩增反应所需的专门序列组成；

其中所述多个核酸引物的组用于说明存在SARS CoV与否。

17.权利要求16的用途，其中第一引物由SEQ ID NO.：2组成，第二引物由SEQ IDNO.：3组成。

18.权利要求16的用途，其中第一引物由SEQ ID NO.：14组成，第二引物由SEQ ID NO.：15组成。

19.权利要求16的用途，其中多个核酸引物的组用于链置换扩增(SDA)反应。

20.权利要求19的用途，其中SDA反应利用一个或多个由SEQ ID NO.：1、12或13组成的缓冲引物。

21.权利要求16的用途，其中多个核酸引物的组用于扩增核酸产物，所述扩增的核酸产物与用于第一核酸引物组的由SEQ ID NO.：4或5的信号引物杂交，或用于第二核酸引物组的由SEQ ID NO.：16或17组成的信号引物杂交。

22.权利要求19的用途，其中SDA反应包括耐热链置换扩增(tSDA)反应。

23.权利要求22的用途，其中tSDA反应是均相荧光实时tSDA反应。

24.第一引物组或第二引物组在制备试剂中的用途，所述试剂用于扩增SARS-CoV的靶核酸序列以检测样品中SARS-CoV是否存在的方法，所述方法包括：

(a)使该核酸与第一引物组或第二引物组杂交，和

(b)在靶核酸序列上延伸杂交的第一和第二扩增引物，由此扩增该靶核酸序列；其中

第一引物组包括：

(i)由SEQ ID NO.：2的靶结合序列以及任选地扩增反应所需的专门序列组成的第一扩增引物；和

(ii)由SEQ ID NO.：3的靶结合序列以及任选地扩增反应所需的专门序列组成的第二扩增引物；

第二引物组包括：

(i)由SEQ ID NO.：14的靶结合序列以及任选地扩增反应所需的专门序列组成的第一扩增引物；和

(ii)由SEQ ID NO.：15的靶结合序列以及任选地扩增反应所需的专门序列组成的第二扩增引物。

25.权利要求24的用途，其中第一扩增引物由SEQ ID NO.：2的靶结合序列以及任选地扩增反应所需的专门序列组成，第二扩增引物由SEQ ID NO.：3的靶结合序列以及任选地扩增反应所需的专门序列组成。

26.权利要求24的用途，其中第一扩增引物由SEQ ID NO.：14的靶结合序列以及任选地扩增反应所需的专门序列组成，第二扩增引物由SEQ ID NO.：15的靶结合序列以及任选地扩增反应所需的专门序列组成。

27.权利要求25的用途，其中扩增反应所需的专门序列包含可被限制性核酸内切酶切割的限制性核酸内切酶识别位点。

28.权利要求25的用途，其中扩增反应所需的专门序列包含RNA聚合酶所识别的启动子。

29.权利要求26的用途，其中扩增反应所需的专门序列包含可被限制性核酸内切酶切割的限制性核酸内切酶识别位点。

30.权利要求26的用途，其中扩增反应所需的专门序列包含RNA聚合酶所识别的启动子。

31.权利要求24的用途，还包括通过与信号引物杂交，间接地检测扩增的靶核酸。

32.权利要求31的用途，其中第一引物组还包括由SEQ ID NO.：4或5组成的信号引物，第二引物组还包括由SEQ ID NO.：16或17组成的信号引物。

33.权利要求24的用途，其中靶核酸序列由用于第一引物组的SEQ ID NO.：6或7，和用于第二引物组的SEQ ID NO.：18或19组成。

34.信号引物和报道探针在制备试剂中的用途，所述试剂用于定量靶样品中SARS-CoV核酸的量以检测SARS-CoV是否存在的方法，所述方法包括步骤：

a)将靶样品与已知浓度的SARS-CoV内对照核酸混合；

b)在扩增反应中扩增靶核酸和内对照核酸；

c)检测扩增的核酸；和

d)分析扩增的SARS-CoV靶核酸与内对照核酸的相对量，其中扩增反应利用一个或多个由包括SEQ ID NO.：4或5的第一系统或包括 SEQ ID NO.：16或17的第二系统的杂交序列组成的信号引物和一个或多个由SEQ ID NO.：8、9、10或11的杂交序列组成的报道探针。

35.权利要求34的用途，其中SEQ ID NO.：4、5、8、9、10、11、16和17的杂交序列包含可间接检测的标记物。

36.权利要求35的用途，其中可间接检测的标记物包含衔接序列。

37.权利要求34的用途，其中步骤(b)包含链置换扩增反应。

38.权利要求37的用途，其中链置换扩增反应包括tSDA反应。