KR102599751B1 - 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 - Google Patents
돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브 세트 및 이를 포함하는 검출용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 돼지 급성설사 증후군 바이러스의 핵산 서열에 특이적으로 결합하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 효과적인 검출 및 진단을 가능하게 한다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 돼지 급성설사 증후군 바이러스를 높은 효율로 검출하는 데에 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스를 특이적으로 검출하는 프라이머 세트, 프라이머 및 프로브 세트, 이들을 포함하는 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.
돼지 급성설사 증후군 코로나 바이러스(swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)는 2017년 중국 광동지역에서 처음 보고된 돼지의 신종 코로나바이러스 감염증이며, 포유자돈에서 급성 구토와 수양성 설사를 일으킨다. 특히, 전염성과 폐사율이 90% 까지 매우 높아 양돈 농가에 상당한 경제적 손실을 초래하였다. 국내에는 아직 발생 보고가 되지 않은 신종 감염병이나, 원인체인 SADS-CoV는 Alphacoronavirus의 일종으로 박쥐 코로나바이러스인 HKU2와 높은 유전자적 상동성(95%)을 보인다. 또한, SADS-CoV가 광범위한 숙주 범위를 가지고 있어 돼지를 중간숙주로 사용하여 인간에 감염할 수 있는 고유한 잠재력을 가지고 있으며, SADS-CoV가 발생했던 지역 및 유래가 SARS-CoV와 동일하다는 점에서 인수공통가능성의 문제가 제기된다(비특허문헌 1).
특히, 중국은 우리나라와 활발한 인적/물적 교류를 하고 있으며, 지리적으로 인접하여 전염병이 발생할 경우 유입이 빠르게 일어날 수 있어 선제대응이 필요한 실정이다.
따라서 향후 국내유입 및 인수공통감염의 잠재적인 위험요인을 가지고 있는 SADS-CoV에 대한 선제적인 대응 체계 마련을 위해서 민감도 높은 진단기술의 확보가 요구되는 실정이다.
본 발명자들은 SADS-CoV에 대한 선제적인 대응 체계 마련을 위해서 민감도 높은 진단기술을 확보하고자, SADS-CoV를 특이적으로 검출할 수 있는 PCR 기반 진단 기술을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, SADS-CoV에 높은 특이성으로 결합하는 프라이머 및 프로브 세트를 성공적으로 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV)에 특이적으로 결합하는 SADS-CoV 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV) 검출 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, (i) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 포함하는 프라이머 세트; 및 (ii) 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브;를 포함하는 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
본 발명에서 검출 대상인 "돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV)"는 돼지의 신종 코로나바이러스 감염증상을 일으키는 바이러스로서, 포유자돈에서 급성 구토와 수양성 설사를 유발하는 증상을 일으키며, 이 SADS-CoV 바이러스는 Alphacoronavirus의 일종으로 박쥐 코로나바이러스인 HKU2와 높은 유전자적 상동성(95%)을 보인다고 알려져 있다. 또한, SADS-CoV가 광범위한 숙주 범위를 가지고 있어 돼지를 중간숙주로 사용하여 인간에 감염할 수 있는 고유한 잠재력을 가지고 있다.
본 발명의 프라이머 및 프로브는 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV) 유래의 핵산 서열에 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 용어,"특이적으로 결합"은 상기 프라이머 및 프로브가 상기 SADS-CoV 유래 핵산 (표적 핵산) 이외의 다른 핵산에 실질적으로 결합하지 않거나 결합 친화도에서 큰 차이를 보여 상기 SADS-CoV 유래 핵산과 다른 핵산과 차별적으로 결합하는 특성을 의미한다.
본 발명에서 용어, "프라이머(primer)"는 표적 핵산(템플레이트)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하에서, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재 시, 그리고 적합한 온도와 pH에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고 뉴클레오타이드를 의미한다.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)"관심의 표적 핵산(템플레이트)에 하이브리드화 또는 어닐링 할 수 있고 표적 핵산의 특이적 검출을 가능하게 하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.
일 구현예에서, 본 발명의 프라이머는 서열번호 1의 염기서열, 또는 상기 염기서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 프라이머는 서열번호 2의 염기서열, 또는 상기 염기서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 상기 80% 이상의 상동성은 80% 이상, 82% 이상, 84% 이상, 86% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 프로브는 서열번호 3의 염기서열, 또는 상기 염기서열과 80% 이상, 82% 이상, 84% 이상, 86% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에서 상술한 프라이머 또는 프로브의 염기서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 및 프로브는 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV)의 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein)을 암호화하는 핵산을 표적 핵산으로 삼았다.
상기 프라이머 또는 프로브는 이의 올리고뉴클레오타이드의 말단에 추가적으로 검출 가능한 표지가 부착될 수 있다.
상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기화학적 표지 또는 이들의 조합일수 있다.
상기 검출가능한 표지는 프라이머 또는 프로브의 특정 염기, 특정 구조 예를 들면, 헤어핀-루프(hairpin-loop) 구조의 특정 부위 또는 내부, 3'-말단 또는 5'-말단에 부착될 수 있고, 특히, 프로브의 5'-말단에 부착될 수 있다.
상기 광학적 표지는 광학적 신호를 발생시키는 물질이고, 상기 광학적 신호를 발생시키는 물질은 형광 물질 또는 인광 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플로레세인(fluorescein), FAM, 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(cyanine 2), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 알렉사 플로어, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY) FL, 보디피 FL-Br 2, 보디피 530/550이 포함될 수 있 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 광학적 표지는, 적절한 거리에 의하여 이격되어 있는 형광 도너 발색소 및 형광 수용자 발색소를 포함하고, 도너(donor)의 형광 발광이 수용자(receptor)에 의하여 억제되어 있는 형광공명에너지전달(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍일 수 있다. 도너 발색소는 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 및 Texas Red를 포함할 수 있다. 수용자 발색소는 그의 여기 스펙트럼이 도너의 발광 스펙트럼과 겹치도록 선택될 수 있다. 또한, 상기 수용자는 넓은 범위의 도너를 켄칭(quenching)하는 비형광 수용자일 수 있다. 도너-수용자 FRET 쌍의 다른 예는 당업계에 알려져 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상술한 프라이머 세트를 포함하는 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상술한 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 검출용 조성물에서, 상술한 바와 같이, 추가적으로 광학적 표지, 전기화학적 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 검출 가능한 표지가 부착될 수 있으며, 이 경우 상기 조성물은 상기 표지 및 상기 표지를 검출할 수 있는 시약, 장치 또는 도구를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 검출용 조성물은 키트 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 검출용 조성물 또는 검출용 키트는 돼지 급성설사 증후군의 검출 또는 진단을 위하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 생물학적 시료내에서의 SADS-CoV 바이러스 존재 유무 뿐만 아니라 SADS-CoV에 의해 나타나는 임상 증상의 예후, 경과, 병기 등을 확인할 수 있다.
상기 생물학적 시료란 SADS-CoV에 걸릴 수 있는 개체로부터 얻어지는 모든 생물학적 시료를 포함한다.
상기 생물학적 시료는 상기 SADS-CoV 바이러스가 포함되어 있을 것으로 추정되는 시료일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 세포, 객담, 조직, 타액(saliva), 생검(biopsy), 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.
상기 키트에는 상기 프라이머 세트, 또는 프라이머 및 프로브 세트를 사용하는 표적 물질의 분석에 사용되는 당분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
상기 검출 키트를 이용할 경우, 기존에 이용한 방법을 사용하는 것에 비해 단시간에, 간편하게, 높은 특이도로, SADS-CoV에 대한 검출 또는 진단 정확성을 높일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 유전자 증폭에 사용되는 것이다.
상기 유전자 증폭은 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것이다.
상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간 (real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다.
상기 중합효소연쇄반응에는 당업계에 알려진 다양한 DNA 중합효소가 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 '클레나우' 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
본 발명의 키트는 중합효소연쇄반응 산물에 의한 캐리오버(carryover) 또는 크로스오버(crossover) 오염을 차단하기 위해 dUTP(deoxyuridine triphosphate) 및 UDG(Uracil DNA Glycosilase)를 추가적으로 포함할 수 있다. UDG는 이전 증폭산물 DNA 주형가닥에 포함된 우라실(Uracil)을 인식하고 잘라내며, 잘려진 DNA 주형가닥은 더이상 주형가닥으로의 역할을 상실하게 됨으로써 증폭반응이 일어나지 않게 된다. 본 발명은 dUTP 및 UDG를 사용함으로써 이전 증폭산물의 오염에 의한 증폭산물의 생성을 원천 차단하여, 이전 증폭생성물의 검사실 오염에 따른 위양성 결과를 배제하여 검사의 정확도를 향상시킨다.
중합효소연쇄반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
중합효소연쇄 반응의 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 발명의 조성물 또는 키트는 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약으로서, 상술한 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 적합한 버퍼(buffer)를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레아제(ribonuclease) 저해제, 내열성 중합 효소 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 DNA 폴리머라제는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(RNA dependent DNA polymerase)와 같은 역전사 효소일 수 있으며, 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증 바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase; AMV RTase), 마우스 백혈병 바이러스-유래 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase; MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase; RAV-2 RTase)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 버퍼는 역전사 버퍼 및 PCR 버퍼를 모두 포함할 수 있으며, 상기 내열성 중합 효소는 EF Taq 중합 효소일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 중합효소연쇄반응은 실시간 PCR(RT-PCR)에 의해 실시되는 것일 수 있다.
상기 실시간 PCR(RT-PCR)은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링 할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값(cycle threshold)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
상기 PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 역치(threshold)를 설정하면 역치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다.
실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. 상기 Interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 상기 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.
본 발명에서 조성물 또는 키트는 필요에 따라 완충용액 및 검출의 수행과 분석을 위한 용기들을 추가로 포함할 수 있으며, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리할 수 있는 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 돼지 급성설사 증후군 코로나 바이러스 검출용 조성물 또는 키트는 SADS-CoV에 대한 최소 검출한계 농도(Limit of Detection, LoD)가 5 copies/μL 이상인 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "최소 검출한계 농도(Limit of Detection, LoD)"는 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 조성물 또는 키트가 SADS-CoV를 검출 또는 감지할 수 있는 최소의 SADS-CoV의 농도이면서, 최소 검출한계 농도는 상기 프라이머 및 프로브 세트가 SADS-CoV를 95% 이상의 검츌률(%)로 검출할 수 있는 경우의 농도를 의미한다.
구체적으로, 본 발명의 검출용 조성물 또는 키트는 최소 검출한계 농도가 10 copies/μL 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어 9 copies/μL 이상, 8 copies/μL 이상, 7 copies/μL 이상, 6 copies/μL 이상, 특히, 5 copies/μL 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 다양한 농도의 SADS-CoV 에 대하여 실시간-PCR을 수행하여, SADS-CoV 바이러스의 검출률을 측정하였다. 그 결과, 5 copies/μL에서 검출률이 100%로 나타나, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는의 최소 검출한계 농도인 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV) 검출 방법을 제공한다:
(a) 분석 대상체의 생물학적 시료로부터 핵산을 준비하는 단계;
(b) 상술한 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트, 또는 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트와, 상기 핵산을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;
(c) 상기 중합효소연쇄반응의 산물을 검출하는 단계.
상기 분석 대상체는 SADS-CoV를 가질 것으로 예상되는 대상체일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 세포, 객담, 조직, 타액(saliva), 생검(biopsy), 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.
상기 핵산을 준비하는 단계는 상기 시료를 PCR 방법에 적용하기 위해 처리하는 단계이다. 상기 시료의 처리 방식은 DNA 추출 또는 RNA 추출방식을 적용할 수 있으며, 구체적으로는 본 발명의 SADS-CoV가 RNA 지놈 바이러스인 점으로부터 RNA 추출방식을 적용할 수 있다. 상기 시료로부터 DNA 또는 RNA를 추출하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal.Biochem. 162:156(1987)).
일 구현예에서, 상기 핵산을 준비하는 단계는 생물학적 시료로부터 추출된 RNA 분자를 cDNA로 역전사하는 단계를 포함할 수 있다.
다음으로 상기 프라이머 세트 또는 프라이머 및 프로브 세트와, 상기 핵산을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계에서, 중합효소연쇄반응은 상술된 PCR 또는 실시간 PCR 에 의하여 이루어지는 것으로서, 이와 동일하게 이해될 수 있으므로, 중복하여 설명되지 않는다.
상기 중합효소연쇄반응의 산물을 검출하는 단계는, PCR 방법을 이용하여 타겟서열을 증폭하는 경우에는 예를 들어 증폭산물을 아가로스 젤 상에서 분리한 후 염색하는 방법을 통해 수행할 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응의 산물을 검출하는 단계는, 실시간 PCR 방식을 이용하여 서열을 증폭하는 경우에는 예를 들어 미지시료의 양성, 음성여부에 관계없이 증폭되는 인터널 콘트롤의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻을 수 있다. 이러한 인터널 콘트롤의 Cp값 또는 Ct값과 형광 세기의 표준 곡선은 음성 대조군의 Cp값 또는 Ct값과 형광세기의 곡선 패턴과 명확하게 구별되어 미지시료의 양성 또는 음성 여부를 판단하는 기준을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 시료를 PCR 증폭하여 전체 PCR 증폭 기간에 대한 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻은 후, 인터널 콘트롤 및 음성 대조군의 Cp값 또는 Ct값과 형광세기의 곡선 패턴과 비교하여 시료 내에 표적 유전자가 포함되어 있는지 여부를 확인할 수 있다.
본 발명은 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV)를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트 및 이를 포함하는 검출용 조성물에 관한 것으로 상기 조성물을 이용하여 qRT-PCR방법을 통해 높은 민감도와 특이도로 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스를 검출할 수 있다. 본 발명의 조성물은 SADS-CoV를 최소 5 copies/μL 의 검출한계 농도로 검출해낼 수 있어 높은 효율로 SADS-CoV를 검출 또는 진단할 수 있다.
도 1은 SADS-CoV qRT-PCR 반응 결과를 보여주는 대표적인 그래프이다.
도 2는 각 농도별 Pre-liminary LoD 테스트 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 5 copies/μL로 Confirmatory LoD 테스트 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 각 농도별 Pre-liminary LoD 테스트 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 5 copies/μL로 Confirmatory LoD 테스트 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 출원을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 출원을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 출원의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
실시예 1: 프라이머 및 프로브의 설계 및 PCR 조건
1.1 프라이머 및 프로브의 설계
돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 다음과 같이 설계하였다.
1.1.1 SADS-CoV 타겟 유전자 선정
SADS-CoV 유전자 정보는 미국 국립생물공학정보센터 (NCBI, National Center for Biotechnology Information, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 입수하였다. 이후, Multiple Sequence Alignment 프로그램을 사용하여 유전자적 상동성을 분석하였다. 상기 입수된 유전자 정보와 상기 유전자 상동성 분석 결과를 바탕으로, 타겟 유전자를 선정하였다.
1.1.2 타겟 유전자 합성 및 표준시료 확보
상기와 같이 SADS-CoV의 선정된 유전자를 pUC57 vector에 클로닝하여 유전자를 합성하였다. SADS-CoV의 선정된 유전자를 이용하여 in vitro transcription mRNA를 합성하여 검사법을 평가하였다. 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV)의 유전자 중 SADS-CoV 바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있는 타겟 핵산 서열로서 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein)을 코딩하는 핵산 서열을 확보하였다.
1.1.3 프라이머/프로브 디자인 및 최적화
상기와 같이 타겟 유전자를 선정하고, 프라이머 및 프로브의 서열을 토대로, 프라이머 및 프로브의 염기서열을 디자인하였다. 상기 프라이머 및 프로브의 길이는 19~30 bp, Tm 값은 60~68℃ GC content는 40~60%가 되도록 고려하여 SADS-CoV의 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 또한, 상기 프로브에서 5'-말단은 FAM의 형광물질로 표지하였고, 소광제(quencher)는 SFCQ1 및 SFCQ2을 사용하였다. 디자인한 본 발명의 프라이머 및 프로브의 염기서열은 아래 표 1에 나타내었다. 상기 디자인된 프라이머 및 프로브의 서열을 in silico 분석을 통해 Inclusivity 및 Exclusivity을 확인함으로써 최적화하였다. 디자인한 프라이머는 마크로젠(Macrogen)사에 합성을 의뢰하여 제작하였고, 디자인한 프로브는 SFC사(대한민국, 충북 청주시)에 합성 의뢰하여 제작하였다.
1.2 PCR 혼합물 제조 및 RT-PCR 수행
SADS-CoV 검출을 위한 one-step RT-PCR의 반응액 조성 및 반응 조건은 하기 표 2 및 표 3과 같이 설정하였다. 구체적으로, RT-PCR의 반응액에는 SADS-CoV 특이 프라이머쌍 및 프로브와 2X Master mix buffer 10ul (제조사: ㈜ 진스랩), 프라이머 (0.2 pmol/1 reaction) 및 프로브(0.05 pmol/1 reaction)와 1X TE Buffer(pH 8.0)를 혼합한 조성물 5 μL, template (in vitro transcription mRNA) 5 μL를 혼합하여 총 volume이 20 μL가 되도록 한 후 real-time PCR의 96 well plate에 반응액을 넣어 PCR을 수행하였다(표 2). 상기 RT-PCR의 단일 진단법 조건은 하기 표 3에 명시되어 있으며, 실험 장비로는 CFX96™ Real-Time PCR Detection System을 사용하였다.
실시예 2: 최소 검출한계 농도(limit of detection, LoD) 농도 확인
상기 RT-PCR을 이용하여 SADS-CoV 검출법의 분석적 민감도를 평가하기 위하여, SADS-CoV in virtro transcript mRNA를 이용하여 최소 검출한계 농도(limit of detection, LoD) 농도를 측정하였다. 구체적으로, SADS-CoV의 mRNA 10, 5, 2.5, 1, 0.5 copies/μL 5개의 농도로 각각 8회 반복 RT-PCR한 후, 95% 이상의 검출률로 SADS-CoV 검출이 가능한 최소 농도를 최소 검출한계 농도로 선정하였다.
RT-PCR의 결과는 다음의 기준에 따라 판독하였다. SADS-CoV signal의 Ct 값과 Internal Control signal의 Ct 값이 40 이하인 경우는 양성으로 판정하고, IC signal의 Ct값만 확인되는 경우에는 음성으로 판정하였다. 또한, IC signal의 Ct 값은 negative control (NC)를 포함한 모든 sample에서 확인되어야 하는 조건을 설정하였다.
그 결과, 표 4 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 최소 검출한계 농도가 2.5 copies/μL 이하일 경우 75%이하의 검출율을 가졌으나, 5 copies/μL 및 10 copies/μL 인 경우, 본 발명의 조성물에 의한 SADS-CoV의 검출률이 100%인 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 조성물은 최소 검출한계 농도가 5 copies/μL 이상인 것으로 매우 우수한 검출력을 가짐을 확인하였다.
또한, 상기 Pre-liminary LoD test에서 선정된 5 copies/μL 농도가 95% 이상 검출 가능한 농도임을 확인하기 위하여, 5 copies/μL의 농도에서 RT-PCR을 30회 반복하는 Confirmatory LoD test를 진행하여 상기 최소 검출한계 농도를 결정하였다.
그 결과, 표 5 및 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 조성물의 SADS-CoV에 대하여 5 copies/μL 농도에서 검출률이 96.67%인 것으로 나타나므로, 본 발명의 조성물의 최소 검출한계 농도는 5 copies/μL인 것으로 확인되었다.
본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술기획평가원의 가축질병대응기술고도화지원 사업의 지원을 받아 연구되었음 과제번호 (122012-2)
Claims (7)
- 삭제
- (i) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 포함하는 프라이머 세트; 및
(ii) 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브;
를 포함하는 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트.
- 삭제
- 청구항 2의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스 검출용 조성물.
- 다음의 단계를 포함하는 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스(SADS-CoV) 검출 방법:
(a) 분석 대상체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 준비하는 단계;
(b) 청구항 2의 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트와, 상기 핵산을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;
(c) 상기 중합효소연쇄반응의 산물을 검출하는 단계.
- 청구항 5에 있어서,
상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 세포, 객담, 조직, 타액(saliva), 생검(biopsy), 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인, 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스 검출 방법.
- 청구항 5에 있어서,
상기 중합효소연쇄반응은 실시간 PCR(real time-polymerase chain reaction)인 것인, 돼지 급성설사 증후군 코로나바이러스 검출 방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN107630109A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-01-26 | 华南农业大学 | 一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光定量pcr引物及试剂盒 |
-
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- 2022-12-22 KR KR1020220182276A patent/KR102599751B1/ko active IP Right Grant
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Non-Patent Citations (1)
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