CN110305987A - 检测诺如病毒i型、诺如病毒ii型和轮状病毒的试剂盒 - Google Patents
检测诺如病毒i型、诺如病毒ii型和轮状病毒的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）技术领域：本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的试剂盒及其使用方法。技术问题：三种病毒均属于腹泻的主要病原体，转播途径和感染后症状等都非常相似，而市面上检测单项病原体的产品无法满足快速检测、区分三种病原体的需求。技术方案：按照荧光PCR法原理，根据三种病毒的核酸序列特点，挑选其各自的特异性保守序列并设计相应的引物即TaqMan荧光探针。主要用途：本试剂盒用于粪便、肛拭子或呕吐物等标本中，同时对上述三种病毒核酸进行定性检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的试剂盒及其使用方法。
背景技术
轮状病毒（Rotavirus，简称RV）是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科。轮状病毒总共有七种，以英文字母编号为A、B、C、D、E、F与G。其中，A种是最为常见的一种。轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，其主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，感染途径为粪－口途径，轮状病毒感染从无症状、轻微发病到严重发病，严重时发生致命性胃肠炎、脱水及电解质平衡。其中急性胃肠炎的临床表现为症状包括发烧、呕吐、腹痛以及无血色水样腹泻，症状可持续3～9天。几乎世界上每个大约五岁的小孩都曾感染过轮状病毒至少一次。
诺如病毒，又称诺瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV），为无包膜单股正链RNA病毒，属于人类杯状病毒科中的诺如病毒（Norovirus,NV）属，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒目前还不能体外培养，无法进行血清型分型鉴定。根据基因特征，诺如病毒被分为6个基因群（Genogroup，GI-GVI），GI和GII是引起人类急性胃肠炎的两个主要基因群，即诺如病毒I型和诺如病毒II型。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15%左右，血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。诺如病毒传播途径包括人传人、经食物和经水传播。其中人传人可通过粪口途径（包括摄入粪便或呕吐物产生的气溶胶）、或间接接触被排泄物污染的环境而传播。诺如病毒感染发病以轻症为主，最常见症状是腹泻和呕吐，其次为恶心、腹痛、头痛、发热、畏寒和肌肉酸痛等。诺如病毒感染病例的病程通常较短，症状持续时间平均为2-3天。
“诺如病毒”感染性腹泻属于自限性疾病，没有疫苗和特效药物，公众搞好个人卫生、食品卫生和饮水卫生是预防本病的关键，要养成勤洗手、不喝生水、生熟食物分开，避免交叉污染等健康生活习惯。
可见，诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的传染源、传播途径和感染后症状等都非常相似，只是强弱稍有差别。而市面上检测单项病原体的产品无法满足快速检测、区分三种病原体的需求。轮状病毒和诺如病毒引发的重要公共卫生问题已越来越受到国际科学界的关注。基于以上情况，对这三种病原体快速检测区分的需求越来越高，因此，为了更加准确和快速诊断，有必要建立一种能够同时灵敏、特异和高效检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的检测手段。
分子诊断技术可以满足对诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒快速诊断的需求，并且由于它们的遗传物质都为核糖核酸，样本提取后都需要进行逆转录过程，再进行分子检测，所以本试剂盒可以对这三种病原体同时进行检测，能够快速、准确地进行病原体筛选，从而配合以正确的治疗，减少抗生素药物的滥用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种可同时快速检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒三种病原体的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该用于检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的试剂盒由混合反应物（2X）（包括Taq热启动DNA聚合酶、UNG酶、TaqMan荧光探针、PCR缓冲液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP、MgCl2等）、酶混合物（20X）（Luna温启动逆转录酶和小鼠RNase抑制剂）、正向引物、反向引物、阳性质控品和无RNase水组成；其中，混合反应液中包括有诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；
所述特异性保守序列的引物序列为：
诺如病毒I型，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
诺如病毒II型，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
轮状病毒，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
所述特异性保守序列的TaqMan探针序列为：
诺如病毒I型，SEQ ID NO.3；
诺如病毒II型，SEQ ID NO.6；
轮状病毒，SEQ ID NO.9。
上述技术方案可对诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒进行快速准确检测，且能在各种环境中简便易用，保证了检测的时效性、特异性和灵敏度；针对诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒各自的保守序列上设计特异性引物探针，并在探针上标记不同的荧光信号，可以同时检测并区分出诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒；解决了仪器兼容性和产物残留污染的问题。试剂盒采用TaqMan探针荧光PCR技术，针对诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒进行检测，设计引物和探针的序列在诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μL。
其中，
SEQ ID NO.1： TGGAYGCGAT TVCATGA
SEQ ID NO.2： CTTAGACGCS ATCATCATT
SEQ ID NO.3： AGATHGCGGT CTCCTGTCC
SEQ ID NO.4： CARGARBCNA TGTTYARRTG GATG
SEQ ID NO.5： GACGCCATCT WCATTCACA
SEQ ID NO.6： TGKGAGKGCG ATCGCAAT
SEQ ID NO.7： ABCTACMCAT GACCCTC
SEQ ID NO.8： GGTCACATAA CKCCCC
SEQ ID NO.9： ACAATAGTTA AMAGCTAACA CTGWC
优选的，所述检测试剂包括有混合反应物（2X）（包括Taq热启动DNA聚合酶、UNG酶、TaqMan荧光探针、PCR缓冲液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP、MgCl2等）、酶混合物（20X）（Luna温启动逆转录酶和小鼠RNase抑制剂）、正向引物、反向引物、阳性质控品和无RNase水。
采用了UNG酶/dUTP防污染体系，能减少前次PCR反应产物带来的污染干扰；试剂盒的混合反应物含有dUTP，qPCR / RT-qPCR前用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）预处理，通过切除尿嘧啶碱基以产生不可扩增的DNA产物来消除先前扩增的含尿嘧啶的产物。所以，在反应混合物中加入0.025单位/μl的NEB的南极热敏UDG，可以实现防止产物残留污染。将逆转录酶与热启动 Taq酶混合在一个PCR反应管中使用，在单管中，RNA首先通过反转录酶转录为cDNA，然后DNA依赖的DNA聚合酶扩增cDNA，通过qPCR完成定量。 基于探针的qPCR / RT-qPCR监测淬灭后5'→3'外切核酸酶切割时荧光增加，靶特异性探针，用于在PCR的每个循环中测量DNA扩增。 在一个在背景上可靠地检测到荧光信号的点荧光，量化循环或Ct值可以确定。Ct值可以用于评估两个或多个样本之间或相对目标丰度，参考适当的标准曲线计算绝对目标量。所使用的探针为5’端荧光标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，即随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在荧光PCR扩增过程中，当特异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时热启动 Taq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
优选的，所述的 Luna温启动逆转录酶是经过设计，比许多其他RT更高的热稳定性，可使最佳反应温度达到55℃。对于困难的目标/模板，可以使用高达60°C的较高RT步骤温度。Luna温启动逆转录酶和Taq热启动DNA聚合酶利用一种对温度敏感、可逆的适配体在45℃以下抑制其活性。因此，可以在室温下建立反应并抑制非特异性扩增。
优选的，所述试剂盒的混合反应物由独特的被动参比染料配制而成，可与各种qPCR仪器平台兼容，包括需要ROX校正的仪器，实验操作过程中不再需要额外的染料。
优选的，所述的引物在扩增体系中的终浓度为100～900nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为100～500nM。Taq热启动DNA聚合酶（1～2U/μL）、Luna温启动逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度为0.5U～5U。
其中，M＝mol/L，是浓度单位；w/v为质量体积比；此外，酶的浓度是在一个反应体系里1U。
优选的，所述阳性质控品中含有诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的扩增基因序列的质粒。
优选的，所述检测试剂的制备方法为：使用标准脱盐方法纯化引物以满足用于qPCR /RT-qPCR。采用HPLC或PAGE纯化可能有助于需要的分析灵敏度提高。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种前述试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：
（1）使用前：
①使用所需的RNA提取和纯化方法制备目标RNA，通过OD260吸光度确定浓度。
②稀释RNA用于标准曲线，这些应在每次实验前新鲜制备，并可在水或TE中稀释。
（2）具体步骤：
①在室温下解冻试剂盒反应混合物和其他反应组分，然后置于冰上。完全解冻后，通过倒置，移液或温和涡旋简单地混合各组分，对于96孔板，建议最终反应体积为20μl。
②确定适当数量反应的总体积，加入10％过量体积，并相应地制备除RNA模板外的所有组分的测定混合物。 通过移液或涡旋但轻柔彻底混合。 通过简单离心将液体收集到管底部。
③将等分试样混合到qPCR管或板中。 为获得最佳效果，请确保准确一致的移液量并尽量减少气泡。
④将RNA模板添加到qPCR管或板中。 密封管，带有光学透明的平盖; 用光学透明薄膜密封板。应注意正确密封板边缘和角落，以防止蒸发造成的伪影。
⑤短暂旋转管或板以除去气泡并收集液体（2500~3000r/min）。
（3）反应设置：为获得最佳结果，我们建议运行每个RNA标准品和样品一式三份。
（4）PCR扩增反应的条件为：55℃逆转录10min，1个循环；95℃预变性1min，1个循环；95℃变性10s，60℃退火延伸30s（包含读板时间），40～45个循环。
（5）有效性判定：
无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤35，否则实验视为无效；
（6）结果判读：
样本检测管Ct值为Undet或40，该样本结果判断为阴性，样本RNA提取失败、待测样本中不含RNA或含量低于检测限；
样本检测管Ct值≤35且曲线有明显的扩增区，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；
样本检测管Ct值为大于35且小于等于40且曲线有明显的扩增区时，需要复检一次，若第二次检测无Ct值则为阴性，若第二次检测有Ct值则为阳性；按照以上判读方法，结合样本检测管检出的诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒对应荧光通道的Ct值来判断三种病原体的检测结果。
附图说明
图1是本发明实施例1的PCR扩增曲线图；
图2是本发明实施例2的PCR扩增曲线图。
具体实施方式
实施例1：本实施例的用于检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的试剂盒，由混合反应物（2X）（包括Taq热启动DNA聚合酶、UNG酶、TaqMan荧光探针、PCR缓冲液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP、MgCl2等）、酶混合物（20X）（Luna温启动逆转录酶和小鼠RNase抑制剂）、正向引物、反向引物、阳性质控品和无RNase水组成；其中，混合反应液中包括有诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；
所述特异性保守序列的引物序列为：
诺如病毒I型，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
诺如病毒II型，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
轮状病毒，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
所述特异性保守序列的TaqMan探针序列为：
诺如病毒I型，SEQ ID NO.3；
诺如病毒II型，SEQ ID NO.6；
轮状病毒，SEQ ID NO.9。
引物在扩增体系中的终浓度为400nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为200nM；所述热启动 TaqDNA聚合酶、Luna温启动逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度均为2U；所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均为0.5mM；所述MgCl2在扩增体系中的终浓度为5.0mM；阳性质控品中含有诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的扩增基因序列的质粒。
该试剂盒的反应体系为20μL，包含混合反应物（2X）10μL、酶混合物（20X）1μL、正向引物0.8μL、反向引物0.8μL、模板RNA量可变化，最后用无RNase水补齐至20μL。
试剂盒的操作和结果判定：
(1)将样品的DNA/RNA共提取模板(从人的粪便、肛拭子或呕吐物标本等中提取)、无RNase水、阳性质控品分别加入不同的PCR反应管（其他组分已配好）中，配成反应体系，盖好管盖混匀离心，放入荧光定量PCR仪中进行荧光PCR检测；
(2)设置仪器中的PCR扩增反应的条件为：55℃逆转录10min，1个循环；95℃预变性1min，1个循环；95℃变性10s，60℃退火延伸30s（包含读板时间），40～45个循环。
(3)反应完成后，基线设定为自动调整，根据扩增曲线图和Ct值对检测结果进行分析；
(4)有效性判定：
无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤35，否则实验视为无效；
(5)结果判读：
样本检测管Ct值为Undet或40，该样本结果判断为阴性，样本RNA提取失败、待测样本中不含RNA或含量低于检测限；
样本检测管Ct值≤35且曲线有明显的扩增区，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；
样本检测管Ct值为大于35且小于等于40且曲线有明显的扩增区时，需要复检一次，若第二次检测无Ct值则为阴性，若第二次检测有Ct值则为阳性；按照以上判读方法，结合样本检测管检出的诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒对应荧光通道的Ct值来判断三种病原体的检测结果。
图1为本发明的PCR扩增曲线图，其中横直线为荧光阈值，3条曲线分别为诺如2型，诺如1型，轮状病毒阳性样本，且Ct值都＜35，表明结果有效。
图2为用本发明的试剂盒分别检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒对应的质粒样本，以及三者混合质粒样本，浓度分别为95copies/μL。阴性对照均未扩增，阳性质粒均扩增出对应产物，且Ct值＜35，表明结果有效。试验结果表明本试剂盒可以同时检出诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒，也可以检出单项且不干扰其他两项病原体的荧光信号通道。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，例如引物在扩增体系中的终浓度在100～900nM范围内进行选择，探针在扩增体系中的终浓度在100～500nM范围内进行选择，热启动 TaqDNA聚合酶、Luna温启动逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度均在0.5U～5U范围内进行选择，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 张鹏
<120> 检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> 诺如1型病毒(small round structured virus)
<400> 1
tggaygcgat tycatga 17
<210> 2
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 诺如1型病毒(small round structured virus)
<400> 2
cttagacgcs atcatcatt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 诺如1型病毒(small round structured virus)
<400> 3
agathgcggt ctcctgtcc 19
<210> 4
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 诺如2型病毒(small round structured virus)
<400> 4
cargarbcna tgttyarrtg gatg 24
<210> 5
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 诺如2型病毒(small round structured virus)
<400> 5
gacgccatct wcattcaca 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 诺如2型病毒(small round structured virus)
<400> 6
tgkgagkgcg atcgcaat 18
<210> 7
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> 轮状病毒(Human rotavirus)
<400> 7
abctacmcat gaccctc 17
<210> 8
<211> 16
<212> DNA/RNA
<213> 轮状病毒(Human rotavirus)
<400> 8
ggtcacataa ckcccc 16
<210> 9
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 轮状病毒(Human rotavirus)
<400> 9
acaatagtta amagctaaca ctgwc 25
Claims (9)
1.一种用于检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由混合反应物(2X)(包括Taq热启动DNA聚合酶、UNG酶、TaqMan荧光探针、PCR缓冲液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP、MgCl2等)、酶混合物(20X)(Luna温启动逆转录酶和小鼠RNase抑制剂)、正向引物、反向引物、阳性质控品和无RNase水组成；其中，混合反应液中包括有诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；
所述特异性保守序列的引物序列为：
诺如病毒I型，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
诺如病毒II型，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
轮状病毒，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
所述特异性保守序列的TaqMan探针序列为：
诺如病毒I型，SEQ ID NO.3；
诺如病毒II型，SEQ ID NO.6；
轮状病毒，SEQ ID NO.9。
其中，SEQ ID NO.1：TGGAYGCGAT TVCATGA
SEQ ID NO.2：CTTAGACGCS ATCATCATT
SEQ ID NO.3：AGATHGCGGT CTCCTGTCC
SEQ ID NO.4：CARGARBCNA TGTTYARRTG GATG
SEQ ID NO.5：GACGCCATCT WCATTCACA
SEQ ID NO.6：TGKGAGKGCG ATCGCAAT
SEQ ID NO.7：ABCTACMCAT GACCCTC
SEQ ID NO.8：GGTCACATAA CKCCCC
SEQ ID NO.9：ACAATAGTTA AMAGCTAACA CTGWC。
2.根据权利要求1所述的用于检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述混合反应液所述引物在扩增体系中的终浓度为100～900nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为100～500nM；Taq热启动DNA聚合酶(1～2U/μL)、Luna温启动逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度为0.5U～5U。
3.根据权利要求1所述的用于检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的Luna温启动逆转录酶是经过设计，比许多其他RT更高的热稳定性，可使最佳反应温度达到55℃；对于困难的目标/模板，可以使用高达60℃的较高RT步骤温度。
4.根据权利要求1所述的用于检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的混合反应物由独特的被动参比染料配制而成，可与各种qPCR仪器平台兼容，包括需要ROX校正的仪器，实验操作过程中不再需要额外的染料。
5.根据权利要求1所述的用于检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的混合反应物含有dUTP，qPCR/RT-qPCR前用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)预处理，通过切除尿嘧啶碱基以产生不可扩增的DNA产物来消除先前扩增的含尿嘧啶的产物。
6.根据权利要求1所述的用于检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中含有诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的扩增基因序列的质粒。
7.根据权利要求1所述的用于检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的试剂盒，其特征在于，采用无RNase水作为阴性对照。
8.根据权利要求1-5任一项所述的用于检测诺如病毒I型、诺如病毒II型和轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂的制备方法：使用标准脱盐方法纯化引物以满足用于qPCR/RT-qPCR。
9.根据权利要求7所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括：提供待检测样本，所述待检测样本为粪便、肛拭子或呕吐物标本等。
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