JP2823566B2 - バクテリア診断プローブ - Google Patents
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、高い特異性のヌクレオチド繰り返し配列に
基づくバクテリアに対する診断プローブに関し、より具
体的には前記目的のための診断試験キットに関する。
基づくバクテリアに対する診断プローブに関し、より具
体的には前記目的のための診断試験キットに関する。
本発明者等は、1982年に初めて、あるDNA配列（30〜4
0bp長）が、エシェリヒア・コリー（Escherichia col
i）およびサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella t
yphimurium）のゲノム中で高頻度（約、1000回）に繰り
返されていることを公表した〔Higgins,C.F.,Ferro−Lu
zzi Ames,G.,Barnes,W.M.,Clement,J.M.およびHofnung
M.（1982）Nature.298,760〜762〕。これらの配列は、
パリンドローム（回文）単位またはPUと称されている。
これらの一次配列の保存率は80％である。
0bp長）が、エシェリヒア・コリー（Escherichia col
i）およびサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella t
yphimurium）のゲノム中で高頻度（約、1000回）に繰り
返されていることを公表した〔Higgins,C.F.,Ferro−Lu
zzi Ames,G.,Barnes,W.M.,Clement,J.M.およびHofnung
M.（1982）Nature.298,760〜762〕。これらの配列は、
パリンドローム（回文）単位またはPUと称されている。
これらの一次配列の保存率は80％である。
その後、エシェリヒア・コリーとサルモネラ・チフィ
ムリウム間では、PU共通塩基配列に若干の相違が認めら
れた。この相違は、サルモネラPU配列に追加のグアニン
残基が存在することである。このことは、PU配列が種特
異性を示す前触れであった。今までのところ、バクテリ
アでは、ほんのわずかな族（family）に高頻度の反復配
列が公表されているにすぎない。PUの如く、それらは厳
密な種特異性を示す。ハイブリッド形成によれば、ナイ
セリア（Nisseria）spp.の26−bp反復配列族（ゲノム当
たり少くとも20コピーにおいて）は、他のいろいろなグ
ラム陰性バクテリアには見い出されていない〔Correia,
F.F.,Inouye,S.およびInouye,M.（1986）J.of Bacterio
l.167.1009〜1015〕。ボルデテラ・パータッシス（Bord
etella Pertussis）に由来する反復配列族もまた種特
異的であることが推察される〔MacPheat,W.L.およびMac
Nally,T.（1987）FEMS Lett.41,357〜360〕。
ムリウム間では、PU共通塩基配列に若干の相違が認めら
れた。この相違は、サルモネラPU配列に追加のグアニン
残基が存在することである。このことは、PU配列が種特
異性を示す前触れであった。今までのところ、バクテリ
アでは、ほんのわずかな族（family）に高頻度の反復配
列が公表されているにすぎない。PUの如く、それらは厳
密な種特異性を示す。ハイブリッド形成によれば、ナイ
セリア（Nisseria）spp.の26−bp反復配列族（ゲノム当
たり少くとも20コピーにおいて）は、他のいろいろなグ
ラム陰性バクテリアには見い出されていない〔Correia,
F.F.,Inouye,S.およびInouye,M.（1986）J.of Bacterio
l.167.1009〜1015〕。ボルデテラ・パータッシス（Bord
etella Pertussis）に由来する反復配列族もまた種特
異的であることが推察される〔MacPheat,W.L.およびMac
Nally,T.（1987）FEMS Lett.41,357〜360〕。
最近、プローブとしてエシェリヒア・コリーのPU DNA
を用いる実験で、エンテロバクテリアセエ（Enterobact
eriaceae）に由来するDNAだけはE.コリーとかなりの効
率でハイブリットを形成することが示された。これらの
実験結果は、未公表のデータであるが、遺伝学の動向を
概説するために言及したものである。かかる研究によ
り、本発明者は、PUの特異性がPU配列に相当するDNAプ
ローブを用いるバクテリアの検出および同定に使用する
ことができると確信した。
を用いる実験で、エンテロバクテリアセエ（Enterobact
eriaceae）に由来するDNAだけはE.コリーとかなりの効
率でハイブリットを形成することが示された。これらの
実験結果は、未公表のデータであるが、遺伝学の動向を
概説するために言及したものである。かかる研究によ
り、本発明者は、PUの特異性がPU配列に相当するDNAプ
ローブを用いるバクテリアの検出および同定に使用する
ことができると確信した。
エンテロバクテリアセエおよびボルデテラ・パータッ
シスの繰り返し配列に関する前記観察から、種特異性の
高い反復配列の存在は、バクテリア間の一般的な事象で
あるように思われる。従って、本発明は、特異性診断プ
ローブとして種特異性の高い反復配列の使用に関する。
この形式のバクテリアプローブは、低コピー数遺伝子に
相当するプローブを用いるアッセイよりもはるかに感度
のよい診断アッセイを提供できる。
シスの繰り返し配列に関する前記観察から、種特異性の
高い反復配列の存在は、バクテリア間の一般的な事象で
あるように思われる。従って、本発明は、特異性診断プ
ローブとして種特異性の高い反復配列の使用に関する。
この形式のバクテリアプローブは、低コピー数遺伝子に
相当するプローブを用いるアッセイよりもはるかに感度
のよい診断アッセイを提供できる。
本発明の目的は、生物流体または別の起源に由来する
試料中のバクテリアの同定方法を提供するにある。この
方法は、高い特異性のヌクレオチド繰り返し配列を含有
する標準化DNAプローブと、ハイブリットを形成し得る
バクテリアに対して適当で、かつ通常の処理法による調
製物を要件とする。かかるハイブリッド形成プロトコー
ルについて適当でかつ通常利用される試薬類が、本発明
の使用に供される。特許請求の方法は、一定の必要な期
間前記DNAプローブにバクテリア試料をさらし、試料バ
クテリアに由来するDNAと前記プローブのハイブリット
を形成させることを要件とする。
試料中のバクテリアの同定方法を提供するにある。この
方法は、高い特異性のヌクレオチド繰り返し配列を含有
する標準化DNAプローブと、ハイブリットを形成し得る
バクテリアに対して適当で、かつ通常の処理法による調
製物を要件とする。かかるハイブリッド形成プロトコー
ルについて適当でかつ通常利用される試薬類が、本発明
の使用に供される。特許請求の方法は、一定の必要な期
間前記DNAプローブにバクテリア試料をさらし、試料バ
クテリアに由来するDNAと前記プローブのハイブリット
を形成させることを要件とする。
通常用いられそして適当である洗浄剤は、反応容器か
ら標識化プローブのみを取り除く。最後に、通常のハイ
ブリッド形成度を分析するための手段は、試料バクテリ
アの定性ならびに定量分析を可能にする。
ら標識化プローブのみを取り除く。最後に、通常のハイ
ブリッド形成度を分析するための手段は、試料バクテリ
アの定性ならびに定量分析を可能にする。
他の態様では、本発明は、高い特異性のバクテリアヌ
クレオチド繰り返し配列を含有する標識化DNAプロー
ブ、および該プローブと試料バクテリアのハイブリット
を形成させる適当な試薬を利用する、試料中のバクテリ
アを同定するための診断試験キットに関する。ハイブリ
ットが生じ得る一般的かつ適当な容器と共に、通常のハ
イブリット形成後の、洗浄剤もまた必要とされる。ハイ
ブリット形成度は、この目的に役立つ適当かつ通常の手
段により測定される。
クレオチド繰り返し配列を含有する標識化DNAプロー
ブ、および該プローブと試料バクテリアのハイブリット
を形成させる適当な試薬を利用する、試料中のバクテリ
アを同定するための診断試験キットに関する。ハイブリ
ットが生じ得る一般的かつ適当な容器と共に、通常のハ
イブリット形成後の、洗浄剤もまた必要とされる。ハイ
ブリット形成度は、この目的に役立つ適当かつ通常の手
段により測定される。
さらに、本発明の目的および効果は、以下の詳細な記
載の欄に示されており、そしておそらくその記載から明
らかになるか、または本発明の実施の態様から理解され
得るだろう。これらの目的および効果は、請求の範囲に
具体的に記載されている容器および組み合わせにより理
解されかつ達成され得るであろう。
載の欄に示されており、そしておそらくその記載から明
らかになるか、または本発明の実施の態様から理解され
得るだろう。これらの目的および効果は、請求の範囲に
具体的に記載されている容器および組み合わせにより理
解されかつ達成され得るであろう。
前述の一般的な記載および後述の詳細な記載のいずれ
も、単に本発明を例示しそして説明するためのものであ
り、特許請求されているところの本発明を限定するもの
でない。
も、単に本発明を例示しそして説明するためのものであ
り、特許請求されているところの本発明を限定するもの
でない。
本発明の好ましい態様の詳細で、現に引用されている
文献は、以下の実施例と共に本発明の原理の説明に供す
るものである。
文献は、以下の実施例と共に本発明の原理の説明に供す
るものである。
E.コリーおよびサルモネラ・チフィムリウムゲノムの
DNA配列の解析は、高頻度の繰り返しDNA配列族〔パリン
ドローム単位（PU）族〕の存在を明らかにした。この発
見は、原核生物のゲノムは一般に小さく、そして低コピ
ー数のDNA配列だけからなると信じられている〔Britte
n,R.J.およびKohne,D.E.（1968）,Science,161,529〜56
0〕ので、予期できなかった。E.コリーDNAにおけるPU配
列は103コピーとなり得て、これらはゲノムの１％を占
め、そしてこの割合は、真核生物のゲノム中の反復DNA
の主要な族について見い出されている値に相当する。
DNA配列の解析は、高頻度の繰り返しDNA配列族〔パリン
ドローム単位（PU）族〕の存在を明らかにした。この発
見は、原核生物のゲノムは一般に小さく、そして低コピ
ー数のDNA配列だけからなると信じられている〔Britte
n,R.J.およびKohne,D.E.（1968）,Science,161,529〜56
0〕ので、予期できなかった。E.コリーDNAにおけるPU配
列は103コピーとなり得て、これらはゲノムの１％を占
め、そしてこの割合は、真核生物のゲノム中の反復DNA
の主要な族について見い出されている値に相当する。
PU配列の高次構造およびゲノムの局在 パリンドローム単位は、２回軸対称を示す一群の反復
配列の20〜４−ヌクレオチドを構成する。共通塩基配列
は、E.コリーK12株におけるPU配列の118種の相違する起
源から確認されている〔Gilson,E.,Clement,J.M.,Brutl
ag,D.およびHofnung,M.（1984）EMBO J.3,1417〜1421〕
（第１図参照）。PUが、RNAまたはDNAの高次構の安定な
ステムおよびループに対応し得るとしても、かか高次構
造の構成を確立するに留まる。この「ステム」は、GCが
豊富でありかつ高い保存性を有し、2,3箇所に５個の塩
基対を有する。２つの部分は、「インターナル（intern
al）」ミスマッチ（mismatch）により分離されている。
「ループ」は、ATが豊富で可変性であり、そして０〜５
ヌクレオチドの鎖長範囲内にある。PUステムのフランキ
ング領域は、高い保存性を有し、「エクスターナル（ex
ternal）」ミスマッチ（第１図および第２図参照）と称
されている。このインターナルおよびエクスターナルミ
スマッチは、PUに対して極性を付与する非対称要素をな
す（第１図）。
配列の20〜４−ヌクレオチドを構成する。共通塩基配列
は、E.コリーK12株におけるPU配列の118種の相違する起
源から確認されている〔Gilson,E.,Clement,J.M.,Brutl
ag,D.およびHofnung,M.（1984）EMBO J.3,1417〜1421〕
（第１図参照）。PUが、RNAまたはDNAの高次構の安定な
ステムおよびループに対応し得るとしても、かか高次構
造の構成を確立するに留まる。この「ステム」は、GCが
豊富でありかつ高い保存性を有し、2,3箇所に５個の塩
基対を有する。２つの部分は、「インターナル（intern
al）」ミスマッチ（mismatch）により分離されている。
「ループ」は、ATが豊富で可変性であり、そして０〜５
ヌクレオチドの鎖長範囲内にある。PUステムのフランキ
ング領域は、高い保存性を有し、「エクスターナル（ex
ternal）」ミスマッチ（第１図および第２図参照）と称
されている。このインターナルおよびエクスターナルミ
スマッチは、PUに対して極性を付与する非対称要素をな
す（第１図）。
パリンドローム単位は、E.コリーおよびS.チフィムリ
ウムの染色体上に、そしてエキストラジェニック（extr
agenic）位置中に少なくとも数百度存在する。このこと
が、PUがときどきREP（反復・エキストラジェニック・
パリンドローム）配列と称される理由であるが、この語
REPは、単位コピーの複製のために必要なプラスミド領
域を識別するためにいつも広義に使用されているので、
混乱があるようである。
ウムの染色体上に、そしてエキストラジェニック（extr
agenic）位置中に少なくとも数百度存在する。このこと
が、PUがときどきREP（反復・エキストラジェニック・
パリンドローム）配列と称される理由であるが、この語
REPは、単位コピーの複製のために必要なプラスミド領
域を識別するためにいつも広義に使用されているので、
混乱があるようである。
パリンドローム単位は、同一のオペロン２種の遺伝子
（インターシストロンPU）間か、またはあるオペロンの
最後の遺伝子（ポストシストロンPU）後のいずれにも見
い出されている。これらは、単離された存在としてか、
それ以外にも４個までの要素のクラスターとして存在す
ることが見い出されている。クラスターの構成は、方向
付けにおいて連続するPUの厳密な二者択一性（第１図参
照）の点で非常に興味深いものである。さらに、ステム
の４つの位置は、類似の頻度で、ＧかまたはＴのいずれ
かか、またさらに他のものであることもできる。このこ
とは、クラスターの世代または選択について非常に特異
的な機構の存在を示唆する。
（インターシストロンPU）間か、またはあるオペロンの
最後の遺伝子（ポストシストロンPU）後のいずれにも見
い出されている。これらは、単離された存在としてか、
それ以外にも４個までの要素のクラスターとして存在す
ることが見い出されている。クラスターの構成は、方向
付けにおいて連続するPUの厳密な二者択一性（第１図参
照）の点で非常に興味深いものである。さらに、ステム
の４つの位置は、類似の頻度で、ＧかまたはＴのいずれ
かか、またさらに他のものであることもできる。このこ
とは、クラスターの世代または選択について非常に特異
的な機構の存在を示唆する。
相同性（共通塩基に対応する塩基数を総塩基数で割っ
た値）は、非常に高く、平均80％（第２図参照）であ
る。ステムの分枝におけるより保存性のある位置の１つ
の変化は、しばしば他の分枝における対応する位置の同
時変化によって達成され、このためこれらの２つの位置
の間の相補性が維持される。配列における驚くべき保存
性および対称性に対するふさわしい理由は、後に検討す
る。
た値）は、非常に高く、平均80％（第２図参照）であ
る。ステムの分枝におけるより保存性のある位置の１つ
の変化は、しばしば他の分枝における対応する位置の同
時変化によって達成され、このためこれらの２つの位置
の間の相補性が維持される。配列における驚くべき保存
性および対称性に対するふさわしい理由は、後に検討す
る。
第１図は、入手できる12種の既知S.チフィムリウムPU
配列に由来する共通塩基配列を示す〔Newbury,S.F.等
（1987）Cell 48,297〜310〕。この配列は、インターナ
ル・ミスマッチのＣの前に高い保存性の追加のＧを除い
てはE.コリーの共通塩基配列と類似である。２つの種の
共通塩基配列におけるこのわずかな相違の意味は、後の
項で検討する。
配列に由来する共通塩基配列を示す〔Newbury,S.F.等
（1987）Cell 48,297〜310〕。この配列は、インターナ
ル・ミスマッチのＣの前に高い保存性の追加のＧを除い
てはE.コリーの共通塩基配列と類似である。２つの種の
共通塩基配列におけるこのわずかな相違の意味は、後の
項で検討する。
E.コリーPU DNAをプローブとして使用した場合、E.コ
リーと密接な関連があるエンテロバクテリアセエに由来
するDNAだけが、適当なハイブリット形成を示すにすぎ
ない。コンピューター検索では、バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）塩基配列のデータベース中に
（いずれかの一次配列の）パリンドロームを本発明者は
は検出できなかった。このために多くの説明が可能であ
る。すなわち、（１）B.ズブチリスの塩基配列のデータ
ベースには瑕疵が存在するかも知れない。
リーと密接な関連があるエンテロバクテリアセエに由来
するDNAだけが、適当なハイブリット形成を示すにすぎ
ない。コンピューター検索では、バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）塩基配列のデータベース中に
（いずれかの一次配列の）パリンドロームを本発明者は
は検出できなかった。このために多くの説明が可能であ
る。すなわち、（１）B.ズブチリスの塩基配列のデータ
ベースには瑕疵が存在するかも知れない。
（２）B.ズブチリスにおけるエンテロバクテリアセエの
PU群と機能上の同等性は、パリンドローム配列でないか
も知れない。（３）B.ズブチリスのPUは、全く機能上の
同等性を有しない可能性がある。E.コリーの同様な検索
は、このバクテリアにおける単なる高い反復パリンドロ
ームDNA配列としてだけのPUを明らかにしている（Sauri
n,W.Cabios 3,121〜127,参照）。ラムダまたはT7ファー
ジの完全なゲノム中には、PU配列を見い出せないことが
認められるであろう。最終的に、「ハーフ（half）−P
U」（すなわち、第２図の１〜17位と18〜36位）のいず
れか１つのPU共通塩基配列も４個以下の変種のいずれも
真核生物の塩基配列データベースには見い出せなかっ
た。
PU群と機能上の同等性は、パリンドローム配列でないか
も知れない。（３）B.ズブチリスのPUは、全く機能上の
同等性を有しない可能性がある。E.コリーの同様な検索
は、このバクテリアにおける単なる高い反復パリンドロ
ームDNA配列としてだけのPUを明らかにしている（Sauri
n,W.Cabios 3,121〜127,参照）。ラムダまたはT7ファー
ジの完全なゲノム中には、PU配列を見い出せないことが
認められるであろう。最終的に、「ハーフ（half）−P
U」（すなわち、第２図の１〜17位と18〜36位）のいず
れか１つのPU共通塩基配列も４個以下の変種のいずれも
真核生物の塩基配列データベースには見い出せなかっ
た。
これらのすべては、PU配列が一定のエンテロバクテリ
アセエの染色体の特徴を示すことを示唆する。ハクテリ
アの殆んどの種に対する塩基配列のデータは、今まだデ
ータベース中に十分に公表されていないので、PUに由来
する相違する配列を有する高頻度の反復パリンドローム
要素が、他のバクテリアの種に存在し得る可能性を除外
できなかった。
アセエの染色体の特徴を示すことを示唆する。ハクテリ
アの殆んどの種に対する塩基配列のデータは、今まだデ
ータベース中に十分に公表されていないので、PUに由来
する相違する配列を有する高頻度の反復パリンドローム
要素が、他のバクテリアの種に存在し得る可能性を除外
できなかった。
PUクラスターの局在は、E.コリーK12株の種々の分離
株のゲノム間に保存されている。このことは、PUは安定
であるか、または少なくとも非常に不安定なゲノム要素
の構成物でないことが明らかである。PUは、E.コリーお
よびS.チフィムリウムのDNAの高い相同性の配列を必ず
しも同じ位置に示さない。従って、PUの一次配列のよう
に、PUゲノムの局在位置は、バクテリアの種に特異的で
ある。
株のゲノム間に保存されている。このことは、PUは安定
であるか、または少なくとも非常に不安定なゲノム要素
の構成物でないことが明らかである。PUは、E.コリーお
よびS.チフィムリウムのDNAの高い相同性の配列を必ず
しも同じ位置に示さない。従って、PUの一次配列のよう
に、PUゲノムの局在位置は、バクテリアの種に特異的で
ある。
PUおよびmRNA 殆んどのPUは、転写ターミネーターとして機能しな
い。S.チフィムリウムにおけるヒスチジン輸送に関する
同時転写遺伝子his Ｊおよびhis Ｑの間に位置する２つ
のPUは、イン・ビボ（in vivo）で転写終結を惹起しな
い（gal Ｋ融合分析系での転写停止は50％以下）。イン
・ビボでは、いかなる転写の減衰または終結も検出され
なかった〔Stern,J.M.等（1984）Cell 37,1015〜102
6〕。E.コリーにおけるマルトース輸送オペロンの同時
転写遺伝子lam Ｂおよびmal Ｍ間に位置する３つのPU
は、下流の遺伝子の転写および翻訳に影響を及ぼさない
（多コピー系のgal Ｋ遺伝子および単コピー系のlac Ｚ
遺伝子）〔Gilson,E.,Rousset,J.P.,Clement,J.M.およ
びHofnug,M.（1986）Ann,Microbiol.（Inst.Pasteur）1
27B.,259〜270〕。いくつかのE.コリーオペロンでは、
主要なメッセンジャー末端は、典型的な因子に依存しな
い転写終結領域またはPUに隣接する位置にマッピングさ
れるが、PUとは明らかに異なる〔Gilson,E.,Rousset,J.
P.,Clement,J.M.およびHofnung,M.（1986）Ann.Microbi
ol.（Inst.Pasteur）127B,259〜270〕。
い。S.チフィムリウムにおけるヒスチジン輸送に関する
同時転写遺伝子his Ｊおよびhis Ｑの間に位置する２つ
のPUは、イン・ビボ（in vivo）で転写終結を惹起しな
い（gal Ｋ融合分析系での転写停止は50％以下）。イン
・ビボでは、いかなる転写の減衰または終結も検出され
なかった〔Stern,J.M.等（1984）Cell 37,1015〜102
6〕。E.コリーにおけるマルトース輸送オペロンの同時
転写遺伝子lam Ｂおよびmal Ｍ間に位置する３つのPU
は、下流の遺伝子の転写および翻訳に影響を及ぼさない
（多コピー系のgal Ｋ遺伝子および単コピー系のlac Ｚ
遺伝子）〔Gilson,E.,Rousset,J.P.,Clement,J.M.およ
びHofnug,M.（1986）Ann,Microbiol.（Inst.Pasteur）1
27B.,259〜270〕。いくつかのE.コリーオペロンでは、
主要なメッセンジャー末端は、典型的な因子に依存しな
い転写終結領域またはPUに隣接する位置にマッピングさ
れるが、PUとは明らかに異なる〔Gilson,E.,Rousset,J.
P.,Clement,J.M.およびHofnung,M.（1986）Ann.Microbi
ol.（Inst.Pasteur）127B,259〜270〕。
しかしながら、いくつかのPUは、転写を終結させる。
単一のポストシストロン（postcistronic）PUは、二方
向転写ターミネーターとして機能するphe Ａ遺伝子とty
r Ａ遺伝子との間に位置する。かかるPUの塩基配列か
ら、本発明者等は、PU＊（第１図参照）と命名したPUの
サブクラスを定義することができる。興味深いことに
は、６種の既知PU＊配列は、それぞれ２つの収束解放読
み取り枠（convergent open reading frams）間に位置
しており、こうしてかかる領域における殆んどのDNAを
説明することができる。他の明らかな転写ターミネータ
ー配列は、これらの周辺には全く存在せず、それらのす
べてが前記機能を有する可能性を残している。
単一のポストシストロン（postcistronic）PUは、二方
向転写ターミネーターとして機能するphe Ａ遺伝子とty
r Ａ遺伝子との間に位置する。かかるPUの塩基配列か
ら、本発明者等は、PU＊（第１図参照）と命名したPUの
サブクラスを定義することができる。興味深いことに
は、６種の既知PU＊配列は、それぞれ２つの収束解放読
み取り枠（convergent open reading frams）間に位置
しており、こうしてかかる領域における殆んどのDNAを
説明することができる。他の明らかな転写ターミネータ
ー配列は、これらの周辺には全く存在せず、それらのす
べてが前記機能を有する可能性を残している。
E.コリーおよびS.チフィムリウムの高い相同性がある
領域（ush Ａ−ORF1領域）の発現の対比は、PU＊配列が
二方向転写ターミネーターとして機能するとの考えに適
合する。２つの遺伝子は、E.コリーのPU＊配列およびS.
チフィムリウムの２つの古典的な（Classical）PUのク
ラスターにより収束的に転写されそして分離されている
（第３図参照）。ORF1に対応するタンパクは、２種とも
に高いレベルで発現される。しかしながら、S.チフィム
リウムに由来するush Ａタンパクは、対応するE.コリー
ush Ａタンパクよりも極端に発現が少ない。驚くべきこ
とに、ORF1転写の遺伝子の不活性は、ush A0の発現を増
大せしめる〔Burns,D.M.およびBeacham,I.R.（1986）J.
Mol.Biol.192,163〜175〕。従って、ORF1転写は、S.チ
フィムリウムのush A0の発現を阻害するが、E.コリーの
ush Ａの発現は、PU＊による転写停止に帰因するもので
ない。
領域（ush Ａ−ORF1領域）の発現の対比は、PU＊配列が
二方向転写ターミネーターとして機能するとの考えに適
合する。２つの遺伝子は、E.コリーのPU＊配列およびS.
チフィムリウムの２つの古典的な（Classical）PUのク
ラスターにより収束的に転写されそして分離されている
（第３図参照）。ORF1に対応するタンパクは、２種とも
に高いレベルで発現される。しかしながら、S.チフィム
リウムに由来するush Ａタンパクは、対応するE.コリー
ush Ａタンパクよりも極端に発現が少ない。驚くべきこ
とに、ORF1転写の遺伝子の不活性は、ush A0の発現を増
大せしめる〔Burns,D.M.およびBeacham,I.R.（1986）J.
Mol.Biol.192,163〜175〕。従って、ORF1転写は、S.チ
フィムリウムのush A0の発現を阻害するが、E.コリーの
ush Ａの発現は、PU＊による転写停止に帰因するもので
ない。
rho−依存性であることが推定される終結部位は、Ａ
遺伝子の後に位置する２つのPU間にマッピングされてい
る〔Spencer,M.E.およびGuest,J.R.（1985）Mol.Gen.Ge
net.200,145〜154〕。これらの２つのPU間に位置するCA
A−CA配列が、いくつかのrho−依存性ターミネーター
（Pr,P1,tRNAtyrおよびtrpt′）の近傍かまたは未端に
も見い出されることは意味があるかも知れない〔Morga
n,W.P.,Bear,D.G.,Litcham,B.L.およびvon Hippel,P.H.
（1985）Nucleic Acids Res.13,3739〜3754〕。
遺伝子の後に位置する２つのPU間にマッピングされてい
る〔Spencer,M.E.およびGuest,J.R.（1985）Mol.Gen.Ge
net.200,145〜154〕。これらの２つのPU間に位置するCA
A−CA配列が、いくつかのrho−依存性ターミネーター
（Pr,P1,tRNAtyrおよびtrpt′）の近傍かまたは未端に
も見い出されることは意味があるかも知れない〔Morga
n,W.P.,Bear,D.G.,Litcham,B.L.およびvon Hippel,P.H.
（1985）Nucleic Acids Res.13,3739〜3754〕。
一定のPUは、mRNAの３′−末端の安定化を介して、遺
伝子の発現に対して限定された効果を有する。his Ｊお
よびhis Ｑ間の２つのインターシストロン（intercistr
onic）PUの欠失は、オペロンの遠位部分に影響を及ぼさ
ないが、上流の遺伝子（his Ｊ）の発現について２倍の
減少をもたらす。gly ＡオペロンのポストシストロンPU
について、同様な観察がPlamann等によってなされてい
る（翻訳停止コドンと最初のPU間に位置するμファージ
挿入物は、上流のgly Ａ遺伝子の発現を３倍減少させる
原因となる）〔Plamann,M.D.およびStauffer,G.V.（198
5）J.Bacteriol.161,650〜654〕。最近になって、この
ような上流遺伝子の発現の上昇は、上流のmRNA類の累積
化に由来することが、２例示された。この観察結果は、
３′−−５′エキソヌクレアーゼ分解から転写を保護す
るPU配列の作用により説明された。
伝子の発現に対して限定された効果を有する。his Ｊお
よびhis Ｑ間の２つのインターシストロン（intercistr
onic）PUの欠失は、オペロンの遠位部分に影響を及ぼさ
ないが、上流の遺伝子（his Ｊ）の発現について２倍の
減少をもたらす。gly ＡオペロンのポストシストロンPU
について、同様な観察がPlamann等によってなされてい
る（翻訳停止コドンと最初のPU間に位置するμファージ
挿入物は、上流のgly Ａ遺伝子の発現を３倍減少させる
原因となる）〔Plamann,M.D.およびStauffer,G.V.（198
5）J.Bacteriol.161,650〜654〕。最近になって、この
ような上流遺伝子の発現の上昇は、上流のmRNA類の累積
化に由来することが、２例示された。この観察結果は、
３′−−５′エキソヌクレアーゼ分解から転写を保護す
るPU配列の作用により説明された。
今や、RNAの二次構造を形成し得る多数の塩基配列
が、３′−−５′エキソヌクレアーゼ消化に対する障壁
として作用し得ることは十分証明されている。従って、
mRNAレベルで安定ステムおよびループ構造を形成する可
能性のあるPU配列が、前記のような活性を示す可能性を
有することは驚くに値しない。
が、３′−−５′エキソヌクレアーゼ消化に対する障壁
として作用し得ることは十分証明されている。従って、
mRNAレベルで安定ステムおよびループ構造を形成する可
能性のあるPU配列が、前記のような活性を示す可能性を
有することは驚くに値しない。
rpl Ｌ−rpo Ｂ領域のあるPUは、RNase IIIプロセッ
シング部位を含む。このPUの塩基配列は定型でない（ス
テムおよびループの上部は欠失している）。興味深いこ
とに、いくつかの厳密でない相同性が、ステムの低部と
ファージT7の既知のRNAase III部位との間に存在する
〔Gilson,E.,Clement,J.M.,Brutlag,D.およびHofnug,M.
（1984）EMBO J.3,1417〜1421〕。PUとRNase IIIプロセ
ッシングとの関連性が存在するとの他の証拠はない。こ
とに、his Ｊ−His Ｑ領域の２つの代表的なPUは、イン
・ビトロでRNase IIIによって切断されない。PU共通塩
基配列に由来するわずかな配列の変性またはPU配列周辺
の変性は、特定のオペロンの転写に対して多様な効果を
与えることができる。PUのこれらの機能的な変性により
細胞に付与される選択性の利点は、PU配列間の差異を高
めがちであろう。しかしながら、これらの構成物のすべ
てが今まだPUとして認められているので、一定の種にお
けるPU配列の間では相同性維持のための何等かの機構が
存在することが予想される。
シング部位を含む。このPUの塩基配列は定型でない（ス
テムおよびループの上部は欠失している）。興味深いこ
とに、いくつかの厳密でない相同性が、ステムの低部と
ファージT7の既知のRNAase III部位との間に存在する
〔Gilson,E.,Clement,J.M.,Brutlag,D.およびHofnug,M.
（1984）EMBO J.3,1417〜1421〕。PUとRNase IIIプロセ
ッシングとの関連性が存在するとの他の証拠はない。こ
とに、his Ｊ−His Ｑ領域の２つの代表的なPUは、イン
・ビトロでRNase IIIによって切断されない。PU共通塩
基配列に由来するわずかな配列の変性またはPU配列周辺
の変性は、特定のオペロンの転写に対して多様な効果を
与えることができる。PUのこれらの機能的な変性により
細胞に付与される選択性の利点は、PU配列間の差異を高
めがちであろう。しかしながら、これらの構成物のすべ
てが今まだPUとして認められているので、一定の種にお
けるPU配列の間では相同性維持のための何等かの機構が
存在することが予想される。
PUおよび染色体の構成 前記のように多数の相同性配列の存在および遺伝子間
の局在は、それらが染色体再配列〔遺伝子のシャフリン
グ（suffling）〕により取り込まれ得ることを示唆す
る。PU一次配列およびその２回軸対称（制限酵素部位思
い出してほしい）の著しい保存性は、PU DNAが構造タン
パクのバインディング部位であり得ることを暗示する。
の局在は、それらが染色体再配列〔遺伝子のシャフリン
グ（suffling）〕により取り込まれ得ることを示唆す
る。PU一次配列およびその２回軸対称（制限酵素部位思
い出してほしい）の著しい保存性は、PU DNAが構造タン
パクのバインディング部位であり得ることを暗示する。
PUは、次の２つの理由で高頻度組換えについての主要
部位でないようである。すなわち、（１）約3kbpによっ
て分離されているPUの２種のクラスターは、E.コリーの
mal Ｂ領域で見つけられているが、どのようなMal −欠
失変異株もmal B PU領域の終点（end−point）を有する
ものは見い出されておらず、そして（２）S.チフィムリ
ウムにおける自然発生的な縦列の複製の殆んどは、rrn
オペロン間の均一でない組換えによって生じる。
部位でないようである。すなわち、（１）約3kbpによっ
て分離されているPUの２種のクラスターは、E.コリーの
mal Ｂ領域で見つけられているが、どのようなMal −欠
失変異株もmal B PU領域の終点（end−point）を有する
ものは見い出されておらず、そして（２）S.チフィムリ
ウムにおける自然発生的な縦列の複製の殆んどは、rrn
オペロン間の均一でない組換えによって生じる。
しかしながら、いずれかの繰り返し配列により促進さ
れるようなPU仲介性の低頻度の組換え活性は、非常によ
く生じ得る。かかる条件下でさえも、PUは染色体の再配
列およびゲノムの進化の調節においてある役割を果すこ
とができる。この考えを支持するものとしては、１の配
列が、S.チフィムリウムにおける１のPUおよびarg Ｂを
含むhis Ｇ−his Ｄ遺伝子間領域の間で検出されている
〔Anderson,P.およびRoth,J.（1978）J.Mol.Biol.119,1
47〜166〕。さらに、１のPUは、E.コリーおよびS.チフ
ィムリウム間のgln Ａの相同性と非相同性領域間の境界
に存在し（第３図）、そしてPU配列は、M1 RNA遺伝子の
後に位置する直線的な繰り返し配列およびtRNAPro遺伝
子の後に位置する直線的な繰り返し配列の境界に必ず存
在する〔Reed,R.EおよびAlt−man,S.（1983）Proc.Na
t′1.Acad.Sci USA 80,5359〜5363,Kuchino,Y.,Mori,F.
およびNis−himura,S.（1985）Nucleic Acids Res.13,3
213〜3220〕。証拠が間接的であるにもかかわらず、こ
れらの観察結果は、PU部位と密接な組換え現象の発生と
整合する。
れるようなPU仲介性の低頻度の組換え活性は、非常によ
く生じ得る。かかる条件下でさえも、PUは染色体の再配
列およびゲノムの進化の調節においてある役割を果すこ
とができる。この考えを支持するものとしては、１の配
列が、S.チフィムリウムにおける１のPUおよびarg Ｂを
含むhis Ｇ−his Ｄ遺伝子間領域の間で検出されている
〔Anderson,P.およびRoth,J.（1978）J.Mol.Biol.119,1
47〜166〕。さらに、１のPUは、E.コリーおよびS.チフ
ィムリウム間のgln Ａの相同性と非相同性領域間の境界
に存在し（第３図）、そしてPU配列は、M1 RNA遺伝子の
後に位置する直線的な繰り返し配列およびtRNAPro遺伝
子の後に位置する直線的な繰り返し配列の境界に必ず存
在する〔Reed,R.EおよびAlt−man,S.（1983）Proc.Na
t′1.Acad.Sci USA 80,5359〜5363,Kuchino,Y.,Mori,F.
およびNis−himura,S.（1985）Nucleic Acids Res.13,3
213〜3220〕。証拠が間接的であるにもかかわらず、こ
れらの観察結果は、PU部位と密接な組換え現象の発生と
整合する。
核様体を取り込んだタンパクを含む抽出物の存在で、
PU配列は、Exo III消化に対して強い障壁を構成する〔G
ilson,E.等（1986）FEBS Lett.206,323〜328〕。いずれ
の配向性においても単一のPUは、分解を停止するのに十
分である。これらの発見は、１つのまたはいくつかの核
様体を取り込んだタンパクが認識でき、そしてPU配列に
結合できるとの考えに調和する。
PU配列は、Exo III消化に対して強い障壁を構成する〔G
ilson,E.等（1986）FEBS Lett.206,323〜328〕。いずれ
の配向性においても単一のPUは、分解を停止するのに十
分である。これらの発見は、１つのまたはいくつかの核
様体を取り込んだタンパクが認識でき、そしてPU配列に
結合できるとの考えに調和する。
この相互作用の生物学的な意義は、知られていない。
このことは、ヌクレオチドの構造としてのPUの複雑さに
整合する。真核性クロマチン構造に対する最近の研究
は、特異なDNA配列を用いる相互作用によって、ループ
ドメイン中のDNAの構成によるトポイソメラーゼIIタン
パクに関係がある。電子顕微鏡による研究およびイン・
ビボでの高次コイルの分布係数の測定に基づき、E.コリ
ーの核様体は、高次コイル状のループドメイン中に保持
されていることが明らかになった。このことは、特異的
なタンパクによる２つのPUクラスターのクランピング
（clamping）が、各ループの首部を構成し、そして／ま
たは安定化することを可能にすることができる。
このことは、ヌクレオチドの構造としてのPUの複雑さに
整合する。真核性クロマチン構造に対する最近の研究
は、特異なDNA配列を用いる相互作用によって、ループ
ドメイン中のDNAの構成によるトポイソメラーゼIIタン
パクに関係がある。電子顕微鏡による研究およびイン・
ビボでの高次コイルの分布係数の測定に基づき、E.コリ
ーの核様体は、高次コイル状のループドメイン中に保持
されていることが明らかになった。このことは、特異的
なタンパクによる２つのPUクラスターのクランピング
（clamping）が、各ループの首部を構成し、そして／ま
たは安定化することを可能にすることができる。
バクテリアの種に対するPUおよびその分子限定 PU配列の高コピー数は、拡散に対する効率的な機構を
包含していることを示唆する。
包含していることを示唆する。
真核性生物における数種の機構は、始原繰り返し配列
に由来する逆向の位置（すなわち、RNA、ときにはtRNA
の逆転写）、遺伝子転換、不均一な組換え、ずれ（slip
page）複製、転位および増幅を含んでいる〔Dover,G.A.
（1986）Trends Genet.2,159,165〕。これらの機構のい
ずれもここでは除外することはできない。しかしなが
ら、PUは、あるトランスポゾンと同じように、それらの
逆になった繰り返し構造（ISを暗示する）、およびPUス
テム共通塩基配列とトランスポゾンの末端との間の部分
的な相同性を含有する特徴を有する。
に由来する逆向の位置（すなわち、RNA、ときにはtRNA
の逆転写）、遺伝子転換、不均一な組換え、ずれ（slip
page）複製、転位および増幅を含んでいる〔Dover,G.A.
（1986）Trends Genet.2,159,165〕。これらの機構のい
ずれもここでは除外することはできない。しかしなが
ら、PUは、あるトランスポゾンと同じように、それらの
逆になった繰り返し構造（ISを暗示する）、およびPUス
テム共通塩基配列とトランスポゾンの末端との間の部分
的な相同性を含有する特徴を有する。
PUの高度な相同性は、少なくとも次の２つの仮説によ
って説明することができる。（１）それらが最近生じそ
して（例えば、転位によって）急速に拡散した；そして
（２）それらは、より古典的な起源のものであり、そこ
には、相同性を維持する特異的な機構が存在する、とす
るものである。E.コリーとS.チフィムリウムのいずれも
あるときは、PUを有しており、そしてそれらは同じ遺伝
子的な局在（例えば、ush Ａ領域）にあるので、PUの形
成は、２つの種が分岐する以前に生じたものであると思
える。このことは、第１の仮説に対立する。それらの共
通塩基配列のわずかな相違は、一方の種におけるPU配列
の相同性が、２つの相違する種間よりも高く、相同性の
維持に対する種特異的機構を含むことを示唆する。ある
配列族内のかかる変異のパターンは、協奏的進化と称さ
れており、既に多くの真核生物類の、例えばrDNA、核内
低分子（sn）RNAまたは長鎖散在的（interspersed）反
復DNA配列（LINE）において観察されている。PU配列に
バインデングするタンパクの存在（前述参照）は、PU配
列と関連のあるタンパクの遺伝子間のゆっくりした相互
変換をもたらし得る可能性がある。このことは、ある種
内のPU類の相同化をもたらすようである。
って説明することができる。（１）それらが最近生じそ
して（例えば、転位によって）急速に拡散した；そして
（２）それらは、より古典的な起源のものであり、そこ
には、相同性を維持する特異的な機構が存在する、とす
るものである。E.コリーとS.チフィムリウムのいずれも
あるときは、PUを有しており、そしてそれらは同じ遺伝
子的な局在（例えば、ush Ａ領域）にあるので、PUの形
成は、２つの種が分岐する以前に生じたものであると思
える。このことは、第１の仮説に対立する。それらの共
通塩基配列のわずかな相違は、一方の種におけるPU配列
の相同性が、２つの相違する種間よりも高く、相同性の
維持に対する種特異的機構を含むことを示唆する。ある
配列族内のかかる変異のパターンは、協奏的進化と称さ
れており、既に多くの真核生物類の、例えばrDNA、核内
低分子（sn）RNAまたは長鎖散在的（interspersed）反
復DNA配列（LINE）において観察されている。PU配列に
バインデングするタンパクの存在（前述参照）は、PU配
列と関連のあるタンパクの遺伝子間のゆっくりした相互
変換をもたらし得る可能性がある。このことは、ある種
内のPU類の相同化をもたらすようである。
PUに類する、バクテリアにおける反復DNA配列の他の
既知の３種類は、厳密な種特異性を示す。ナイセリア
（Neisseria）spp.の26−bp反復配列類（ゲノム当たり
少なくとも20コピー以上の）がハイブットを形成するい
かなる配列も、多様な他のグラム陰性バクテリアには見
い出されていない〔Correia,F.F.,Inouye,S.およびInou
ye,M.（1986）J.Bacteriol.167,1009〜1015〕。リゾビ
ウム・トリフォリイ（Rhizobium trifolii）の共生プ
ラスミド上で３〜６度繰り返されているnif HDKプロモ
ーター配列は、試験された他のすべての共生プラスミド
を含有するリゾビウム種のDNAとハイブリットを形成し
ない〔Watson,J.M.およびShofield,P.R.（1985）Mol.Ge
n.Genet.199,279〜289〕。ヘモフィリス（Haemophilu
s）の11−bp繰り返し配列（ゲノム当たり103コピー）
は、コンピテント細胞により処理されたヘモフィリスDN
Aの特異的認識をする〔Danner,D.B.Deich,R.A.,Sisco,
K.L.,およびSmith,H.O.（1980）Gene 11,311〜318〕。
さらに、繰り返しDNA配列族が、最近ボルデテラ・パー
タッシス（Bordetella pertussis）において見い出さ
れた。さらに、この配列も種特異性であるようである
〔MacPheat,W.L.およびMacNally,T.（1987）FEMS Lett.
41,357〜360およびA.Ullman,個人的な情報〕。
既知の３種類は、厳密な種特異性を示す。ナイセリア
（Neisseria）spp.の26−bp反復配列類（ゲノム当たり
少なくとも20コピー以上の）がハイブットを形成するい
かなる配列も、多様な他のグラム陰性バクテリアには見
い出されていない〔Correia,F.F.,Inouye,S.およびInou
ye,M.（1986）J.Bacteriol.167,1009〜1015〕。リゾビ
ウム・トリフォリイ（Rhizobium trifolii）の共生プ
ラスミド上で３〜６度繰り返されているnif HDKプロモ
ーター配列は、試験された他のすべての共生プラスミド
を含有するリゾビウム種のDNAとハイブリットを形成し
ない〔Watson,J.M.およびShofield,P.R.（1985）Mol.Ge
n.Genet.199,279〜289〕。ヘモフィリス（Haemophilu
s）の11−bp繰り返し配列（ゲノム当たり103コピー）
は、コンピテント細胞により処理されたヘモフィリスDN
Aの特異的認識をする〔Danner,D.B.Deich,R.A.,Sisco,
K.L.,およびSmith,H.O.（1980）Gene 11,311〜318〕。
さらに、繰り返しDNA配列族が、最近ボルデテラ・パー
タッシス（Bordetella pertussis）において見い出さ
れた。さらに、この配列も種特異性であるようである
〔MacPheat,W.L.およびMacNally,T.（1987）FEMS Lett.
41,357〜360およびA.Ullman,個人的な情報〕。
バクテリアの反復配列の発見の刺激的な点は、真核生
物におけるこれらの構成物の発明に由来する多くの刺激
的な仮説や推測が、今やE.コリーのような遺伝子的によ
く特徴がわかっている生物体の実験的で手が届く範囲に
あることである。かかる配列の起源および機能が、近い
将来わかってくるであろう。
物におけるこれらの構成物の発明に由来する多くの刺激
的な仮説や推測が、今やE.コリーのような遺伝子的によ
く特徴がわかっている生物体の実験的で手が届く範囲に
あることである。かかる配列の起源および機能が、近い
将来わかってくるであろう。
本発明の技術の具体的な課題または情況への適用は、
本明細書に含まれる教示に照らして、当業者が有し得る
範囲内のものと理解される。本発明の調製物およびそれ
らを単離し、そして調製するための代表的な実施例
（例）は、以下の例に明らかにされる。
本明細書に含まれる教示に照らして、当業者が有し得る
範囲内のものと理解される。本発明の調製物およびそれ
らを単離し、そして調製するための代表的な実施例
（例）は、以下の例に明らかにされる。
例 １ その他の点では相同性のあるバクテリアDNA配列間のP
Uにおける相違の根拠。
Uにおける相違の根拠。
（１）エシェリヒア・コリーとサルモネラ・チフィムリ
ウム間の他の点では高い相同性を有する３つの遺伝子領
域は、同一の位置にPUを含まない（Newburry等1986;Gil
son等）。
ウム間の他の点では高い相同性を有する３つの遺伝子領
域は、同一の位置にPUを含まない（Newburry等1986;Gil
son等）。
gln Ａの停止コドンと転写ターミネーター間の領域
は、エシェリヒア・コリーにおいて３つのPUを含み、そ
してサルモネラ・チフィムリウムおよびクレブシェラ・
ニューモニエ（Klebsiellapneumoniae）の等価な領域に
は一つも含まない（MacFarleneおよびMerrick,1985）。
は、エシェリヒア・コリーにおいて３つのPUを含み、そ
してサルモネラ・チフィムリウムおよびクレブシェラ・
ニューモニエ（Klebsiellapneumoniae）の等価な領域に
は一つも含まない（MacFarleneおよびMerrick,1985）。
２つのPUは、エシェリヒア・コリーのmet Ｊ遺伝子の
停止コドン後の20bpに位置する、サルモネラ・チフィム
リウムの等価な領域は、まったくPUを含まないが、特異
的なファクター非依存性終結部位を含む（Saint−Giron
s等,1984）（UrbanowskiおよびStauffer,1985）。入手
し得るデータでは、エシェリヒア・コリーにおけるPUを
含有する挿入部の正確な境界を限定することができな
い。
停止コドン後の20bpに位置する、サルモネラ・チフィム
リウムの等価な領域は、まったくPUを含まないが、特異
的なファクター非依存性終結部位を含む（Saint−Giron
s等,1984）（UrbanowskiおよびStauffer,1985）。入手
し得るデータでは、エシェリヒア・コリーにおけるPUを
含有する挿入部の正確な境界を限定することができな
い。
単一のPUは、サルモネラ・チフィムリウムのrpo Ｄ遺
伝子末端と機能性ファクター領域間に位置しており、こ
のPUの位置だけが示されている（Erickson等,1985）。
伝子末端と機能性ファクター領域間に位置しており、こ
のPUの位置だけが示されている（Erickson等,1985）。
種々の研究室で、相違するエシェリヒア・コリー源に
由来するmal Ｅ−mal Ｆ遺伝子間領域（Duplay等,1984
およびDuplya,個人的な情報）、uvr Ｄの３′フランキ
ング領域（FinchおよびEmmerson,1984）（Yamamoto等,1
986）が、クローン化されそして配列が決定されてい
る。この３つの場合には、前記領域が同一のPU配列を含
む。
由来するmal Ｅ−mal Ｆ遺伝子間領域（Duplay等,1984
およびDuplya,個人的な情報）、uvr Ｄの３′フランキ
ング領域（FinchおよびEmmerson,1984）（Yamamoto等,1
986）が、クローン化されそして配列が決定されてい
る。この３つの場合には、前記領域が同一のPU配列を含
む。
従って、PUの局在は、エシェリヒア・コリーとサルモ
ネラ・チフィムリウム間では保存されていないにもかか
わらず、エシェリヒア・コリーの相違する種間では保存
されていることが明らかである。
ネラ・チフィムリウム間では保存されていないにもかか
わらず、エシェリヒア・コリーの相違する種間では保存
されていることが明らかである。
（２）エシェリヒア・コリーおよびサルモネラ・チフィ
ムリウムに由来する入手可能なPU配列 入手し得る９種の既知サルモネラ・チフィムリウムPU
配列は、すべてＣ−Ｔ「ミスマッチ（mismatch）」のＣ
の前に追加のＧを含む（第４図）。
ムリウムに由来する入手可能なPU配列 入手し得る９種の既知サルモネラ・チフィムリウムPU
配列は、すべてＣ−Ｔ「ミスマッチ（mismatch）」のＣ
の前に追加のＧを含む（第４図）。
本発明者等の研究所で確認された103種のエシェリヒ
ア・コリーPU配列間では、１種のみ（gdh A,PUa）が、
追加のＧを含むので、本発明者等は、このPU共通塩基配
列は、エシェリヒア・コリーおよびサルモネラ・チフィ
ムリウム（変性サルモネラ・チフィムリウムPU共通塩基
配列は、第４図に示した）におけるわずかな相違の可能
性があることを提案する。これらの２つが、これらのPU
配列のこのわずかな相違を示すエンテロバクテリアセエ
に関連することは、PUの一次配列がバクテリアの種の１
つまたは１群のものの特異性であることができる。さら
に、PU配列は、ラムダまたはT7ファージの完全なゲノム
中に存在しないことを思い出してほしい（Gilson等,198
4）。
ア・コリーPU配列間では、１種のみ（gdh A,PUa）が、
追加のＧを含むので、本発明者等は、このPU共通塩基配
列は、エシェリヒア・コリーおよびサルモネラ・チフィ
ムリウム（変性サルモネラ・チフィムリウムPU共通塩基
配列は、第４図に示した）におけるわずかな相違の可能
性があることを提案する。これらの２つが、これらのPU
配列のこのわずかな相違を示すエンテロバクテリアセエ
に関連することは、PUの一次配列がバクテリアの種の１
つまたは１群のものの特異性であることができる。さら
に、PU配列は、ラムダまたはT7ファージの完全なゲノム
中に存在しないことを思い出してほしい（Gilson等,198
4）。
（３）エシェリヒア・コリーからより遠縁の原核性生物
種における配列の存在 TGVプログラム（SaurinおよびMarliere,1987）を使用
して、バチルス・スブチリスの塩基配列データベースを
調査した（ジーンバンクから取り出した38種から抽出さ
れる33種の配列についての29417b.p.,1985年11月）。こ
のプログラムは、反復DNAパターンの一次配列にかかわ
りなく、それらを検索することができる。必要とされる
パラメーターは、反復DNAパターン連続塩基、Watson−C
rick則および相補則を用いて対を形成（すなわち、Ａ−
ＴまたはＧ−Ｃのペアリング）している全塩基である。
この検索は、バチルス・ズブチリスの塩基配列データベ
ースにおいては、反復パリンドローム配列のいかなる類
縁のものも示さなかった。ここに、本発明者等は、ただ
１つの配列のみが２以上の発生源を有することを見い出
した。この配列（CCACCTTGCCAAGGTGG）は、３種の相違
する遺伝子領域〔trrn B（WawrousekおよびHansen,198
3）、trrn D（Wawrousek等,1984）およびtrrn E（Green
およびVold,1983;Wawrousek等,1984）〕にコードされて
いるアンチコドンステムおよびGly−tRNAのループに対
応する。バチルス・ズブチリスの塩基配列データベース
が、エシェリヒア・コリーのものより10倍少ない配列を
含むにもかかわらず、「PU株」の配列が両種間において
同じ頻度で存在するとすれば、１つは、バチルス・ズブ
チリスの約10個の発生源から発見されることが期待でき
るだろう。エシェリヒア・コリーの同じ検索が、このバ
クテリアにおけるただ高い反復パリンドローム配列とし
てだけPUを示すことが認められるであろう（Saurin,198
7）。
種における配列の存在 TGVプログラム（SaurinおよびMarliere,1987）を使用
して、バチルス・スブチリスの塩基配列データベースを
調査した（ジーンバンクから取り出した38種から抽出さ
れる33種の配列についての29417b.p.,1985年11月）。こ
のプログラムは、反復DNAパターンの一次配列にかかわ
りなく、それらを検索することができる。必要とされる
パラメーターは、反復DNAパターン連続塩基、Watson−C
rick則および相補則を用いて対を形成（すなわち、Ａ−
ＴまたはＧ−Ｃのペアリング）している全塩基である。
この検索は、バチルス・ズブチリスの塩基配列データベ
ースにおいては、反復パリンドローム配列のいかなる類
縁のものも示さなかった。ここに、本発明者等は、ただ
１つの配列のみが２以上の発生源を有することを見い出
した。この配列（CCACCTTGCCAAGGTGG）は、３種の相違
する遺伝子領域〔trrn B（WawrousekおよびHansen,198
3）、trrn D（Wawrousek等,1984）およびtrrn E（Green
およびVold,1983;Wawrousek等,1984）〕にコードされて
いるアンチコドンステムおよびGly−tRNAのループに対
応する。バチルス・ズブチリスの塩基配列データベース
が、エシェリヒア・コリーのものより10倍少ない配列を
含むにもかかわらず、「PU株」の配列が両種間において
同じ頻度で存在するとすれば、１つは、バチルス・ズブ
チリスの約10個の発生源から発見されることが期待でき
るだろう。エシェリヒア・コリーの同じ検索が、このバ
クテリアにおけるただ高い反復パリンドローム配列とし
てだけPUを示すことが認められるであろう（Saurin,198
7）。
（４）分 析 前述の３つの指摘のすべては、PUがバクテリアの種の
分化に寄与することを示唆する。直接的または間接的な
作用に対する多様性が想像され得る。本発明者等が考慮
したい１つの仮説は、PUはバクテリアの染色体構造中で
ある役割を果たすであろうというものである。このこと
は、PUを含有しない異種染色体の大きな断片の挿入の安
定化または生存可能性を妨げることができる。予備的な
結果は、クロモイド（chromoid）関連性のタンパクがPU
DDNAと特異的に相互作用することを示す（Gilson等,19
86a）。このことは、PU配列が染色体の構造中に含まれ
得るとの考えと整合する。
分化に寄与することを示唆する。直接的または間接的な
作用に対する多様性が想像され得る。本発明者等が考慮
したい１つの仮説は、PUはバクテリアの染色体構造中で
ある役割を果たすであろうというものである。このこと
は、PUを含有しない異種染色体の大きな断片の挿入の安
定化または生存可能性を妨げることができる。予備的な
結果は、クロモイド（chromoid）関連性のタンパクがPU
DDNAと特異的に相互作用することを示す（Gilson等,19
86a）。このことは、PU配列が染色体の構造中に含まれ
得るとの考えと整合する。
例 ２ E.コリーの標識プローブを利用するハイブット形成分
析。
析。
相違するバクテリア種の100のDNAについて、３つのPU
配列を含有する200bp DNAプローブを用いるドット・ブ
ロット（dot blot）またはサザーン・ブロット（southe
rn blot）により試験した。上記プローブは第１図に示
す配列を含み、そして同図に示す通り、３個のPU配列、
PUa,PUb′及びPU＊を有する。ハイブット形成試験は、
次のような改良を加えた標準的な方法を用いて実施した
（bsscにおける0.1％のSDSで58℃にて12時間ハイブリッ
トを形成する段階および0.2SSCにおける0.1％SDSで45℃
にて１時間洗浄）。プローブはアルファー32Pヌクレオ
チドを用いるニックトランスレーションにより調製し
た。100のバクテリア種は、一組の代表的なエンテロバ
クテリア（85の相違する種）および３つの相違する種か
らなる他のバクテリアの一組、および３つの相違するキ
セノルハブダス（Xenorhabdus）種、アシネトバクター
（Acinetobacter）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（B
ordetella bronchiseptica）、シューウドモナス・ア
エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、アエロモ
ナス（Aeromonas）、アクチノバシラス（Actinobacillu
s）、パスツレラ（Pasteurella）、ビブリオ・コレレ
（Vibrio cholerae）、ビブリオ・ミニカス（Vibrio
min−icus）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legione−
lla pneumophila）、バチルス・ズブチリス（Bac−ill
us subtilis）、カロスリックス（Calothrix）および
メタノコッカス（Methanococcus）の他のバクテリアの
構成物を包含する。
配列を含有する200bp DNAプローブを用いるドット・ブ
ロット（dot blot）またはサザーン・ブロット（southe
rn blot）により試験した。上記プローブは第１図に示
す配列を含み、そして同図に示す通り、３個のPU配列、
PUa,PUb′及びPU＊を有する。ハイブット形成試験は、
次のような改良を加えた標準的な方法を用いて実施した
（bsscにおける0.1％のSDSで58℃にて12時間ハイブリッ
トを形成する段階および0.2SSCにおける0.1％SDSで45℃
にて１時間洗浄）。プローブはアルファー32Pヌクレオ
チドを用いるニックトランスレーションにより調製し
た。100のバクテリア種は、一組の代表的なエンテロバ
クテリア（85の相違する種）および３つの相違する種か
らなる他のバクテリアの一組、および３つの相違するキ
セノルハブダス（Xenorhabdus）種、アシネトバクター
（Acinetobacter）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（B
ordetella bronchiseptica）、シューウドモナス・ア
エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、アエロモ
ナス（Aeromonas）、アクチノバシラス（Actinobacillu
s）、パスツレラ（Pasteurella）、ビブリオ・コレレ
（Vibrio cholerae）、ビブリオ・ミニカス（Vibrio
min−icus）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legione−
lla pneumophila）、バチルス・ズブチリス（Bac−ill
us subtilis）、カロスリックス（Calothrix）および
メタノコッカス（Methanococcus）の他のバクテリアの
構成物を包含する。
前述の分析による結果は、単にE.コリーおよびサルモ
ネラ群だけが、前述のハイブット形成条件下でかかるプ
ローブとハイブットを形成することを示した。
ネラ群だけが、前述のハイブット形成条件下でかかるプ
ローブとハイブットを形成することを示した。
例 ３ ボルデテラ配列のハイブリット形成の特異性。
例１の一般的な方法に従い、ボルデララ・パータッシ
ス（Bordetell pertussis）から抽出した240bp配列単
位物を用いてハイブリット形成試験を行った。上記プロ
ーブは第５図に示すヌクレオチド配列における種々の24
0bpの連続ヌクレオチド配列とした。通常のハイブリッ
ト形成プロトコール段階の変法は、50％のホルムアミド
を用い、42℃で12時間インキュベートし、次いで65℃に
で0.1SSCおよび0.1％のSDSを用いて洗浄した。さらに、
ハイブリット形成を、2SCCおよび0.1％のSDSを有するわ
ずかに低いストリンジェント条件下で実施した。B.パー
タッシスの配列は、B.B.パラパータッシス、B.アビアム
またはB.ブロンキセプチカのどれともハイブリットを形
成しなかった。
ス（Bordetell pertussis）から抽出した240bp配列単
位物を用いてハイブリット形成試験を行った。上記プロ
ーブは第５図に示すヌクレオチド配列における種々の24
0bpの連続ヌクレオチド配列とした。通常のハイブリッ
ト形成プロトコール段階の変法は、50％のホルムアミド
を用い、42℃で12時間インキュベートし、次いで65℃に
で0.1SSCおよび0.1％のSDSを用いて洗浄した。さらに、
ハイブリット形成を、2SCCおよび0.1％のSDSを有するわ
ずかに低いストリンジェント条件下で実施した。B.パー
タッシスの配列は、B.B.パラパータッシス、B.アビアム
またはB.ブロンキセプチカのどれともハイブリットを形
成しなかった。
例 ４ 他の一般的な標識化物の利用。
例１および例２のようなハイブリット形成試験を、標
識化プローブを用いて実施した。一般的な放射線活性、
酵素抗体法、蛍光抗体法を含む通常の標識化技術を利用
した。利用したプローブ配列と標的バクテリアのハイブ
リット形成の存否について、例１および例２と同様な結
果が確認できた。
識化プローブを用いて実施した。一般的な放射線活性、
酵素抗体法、蛍光抗体法を含む通常の標識化技術を利用
した。利用したプローブ配列と標的バクテリアのハイブ
リット形成の存否について、例１および例２と同様な結
果が確認できた。
本発明の方法や調製物について多様な改良や変形がな
し得ることは、当業者にとって明らかとなるであろう。
従って、本発明はそれらによって提供される本発明の改
良や変形をも特許請求の範囲内に含めることを意図して
いる。
し得ることは、当業者にとって明らかとなるであろう。
従って、本発明はそれらによって提供される本発明の改
良や変形をも特許請求の範囲内に含めることを意図して
いる。
例 ５ 生物流体または他の起源に由来する試料中のバクテリ
アのイン・ビトロにおける同定のための診断試験キット
は、固定されるバクテリアを含む適当に処理された既知
量の試料を添加してもよい通常のハイブット形成容器か
らなる。分離剤として標識化プローブDNAを添加しても
よく、また別に、適当な手段により固定したものとして
存在させてもよい。
アのイン・ビトロにおける同定のための診断試験キット
は、固定されるバクテリアを含む適当に処理された既知
量の試料を添加してもよい通常のハイブット形成容器か
らなる。分離剤として標識化プローブDNAを添加しても
よく、また別に、適当な手段により固定したものとして
存在させてもよい。
適当なインキュベーション期間が経過した後、ハイブ
リット形成を試料容器から標識化されていないプローブ
物質を洗浄することによって停止した。ハイブット形成
の存在および存在量は、試料バクテリアのDNAに結合し
たプローブの量を測定することにより決定した。
リット形成を試料容器から標識化されていないプローブ
物質を洗浄することによって停止した。ハイブット形成
の存在および存在量は、試料バクテリアのDNAに結合し
たプローブの量を測定することにより決定した。
第１図は、E.コリーおよびS.チフィムリウムに由来する
パリンドローム単位の共通塩基配列を示し、第２図は、
E.コリーおよびS.チフィムリウムPU配列の一次構造の保
存を示し、第３図は、クレブシェラ・ニューモニエ、S.
チフィムリウムおよびE.コリーにおけるgln Ａ遺伝子な
らびにS.チフィムリウムおよびE.コリーにおけるush Ａ
遺伝子の３′フランキング領域の構造の比較を示すもの
であり、そして第４図は、E.コリーとS.チフィムリウム
間のPU共通塩基配列を示すものであり、第５図は、ボル
デテラ・パータッシス配列情報を示すものである。
パリンドローム単位の共通塩基配列を示し、第２図は、
E.コリーおよびS.チフィムリウムPU配列の一次構造の保
存を示し、第３図は、クレブシェラ・ニューモニエ、S.
チフィムリウムおよびE.コリーにおけるgln Ａ遺伝子な
らびにS.チフィムリウムおよびE.コリーにおけるush Ａ
遺伝子の３′フランキング領域の構造の比較を示すもの
であり、そして第４図は、E.コリーとS.チフィムリウム
間のPU共通塩基配列を示すものであり、第５図は、ボル
デテラ・パータッシス配列情報を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アグネ ウルマン フランス国，75016 パリ，リュ ポー ル デュピュイ，３ (72)発明者 モーリス オフノン フランス国，75015 パリ，リュ バル ギュ 19ビス (56)参考文献 ｎａｔｕｒｅ，298（1982）ｐ．760− 762 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 Ｍｅｄｌｉｎｅ
Claims (6)
- 【請求項１】試料中のバクテリア種を同定するためのイ
ン・ビトロ（in vitro）診断試験キットであって、バク
テリア種特異性の１又は複数のヌクレオチド繰り返し配
列を含有する標識化DNAプローブ、該プローブと同定さ
れる試料のバクテリアに由来するDNAがハイブリットを
形成するのに適する試薬、該プローブと該試料のバクテ
リアとの間のハイブリットが生じ得るハイブリット形成
容器、ハイブリット形成処理後にハイブリットを形成し
ていないプローブを除去するために適する洗浄剤および
ハイブリット形成度を分析するための手段を含んで成
り、ここで前記バクテリア種特異性のヌクレオチド繰り
返し配列が、 （ａ）下記のボルデテラ・パータッシス（Bordetella p
ertussis）種特異性のヌクレオチド配列： またはその種特異性のフラグメント；及び （ｂ）下記のいずれかを含んで成るパリンドロームユニ
ット（PU） ｉ）配列： （配列中、Ｘは０〜５個のヌクレオチドの長さを有する
ヌクレオチドループであり、そして（Ｇ）は存在してい
てもしていなくてもよい）、または ii）この配列と80％以上の相同性を有する配列、または iii）配列であって、ループ「Ｘ」の両側の「ハーフ配
列」のそれぞれにおいて４個以下の相違が存在する配
列、 より成る群から選ばれる、前記試験キット。 - 【請求項２】前記ヌクレオチド配列が、前記ボルデテラ
・パータッシス種特異性のヌクレオチド配列のうちの約
240個の連続ヌクレオチド配列を含んで成るフラグメン
トを含む、請求項１記載の試験キット。 - 【請求項３】前記標識化プローブが、酵素抗体法、ラジ
オアイソトープ法または蛍光抗体法により標識化された
ものである請求項１又は２記載の試験キット。 - 【請求項４】試料中のバクテリア種の同定方法であっ
て、前記バクテリア種に特異性の１又は複数のヌクレオ
チド繰り返し配列を含有する標識化DNAプローブに前記
試料を、前記プローブと同定される試料バクテリアの天
然DNAとがハイブリットを形成するのに適する試薬の存
在下でさらす段階、前記試料からハイブリットを形成し
ていない標識化プローブを洗浄する段階および得られた
ハイブリットの形成度を分析する段階を含んで成り、こ
こで前記バクテリア種特異性のヌクレオチド繰り返し配
列が、 （ａ）下記のボルデテラ・パータッシス（Bordetella p
ertussis）種特異性のヌクレオチド配列： またはその種特異性のフラグメント；及び （ｂ）下記のいずれかを含んで成るパリンドロームユニ
ット（PU） ｉ）配列： （配列中、Ｘは０〜５個のヌクレオチドの長さを有する
ヌクレオチドループであり、そして（Ｇ）は存在してい
てもしていなくてもよい）、または ii）この配列と80％以上の相同性を有する配列、または iii）配列であって、ループ「Ｘ」の両側の「ハーフ配
列」のそれぞれにおいて４個以下の相違が存在する配
列、 ここでPUはエンテロバクテリアセエ（enterobacteriace
a）科に属する種に特異的であり、そのPUゲノムの局在
は種特有である、 より成る群から選ばれる、前記試料中のバクテリア種の
同定方法。 - 【請求項５】前記ヌクレオチド配列が、前記ボルデテラ
・パータッシス種特異性のヌクレオチド配列のうちの約
240個の連続ヌクレオチド配列を含んで成るフラグメン
トを含む、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】前記標識化プローブが、酵素抗体法、ラジ
オアイソトープ法または蛍光抗体法により標識化された
ものである請求項４又は５記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8517887A | 1987-08-14 | 1987-08-14 | |
| US085178 | 1987-08-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01157400A JPH01157400A (ja) | 1989-06-20 |
| JP2823566B2 true JP2823566B2 (ja) | 1998-11-11 |
Family
ID=22189960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63201060A Expired - Lifetime JP2823566B2 (ja) | 1987-08-14 | 1988-08-13 | バクテリア診断プローブ |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5492811A (ja) |
| EP (1) | EP0307270B1 (ja) |
| JP (1) | JP2823566B2 (ja) |
| AT (1) | ATE103005T1 (ja) |
| DE (1) | DE3888434T2 (ja) |
| ES (1) | ES2049758T3 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4038804A1 (de) * | 1990-10-09 | 1992-04-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur genus- oder/und spezies-spezifischen detektion von bakterien in einer probenfluessigkeit |
| JP2823566B2 (ja) * | 1987-08-14 | 1998-11-11 | アンスティテュ パストゥール | バクテリア診断プローブ |
| EP0452596A1 (en) | 1990-04-18 | 1991-10-23 | N.V. Innogenetics S.A. | Hybridization probes derived from the spacer region between the 16S and 23S rRNA genes for the detection of non-viral microorganisms |
| US5536638A (en) * | 1990-04-18 | 1996-07-16 | N.V. Innogenetics S.A. | Hybridization probes derived from the spacer region between the 16S and 23S rRNA genes for the detection of Neisseria gonorrhoeae |
| US5958686A (en) * | 1996-10-28 | 1999-09-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Simple PCR technique for detecting and differentiating bacterial pathogens |
| US6261785B1 (en) | 2000-07-27 | 2001-07-17 | Becton, Dickinson And Company | Amplification and detection of Bordetella pertussis |
| US6251609B1 (en) | 2000-07-27 | 2001-06-26 | Becton, Dickinson And Company | Amplification and detection of Legionella pneumophila targeting the mip gene |
| CA2474458A1 (en) * | 2002-01-31 | 2003-08-07 | Mitchell C. Sanders | Method for detecting microorganisms |
| US10465252B2 (en) * | 2007-10-26 | 2019-11-05 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Bordetella detection assay |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4342833A (en) * | 1977-05-31 | 1982-08-03 | Bethesda Research Laboratory | Immobilized restriction endonucleases |
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| EP0119209A1 (en) * | 1982-09-20 | 1984-09-26 | President And Fellows Of Harvard College | Identification of microorganisms |
| US5288611A (en) * | 1983-01-10 | 1994-02-22 | Gen-Probe Incorporated | Method for detecting, identifying, and quantitating organisms and viruses |
| US4801530A (en) * | 1984-02-29 | 1989-01-31 | Rockefeller University | Nucleotide hybridization assay for protozoan parasites |
| FR2596774B1 (fr) * | 1986-04-04 | 1988-07-22 | Pasteur Institut | Sondes oligonucleotidiques et procedes pour la detection par hybridation des acides nucleiques de bacteries et autres etres vivants |
| IT1196453B (it) * | 1986-07-04 | 1988-11-16 | Sclavo Spa | Elemento di dna di corynebacterium diphtheriae con proprieta' tipiche di un elemento di inserzione is |
| JP2823566B2 (ja) * | 1987-08-14 | 1998-11-11 | アンスティテュ パストゥール | バクテリア診断プローブ |
-
1988
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Non-Patent Citations (1)
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| ｎａｔｕｒｅ，２９８（１９８２）ｐ．７６０−７６２ |
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