JP2991200B2 - 魚類病原性菌種の決定遺伝子ｄｎａおよびその用途 - Google Patents
魚類病原性菌種の決定遺伝子ｄｎａおよびその用途Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は魚類病原菌の種決
定遺伝子DNAに関するものであり、さらに詳細にはエド
ワジエラ・タルダ種の種決定遺伝子DNAおよびそれを含
有する該菌種の同定試薬に関するものである。
定遺伝子DNAに関するものであり、さらに詳細にはエド
ワジエラ・タルダ種の種決定遺伝子DNAおよびそれを含
有する該菌種の同定試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】魚類病原菌による感染症が養殖場で発生
したとき、その原因菌を究明することは魚病の予防・治
療にとって重要なことである。従来、魚類病原菌を問わ
ず一般細菌の分類、同定はその形態や生化学的性状ある
いは免疫学的手法を用いた生物学的性状で行われてき
た。最近、生化学あるいは分子遺伝学の進歩により、そ
の菌の持つ染色体DNAやRNA、菌体物質および菌が生産す
る物質を比較することによる、いわゆる化学的性状によ
る分類が行われるようになってきた。
したとき、その原因菌を究明することは魚病の予防・治
療にとって重要なことである。従来、魚類病原菌を問わ
ず一般細菌の分類、同定はその形態や生化学的性状ある
いは免疫学的手法を用いた生物学的性状で行われてき
た。最近、生化学あるいは分子遺伝学の進歩により、そ
の菌の持つ染色体DNAやRNA、菌体物質および菌が生産す
る物質を比較することによる、いわゆる化学的性状によ
る分類が行われるようになってきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、生物学
的性状あるいは化学的性状による分類法は、最近の分類
学にとっては重要であるが、各々の手法は複雑で時間を
費やすために、病魚の原因菌を簡便かつ迅速に同定する
には適していない。
的性状あるいは化学的性状による分類法は、最近の分類
学にとっては重要であるが、各々の手法は複雑で時間を
費やすために、病魚の原因菌を簡便かつ迅速に同定する
には適していない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】生物は種によって形態や
それを構成する成分が異なる。これらの特徴はその生物
の持つ遺伝子によって規定されている。細菌においても
同様で、種によって生化学的性状が異なる。即ち性状が
異なることはそれを規定する遺伝子も異なる。このよう
な観点から、この発明者等は養殖場で流行が絶えず、経
済的に損失が大きいエロモナス病（せっそう病および出
血性敗血症）、連鎖球菌症およびエドワジエラ感染症に
ついて、それらの病原菌である、遺伝子的に等しいと考
えられるため区別できないエロモナス・サルモニシダ
（Aeromonas salmonicida）およびエロモナス・ハイド
ロフィラ（Aeromonas hydrophila）、非溶血性ストレプ
トコッカス sp.（Streptococcus sp.）およびエドワジ
エラ・タルダ(Edwardsiellatarda)のみが持つ種特定遺
伝子をそれぞれ見出し、さらにこれらのDNAをプローブ
（標識した検出試料）として菌種未知の魚病の病原菌の
DNAとハイブリダイゼー ションすることにより、該菌が
エロモナス・ハイドロフィラあるいはエロモナス・サル
モニシダ種、非溶血性ストレプトコッカス sp.種または
エドワジエラ・タルダ種であるか否かを簡易かつ迅速に
同定できるという新知見を得、この発明を完成した。
それを構成する成分が異なる。これらの特徴はその生物
の持つ遺伝子によって規定されている。細菌においても
同様で、種によって生化学的性状が異なる。即ち性状が
異なることはそれを規定する遺伝子も異なる。このよう
な観点から、この発明者等は養殖場で流行が絶えず、経
済的に損失が大きいエロモナス病（せっそう病および出
血性敗血症）、連鎖球菌症およびエドワジエラ感染症に
ついて、それらの病原菌である、遺伝子的に等しいと考
えられるため区別できないエロモナス・サルモニシダ
（Aeromonas salmonicida）およびエロモナス・ハイド
ロフィラ（Aeromonas hydrophila）、非溶血性ストレプ
トコッカス sp.（Streptococcus sp.）およびエドワジ
エラ・タルダ(Edwardsiellatarda)のみが持つ種特定遺
伝子をそれぞれ見出し、さらにこれらのDNAをプローブ
（標識した検出試料）として菌種未知の魚病の病原菌の
DNAとハイブリダイゼー ションすることにより、該菌が
エロモナス・ハイドロフィラあるいはエロモナス・サル
モニシダ種、非溶血性ストレプトコッカス sp.種または
エドワジエラ・タルダ種であるか否かを簡易かつ迅速に
同定できるという新知見を得、この発明を完成した。
【０００５】以下に、エロモナス・ハイドロフィラある
い はエロモナス・サルモニシダ種の種決定遺伝子DNA、
非溶血性ストレプトコッカス sp.種の種決定遺伝子DNA
およびエドワジエラ・タルダ種の種決定遺伝子DNAの一
般的な製造法を示す。図４に示すように、せっそう病の
起因菌、たとえばエロモナス・サルモニシダATCC1417
4、連鎖球菌症の起因菌、ストレプトコッカス sp.NG820
6およびパラコロ病等の起因菌エドワジエラ・タルダ E
dk-1それぞれの染色体DNAを常法、例えばマーマー（Mar
mur）法により抽出する。ここで用いるエロモナス・サ
ルモニシダATCC14174はアメリカン・タイプ・カルチュ
アー・コレクションに寄託されていて一般に入手できる
菌株であり、エドワジエラ・タルダ Edk−1も工業技術
院微生物工業技術研究所に受託番号微工研菌寄第11372
号として寄託されている。
い はエロモナス・サルモニシダ種の種決定遺伝子DNA、
非溶血性ストレプトコッカス sp.種の種決定遺伝子DNA
およびエドワジエラ・タルダ種の種決定遺伝子DNAの一
般的な製造法を示す。図４に示すように、せっそう病の
起因菌、たとえばエロモナス・サルモニシダATCC1417
4、連鎖球菌症の起因菌、ストレプトコッカス sp.NG820
6およびパラコロ病等の起因菌エドワジエラ・タルダ E
dk-1それぞれの染色体DNAを常法、例えばマーマー（Mar
mur）法により抽出する。ここで用いるエロモナス・サ
ルモニシダATCC14174はアメリカン・タイプ・カルチュ
アー・コレクションに寄託されていて一般に入手できる
菌株であり、エドワジエラ・タルダ Edk−1も工業技術
院微生物工業技術研究所に受託番号微工研菌寄第11372
号として寄託されている。
【０００６】得られるDNA断片のそれぞれについて、DNA
をそれぞれエロモナス・サルモニシダATCC14174は制限
酵素BamHIで、非溶血性ストレプトコッカスsp. NG8206
およびエドワジエラ・タルダEdk-1は制限酵素Sau3AIで
切断し、得られるDNA断片それぞれについてベクタープ
ラスミドpUC119にショットガンクローニングを行う。こ
こで使用するベクタープラスミドpUC119は、例えばMeth
ods in enzymology第153巻(1987年)（ACADEMIC PRESS,
INC.）に記載されている公知のプラスミドである。
をそれぞれエロモナス・サルモニシダATCC14174は制限
酵素BamHIで、非溶血性ストレプトコッカスsp. NG8206
およびエドワジエラ・タルダEdk-1は制限酵素Sau3AIで
切断し、得られるDNA断片それぞれについてベクタープ
ラスミドpUC119にショットガンクローニングを行う。こ
こで使用するベクタープラスミドpUC119は、例えばMeth
ods in enzymology第153巻(1987年)（ACADEMIC PRESS,
INC.）に記載されている公知のプラスミドである。
【０００７】このようにして得られるリコンビナントプ
ラスミドをそれぞれエスシェリヒア・コリMV1184株（Me
ssing. J., R.Crea, and P. H. Seeburg. 1981. A syst
em for shotgun DNA seqencing. Nucleic Acids Res. 9
: 309 参照）に形質転換を行い、得られるエロモナス
・サルモニシダATCC14174、ストレプトコッカス sp.NG8
206およびエドワジエラ・タルダ Edk-1の染色体DNA断
片を含むリコンビナントプラスミドDNAをアルカリSDS法
｛Plasmids (IRL PRESS)-a practical approachに記載
の方法｝により抽出し、そのDNAをそれぞれエロモナス
・サルモニシダATCC14174は制限酵素BamHIで、非溶血性
ストレプトコッカス sp.NG8206およびエドワジエラ・タ
ルダEdk-1は制限酵素Sau3AIで切断し、電気泳動により
これらのクローン化されたDNAの分子量を求め、エロモ
ナス・サルモニシダATCC14174についてはアガロース電
気泳動法により測定した分子量0.35kbp附近のクローン
を、非溶血性ストレプトコッカスsp. NG8206に就いて
は、同様の測定法により測定した分子量0.45kbp附近の
クローンを、エドワジエラ・タルダEdk−1についても分
子量0.65kbp附近のクローンをそれぞれ選択し、単離す
る。
ラスミドをそれぞれエスシェリヒア・コリMV1184株（Me
ssing. J., R.Crea, and P. H. Seeburg. 1981. A syst
em for shotgun DNA seqencing. Nucleic Acids Res. 9
: 309 参照）に形質転換を行い、得られるエロモナス
・サルモニシダATCC14174、ストレプトコッカス sp.NG8
206およびエドワジエラ・タルダ Edk-1の染色体DNA断
片を含むリコンビナントプラスミドDNAをアルカリSDS法
｛Plasmids (IRL PRESS)-a practical approachに記載
の方法｝により抽出し、そのDNAをそれぞれエロモナス
・サルモニシダATCC14174は制限酵素BamHIで、非溶血性
ストレプトコッカス sp.NG8206およびエドワジエラ・タ
ルダEdk-1は制限酵素Sau3AIで切断し、電気泳動により
これらのクローン化されたDNAの分子量を求め、エロモ
ナス・サルモニシダATCC14174についてはアガロース電
気泳動法により測定した分子量0.35kbp附近のクローン
を、非溶血性ストレプトコッカスsp. NG8206に就いて
は、同様の測定法により測定した分子量0.45kbp附近の
クローンを、エドワジエラ・タルダEdk−1についても分
子量0.65kbp附近のクローンをそれぞれ選択し、単離す
る。
【０００８】このようにして得られるエロモナス・サル
モニシダATCC14174の分子量0.35kbp附近のDNA断片をそ
れぞれプローブとして、これらとエロモナス・サルモニ
シダの染色体DNAのBamHI消化断片とサザン ブロット
ハイブリダイゼーションを行い、かつエロモナス・サル
モニシダの増殖したコロニーとコロニーハイブリダイゼ
ーションを行い、エロモナス・サルモニシダおよびエロ
モナス・ハイドロフィラとのみハイブリッドを形成し、
他の細菌とハイブリッドを形成しないものを探索するこ
とにより、目的とするエロモナス・ハイドロフィラある
いはエロモナス・サルモニシダ種の決定遺伝子DNAが得
られる。
モニシダATCC14174の分子量0.35kbp附近のDNA断片をそ
れぞれプローブとして、これらとエロモナス・サルモニ
シダの染色体DNAのBamHI消化断片とサザン ブロット
ハイブリダイゼーションを行い、かつエロモナス・サル
モニシダの増殖したコロニーとコロニーハイブリダイゼ
ーションを行い、エロモナス・サルモニシダおよびエロ
モナス・ハイドロフィラとのみハイブリッドを形成し、
他の細菌とハイブリッドを形成しないものを探索するこ
とにより、目的とするエロモナス・ハイドロフィラある
いはエロモナス・サルモニシダ種の決定遺伝子DNAが得
られる。
【０００９】同様にして、非溶血性ストレプトコッカス
sp. NG8206の分子量0.45kbp附近のDNA断片をそれぞれ
プローブとして、これらと非溶血性ストレプトコッカス
sp.の染色体DNAのSau3AI消化断片とサザンブロット
ハイブリダイゼーションを行い、かつ非溶血性ストレプ
トコッカス sp.の増殖したコロニーとコロニーハイブリ
ダイゼーションを行い、非溶血性ストレプトコッカス s
p.とのみハイブリッドを形成し、他の細菌とハイブリッ
ドを形成しないものを探索することにより、目的とする
非溶血性ストレプトコッカス sp.の決定遺伝子DNAが得
られる。
sp. NG8206の分子量0.45kbp附近のDNA断片をそれぞれ
プローブとして、これらと非溶血性ストレプトコッカス
sp.の染色体DNAのSau3AI消化断片とサザンブロット
ハイブリダイゼーションを行い、かつ非溶血性ストレプ
トコッカス sp.の増殖したコロニーとコロニーハイブリ
ダイゼーションを行い、非溶血性ストレプトコッカス s
p.とのみハイブリッドを形成し、他の細菌とハイブリッ
ドを形成しないものを探索することにより、目的とする
非溶血性ストレプトコッカス sp.の決定遺伝子DNAが得
られる。
【００１０】同様にしてエドワジエラ・タルダEdk−1の
分子量0.65kbp附近のDNA断片をそれぞれプローブとし
て、これらとエドワジエラ・タルダの染色体DNAのSau3A
I消化断片とサザン ブロット ハイブリダイゼーショ
ンを行い、かつエドワジエラ・タルダの増殖したコロニ
ーとコロニーハイブリダイゼーションを行い、エドワジ
エラ・タルダとのみハイブリッドを形成し、他の細菌と
ハイブリッドを形成しないものを探索することにより、
目的とするエドワジエラ・タルダの種決定遺伝子DNAが
得られる。
分子量0.65kbp附近のDNA断片をそれぞれプローブとし
て、これらとエドワジエラ・タルダの染色体DNAのSau3A
I消化断片とサザン ブロット ハイブリダイゼーショ
ンを行い、かつエドワジエラ・タルダの増殖したコロニ
ーとコロニーハイブリダイゼーションを行い、エドワジ
エラ・タルダとのみハイブリッドを形成し、他の細菌と
ハイブリッドを形成しないものを探索することにより、
目的とするエドワジエラ・タルダの種決定遺伝子DNAが
得られる。
【００１１】このようにして得られるエロモナス・ハイ
ドロフィラあるいはエロモナス・サルモニシダ種の決定
遺伝子DNAは次のような特徴を有する。 (イ)該DNAの塩基配列は図１に示す通りである。 (ロ)該DNAの塩基対数は352bpである。 また、非溶血性ストレプトコッカス sp.の種決定遺伝子
DNAは次のような特徴を有する。 (イ)該DNAの塩基配列は図２に示す通りである。 (ロ)該DNAの塩基対数は454bpである。 さらにエドワジエラ・タルダの種決定遺伝子DNAは次の
ような特徴を有する。 (イ)該DNAの塩基配列は図３に示す通りある。 (ロ)該DNAの塩基対数は663bpである。
ドロフィラあるいはエロモナス・サルモニシダ種の決定
遺伝子DNAは次のような特徴を有する。 (イ)該DNAの塩基配列は図１に示す通りである。 (ロ)該DNAの塩基対数は352bpである。 また、非溶血性ストレプトコッカス sp.の種決定遺伝子
DNAは次のような特徴を有する。 (イ)該DNAの塩基配列は図２に示す通りである。 (ロ)該DNAの塩基対数は454bpである。 さらにエドワジエラ・タルダの種決定遺伝子DNAは次の
ような特徴を有する。 (イ)該DNAの塩基配列は図３に示す通りある。 (ロ)該DNAの塩基対数は663bpである。
【００１２】
【発明の効果】この発明のエロモナス・ハイドロフィラ
あるいはエロモナス・サルモニシダ種の決定遺伝子DNA
はエロモナス・サルモニシダあるいはエロモナス・ハイ
ドロフィラの同定に、非溶血性ストレプトコッカス sp.
の種決定遺伝子DNAは魚類病原菌非溶血性ストレプトコ
ッカス sp.の同定に、エドワジエラ・タルダの種決定遺
伝子DNAは魚類病原菌エドワジエラ・タルダの同定にそ
れぞれ有用である。すなわち、適当な標識物で標識した
エロモナス・ハイドロフィラあるいはエロモナス・サル
モニシダ種の決定遺伝子DNAの一本鎖DNA（同様に、適当
な標識物で標識した非溶血性ストレプトコッカス sp.の
種決定遺伝子DNAの一本鎖DNAあるいはエドワジエラ・タ
ルダの種決定遺伝子DNAの一本鎖DNA）と種未知の魚の病
原菌のDNAの一本鎖とをハイブリダイゼーションするこ
とによって、該菌種未知の魚の病原菌がエロモナス・ハ
イドロフィラあるいはエロモナス・サルモニシダ種（同
様にして、非溶血性ストレプトコッカス sp.あるいはエ
ドワジエラ・タルダであるか否か）を同定することがで
きる。
あるいはエロモナス・サルモニシダ種の決定遺伝子DNA
はエロモナス・サルモニシダあるいはエロモナス・ハイ
ドロフィラの同定に、非溶血性ストレプトコッカス sp.
の種決定遺伝子DNAは魚類病原菌非溶血性ストレプトコ
ッカス sp.の同定に、エドワジエラ・タルダの種決定遺
伝子DNAは魚類病原菌エドワジエラ・タルダの同定にそ
れぞれ有用である。すなわち、適当な標識物で標識した
エロモナス・ハイドロフィラあるいはエロモナス・サル
モニシダ種の決定遺伝子DNAの一本鎖DNA（同様に、適当
な標識物で標識した非溶血性ストレプトコッカス sp.の
種決定遺伝子DNAの一本鎖DNAあるいはエドワジエラ・タ
ルダの種決定遺伝子DNAの一本鎖DNA）と種未知の魚の病
原菌のDNAの一本鎖とをハイブリダイゼーションするこ
とによって、該菌種未知の魚の病原菌がエロモナス・ハ
イドロフィラあるいはエロモナス・サルモニシダ種（同
様にして、非溶血性ストレプトコッカス sp.あるいはエ
ドワジエラ・タルダであるか否か）を同定することがで
きる。
【００１３】ここで用いられる標識物としては、通常こ
の分野で用いられる標識物をそのまま使用することがで
き、そのような例としては、放射性同位元素、酵素、蛍
光性化合物、化学的発光性化合物、化学的発色性化合
物、生物発光性化合物、生物発色性化合物等が挙げられ
る。この発明の、標識物で標識されたエロモナス・ハイ
ドロフィラあるいはエロモナス・サルモニシダの種決定
遺伝子、非溶血性ストレプトコッカスsp.の種決定遺伝
子DNAおよびエドワジエラ・タルダの種決定遺伝子DNA
は、それぞれの一本鎖と各種担体、希釈剤とを含有する
エロモナス・ハイドロフィラあるいはエロモナス・サル
モニシダ種、非溶血性ストレプトコッカス sp.種および
エドワジエラ・タルダ種の同定用試薬として、また、こ
れらの標識された種決定遺伝子DNAをそれぞれ含有する
キットとして用いることができる。
の分野で用いられる標識物をそのまま使用することがで
き、そのような例としては、放射性同位元素、酵素、蛍
光性化合物、化学的発光性化合物、化学的発色性化合
物、生物発光性化合物、生物発色性化合物等が挙げられ
る。この発明の、標識物で標識されたエロモナス・ハイ
ドロフィラあるいはエロモナス・サルモニシダの種決定
遺伝子、非溶血性ストレプトコッカスsp.の種決定遺伝
子DNAおよびエドワジエラ・タルダの種決定遺伝子DNA
は、それぞれの一本鎖と各種担体、希釈剤とを含有する
エロモナス・ハイドロフィラあるいはエロモナス・サル
モニシダ種、非溶血性ストレプトコッカス sp.種および
エドワジエラ・タルダ種の同定用試薬として、また、こ
れらの標識された種決定遺伝子DNAをそれぞれ含有する
キットとして用いることができる。
【００１４】
【実施例】次にこの発明を実施例により説明する。な
お、以下の実施例の説明には、下記の略号を使用した。 HIA：ハートインフュージョン寒天培地 1HIA：0.5％食塩加ハートインフュージョン寒天培地 2HIYA：0.2％イーストエクストラクト添加および1.5％
食塩加ハートインフュージョン寒天培地 HIGA：0.3％グルコース添加ハートインフュージョン寒
天培地 dDW：精製水 トリス：ヒドロキシメチル アミノメタン DTT：ジチオスレイトール ATP：アデノシン−５’−トリフォスフェート BSA：牛血清アルブミン X-gal：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリール−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド TBE緩衝液：0.089Mトリス・ホウ酸塩 0.089M−ホウ酸及び0.002M EDTA混液 2ME：２−メルカプトエタノール Kbp：キロ塩基対 EDTA：エチレンジアミンテトラ酢酸 TE：10mlM トリス・HCl（pH8.0） 1mM EDTA 混液 CTAB−NaCl溶液： 10％CTAB（ヘキサデシルトリメチル アンモニウムブロ
マイド） 0.7M NaCl
お、以下の実施例の説明には、下記の略号を使用した。 HIA：ハートインフュージョン寒天培地 1HIA：0.5％食塩加ハートインフュージョン寒天培地 2HIYA：0.2％イーストエクストラクト添加および1.5％
食塩加ハートインフュージョン寒天培地 HIGA：0.3％グルコース添加ハートインフュージョン寒
天培地 dDW：精製水 トリス：ヒドロキシメチル アミノメタン DTT：ジチオスレイトール ATP：アデノシン−５’−トリフォスフェート BSA：牛血清アルブミン X-gal：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリール−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド TBE緩衝液：0.089Mトリス・ホウ酸塩 0.089M−ホウ酸及び0.002M EDTA混液 2ME：２−メルカプトエタノール Kbp：キロ塩基対 EDTA：エチレンジアミンテトラ酢酸 TE：10mlM トリス・HCl（pH8.0） 1mM EDTA 混液 CTAB−NaCl溶液： 10％CTAB（ヘキサデシルトリメチル アンモニウムブロ
マイド） 0.7M NaCl
【００１５】実施例１（エロモナス・サルモニシダある
いはエロモナス・ハイドロフィラ種の種決定遺伝子DNA
の製法） (1)エロモナス・サルモニシダの染色体DNAの抽出：エロ
モナス・サルモニシダ ATCC14174株を1NB培地で25℃一
夜培養した。該菌培養液から6,000rpmで10分間遠心分離
し、上澄を捨て、沈殿菌体を得た。この沈殿菌体から、
Meadeらの方法（J.Bacteriology, 149:114-122, 1982）
でエロモナス・サルモニシダ ATCC14174株の染色体DNA
を得た。これを真空乾燥した後、1mlのTE溶液に溶解さ
せ、得られたDNAを-20℃で保存した。 (2)ベクタープラスミドpUC119 DNAの抽出：ベクタープ
ラスミドDNA pUC119を保持するエスシェリヒア・コリ M
V1184株を2xYT培地で一晩培養し、アルカリSDS法に従っ
てベクタープラスミドDNA pUC 119を採取した。 (3)エロモナス・サルモニシダ染色体DNAの消化：エロモ
ナス・サルモニシダ染色体DNA約１μgをBamHI緩衝液［1
50mM NaCl、6mMトリス・HCl（pH8.0）、6mM MgCl2］20
μlに溶かし、BamHI約２〜４ユニットを加えて37℃で１
時間反応させた。反応後、常法に従ってフェノール処理
を１回、ジエチルエーテル処理を２回行って反応を止
め、BamHIによるDNAの消化断片液を得た。
いはエロモナス・ハイドロフィラ種の種決定遺伝子DNA
の製法） (1)エロモナス・サルモニシダの染色体DNAの抽出：エロ
モナス・サルモニシダ ATCC14174株を1NB培地で25℃一
夜培養した。該菌培養液から6,000rpmで10分間遠心分離
し、上澄を捨て、沈殿菌体を得た。この沈殿菌体から、
Meadeらの方法（J.Bacteriology, 149:114-122, 1982）
でエロモナス・サルモニシダ ATCC14174株の染色体DNA
を得た。これを真空乾燥した後、1mlのTE溶液に溶解さ
せ、得られたDNAを-20℃で保存した。 (2)ベクタープラスミドpUC119 DNAの抽出：ベクタープ
ラスミドDNA pUC119を保持するエスシェリヒア・コリ M
V1184株を2xYT培地で一晩培養し、アルカリSDS法に従っ
てベクタープラスミドDNA pUC 119を採取した。 (3)エロモナス・サルモニシダ染色体DNAの消化：エロモ
ナス・サルモニシダ染色体DNA約１μgをBamHI緩衝液［1
50mM NaCl、6mMトリス・HCl（pH8.0）、6mM MgCl2］20
μlに溶かし、BamHI約２〜４ユニットを加えて37℃で１
時間反応させた。反応後、常法に従ってフェノール処理
を１回、ジエチルエーテル処理を２回行って反応を止
め、BamHIによるDNAの消化断片液を得た。
【００１６】(4)ベクタープラスミドDNA pUC119のBamHI
による消化：ベクタープラスミドDNA pUC119約0.1μgを
BamHI緩衝液に溶かし、BamHI約１ユニットを加えて37℃
で１時間反応させた。反応後、常法に従ってフェノール
処理を１回、ジエチルエーテル処理を２回行って反応を
止め、BamHIによるDNAの消化断片液を得た。 (5)エロモナス・サルモニシダDNAのBamHI消化断片のベ
クタープラスミドDNA pUC119へのクローニング：エロモ
ナス・サルモニシダ染色体DNAのBamHI消化断片とベクタ
ープラスミドDNA pUC119のBamHI消化断片とを混合し、
２倍量の99％冷エタノール（-20℃保存）と10分の１量
の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、-70℃で15分間静置し
た。これを14,000rpmで５分間遠心後、アスピレート
し、75％冷エタノールでリンスした後、乾燥させた。dD
W 14μlを入れライゲーション緩衝液［0.5Mトリス・HCl
（pH7.4）、0.1M MgCl2、0.1M DTT 10mM スペルミジ
ン、10mM ATP、１mg／ml BSA］４μlを加え、さらにＴ4
ガーゼ（エスシェリヒア・コリＣ75Ｔ4リガーゼ）２μl
追加し、15℃で一晩反応させて、環状のリコンビナント
プラスミドDNAを得た。
による消化：ベクタープラスミドDNA pUC119約0.1μgを
BamHI緩衝液に溶かし、BamHI約１ユニットを加えて37℃
で１時間反応させた。反応後、常法に従ってフェノール
処理を１回、ジエチルエーテル処理を２回行って反応を
止め、BamHIによるDNAの消化断片液を得た。 (5)エロモナス・サルモニシダDNAのBamHI消化断片のベ
クタープラスミドDNA pUC119へのクローニング：エロモ
ナス・サルモニシダ染色体DNAのBamHI消化断片とベクタ
ープラスミドDNA pUC119のBamHI消化断片とを混合し、
２倍量の99％冷エタノール（-20℃保存）と10分の１量
の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、-70℃で15分間静置し
た。これを14,000rpmで５分間遠心後、アスピレート
し、75％冷エタノールでリンスした後、乾燥させた。dD
W 14μlを入れライゲーション緩衝液［0.5Mトリス・HCl
（pH7.4）、0.1M MgCl2、0.1M DTT 10mM スペルミジ
ン、10mM ATP、１mg／ml BSA］４μlを加え、さらにＴ4
ガーゼ（エスシェリヒア・コリＣ75Ｔ4リガーゼ）２μl
追加し、15℃で一晩反応させて、環状のリコンビナント
プラスミドDNAを得た。
【００１７】(6)エスシェリヒア・コリの形質転換によ
るリコンビナントプラスミドDNAの複製：連結された環
状のリコンビナントDNAを用い、Molecular Clonig （Co
ld Spring Harbar Laboratory）記載の方法に従って、
エスシェリヒア・コリMV1184株に形質転換した。得られ
た形質転換株をアンピシリン100μg／mlおよびX−gal 4
0μg／ml含有2xYT平板に塗抹し、37℃で一晩培養した。
培地上に成育したアンピシリン耐性白色のコロニーを、
リコンビナントDNAの複製株として回収した。 (7)エロモナス・サルモニシダDNAの消化断片クローンの
選択：得られた環状のリコンビナントプラスミドDNA複
製株を、アルカリSDS法で抽出し、BamHIで消化後、0.8
％アガロースゲルを用いてTBE緩衝液中80mAで１時間電
気泳動を行った。アガロースゲルにおけるDNAバンドの
検出は Molecular Cloning 記載の方法で行った。切断D
NA断片の分子サイズは、アガロースゲルにおけるそれら
の相対移動速度をλファージDNAのHind 消化断片の移
動度[L.H.Robinsonand A.Landy, Gene 2 （1977）]と比
較して測定し、約0.45kbpのBamHI消化DNA断片を得た。
るリコンビナントプラスミドDNAの複製：連結された環
状のリコンビナントDNAを用い、Molecular Clonig （Co
ld Spring Harbar Laboratory）記載の方法に従って、
エスシェリヒア・コリMV1184株に形質転換した。得られ
た形質転換株をアンピシリン100μg／mlおよびX−gal 4
0μg／ml含有2xYT平板に塗抹し、37℃で一晩培養した。
培地上に成育したアンピシリン耐性白色のコロニーを、
リコンビナントDNAの複製株として回収した。 (7)エロモナス・サルモニシダDNAの消化断片クローンの
選択：得られた環状のリコンビナントプラスミドDNA複
製株を、アルカリSDS法で抽出し、BamHIで消化後、0.8
％アガロースゲルを用いてTBE緩衝液中80mAで１時間電
気泳動を行った。アガロースゲルにおけるDNAバンドの
検出は Molecular Cloning 記載の方法で行った。切断D
NA断片の分子サイズは、アガロースゲルにおけるそれら
の相対移動速度をλファージDNAのHind 消化断片の移
動度[L.H.Robinsonand A.Landy, Gene 2 （1977）]と比
較して測定し、約0.45kbpのBamHI消化DNA断片を得た。
【００１８】(8)ハイブリダイゼーションによる確認：
得られた約0.45kbpのDNA断片は、ニック・トランススレ
ーション法（Molecular Cloning 記載の方法）により32
Ｐで標識し、目的細菌であるエロモナス・サルモニシダ
およびエロモナス・ハイドロフィラの一本鎖DNAとのみ
ハイブリッドを形成することをサザン ブロット ハイ
ブリダイゼーション法およびコロニーハイブリダイゼー
ション法（表１）により確認した。
得られた約0.45kbpのDNA断片は、ニック・トランススレ
ーション法（Molecular Cloning 記載の方法）により32
Ｐで標識し、目的細菌であるエロモナス・サルモニシダ
およびエロモナス・ハイドロフィラの一本鎖DNAとのみ
ハイブリッドを形成することをサザン ブロット ハイ
ブリダイゼーション法およびコロニーハイブリダイゼー
ション法（表１）により確認した。
【００１９】
【表１】
【００２０】(9)塩基配列の決定：確認の済んだ約0.45k
bpのDNAクローン断片の塩基配列を、ニッポンジーン
のM13 Sequencing Kit 1 を用いてジデオキシ法［J. Me
ssing, Methods in enzymology, 101, 78（1983）］で
決定した。その結果は、図１に示した。
bpのDNAクローン断片の塩基配列を、ニッポンジーン
のM13 Sequencing Kit 1 を用いてジデオキシ法［J. Me
ssing, Methods in enzymology, 101, 78（1983）］で
決定した。その結果は、図１に示した。
【００２１】実施例２（非溶血性ストレプトコッカス s
p.種の種決定DNA断片の製法） (1)非溶血性ストレプトコッカス sp.の染色体DNAの抽
出：非溶血性ストレプトコッカス sp.NG8206株を1NB培
地200mlで一夜培養し、菌培養液を得た。該菌培養液を
6,000rpmで10分間４℃で遠心して上澄液を捨て、沈殿菌
体に10mMトリス・HCl(pH8.0)と10mM EDTAの混液を加え
て撹拌し、この液を6,000rpmで15分間４℃で遠心して上
澄液を捨てた。残った菌体を25mlの10mMトリス・HCl(pH
8.0)と10mM EDTAの混液で懸濁し、50mgのリゾチーム
（和光純薬製）を加え、穏やかに混合し、４℃で２〜３
時間放置した。この液を6,000rpmで15分間４℃で遠心し
て、再度10mMトリス・HCl(pH8.0)と10mM EDTAの混液で
懸濁し、1mlの20％SDSを加えて37℃で１時間反応させ
た。さらに、1mlのTE飽和フェノールを加え、５分間穏
やかに振盪後8,000rpmで15分間遠心した。この上澄を別
の遠心チューブに移し、これと等量のフェノール／クロ
ロホルム（１：１）を加え、穏やかに振盪した後、8,00
0rpmで15分間遠心した。この上澄を別の遠心チューブに
移し、１／10量の酢酸ナトリウム溶液と2.5倍量の冷エ
タノールを加え、-80℃で10分間放置した。その後、12,
000rpm10分間４℃で遠心し、上澄を捨て、これに75％冷
エタノールを加え、洗浄し、真空乾燥した。最後に1ml
のTE溶液で溶解させ、得られたDNAを-20℃で保存した。 (2)ベクタープラスミド pUC119 DNAの抽出：実施例１−
(2)と同じ方法でベクタープラスミド pUC119 DNAを精製
した。 (3)非溶血性ストレプトコッカス sp.染色体DNAの消化：
非溶血性ストレプトコッカス sp.染色体DNA約１μgをSa
u3AI［50mM NaCl、20mMトリス・HCl（pH7.5）、10mM Mg
Cl ］緩衝液に溶かし、Sau3AI約2２〜４ユニットを加え
て37℃で１時間反応させた。反応後、常法に従ってフェ
ノール処理を１回、ジエチルエーテル処理を２回行って
反応を止め、Sau3AIによるDNAの消化断片液を得た。
p.種の種決定DNA断片の製法） (1)非溶血性ストレプトコッカス sp.の染色体DNAの抽
出：非溶血性ストレプトコッカス sp.NG8206株を1NB培
地200mlで一夜培養し、菌培養液を得た。該菌培養液を
6,000rpmで10分間４℃で遠心して上澄液を捨て、沈殿菌
体に10mMトリス・HCl(pH8.0)と10mM EDTAの混液を加え
て撹拌し、この液を6,000rpmで15分間４℃で遠心して上
澄液を捨てた。残った菌体を25mlの10mMトリス・HCl(pH
8.0)と10mM EDTAの混液で懸濁し、50mgのリゾチーム
（和光純薬製）を加え、穏やかに混合し、４℃で２〜３
時間放置した。この液を6,000rpmで15分間４℃で遠心し
て、再度10mMトリス・HCl(pH8.0)と10mM EDTAの混液で
懸濁し、1mlの20％SDSを加えて37℃で１時間反応させ
た。さらに、1mlのTE飽和フェノールを加え、５分間穏
やかに振盪後8,000rpmで15分間遠心した。この上澄を別
の遠心チューブに移し、これと等量のフェノール／クロ
ロホルム（１：１）を加え、穏やかに振盪した後、8,00
0rpmで15分間遠心した。この上澄を別の遠心チューブに
移し、１／10量の酢酸ナトリウム溶液と2.5倍量の冷エ
タノールを加え、-80℃で10分間放置した。その後、12,
000rpm10分間４℃で遠心し、上澄を捨て、これに75％冷
エタノールを加え、洗浄し、真空乾燥した。最後に1ml
のTE溶液で溶解させ、得られたDNAを-20℃で保存した。 (2)ベクタープラスミド pUC119 DNAの抽出：実施例１−
(2)と同じ方法でベクタープラスミド pUC119 DNAを精製
した。 (3)非溶血性ストレプトコッカス sp.染色体DNAの消化：
非溶血性ストレプトコッカス sp.染色体DNA約１μgをSa
u3AI［50mM NaCl、20mMトリス・HCl（pH7.5）、10mM Mg
Cl ］緩衝液に溶かし、Sau3AI約2２〜４ユニットを加え
て37℃で１時間反応させた。反応後、常法に従ってフェ
ノール処理を１回、ジエチルエーテル処理を２回行って
反応を止め、Sau3AIによるDNAの消化断片液を得た。
【００２２】(4)ベクタープラスミドDNA pUC119の消
化：実施例１−(4)と同じ方法でベクタープラスミド pU
C119のBamHI消化断片DNAを得た。 (5)非溶血性ストレプトコッカス sp.DNAのSau3AI消化断
片とベクタープラスミドpUC119へのクローニング：非溶
血性ストレプトコッカス sp.染色体DNAのSau3AIの消化
断片とベクタープラスミドDNApUC119のBamHIの消化断片
とを混合し、これにフェノール／クロロホルム（１：
１）を等量入れ良く混合した後、12,000rpmで５分間遠
心し、上澄を新しいチューブに移し、ジエチルエーテル
処理を２回行なった。ジエチルエーテルを完全に除いた
後、1／10量の３Ｍ酢酸ナトリウムと2.5倍量の99％冷エ
タノールを加え、-80℃で20分間静置した。これを13,00
0rpmで５分間４℃で遠心を行ない上澄を取除いた。沈殿
物を70％冷エタノールでリンスした後、真空乾燥し、dD
W20μlに溶解させた。これに20％PEG6000／2.5M NaCl液
１μlに２μlのＴ4ライゲーション緩衝液と100ユニット
のＴ4リガーゼを混ぜて、15℃で一晩反応させ、環状の
リコンビナントプラスミドDNAを得た。 (6)エスシェリヒア・コリの形質転換によるリコンビナ
ントプラスミドDNAの複製：連結された環状のリコンビ
ナントDNAを用い、Molecular Clonig記載の方法に従っ
て、エスシェリヒア・コリ MV1184に形質転換した。得
られた形質転換株をアンピシリン200μg／ml、Ｘ−gal4
0μg／mlおよび0.01％チアミン含有2xYT平板に塗抹し、
37℃で一晩培養した。培地上に成育したアンピシリン耐
性白色のコロニーを、リコンビナントDNAの複製株とし
て単離した。
化：実施例１−(4)と同じ方法でベクタープラスミド pU
C119のBamHI消化断片DNAを得た。 (5)非溶血性ストレプトコッカス sp.DNAのSau3AI消化断
片とベクタープラスミドpUC119へのクローニング：非溶
血性ストレプトコッカス sp.染色体DNAのSau3AIの消化
断片とベクタープラスミドDNApUC119のBamHIの消化断片
とを混合し、これにフェノール／クロロホルム（１：
１）を等量入れ良く混合した後、12,000rpmで５分間遠
心し、上澄を新しいチューブに移し、ジエチルエーテル
処理を２回行なった。ジエチルエーテルを完全に除いた
後、1／10量の３Ｍ酢酸ナトリウムと2.5倍量の99％冷エ
タノールを加え、-80℃で20分間静置した。これを13,00
0rpmで５分間４℃で遠心を行ない上澄を取除いた。沈殿
物を70％冷エタノールでリンスした後、真空乾燥し、dD
W20μlに溶解させた。これに20％PEG6000／2.5M NaCl液
１μlに２μlのＴ4ライゲーション緩衝液と100ユニット
のＴ4リガーゼを混ぜて、15℃で一晩反応させ、環状の
リコンビナントプラスミドDNAを得た。 (6)エスシェリヒア・コリの形質転換によるリコンビナ
ントプラスミドDNAの複製：連結された環状のリコンビ
ナントDNAを用い、Molecular Clonig記載の方法に従っ
て、エスシェリヒア・コリ MV1184に形質転換した。得
られた形質転換株をアンピシリン200μg／ml、Ｘ−gal4
0μg／mlおよび0.01％チアミン含有2xYT平板に塗抹し、
37℃で一晩培養した。培地上に成育したアンピシリン耐
性白色のコロニーを、リコンビナントDNAの複製株とし
て単離した。
【００２３】(7)非溶血性ストレプトコッカス sp.DNAの
消化断片クローンの選択：得られた環状のリコンビナン
トプラスミドDNA複製株を、実施例１−(7)と同じ電気泳
動法で、約0.45kbpのSau3AI消化DNA断片を得た。 (8)ハイブリダイゼーションによる確認：得られた約0.4
5kbpのDNA断片は、実施例１−(8)の方法で標識し、目的
細菌である非溶血性ストレプトコッカス sp.の一本鎖DN
Aとのみハイブリッドを形成することをサザン ブロッ
ト ハイブリゼーション法およびコロニーハイブリダイ
ゼーション法（表２）により確認した。
消化断片クローンの選択：得られた環状のリコンビナン
トプラスミドDNA複製株を、実施例１−(7)と同じ電気泳
動法で、約0.45kbpのSau3AI消化DNA断片を得た。 (8)ハイブリダイゼーションによる確認：得られた約0.4
5kbpのDNA断片は、実施例１−(8)の方法で標識し、目的
細菌である非溶血性ストレプトコッカス sp.の一本鎖DN
Aとのみハイブリッドを形成することをサザン ブロッ
ト ハイブリゼーション法およびコロニーハイブリダイ
ゼーション法（表２）により確認した。
【００２４】
【表２】 (9)塩基配列の決定：確認の済んだ約0.45kbpのDNAクロ
ーン断片の塩基配列を、ファルマシア社のT7DNA Sequen
cing Kitを用いてジデオキシ法で決定した。その結果
は、図２に示した。
ーン断片の塩基配列を、ファルマシア社のT7DNA Sequen
cing Kitを用いてジデオキシ法で決定した。その結果
は、図２に示した。
【００２５】実施例３（エドワジエラ・タルダ種の種決
定 DNA断片の製法） (1)エドワジエラ・タルダ染色体DNAの抽出：エドワジエ
ラ・タルダ Edk−1株を1NB培地100mlで一夜培養し、菌
培養液を得た。該菌培養液を6,000rpmで10分間４℃で遠
心して上澄液を捨て、沈澱菌体に９mlのTE緩衝液を加え
懸濁し、0.5mlの10％SDS溶液および50μlのプロテナー
ゼＫ溶液（20mg／ml:dDW）を加え37℃で１時間反応させ
た。この溶液に5M NaClを1.8ml加え完全に混合し、さら
にCTAB／NaCl溶液を加え混合後、65℃で20分間反応させ
た。反応後、等量のクロロホルム／イソアミルアルコー
ルを加え8,000rpmで10分間４℃で遠心し、上澄を新しい
チューブに移し、等量のフェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコールを加えて8,000rpmで10分間４℃で遠
心した。上澄を新しいチューブに移し、0.6容のイソプ
ロパノールを加え、15分間放置した後、12,000rpmで10
分間４℃で遠心した。この上澄を捨て、70％エタノール
を加えてリンスし、真空乾燥した。乾燥残渣を２mlのTE
緩衝液で溶解した。溶解した乾燥残渣に100μlのエチジ
ウムブロマイドおよび2.6ｇのCsClを加え、100,000rpm
で５時間20℃で遠心した。紫外線照射下で遠心チューブ
にDNAのバンドを確認し、その部分を抜取り、イソプロ
パノールでエチジウムブロマイドを除去した。次に、こ
の溶液を2lのTE緩衝液で一昼夜透析を行ない、CsClを取
除き、染色体DNAを採取した後、トリス・HCL（pH7.5）5
0mMとEDTA1mMを含有する液２mlを加えて４℃で保存し
た。 (2)ベクタープラスミド pUC119 DNAの抽出：実施例１−
(2)と同様にしてベクタープラスミドDNA pUC119を採取
した。 (3)エドワジエラ・タルダ染色体DNAの消化：エドワジエ
ラ・タルダ染色体DNA約１μgをSau3AI緩衝液20μlに溶
かし、Sau3AI約３ユニットを加えて37℃で１時間反応さ
せた。反応後、常法に従ってフェノール処理を１回、ジ
エチルエーテル処理を２回行って反応を止め、Sau3AIに
よるDNAの消化断片液を得た。
定 DNA断片の製法） (1)エドワジエラ・タルダ染色体DNAの抽出：エドワジエ
ラ・タルダ Edk−1株を1NB培地100mlで一夜培養し、菌
培養液を得た。該菌培養液を6,000rpmで10分間４℃で遠
心して上澄液を捨て、沈澱菌体に９mlのTE緩衝液を加え
懸濁し、0.5mlの10％SDS溶液および50μlのプロテナー
ゼＫ溶液（20mg／ml:dDW）を加え37℃で１時間反応させ
た。この溶液に5M NaClを1.8ml加え完全に混合し、さら
にCTAB／NaCl溶液を加え混合後、65℃で20分間反応させ
た。反応後、等量のクロロホルム／イソアミルアルコー
ルを加え8,000rpmで10分間４℃で遠心し、上澄を新しい
チューブに移し、等量のフェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコールを加えて8,000rpmで10分間４℃で遠
心した。上澄を新しいチューブに移し、0.6容のイソプ
ロパノールを加え、15分間放置した後、12,000rpmで10
分間４℃で遠心した。この上澄を捨て、70％エタノール
を加えてリンスし、真空乾燥した。乾燥残渣を２mlのTE
緩衝液で溶解した。溶解した乾燥残渣に100μlのエチジ
ウムブロマイドおよび2.6ｇのCsClを加え、100,000rpm
で５時間20℃で遠心した。紫外線照射下で遠心チューブ
にDNAのバンドを確認し、その部分を抜取り、イソプロ
パノールでエチジウムブロマイドを除去した。次に、こ
の溶液を2lのTE緩衝液で一昼夜透析を行ない、CsClを取
除き、染色体DNAを採取した後、トリス・HCL（pH7.5）5
0mMとEDTA1mMを含有する液２mlを加えて４℃で保存し
た。 (2)ベクタープラスミド pUC119 DNAの抽出：実施例１−
(2)と同様にしてベクタープラスミドDNA pUC119を採取
した。 (3)エドワジエラ・タルダ染色体DNAの消化：エドワジエ
ラ・タルダ染色体DNA約１μgをSau3AI緩衝液20μlに溶
かし、Sau3AI約３ユニットを加えて37℃で１時間反応さ
せた。反応後、常法に従ってフェノール処理を１回、ジ
エチルエーテル処理を２回行って反応を止め、Sau3AIに
よるDNAの消化断片液を得た。
【００２６】(4)ベクタープラスミドDNA pUC119の消
化：実施例１−(4)と同様にしてベクタープラスミド pU
C119の、BamHIによるDNAの消化断片液を得た。 (5)エドワジエラ・タルダDNAのSau3AI消化断片のベクタ
ープラスミド pUC119へのクローニング：エドワジエラ
・タルダ染色体DNAのSau3AI消化断片とベクタープラス
ミドDNA pUC119のBamHI消化断片を混合し、実施例１−
(5)と同様にして、環状のリコンビナントプラスミドDNA
を得た。 (6)エスシェリヒア・コリの形質転換によるリコンビナ
ントプラスミドDNAの複製：連結された環状のリコンビ
ナントDNAを用い、Molecular Clonig記載の方法に従っ
て、エスシェリヒア・コリ MV1184株に形質転換した。
得られた形質転換株をアンピシリン50μg／mlおよびX−
gal 40μg／ml含有2xYT平板に塗抹し、37℃で一晩培養
した。培地上に成育したアンピシリン耐性白色のコロニ
ーを、リコンビナントDNAの複製株として回収した。 (7)エドワジエラ・ タルダDNAの消化断片クローンの選
択：得られた環状のリコンビナントプラスミドDNA複製
株を、アルカリSDS法で抽出し、Sau3AIで消化後、0.8％
アガロースゲルを用いてTBE緩衝液中80mAで１時間電気
泳動を行った。アガロースゲルにおけるDNAバンドの検
出はMolecular Cloning記載の方法で行った。切断DNA断
片の分子サイズは、アガロースゲルにおけるそれらの相
対移動速度をλファージDNAのHind 及びEcoR 消化断
片の移動度と比較して測定し、約0.65kbpのDNA断片を得
た。 (8)ハイブリダイゼーションによる確認：得られた約0.6
5kbpのDNA断片は、ニック・トランスレーション法によ
り32Pで標識し、目的細菌であるエドワジエラ・タルダ
の一本鎖DNAとのみハイブリッドを形成することをサザ
ン ブロットハイブリダイゼーション法およびコロニー
ハイブリダイゼーション法（表３）により確認した。
化：実施例１−(4)と同様にしてベクタープラスミド pU
C119の、BamHIによるDNAの消化断片液を得た。 (5)エドワジエラ・タルダDNAのSau3AI消化断片のベクタ
ープラスミド pUC119へのクローニング：エドワジエラ
・タルダ染色体DNAのSau3AI消化断片とベクタープラス
ミドDNA pUC119のBamHI消化断片を混合し、実施例１−
(5)と同様にして、環状のリコンビナントプラスミドDNA
を得た。 (6)エスシェリヒア・コリの形質転換によるリコンビナ
ントプラスミドDNAの複製：連結された環状のリコンビ
ナントDNAを用い、Molecular Clonig記載の方法に従っ
て、エスシェリヒア・コリ MV1184株に形質転換した。
得られた形質転換株をアンピシリン50μg／mlおよびX−
gal 40μg／ml含有2xYT平板に塗抹し、37℃で一晩培養
した。培地上に成育したアンピシリン耐性白色のコロニ
ーを、リコンビナントDNAの複製株として回収した。 (7)エドワジエラ・ タルダDNAの消化断片クローンの選
択：得られた環状のリコンビナントプラスミドDNA複製
株を、アルカリSDS法で抽出し、Sau3AIで消化後、0.8％
アガロースゲルを用いてTBE緩衝液中80mAで１時間電気
泳動を行った。アガロースゲルにおけるDNAバンドの検
出はMolecular Cloning記載の方法で行った。切断DNA断
片の分子サイズは、アガロースゲルにおけるそれらの相
対移動速度をλファージDNAのHind 及びEcoR 消化断
片の移動度と比較して測定し、約0.65kbpのDNA断片を得
た。 (8)ハイブリダイゼーションによる確認：得られた約0.6
5kbpのDNA断片は、ニック・トランスレーション法によ
り32Pで標識し、目的細菌であるエドワジエラ・タルダ
の一本鎖DNAとのみハイブリッドを形成することをサザ
ン ブロットハイブリダイゼーション法およびコロニー
ハイブリダイゼーション法（表３）により確認した。
【００２７】
【表３】 (9)塩基配列の決定：確認の済んだ約0.65kbpのDNAクロ
ーン断片の塩基配列を、ファルマシア社製のT7 DNA Seq
uenc-ing Kit を用いてジデオキシ法で決定した。その
結果は、 図３に示した。
ーン断片の塩基配列を、ファルマシア社製のT7 DNA Seq
uenc-ing Kit を用いてジデオキシ法で決定した。その
結果は、 図３に示した。
【００２８】実施例４（エロモナス・サルモニシダある
いはエエモナス・ハイドロフィラ感染のコロニーハイブ
リダイゼーションによる診断） 実施例１で得られたエロモナス・サルモニシダあるいは
エロモナス・ハイドロフィラ種を決定する352bpの染色
体DNA断片を、ニックトランスレーション法によりアイ
ソトープ32Pでラベルした。この32Pラベル断片で、野外
から入手した新鮮病魚から菌を分離し、エロモナス・サ
ルモニシダあるいはエロモナス・ハイドロフィラによる
感染であるか否かの診断を行なった。日本各地の養殖場
から、明らかに感染症を疑う疾病の発生が認められた
「あまご」および「こい」の、各魚群の魚の肝臓からHI
A培地に直接釣菌した平板の送付を受けた。このHIA平板
上に成育していたコロニーを無作為に１枚当り３株選
び、実施例１−（８）に記載の方法で当日中にコロニー
ハイブリダイゼーション法による迅速同定を行なった。
なお、細菌の生育が旺盛なため単独コロニーが得られ無
い時は、細菌の生育中心と推定される部分３点を選ん
だ。同様に、初期平板上で単独コロニーが得られる場合
はそのまま、得られない場合はモノセルを反復した後、
バーギース（Bergey’s）マニュアル第８版に従って生
物学的方法でも同定を行なった。但し、生物学的方法で
は文献上当該魚種の疾病と認知されている菌と明らかに
異なる性質の菌であった場合には、雑菌として処理し、
最終同定まで行なわなかった。結果は、表４に示したよ
うに今回用いたエロモナス・サルモニシダあるいはエロ
モナス・ハイドロフィラの種決定一本鎖DNAは、単一コ
ロニーが得られなかった場合でも、該菌が存在した時は
エロモナス・サルモニシダおよびエロモナス・ハイドロ
フィラともにハイブリッドを形成し、診断までに要した
日数は２日であった。一方、生物学的方法では最長７日
を要し、雑菌の繁殖のため診断できないこともあった。
実用上エロモナス・サルモニシダあるいはエロモナス・
ハイドロフィラのいずれであっても、魚類に対する病原
性および宿種特異性は既知で、種を特定しなくとも診断
用としては充分有益である。また、菌の増殖確認後直ち
に診断が可能であったことは、対象魚の早期治療に資す
る意味が大きく、種決定遺伝子DNAのコロニーハイブリ
ダイゼーション法による早期診断の有益性が示唆され
た。
いはエエモナス・ハイドロフィラ感染のコロニーハイブ
リダイゼーションによる診断） 実施例１で得られたエロモナス・サルモニシダあるいは
エロモナス・ハイドロフィラ種を決定する352bpの染色
体DNA断片を、ニックトランスレーション法によりアイ
ソトープ32Pでラベルした。この32Pラベル断片で、野外
から入手した新鮮病魚から菌を分離し、エロモナス・サ
ルモニシダあるいはエロモナス・ハイドロフィラによる
感染であるか否かの診断を行なった。日本各地の養殖場
から、明らかに感染症を疑う疾病の発生が認められた
「あまご」および「こい」の、各魚群の魚の肝臓からHI
A培地に直接釣菌した平板の送付を受けた。このHIA平板
上に成育していたコロニーを無作為に１枚当り３株選
び、実施例１−（８）に記載の方法で当日中にコロニー
ハイブリダイゼーション法による迅速同定を行なった。
なお、細菌の生育が旺盛なため単独コロニーが得られ無
い時は、細菌の生育中心と推定される部分３点を選ん
だ。同様に、初期平板上で単独コロニーが得られる場合
はそのまま、得られない場合はモノセルを反復した後、
バーギース（Bergey’s）マニュアル第８版に従って生
物学的方法でも同定を行なった。但し、生物学的方法で
は文献上当該魚種の疾病と認知されている菌と明らかに
異なる性質の菌であった場合には、雑菌として処理し、
最終同定まで行なわなかった。結果は、表４に示したよ
うに今回用いたエロモナス・サルモニシダあるいはエロ
モナス・ハイドロフィラの種決定一本鎖DNAは、単一コ
ロニーが得られなかった場合でも、該菌が存在した時は
エロモナス・サルモニシダおよびエロモナス・ハイドロ
フィラともにハイブリッドを形成し、診断までに要した
日数は２日であった。一方、生物学的方法では最長７日
を要し、雑菌の繁殖のため診断できないこともあった。
実用上エロモナス・サルモニシダあるいはエロモナス・
ハイドロフィラのいずれであっても、魚類に対する病原
性および宿種特異性は既知で、種を特定しなくとも診断
用としては充分有益である。また、菌の増殖確認後直ち
に診断が可能であったことは、対象魚の早期治療に資す
る意味が大きく、種決定遺伝子DNAのコロニーハイブリ
ダイゼーション法による早期診断の有益性が示唆され
た。
【００２９】
【表４】
【００３０】実施例５（非溶血性ストレプトコッカス s
p.感染症のコロニーハイブリダイゼーションによる診
断） 実施例２で得られた非溶血性ストレプトコッカス sp.の
種を決定する454bpの染色体DNA断片を、ニックトランス
レーション法によりアイソトープ32Pでラベルした。こ
の32Pラベル断片で、野外から入手した新鮮病魚から菌
を分離し、非溶血性ストレプトコッカス sp.による感染
であるか否かの診断を行なった。日本各地の養殖場か
ら、明らかに感染症を疑う疾病の発生が認められた「は
まち」の、各魚群の魚の肝臓から１HIA培地に直接釣菌
した平板の送付を受けた。この１HIA平板上に成育して
いたコロニーを無作為に１枚当り３株選び、実施例４と
同様の方法および基準で、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン法および生物学的方法による同定を行なった。結果
は、表５に示したように今回用いた非溶血性ストレプト
コッカス sp.の種を決定する一本鎖DNAは、単一コロニ
ーが得られなかった場合でも、該菌が存在した時は全て
ハイブリッドを形成し、診断までに要した日数は２日で
あった。一方、生物学的方法では最長６日を要し、雑菌
の繁殖のため診断できないこともあった。この、種決定
一本鎖DNAのコロニーハイブリダイゼーション法による
診断は、菌の増殖確認後直ちに診断が可能であり、精度
も高いため、有益であることが示唆された。
p.感染症のコロニーハイブリダイゼーションによる診
断） 実施例２で得られた非溶血性ストレプトコッカス sp.の
種を決定する454bpの染色体DNA断片を、ニックトランス
レーション法によりアイソトープ32Pでラベルした。こ
の32Pラベル断片で、野外から入手した新鮮病魚から菌
を分離し、非溶血性ストレプトコッカス sp.による感染
であるか否かの診断を行なった。日本各地の養殖場か
ら、明らかに感染症を疑う疾病の発生が認められた「は
まち」の、各魚群の魚の肝臓から１HIA培地に直接釣菌
した平板の送付を受けた。この１HIA平板上に成育して
いたコロニーを無作為に１枚当り３株選び、実施例４と
同様の方法および基準で、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン法および生物学的方法による同定を行なった。結果
は、表５に示したように今回用いた非溶血性ストレプト
コッカス sp.の種を決定する一本鎖DNAは、単一コロニ
ーが得られなかった場合でも、該菌が存在した時は全て
ハイブリッドを形成し、診断までに要した日数は２日で
あった。一方、生物学的方法では最長６日を要し、雑菌
の繁殖のため診断できないこともあった。この、種決定
一本鎖DNAのコロニーハイブリダイゼーション法による
診断は、菌の増殖確認後直ちに診断が可能であり、精度
も高いため、有益であることが示唆された。
【００３１】
【表５】
【００３２】実施例６（エドワジエラ・タルダ感染症の
コロニーハイブリダイゼーションによる診断） 実施例３で得られたエドワジエラ・タルダの種を決定す
る663bpの染色体DNA断片を、ニックトランスレーション
法によりアイソトープ32Pでラベルした。この32Pラベル
断片で、野外から入手した新鮮病魚から菌を分離し、エ
ドワジエラ・タルダによる感染であるか否かの診断を行
なった。日本各地の養殖場から、明らかに感染症を疑う
疾病の発生が認められた「ひらめ」および「うなぎ」
の、各魚群の魚の肝臓から1HIAおよびHIA培地に直接釣
菌した平板の送付を受けた。この1HATおよびHIA平板上
に成育していたコロニーを無作為に１枚当り３株選び、
実施例４と同様の方法および基準で、コロニーハイブリ
ダイゼーション法および生物学的方法による同定を行な
った。結果は、表６に示したように今回用いたエドワジ
エラ・タルダの種を決定する一本鎖DNAは、単一コロニ
ーが得られなかった場合でも、該菌が存在した時は全て
ハイブリッドを形成し、診断までに要した日数は２日で
あった。一方、生物学的方法では最長７日を要し、雑菌
の繁殖のため診断できないこともあった。即ち、実施例
４および５と同様に、種決定遺伝子の一本鎖DNAのコロ
ニーハイブリダイゼーション法による細菌同定の有益性
が示された。
コロニーハイブリダイゼーションによる診断） 実施例３で得られたエドワジエラ・タルダの種を決定す
る663bpの染色体DNA断片を、ニックトランスレーション
法によりアイソトープ32Pでラベルした。この32Pラベル
断片で、野外から入手した新鮮病魚から菌を分離し、エ
ドワジエラ・タルダによる感染であるか否かの診断を行
なった。日本各地の養殖場から、明らかに感染症を疑う
疾病の発生が認められた「ひらめ」および「うなぎ」
の、各魚群の魚の肝臓から1HIAおよびHIA培地に直接釣
菌した平板の送付を受けた。この1HATおよびHIA平板上
に成育していたコロニーを無作為に１枚当り３株選び、
実施例４と同様の方法および基準で、コロニーハイブリ
ダイゼーション法および生物学的方法による同定を行な
った。結果は、表６に示したように今回用いたエドワジ
エラ・タルダの種を決定する一本鎖DNAは、単一コロニ
ーが得られなかった場合でも、該菌が存在した時は全て
ハイブリッドを形成し、診断までに要した日数は２日で
あった。一方、生物学的方法では最長７日を要し、雑菌
の繁殖のため診断できないこともあった。即ち、実施例
４および５と同様に、種決定遺伝子の一本鎖DNAのコロ
ニーハイブリダイゼーション法による細菌同定の有益性
が示された。
【００３３】
【表６】
【００３４】
【図１】 エロモナス・サルモニシダあるいはエロモナ
ス・ハイドロフィラの種決定遺伝子DNAの塩基配列を示
す。
ス・ハイドロフィラの種決定遺伝子DNAの塩基配列を示
す。
【図２】 非溶血性ストレプトコッカス sp.の種決定遺
伝子DNAの塩基配列を示す。
伝子DNAの塩基配列を示す。
【図３】 エドワジエラ・タルダの種決定遺伝子DNAの
塩基配列を示す。
塩基配列を示す。
【図４】 エロモナス・サルモニシダあるいはエロモナ
ス・ハイドロフィラの種決定遺伝子DNA、非溶血性スト
レプトコッカス sp.の種決定遺伝子DNAおよびエドワジ
エラ・タルダの種決定遺伝子DNAのクローニング過程を
れ示す。
ス・ハイドロフィラの種決定遺伝子DNA、非溶血性スト
レプトコッカス sp.の種決定遺伝子DNAおよびエドワジ
エラ・タルダの種決定遺伝子DNAのクローニング過程を
れ示す。
Claims (1)
- 【請求項１】 次のような特徴を有する魚類病原菌エド
ワジエラ・タルダ種の決定遺伝子DNA： (イ)該DNAの塩基配列は図３に示す通りである。 (ロ)該DNAの塩基対数は663bpである。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33348098A JP2991200B2 (ja) | 1998-11-25 | 1998-11-25 | 魚類病原性菌種の決定遺伝子ｄｎａおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33348098A JP2991200B2 (ja) | 1998-11-25 | 1998-11-25 | 魚類病原性菌種の決定遺伝子ｄｎａおよびその用途 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8004490A Division JP2903611B2 (ja) | 1990-03-28 | 1990-03-28 | 魚類病原性菌種の決定遺伝子ｄｎａおよびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11221090A JPH11221090A (ja) | 1999-08-17 |
| JP2991200B2 true JP2991200B2 (ja) | 1999-12-20 |
Family
ID=18266544
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33348098A Expired - Lifetime JP2991200B2 (ja) | 1998-11-25 | 1998-11-25 | 魚類病原性菌種の決定遺伝子ｄｎａおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2991200B2 (ja) |
-
1998
- 1998-11-25 JP JP33348098A patent/JP2991200B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11221090A (ja) | 1999-08-17 |
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