JP2570652B2 - パスツレラ・ピシシーダ種の決定遺伝子ｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は魚類病原菌の種決
定遺伝子ＤＮＡに関するものであり、さらに詳細にはビ
ブリオ・アンギュラルムおよびパスツレラ・ピシシーダ
種の決定遺伝子ＤＮＡおよびそれを含有する該菌種の同
定用試薬に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】魚類病原菌による感染症が養殖場で発生
したとき、その原因菌を究明することは魚病の予防・治
療にとって重要なことである。従来、魚類病原菌を問わ
ず一般細菌の分類、同定はその形態や生化学的性状ある
いは免疫学的手法を用いた生物的性状で行われてきた。
最近、生化学あるいは分子遺伝学の進歩により、その菌
の持つ染色体ＤＮＡやＲＮＡ、菌体物質および菌が生産
する物質を比較することによる、いわゆる化学的性状に
よる分類が行われるようになってきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、生物的
性状あるいは化学的性状による分類法は、最近の分類学
にとっては重要であるが、各々の手法は複雑で時間を費
やすために、病魚の原因菌を簡便かつ迅速に同定するに
は適していない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】生物は種によって形態や
それを構成する成分が異なる。これら種の特徴はその生
物の持つ遺伝子によって規定されている。細菌において
も同様で、種によって生化学的性状が異なる。即ち性状
が異なることはそれを規定する遺伝子も異なる。このよ
うな観点から、この発明者等は養殖場で流行が絶えず、
経済的に損失が大きいビブリオ病および細菌性類結節症
について、それらの原因菌であるビブリオ・アンギュラ
ルム（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）および
パスツレラ・ピシシーダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐ
ｉｓｃｉｃｉｄａ）のみが持つ特定遺伝子ＤＮＡをそれ
ぞれ見出し、さらにこれらの遺伝子ＤＮＡをプローブ
（標識した検出資料）として菌種の未知の魚病の病原菌
のＤＮＡとハイブリダイゼーションすることにより、該
菌がビブリオ・アンギュラルム種またはパスツレラ・ピ
シシーダ種であるか否かを簡易かつ迅速に同定できると
いう新知見を得、この発明を完成した。

【０００５】以下に、ビブリオ・アンギュラルム種の決
定遺伝子ＤＮＡおよびパスツレラ・ピシシーダ種の決定
遺伝子ＤＮＡの一般的な製造法を示す。図４に示すよう
に、ビブリオ病の起因菌、例えばビブリオ・アンギュラ
ルムＰＴ８３４１および細菌性類結節症の起因菌、例え
ばパスツレラ・ピシシーダＫＧ８６０１それぞれの染色
体ＤＮＡを常法、例えばマーマー（Ｍａｒｍｕｒ）法に
より抽出する。ここで用いるビブリオ・アンギュラルム
ＰＴ８３４１およびパスツレラ・ピシシーダＫＧ８６０
１は、工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれ受託
番号微工研菌寄第９６１６号および９６１７号として寄
託されている。得られるＤＮＡをそれぞれ制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩで切断し、得られるＤＮＡ断片のそれぞれに
ついてベクタープラスミドｐＵＣ９にショットガンクロ
ーニングを行う。

【０００６】ここで使用するベクタープラスミドｐＵＣ
９は、例えばＶｉｅｒｉａ Ｊ．，Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ
Ｇｅｎｅ １９，２５９（１９８２）に記載されてい
る公知のプラスミドである。このようにして得られるリ
コンビナントプラスミドをそれぞれ大腸菌Ｋ−１２ＪＭ
１０３株（Ｍｅｓｓｉｎｇ．Ｊ．，Ｒ．Ｃｒｅａ，ａｎ
ｄ Ｐ．Ｈ．Ｓｅｅｂｕｒｇ．１９８１．Ａ ｓｙｓｔ
ｅｍ ｆｏｒ ｓｈｏｔｇｕｎ ＤＮＡ ｓｅｇｕｅｎ
ｃｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
９：３０９参照）に形質転換を行い得られるビブリオ・
アンギュラルムＰＴ８３４１およびパスツレラ・ピシシ
ーダＫＧ８６０１の染色体ＤＮＡ断片を含むリコンビナ
ントプラスミドＤＮＡをアルカリＳＤＳ法により抽出
し、そのＤＮＡをそれぞれＨｉｎｄＩＩＩで切断し、電
気泳動によりこれらのクローン化されたＤＮＡの分子量
を求め、ビブリオ・アンギュラルムＰＴ８３４１につい
ては、アガロースゲル電気泳動法によって測定した分子
量０．６ｋｂｐ付近のクローンを、パスツレラ・ピシシ
ーダＫＧ８６０１については、同様の測定法によって測
定した分子量０．８Ｋｂｐ付近のクローンをそれぞれ選
択し、単離する。

【０００７】このようにして得られるビブリオ・アンギ
ュラルムＰＴ８３４１の分子量０．６Ｋｂｐ付近のＤＮ
Ａ断片をそれぞれプローブとして、これらとビブリオ・
アンギュラルムの染色体ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化断
片とサザンブロットハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を
行い、かつビブリオ・アンギュラルムの増殖したコロニ
ーとコロニーハイブリダイゼーションを行い、ビブリオ
・アンギュラルムとのみハイブリットを形成し、他の細
菌とハイブリッドしないものを集めると、目的とするビ
ブリオ・アンギュラルム種の決定遺伝子ＤＮＡが得られ
る。

【０００８】同様にして、パスツレラ・ピシシーダＫＧ
８６０１の分子量０．８Ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片をそれ
ぞれプローブとして、これらとパスツレラ・ピシシーダ
の染色体ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化断片とサザンブロ
ットハイブリダイゼーションを行い、かつパスツレラ・
ピシシーダの増殖したコロニーとコロニーハイブリダイ
ゼーションを行い、パスツレラ・ピシシーダとのみハイ
ブリッドを形成し、他の細菌とハイブリッドしないもの
を集めると、目的とするパスツレラ・ピシシーダ種の決
定遺伝子ＤＮＡが得られる。

【０００９】このようにして得られるビブリオ・アンギ
ュラルムの種決定遺伝子ＤＮＡは次のような特徴を有す
る。 （イ）該ＤＮＡの制限酵素地図は図１に示す通りであ
る。 （ロ）アガロースゲル電気泳動法により測定した該ＤＮ
Ａの分子量は約０．６Ｋｂｐである。 （ハ）該ＤＮＡの部分塩基配列は図２に示す通りであ
る。 （ニ）該ＤＮＡを、制限酵素ＴａｇＩ、ＲｓａＩ、Ｈｉ
ｎｆＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、Ｅｃｏ
ＲＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、Ｘ
ｈｏＩ、ＡｌｕＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｐａＩＩおよびＨ
ｈａＩのそれぞれを用いて切断を行い、制限サイトを求
めた結果、ＴａｇＩ、ＲｓａＩおよびＨｉｎｆＩのみに
制限サイトが認められた。

【００１０】また、パスツレラ・ピシシーダ種の決定遺
伝子ＤＮＡは次のような特徴を有する。 （イ）該ＤＮＡの制限酵素地図は図３に示す通りであ
る。 （ロ）アガロースゲル電気泳動法により測定した該ＤＮ
Ａの分子量は約０．８Ｋｂｐである。 （ハ）該ＤＮＡを制限酵素、ＴａｇＩ、ＲｓａＩ、Ｈｉ
ｎｆＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ、ＡｌｕＩ、Ｈａｅ
ＩＩＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｐａＩおよびＳ
ａｕ３ＡＩのそれぞれを用いて切断を行い、制限サイト
を求めた結果、ＨｐａＩＩ、ＴａｇＩおよびＲｓａＩの
みに制限サイトが認められた。

【００１１】

【発明の効果】この発明のビブリオ・アンギュラルム種
の決定遺伝子ＤＮＡおよびパスツレラ・ピシシーダ種の
決定遺伝子ＤＮＡは、それぞれビブリオ・アンギュラル
ム種およびパスツレラ・ピシシーダ種を同定するために
有用である。すなわち、適当な標識物で標識したビブリ
オ・アンギュラルム種の決定遺伝子ＤＮＡの一本鎖ＤＮ
Ａ（同様に、適当な標識物で標識したパスツレラ・ピシ
シーダ種の決定遺伝子ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡ）と種未知
の魚の病原菌のＤＮＡの一本鎖とをハイブリダイゼーシ
ョンすることによって、該種未知の魚の病原菌がビブリ
オ・アンギュラルムであるか否か（同様にして、パスツ
レラ・ピシシーダであるか否か）を同定することができ
る。

【００１２】ここで用いられる標識物としては、通常こ
の分野で用いられる標識物をそのまま使用することがで
き、そのような例としては、放射性同位元素、酵素、螢
光性化合物、化学的発光性化合物、化学的発色性化合
物、生物的発光性化合物、生物学的発色性化合物等が挙
げられる。この発明の、標識物で標識されたビブリオ・
アンギュラルム種の決定遺伝子ＤＮＡおよびパスツレラ
・ピシシーダ種の決定遺伝子ＤＮＡはそれぞれの一本鎖
ＤＮＡと各種担体、希釈剤とを含有するビブリオ・アン
ギュラルム種およびパスツレラ・ピシシーダ種の同定用
の試薬として、またこれらの標識された種決定遺伝子Ｄ
ＮＡをそれぞれ含有するキットとして用いることができ
る。

【００１３】

【実施例】次にこの発明を実施例により説明する。な
お、以下の実施例の説明には、下記の略号を使用した。

【００１４】ＨＩＡ：ハートインフュージョン寒天培地 １ＨＩＡ：０．５％食塩加ハートインフュージョン寒天
培地 ２ＨＩＹＡ：１．５％食塩及び０．３％酵母エキス加ハ
ートインフュージョン寒天培地

【００１５】ｄＤＷ：精製水 トリス：ヒドロキシメチル アミノメタン ＤＴＴ：ジチオスレイトール ＡＴＰ：アデノシン−５′−トリホスフェート ＢＳＡ：牛血清アルブミン Ｘ−ｇａｌ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリー
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド ＴＢＥ緩衝液：０．０８９Ｍトリス・硼酸塩、０．０８
９Ｍ−硼酸及び０．００２Ｍ ＥＤＴＡ混液 Ｋｂｐ：キロ塩基対 ２Ｍ−Ｅ：２−メルカプトエタノール ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸 ＳＴＥＰ溶液：０．５％ラウリル硫酸ナトリウム、５０
ｍＭ トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．４Ｍ ＥＤ
ＴＡ 及び１ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫ（メルク社）混
液 ＴＥ：１０ｍＭ トリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍＭ
ＥＤＴＡ 混液 ＴＥフェノール：飽和ＴＥフェノール ２５０ｍｌ クロロホルム ２４０ｍｌ イソアミルアルコール １０ｍｌ キノリノール ７０ｍｌ メタクレゾール ７ｍｌ

【００１６】実施例１（ビブリオ・アンギュラルム種の
決定遺伝子ＤＮＡの製法） （１）ビブリオ・アンギュラルム染色体ＤＮＡの抽出：
ビブリオ・アンギュラルムＰＴ８３４１株を１ＮＢ培地
１００ｍｌで一夜培養し、５×１０⁸ 個／ｍｌの菌培養
液を得た。該菌培養液を６０００ｒｐｍで１０分間遠心
して上澄液を捨て、沈でん菌体にトリス・ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）とＥＤＴＡをそれぞれ５０ｍＭ含有する溶液５
ｍｌを加えた。この菌体を含む溶液を−２０℃で凍結し
た後、０．２５Ｍトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にリゾ
チーム（和光純薬製）１０ｍｇ／ｍｌを溶解した溶液を
０．５ｍｌ加えた。これを室温に放置して解凍した後、
氷冷下で４５分間反応させた。次にＳＴＥＰ溶液を１ｍ
ｌ加え、時々撹拌しながら５０℃で６０分間反応させ
た。反応後、ＴＥフェノール６ｍｌを加えて、６０００
ｒｐｍで１５分間遠心し、上澄液を得た。

【００１７】この上澄液に１０分の１量の３Ｍ酢酸ナト
リウムを入れ、さらに２倍量のエタノールを加え、核酸
混合物を沈殿させた。該沈殿物を細いガラス棒に巻きつ
けるようにして分取し、トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
５０ｍＭとＥＤＴＡ１ｍＭを含有する液５ｍｌに溶解
し、１００μｌのＲＮａｓｅ（シグマ社製）１０ｍｇ／
ｍｌ溶液を加え、４℃で一晩静置した。静置後、等量の
クロロホルムを加えて良く混合した上で、６０００ｒｐ
ｍで１５分間遠心し、上澄液を分取した。これに１０分
の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量のエタノールを加
え混合し、染色体ＤＮＡを沈殿させた。沈殿した染色体
ＤＮＡは細いガラス棒に巻きつけるようにして分取した
後、トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＭとＥＤＴＡ
１ｍＭを含有する液２ｍｌを加えて４℃で保存した。

【００１８】（２）ベクタープラスミドｐＵＣ９ＤＮＡ
の抽出：ベクタープラスミドｐＵＣ９を保持するエスシ
ェリヒア・コリ Ｋ−１２ ＪＭ１０３株をＬＢ培地１
０ｍｌで一晩培養し、アルカリＳＤＳ法（Ｐｌａｓｍｉ
ｄｓ（ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ）−ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ
ａｐｐｒｏａｃｈに記載の方法）に従ってベクタープ
ラスミドｐＵＣ９を採取した。

【００１９】（３）ビブリオ・アンギュラルム染色体Ｄ
ＮＡのＨｉｎｄＩＩＩによる消化：ビブリオ・アンギュ
ラルム染色体ＤＮＡ約１μｇをＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液
［６０ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂］３００μｌに溶かし、
ＨｉｎｄＩＩＩ約４５ユニットを加えて３７℃で１時間
反応させた。反応後、常法に従ってフェノール処理を１
回、ジエチルエーテル処理を２回行って反応を止め、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩによるＤＮＡの消化断片液を得た。

【００２０】（４）ベクタープラスミドＤＮＡ ｐＵＣ
９のＨｉｎｄＩＩＩによる消化：ベクタープラスミドＤ
ＮＡ ｐＵＣ９約０．１μｇをＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液
［前出］に溶かし、ＨｉｎｄＩＩＩ約１ユニットを加え
て３７℃で１時間反応させた。反応後、常法に従ってフ
ェノール処理を１回、ジエチチルエーテル処理を２回行
って反応を止め、ＨｉｎｄＩＩＩによるＤＮＡの消化断
片液を得た。

【００２１】（５）ビブリオ・アンギュラルムＤＮＡの
ＨｉｎｄＩＩＩ消化断片とベクタープラスミドＤＮＡ
ｐＵＣ９へのクローニング：ビブリオ・アンギュラルム
染色体ＤＮＡとベクタープラスミドＤＮＡ ｐＵＣ９を
混合し、２倍量の９９％コールドエタノール（−２０℃
保存）と１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−
７０℃で１５分間静置した。これを１４０００ｒｐｍで
５分間遠心後、アスピレートし、７５％コールドエタノ
ールでリンスした後、乾燥させた。ｄＤｗ １４μｌを
入れライゲーション緩衝液［０．５Ｍ トリス・ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、０．１Ｍ ＭｇＣｌ₂ 、０．１Ｍ Ｄ
ＴＴ、１０ｍＭ スペルミジン、１０ｍＭ ＡＴＰ、１
ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ］４μｌを加え、さらにＴ₄ リガー
ゼ（エスシェリヒア・コリ Ｃ７５ Ｔ₄ リガーゼ）２
μｌを追加し、１５℃で一晩反応させて、環状のリコン
ビナントプラスミドＤＮＡを得た。

【００２２】（６）エスシェリヒア・コリの形質転換に
よるリコンビナントプラスミドＤＮＡの複製：連結され
た環状のリコンビナントＤＮＡを用い、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）記載の方法に従っ
て、エスシェリヒア・コリＫ−１２ＪＭ１０３株に形質
転換した。得られた形質転換株をアンピシリン５０μｇ
／ｍｌ及びＸ−ｇａｌ ４０μｇ／ｍｌ含有ＬＡ平板に
塗抹し、37℃で一晩培養した。培地上に生育したアンピ
シリン耐性白色のコロニーを、リコンビナントＤＮＡの
複製株として回収した。

【００２３】（７）ビブリオ・アンギュラルムＤＮＡの
ＨｉｎｄＩＩＩ消化断片クローンの選択：得られた環状
のリコンビナントプラスミドＤＮＡ複製株を、アルカリ
ＳＤＳ法（前出の方法）で抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩで消
化（前出の方法）後、０．８％アガロースゲルを用いて
ＴＢＥ緩衝液中８０ｍＡで１時間電気泳動を行った。ア
ガロースゲルにおけるＤＮＡバンドの検出はＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）記載の方法で行っ
た。切断ＤＮＡ断片の分子サイズは、アガロースゲルに
おけるそれらの相対移動速度をλファージＤＮＡのＨｉ
ｎｄＩＩＩ消化断片の移動度［Ｌ． Ｈ． Ｒｏｂｉｎ
ｓｏｎ ａｎｄ Ａ．Ｌａｎｄｙ， Ｇｅｎｅ ２（１
９７７）］と比較して測定し、約０．６ｋｂｐのＤＮＡ
断片を得た。電気泳動の結果は、図５に示した。

【００２４】（８）ハイブリダイゼーションによる確
認：得られた約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片は、ニック・
トランスレーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｇ記載の方法）（前出）により³²Ｐで標識し、目的細
菌であるビブリオ・アンギュラルムのＤＮＡとのみハイ
ブリッドを形成することをコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法（第１表）及びサザン・ブロット・ハイブリダイ
ゼーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社 １９８６
年記載の方法）（図７）により確認した。

【００２５】

【表１】

【００２６】（９）制限酵素地図の決定：確認の済んだ
約０．６ｋｂｐのＤＮＡクローン断片の各種制限酵素切
断サイトは、下記第２表に示した種々の制限酵素を用い
てそれぞれに対応する緩衝液中で反応させ、読みとっ
た。即ち、各制限酵素による消化断片物をポリアクリル
アミドゲル電気泳動（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｇ記載の方法）（前出）により、ＤＮＡバンドを分離
し、ポリアクリルゲル平板ゲルにおけるｐＢＲ３２２−
ＨｉｎｆＩの相対移動度によってそれぞれのＤＮＡ断片
の分子サイズを決定した。このようにして求めた、ビブ
リオ・アンギュラルムの種を決定する約０．６ｋｂｐの
ＤＮＡクローン断片の制限酵素地図は図１に示した。そ
れぞれの酵素はニッポンジーン(株)あるいはタカラ酒造
(株)のものを使用した。

【００２７】

【表２】

【００２８】（１０）塩基配列の決定：確認の済んだ約
０．６ｋｂｐのＤＮＡクローン断片の部分塩基配列を、
ニッポンジーン(株)のＭ１３ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ １を用いてジデオキシ法［Ｊ． Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
１０１， ７８（１９８３）］で決定した。その結果
は、図２に示した。

【００２９】実施例２（パスツレラ・ピシシーダ種の決
定ＤＮＡの製法） （１）パスツレラ・ピシシーダ染色体ＤＮＡの抽出：パ
スツレラ・ピシシーダＫＧ８６０１株を２ＮＹＢ培地１
００ｍｌで一夜培養し、５×１０⁸個／ｍｌの菌培養液
を得た。該菌培養液を６０００ｒｐｍで１０分間遠心し
て上澄液を捨て、沈でん菌体にトリス・ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）とＥＤＴＡをそれぞれ５０ｍＭ含有する溶液５
ｍｌを加えた。この菌体を含む溶液を−２０℃で凍結し
た後、０．２５Ｍ トリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にリ
ゾチーム（和光純薬製）１０ｍｇ／ｍｌを溶解した液
０．５ｍｌを加えた。これを室温に放置して解凍した
後、氷冷下で４５分間反応させた。次にＳＴＥＰ溶液を
１ｍｌ加え、時々撹拌しながら５０℃で６０分間反応さ
せた。反応後、ＴＥフェノール６ｍｌを加えて、６００
０ｒｐｍで１５分間遠心し、上澄液を得た。

【００３０】この上澄液に１０分の１量の３Ｍ酢酸ナト
リウムを入れ、さらに２倍量のエタノールを加え、核酸
混合物を沈殿させた。該沈殿物を細いガラス棒に巻きつ
けるようにして分取し、トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
５０ｍＭとＥＤＴＡ １ｍＭを含有する液５ｍｌに溶解
し、１００μｌのＲＮａｓｅ（シグマ社製）１０ｍｇ／
ｍｌ溶液を加え、４℃で一晩静置した。静置後、等量の
クロロホルムを加えて良く混合した上で、６０００ｒｐ
ｍで１５分間遠心し、上澄液を分取した。これに１０分
の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量のエタノールを加
え混合し、染色体ＤＮＡを沈殿させた。沈殿した染色体
ＤＮＡは細いガラス棒に巻きつけるようにして分取した
後、トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＭとＥＤＴＡ
１ｍＭを含有する液２ｍｌを加えて４℃で保存した。

【００３１】（２）ベクタープラスミドｐＵＣ９ＤＮＡ
の抽出：ベクタープラスミドｐＵＣ９を保持するエスシ
ェリヒア・コリ Ｋ−１２ ＪＭ１０３株をＬＢ培地１
０ｍｌで一晩培養し、アルカリＳＤＳ法（前出）に従っ
てベクタープラスミドｐＵＣ９を採取した。 （３）パスツレラ・ピシシーダ染色体ＤＮＡのＨｉｎｄ
ＩＩＩによる消化：パスツレラ・ピシシーダ染色体ＤＮ
Ａ約１μｇをＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液［６０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、７ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ
ＭｇＣｌ₂］３００μｌに溶かし、ＨｉｎｄＩＩＩ約４
５ユニットを加えて３７℃で１時間反応させた。反応
後、常法に従ってフェノール処理を１回、ジエチルエー
テル処理を２回行って反応を止め、ＨｉｎｄＩＩＩによ
るＤＮＡの消化断片液を得た。

【００３２】（４）ベクタープラスミドＤＮＡ ｐＵＣ
９のＨｉｎｄＩＩＩによる消化：ベクタープラスミドＤ
ＮＡ ｐＵＣ９約０．１μｇをＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液
（前出）に溶かし、ＨｉｎｄＩＩＩ約１ユニットを加え
て３７℃で１時間反応させた。反応後、常法に従ってフ
ェノール処理を１回、ジエチルエーテル処理を２回行っ
て反応を止め、ＨｉｎｄＩＩＩによるＤＮＡの消化断片
液を得た。

【００３３】（５）パスツレラ・ピシシーダＤＮＡのＨ
ｉｎｄＩＩＩ消化断片のベクタープラスミド ｐＵＣ９
へのクローニング：パスツレラ・ピシシーダ染色体ＤＮ
ＡとベクタープラスミドＤＮＡ ｐＵＣ９を混合し、２
倍量の９９％コールドエタノール（前出）と１０分の１
量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−７０℃で１５分間静
置した。これを１４０００ｒｐｍで５分間遠心後、アス
ピレートし、７５％コールドエタノール（前出）でリン
スした後、乾燥させた。ｄＤｗ １４μｌを入れライゲ
ーション緩衝液（前出）４μｌを加え、さらにＴ ₄ リガ
ーゼ（前出）２μｌを追加し、１５℃で一晩反応させ
て、環状のリコンビナントプラスミドＤＮＡを得た。

【００３４】（６）エスシェリヒア・コリの形質転換に
よるリコビナントプラスミドＤＮＡの複製：連結された
環状のリコンビナントＤＮＡを用い、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）記載の方法に従って、エス
シェリヒア・コリＫ−１２ＪＭ１０３株に形質転換し
た。得られた形質転換株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ
及びＸ−ｇａｌ ４０μｇ／ｍｌ含有ＬＡ平板に塗抹
し、３７℃で一晩培養した。培地上に生育したアンピシ
リン耐性白色のコロニーを、リコンビナントＤＮＡの複
製株として回収した。

【００３５】（７）パスツレラ・ピシシーダＤＮＡのＨ
ｉｎｄＩＩＩ消化断片クローンの選択：得られた環状の
リコンビナントプラスミドＤＮＡ複製株を、アルカリＳ
ＤＳ法（前出）で抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化（前
出）後、０．８％アガロースゲルを用いてＴＢＥ緩衝液
中８０ｍＡで１時間電気泳動を行った。アガロースゲル
におけるＤＮＡバンドの検出はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ（前出）記載の方法で行った。切断ＤＮＡ
断片の分子サイズは、アガロースゲルにおけるそれらの
相対移動速度をλファージＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＥｃｏＲＩ消化断片の移動度（前出）と比較して測定
し、約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。電気泳動の結
果は、図６に示した。

【００３６】（８）ハイブリダイゼーションによる確
認：得られた約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片は、ニック・
トランスレーション法（前出）により³²Ｐで標識し、目
的細菌であるパスツレラ・ピシシーダのＤＮＡとのみハ
イブリッドを形成することをコロニーハイブリダイゼー
ション法（第３表）及びサザン・ブロット・ハイブリダ
イゼーション法（前出）（図８）により確認した。

【００３７】

【表３】

【００３８】（９）制限酵素地図の決定：確認の済んだ
約０．８ｋｂｐのＤＮＡクローン断片の各種制限酵素切
断サイトは、第４表に示した種々の制限酵素を用い、そ
れぞれに対応する緩衝液中で反応させ、読みとった。即
ち、各制限酵素による消化物をポリアクリルアミドゲル
電気泳動（前出）により、ＤＮＡバンドを分離し、ポリ
アクリルゲル平板ゲルにおけるｐＢＲ３２２−Ｈｉｎｆ
Ｉの相対移動度によってそれぞれのＤＮＡ断片の分子サ
イズを決定した。このようにして求めた、パスツレラ・
ピシシーダの種を決定する約０．８ｋｂｐのＤＮＡクロ
ーン断片の制限酵素地図は図３に示した。それぞれの酵
素はニッポンジーン(株)あるいはタカラ酒造(株)のもの
を使用した。

【００３９】

【表４】

【００４０】実施例３ 実施例１で得られたビブリオ・アンギュラルムの種を決
定する約０．６ｋｂｐの染色体ＤＮＡ断片を、ニックト
ランスレーション法（前出）によりアイソトープ³²Ｐで
ラベルした。この³²ＰラベルＤＮＡ断片でビブリオ・ア
ンギュラルムを感染させたアユの早期疾病診断を試み
た。体重１０ｇのアユ１０尾を５尾ずつの２区に分け、
それぞれ100ｌの水槽に分養した。しばらく水槽で馴致
した後、ビブリオ・アンギュラルムＡ−８３０８１を菌
浴感染させた。流水下（水温１８．５℃）でそのまま放
置し、１区は感染後３日目に生残魚をすべて屠殺し、無
菌的に肝臓から１ＨＩＡ平板上に菌を分離した。２区
は、感染の程度を見るために無処置のまま放置し、斃死
率の観察に供した。

【００４１】１ＨＩＡ平板上に分離した菌を２５℃で一
晩培養後、平板上に生育したコロニーを無作為に１尾当
たり３株選び、実施例１−（８）に記載の方法で当日中
にコロニーハイブリダイゼーション法による迅速同定を
行った。また、確認のために常法に従って生物学的性状
検査による同定も試みた。結果は、第５表に示したよう
に試験した５尾から分離された菌は全て今回用いたプロ
−ブＤＮＡとコロニ−ハイブリダイゼ−ション法により
ハイブリッドを形成し、ビブリオ・アンギュラルムと同
定された。それらの菌は生物学的性状検査の結果におい
ても全てビブラリオ・アンギュラムと同定することがで
きた。さらに、無処置のまま放置したアユは第６表に示
したように感染後８日目に全例斃死し、コロニーハイブ
リダイゼーション法による早期診断の有益性が示唆され
た。

【００４２】

【表５】

【００４３】

【表６】

【００４４】実施例４ 実施例１で得られたビブリオ・アンギュラルムの種を決
定する約０．６ｋｂｐの染色体ＤＮＡ断片を、ニックト
ランスレーション法（前出）によりアイソトープ³²Ｐで
ラベルした。この³²ＰラベルＤＮＡ断片で各種細菌の混
合希釈液中に存在するビブリオ・アンギュラルムの検出
を試みた。養殖ハマチの病原菌である、ビブリオ・アン
ギュラルム、エロモナス・ハイドロヒラ及びストレプト
コッカス・ｓｐをそれぞれ液体培養し、５×１０⁸ 個／
ｍｌの菌液を調整した。これらをそれぞれ、予め用意し
た滅菌生理食塩水の中に、それぞれの菌濃度が約１０⁶
個／ｍｌになるように種々の組合せの混合菌液を作成し
た。用意した菌液について、実施例１−（８）の方法で
コロニーハイブリダイゼーション法によって、ハイブリ
ッド形成の有無を見た。その結果、約０．６ｋｂｐの染
色体ＤＮＡ断片は、第７表に示したようにビブリオ・ア
ンギュラルムの存在しない希釈菌液とはハイブリッドの
形成を起こさなかった。

【００４５】

【表７】

【００４６】実施例５ 実施例２で得られたパスツレラ・ピシシーダの種を決定
する約０．８ｋｂｐの染色体ＤＮＡ断片を、ニックトラ
ンスレーション法（前出）によりアイソトープ ³²Ｐで標
識した。この³²Ｐ標識ＤＮＡ断片で、野外発生した養殖
ハマチの類結節症の早期診断を試みた。数尾の類結節症
状を伴う斃死魚の見られる、１小割り約２０，０００尾
の養殖イカダから、外見上健康なハマチ稚魚１０尾を取
り上げた。これらを無菌的に解剖し、それぞれ腎臓から
２ＨＩＹＡ平板上に釣菌した。４８時間培養後、平板上
に発育した露滴状の微小コロニーを、あるいは雑菌によ
るスワォーミングを起こした平板については、微小コロ
ニーとの重複部と推察される部分を掻き取り、分画され
たニトロセルロースフィルター上にそれぞれ塗抹した。
このニトロセルロースフィルターを使って、実施例２−
（８）の方法で、コロニーハイブリダイゼーションによ
る菌の同定を実施し、従来の方法である、菌のシングル
コロニーアイソレーションを反復して生物学的性状検査
で診断する方法と比較した。結果は、第８表に示したよ
うにコロニーハイブリダイゼーションによる同定では大
部分の健康魚が、最初の培養でパスツレラ・ピシシーダ
の罹患魚であると診断されたのに、従来の方法では雑菌
の混入により診断できないことが多かった。

【００４７】

【表８】

【００４８】実施例６ 実施例２で得られたパスツレラ・ピシシーダの種を決定
する約０．８ｋｂｐの染色体ＤＮＡ断片を、ニックトラ
ンスレーション法（前出）によりアイソトープ ³²Ｐで標
識した。この³²Ｐ標識ＤＮＡ断片で各種細菌の混合希釈
液中に存在するパスツレラ・ピシシーダの検出を試み
た。養殖ハマチの病原菌である、パスツレラ・ピシー
ダ、ビブリオ・アンギュラルム及びストレプトコッカス
・ｓｐをそれぞれ液体培養し、５×１０⁸ 個／ｍｌの菌
液を調整した。これらをそれぞれ、予め用意した滅菌生
理食塩水の中に、それぞれの菌濃度が約１０⁶ 個／ｍｌ
になるように種々の組合せの混合菌液を作成した。用意
した菌液について、実施例２−（８）の方法コロニーハ
イブリダイゼーションによって、ＤＮＡプローブとのハ
イブリッド形成の有無を見た。その結果、この発明の約
０．８ｋｂｐの染色体ＤＮＡ断片は、第９表に示したよ
うにパスツレラ・ピシシーダの存在しない希釈液とはハ
イブリッド形成を起こさなかった。

【００４９】

【表９】

【００５０】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ビブリオ・アンギュラルム種の決定遺伝子Ｄ
ＮＡの制限酵素地図を示す図面である。

【図２】 ビブリオ・アンギュラルム種の決定遺伝子Ｄ
ＮＡの部分塩基配列を示す図面である。

【図３】 パスツレラ・ピシシーダ種の決定遺伝子ＤＮ
Ａの制限酵素地図を示す図面である。

【図４】 ビブリオ・アンギュラルム種の決定遺伝子Ｄ
ＮＡおよびパスツレラ・ピシシータ種の決定遺伝子ＤＮ
Ａのクローニング過程を示す図面である。

【図５】 ビブリオ・アンギュラルムＰＴ８３４１の各
クローニング断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示
す図面である。

【図６】 パスツレラ・ピシシーダＫＧ８６０１の各ク
ローニング断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す
図面である。

【図７】 ビブリオ・アンギュラルム種の決定遺伝子Ｄ
ＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションの結果を
示す図面である。

【図８】 パスツレラ・ピシシーダ種の決定遺伝子ＤＮ
Ａのサザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示
す図面である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次のような特徴を有するパスツレラ・ピ
   シシーダ種の決定遺伝子ＤＮＡ： （イ）該ＤＮＡはパスツレラ・ピシシーダ種由来であっ
   て、その制限酵素地図は下記に示す通りである。 【化１】 （ロ）該ＤＮＡの分子量は約０．８ｋｂｐである。