KR100398558B1 - 박테리아 플라스미드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 도 1 또는 도 4에 도시된 누클레오티드 서열을 갖는 플라스미드 및 DNA 서열 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

박테리아 플라스미드 {BACTERIAL PLASMIDS}

플라스미드는 거의 모든 박테리아 및 몇몇 진핵 생물 그리고 미토콘트리아에 존재하는, 작고 염색체외이며 대부분 환형인 자기 복제 DNA 분자이다. 플라스미드의 크기는 약 1.5 내지 300 kb 사이에서 다양하다.

박테리아 플라스미드는 일반적으로 환형이고 공유 결합하며 수퍼코일 구조이다. 상기 박테리아 플라스미드는 항생 물질 또는 중금속에 대한 내성 유전자, 전형적 기질의 대사를 위한 유전자, 또는 대사 특성 또는 독성 인자와 같은 다수의 종 특이적 특징에 관한 유전자를 갖는다. 몇몇 플라스미드는 하나의 세포에서 또 다른 세포로 전달될 수 있다. 박테리아의 병원성은 현재의 시각에 따르면 부분적으로 플라스미드의 특성에 의해 결정되므로, 플라스미드 DNA 특성을 밝히는 데에 대한 관심이 점점 늘고 있다.

14개의 주요 변종 및 그밖의 6개의 변종이 속해있는 장내세균과에 있어서, 상기 과의 구성원들이 상이한 특성을 발현시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. 전형적인 예는 대장균, 살모넬라 및 클레브시엘라(Klebsiella)이다. 대장균은 박테리아 유전학의 연구를 위한 고전적인 모델이다. 대장균의 다양한 독성 인자를 발견하고 특징화함으로써, 상기 종의 균주들이 인간 및 동물 질병유발에서 차이를 나타내는 것으로 일반적으로 밝혀졌다. 이들 차이는 극단적일 수 있는데, "EHEC"로 알려진 최근 확산되고 있는 변종의 경우에서와 같이 무독성에서 높은 등급의 독성에 이른다. 따라서, 장외 대장균 균주 뿐만 아니라 장내 대장균 균주에 대해 다수의 독성 인자가 공지되었지만, 장내 대장균 균주는 부분적으로 특징화되었다. 혈청 변종 O6:K5 독성 인자, 예를 들어 헤몰리신(haemolycin) 및 P-핌브리얼 어드히션 (P-fimbrial adhesion)은 병원성 대장균과 관련된 것으로 공지되어 있으며, 이러한 혈청 변종의 비병원성 표현체는 전형적으로 이들 독성 인자를 지니고 있지 않다.

독성 유전자는 장내세균에서 일반적으로 큰 플라스미드(약 60 kb)로 발견된다. 또한, 소형의, 소위 크립틱(cryptic) 플라스미드를 갖는 장내세균도 있으며, 상기 플라스미드의 기능을 지금까지 확실히 확정할 수 없었다.

대장균 독성 인자가 적어도 부분적으로 플라스미드의 유전자에도 존재하는 것으로 알려져 있으므로, 예를 들어 장내세균에 의한 감염의 진단적 및 치료적 처리를 향상시키기 위해, 장내세균, 특히 대장균의 플라스미드의 검출 및 특징화에 대한 추가의 데이터가 필요하다. 이러한 플라스미드, 또는 이들의 박테리아 운반체, 또는 상응하는 합성 DNA는 치료학에서 의학적으로 적용되거나 장내세균 감염의 예방에 적용될 수 있을 뿐만 아니라 이러한 감염의 미생물학적 분석 또는 진단에서 영양 생리적 또는 프로바이오틱(probiotic) 목적으로 적용될 수 있다. 또한, 플라스미드, 특히 대장균의 플라스미드는 유전공학에 사용되는 공지된 발현 벡터이므로, 이러한 플라스미드의 특성에 대한 관심을 증가시키고 이를 더 연구하게 한다.

본 발명은 박테리아 플라스미드에 관한 것이다.

도 1은 DSM 6601 균주의 약 3 kb 크기의 pMUT1 플라스미드의 누클레오티드 서열이다.

도 2는 pMUT1 플라스미드의 제한 지도이고, 검정색 띠는 다른 장내세균의 DNA 서열에 대해 발견된 DNA 서열 상동성을 의미하며, 관련된 제한 교점의 위치가 도시된다.

도 3은 오픈 리딩 프레임으로 발견된 2개의 플라스미드 pMUT1(a) 및 pMUT2(b)를 나타낸 도면이다.

도 4는 균주 DSM 6601의 약 5 kb 크기의 플라스미드 pMUT2의 누클레오티드 서열이다.

도 5는 pMUT2 플라스미드의 제한 지도이고, 검정색 띠는 다른 장내세균의 플라스미드의 DNA 서열에 대해 발견된 DNA 서열 상동성을 의미하며, 관련된 제한 교점의 위치가 도시된다.

이를 위해 대장균 균주 DSM 6601을 사용하여 분자유전학적 연구를 수행하였다. 상기 대장균 균주로부터 수득한 DNA 서열을 데이터 뱅크 프로그램으로 조사하고, 다른 박테리아에 이미 존재하는 DNA 서열과 비교하였다.

균주 DSM 6601은 3177 또는 5552bp의 크기를 갖는 2개의 소형 플라스미드를 가지며, 상기 플라스미드는 pMUT1 또는 pMUT2로 각각 표기되었다.

작은 플라스미드 pMUT1의 DNA를, 효소HindⅢ에 의한 절단 후, 선형 단편으로서 벡터 pUC18 내로 서브클로닝시킨 다음 DNA 서열을 결정하였다. 이는 첨부한 도 1에 도시되었다. 이렇게 획득된 DNA 서열을 GenEMBL 데이터뱅크와 상동성 비교에 의해 조사하였다. 상기 비교 결과는 도 2에 도시되었다.

이러한 비교를 위해HindⅢ 교점을 제 1 위치로서 고정시켰다. 200 내지 800bp 위치에서 플라스미드 pMUT1의 DNA는 다른 장내세균 플라스미드의 다양한 복제 개시점(origins of replication), 특히 플라스미드 NTP1, NTP16 및 CloDF13에 대해 현저한 상동성을 나타낸다. 위치 950bp의 영역에서는, 살모넬라 티피무리움으로부터 최초로 분리된 플라스미드 NTP16에 대해 570bp 크기의 상동성이 시작한다. 이러한 상동성은 플라스미드 NTP16의 가동성(mobilizability)에 있어 필수적인 mobA-유전자 및 전달 개시점(origin of transfer(oriT))을 함유한다. 또한, 1790 내지 1920bp 위치에서 parA 및 cer 유전자에 대한 현저한 상동성이 발견되었으며, 이는 세포 분열 도중에 플라스미드 분자의 안정성 및 연속적인 전달과 분배를 위해 중요하다. 나머지 DNA 영역에 대해서는 현저한 상동성이 확인되지 않았다.

또한, 플라스미드 pMUT1의 DNA 서열을 아미노산 서열로 번역하였고 오픈 리딩 프레임의 존재에 대해 분석하였다. 6개의 상이한 리딩 프레임 가능성이 조사되었다. 전체적으로, 143, 62, 56, 49 및 48개 아미노산 크기를 갖는 5개의 오픈 리딩 프레임이 발견될 수 있었다. 상기 분석의 도해적 표현이 도 3에 도시된다.

큰 플라스미드 pMUT2의 DNA를 마찬가지로 제한 효소SphⅠ로 선형화시킨 후 벡터 pUC18 내로 서브클로닝시킨 다음, 완전히 서열화하였다. 상기 DNA 서열은 도 4에 제시된다. 이렇게 얻어진 DNA 서열을 공지된 DNA 서열과의 상동성에 대해 GenEMBL 데이터뱅크 프로그램으로 조사하였다. 그 결과가 도 5에 도해되어 있다. 플라스미드 pMUT2의 DNA는 890 내지 1660bp 위치에서 대장균의 다른 ColE1 플라스미드의 복제 영역에 대해 현저한 상동성을 나타낸다. ColE1 플라스미드에 대한 추가의 현저한 상동성은 3800 내지 4950bp 위치의 영역에서 발견된다. 이 경우는 ColE1 플라스미드의 가동 영역에 대한 상동성에 관한 것이다. 3770 내지 4980bp 위치의 영역에서는 파스퇴렐라-헤몰리티카(Pasteurella haemolytica) 균주 A1의 플라스미드에 대해 상동성이 발견되었다. 상기 플라스미드에는 파스퇴렐라 중의 항미생물 내성 단백질을 엔코딩하는 유전자가 존재한다. 그러나, 상동성이 유전자간 영역에 걸쳐 있으므로, 이는 또한 가능하게는 플라스미드의 가동성에 필요한 서열에 관여한다.

다른 장내세균 플라스미드에 대해 현저한 상동성을 나타내는 2개의 영역이 확인되었다. 이들 상동 영역은 플라스미드의 가동성에 필수적인 복제 개시점 영역 및 mob 영역과 관계가 있다. pMUT2에 있어서는, 나머지 DNA 섹션에 대해 현저한 상동성이 확인될 수 없었다.

그 후, 플라스미드 pMUT2의 DNA 서열을 아미노산 서열로 나타내고 오픈 리딩 프레임의 존재에 대해 분석하였다. 그 결과를 도 3에 도해하였다. 327, 318, 264, 76 및 63개 아미노산 크기 순서의 아미노산 서열의 5개의 오픈 리딩 프레임이 발견되었다.

지금까지 공지된 사실이 없는 플라스미드 pMUT1 및 pMUT2는 단독으로 또는 조합된 형태로도 대장균 균주 또는 다른 장내세균에 존재하는 것으로 알려져 있지않았다.

플라스미드의 발견은 균주 DSM 6601의 대사적 및 의학적 및/또는 영양 생리학적 또는 프로바이오틱 이용 특성과 관련된다.

플라스미드 연구는 장내세균, 특히 에스케리챠(Escherichia) 그룹의 보다 정확한 결정 및 분석을 가능하게 한다. 또한, 상기 플라스미드는 유전공학을 위한 신뢰할 만한 발현 벡터를 제공한다.

실시예 1

플라스미드의 분리

번보임(Birnboim) 등의 문헌(Birnboim, A.C 및 Doly, J(1979) Nucl.Acids Res. 7:1513-1523, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA)에 기재된 방법에 따라 플라스미드 DNA를 분리시켰다.

3 ml LB 배지에 박테리아 콜로니를 접종하고 37℃에서 하룻밤 교반시켰다. 상기 배양물을 에펜도르프(Eppendorf) 용기에서 원심 분리하고, 배지 잔류물을 피펫으로 제거했다. 세포 침강물을 100μl 용액(Ⅰ)(50mM 글루코스; 10mM EDTA, pH 8; 25mM Tris-HCI, pH 8)으로 재현탁시켰다. 실온에서 5분간 인큐베이션시킨 후, 200μl 용액(Ⅱ)(0.2 N NaOH; 1% SDS)을 첨가하고, 맑아질 때까지 혼합하고, 에펜도르프 용기를 얼음상에서 5분 더 정치시켰다. 그 후, 150μl 용액(Ⅲ)(3M 초산나트륨, pH 4.8)을 첨가하고, 염색체 DNA가 양털뭉치모양으로 침전될 때까지 간단히 교반시키고 침강물을 다시 한번 5분간 얼음위에 정치시켰다. 침전된 염색체 DNA 및 세포 잔류물을 원심분리기에서 5분간 펠레트화시키고, 플라스미드 DNA를 함유한 잔류물을 새로운 용기에 옮겼다. 플라스미드 DNA의 정제를 위해, 50μl 페놀 및 150μl 클로로포름/이소아밀 알코올(24:1)을 첨가하고, 간단히 교반시킨 후, 2분간 원심분리시켰다. 액상(phase)을 피펫으로 새로운 용기에 옮겼다. 플라스미드 DNA를 2 부피의 빙냉 에탄올에로 침전시키고, 10분간 원심분리시켰다. 상기 펠레트를 70% 에탄올로 세척하고 스피드백(Speedvac)에서 건조시켰다. 플라스미드 DNA를 20μl H₂O _bidest 에 재현탁시키고 -20℃에서 보관했다.

실시예 2

DNA 서열화

에프 생거(F.Sanger) 등의 문헌[Sanger, F., Nicklen, S. 및 Coulson, A.R.(1977) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74: 5463-5467, DNA sequencing with chain terminating inhibitors]에 기재된 방법에 따라 DNA 서열화를 수행했다.

상기 DNA 서열화는 파마시아(Pharmacia) LKB사의 T7 서열화 키트로 수행하였다.

변성 단계를 위해 8μl(1.5 내지 2μg)의 플라스미드 DNA를 2μl의 2N 수산화나트륨과 혼합하고, 간단히 원심분리하고, 실온에서 10분간 인큐베이션시켰다. DNA를 3μl의 3M 초산나트륨, pH 4.8 뿐만 아니라 7μl의 H₂O _bidest 및 60μl의 빙냉 무수 에탄올로 -70℃에서 15분간 침전시켰다. 침전시킨 DNA를 10분간 원심분리하고, 70%의 에탄올로 세척하고, 건조시켰다.

어니일링(annealing) 반응을 위해, 변성시킨 DNA를 10μl의 H₂O _bidest 에 현탁시키고, 2μl의 어니일링 분말 및 2μl의 프라이머(40ng)와 혼합시켰다. 침강물을 37℃에서 20분간 인큐베이션시켜, 프라이머가 주형 DNA에 결합할 수 있도록 하였다. 반응 침강물을 실온에서 10분간 냉각시킨 다음, 곧바로 표지화 반응에 사용하거나 -20℃에서 동결시켰다. 표지화 반응의 경우, 3μl의 표지화 혼합물, 1μl의 [α-P³²]dATP 및 2μl의 T7 폴리머(T7 폴리머는 효소 희석 분말로 1:5로 희석됨)를 어니일링 반응 혼합물에 피펫팅하고, 간단히 혼합시킨 후, 실온에서 5분간 반응시켰다. 한편, 종결 반응을 위해 미리 준비한 서열화 혼합물 (각각의 용기는 2.5 μl의 'G'-, 'A'-, 'T'- 및 'C'-믹스 "쇼트(short)"를 지님)을 37℃에서 미리 가열시켰다. 표지화 반응을 완료한 후, 이의 4μl를 각각의 4개의 서열 혼합물에 첨가하고, 혼합했다. 상기 종결 반응물을 37℃에서 5분간 인큐베이션시켰다. 종결 반응을 종료시키기 위해, 각각 5μl의 정지 용액을 첨가했다. 상기 침강물을 95℃의 인큐베이터로 옮기고, 2분간 변성시킨 다음, 얼음에 정치시켰다. 각각 2.5μl의 반응물을 서열화 겔 [25.2g의 카바마이드, 22 ml의 H₂O _bidest , 6 ml의 10× TBE, 10 ml의 폴리아크릴아미드(40%), 2 ml의 과황산암모늄(16 mg/ml), 60μl의 TEMED] 상에 'G', 'A', 'T', 'C'의 순서로 스프레딩하였다. 40 와트 및 1500 볼트에서 4.5 시간동안 전기영동시켰다.

Claims (7)

1. 도 1의 DNA 서열 및 그의 대립유전자 변이체를 갖는 플라스미드.
2. 도 4의 DNA 서열 및 그의 대립유전자 변이체를 갖는 플라스미드.
3. 도 1의 누클레오티드 서열을 갖거나, 이 누클레오티드 서열로 구성된 DNA 서열.
4. 도 4의 누클레오티드 서열을 갖거나, 이 누클레오티드 서열로 구성된 DNA 서열.
5. 제 1항 또는 제 2항의 플라스미드 또는 제 3항 또는 제 4항의 DNA 서열을 이용하여 미생물학적 분석 및/또는 진단을 수행하는 방법.
6. 의학적 및/또는 영양 생리학적 또는 프로바이오틱(probiotic) 목적으로 사용되는, 제 1항 또는 제 2항의 플라스미드 또는 제 3항 또는 제 4항의 DNA 서열을 포함하는 조성물.
7. 제 1항 또는 제 2항의 플라스미드 또는 제 3항 또는 제 4항의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.