PL192687B1 - Plazmid i jego zastosowanie oraz sekwencja DNA i jej zastosowanie - Google Patents
Plazmid i jego zastosowanie oraz sekwencja DNA i jej zastosowanieInfo
- Publication number
- PL192687B1 PL192687B1 PL336156A PL33615698A PL192687B1 PL 192687 B1 PL192687 B1 PL 192687B1 PL 336156 A PL336156 A PL 336156A PL 33615698 A PL33615698 A PL 33615698A PL 192687 B1 PL192687 B1 PL 192687B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- plasmids
- bacterial
- dna sequence
- Prior art date
Links
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 5
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 238000012543 microbiological analysis Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 235000012888 dietary physiology Nutrition 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 2
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 2
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 208000034801 Enterobacteriaceae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000909851 Epiphora Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150048063 NTP1 gene Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100492656 Plasmodium berghei (strain Anka) ApiAT8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 208000016747 lacrimal apparatus disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 101150035026 mobA gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Plazmid, znamienny tym, ze ma sekwencj e DNA przedstawion a na fig. 1 i jej odmia- ny alleliczne. PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest plazmid bakteryjny i jego zastosowanie oraz sekwencja DNA i jej zastosowanie.
Plazmidy są małymi, pozachromosomalnymi, najczęściej kolistymi i samodzielnie replikującymi się cząsteczkami DNA, które występują u prawie wszystkich bakterii, jak również pewnych eukariotów oraz w mitochondriach. Wielkość plazmidów oscyluje do 1,5 do 300 kpz.
Plazmidy bakteryjne są w zasadzie koliste, kowalencyjnie zamknięte i superskręcone. Często niosą one geny oporności przeciwko antybiotykom lub metalom ciężkim, geny metabolizmu nietypowych substratów lub geny ustalające charakterystykę rodzajową, takie jak właściwości metaboliczne lub czynniki wirulencji. Pewne plazmidy mogą być przenoszone z jednej komórki do drugiej. Ponieważ patogenność bakterii zgodnie z dzisiejszym poglądem jest warunkowana również przez właściwości plazmidów, zwiększa się zainteresowanie wyjaśnieniem właściwości plazmidowego DNA.
Rodzina Enterobacteriaceae, do której należy 14 głównych rodzajów i 6 dalszych, jest znana z tego, że jej przedstawiciele mogą posiadać różnorakie właściwości. Typowym przykładem są Escherichia, Salmonella i Klebsiella. Escherichia coli (E. coli) jest klasycznym obiektem genetyki bakteryjnej. Dopiero odkrycie i scharakteryzowanie różnych czynników wirulencji z E. coli umożliwiło znalezienie zadowalającego wyjaśnienia faktu, że szczepy tego gatunku należą do skrajnie różnych patogenów ludzkich i zwierzęcych, które wykazują wirulencję od znikomej do wysokiej, jak w przypadku ostatnio rozprzestrzeniających się wariantów określanych jako EHEC.
Opisano wiele czynników wirulencji pochodzących zarówno z pozajelitowych jak i jelitowych szczepów E. coli, których część jest dobrze scharakteryzowana. W przypadku szczepów E. coli należących do grupy serologicznej O6:K5 znaleziono czynniki wirulencji takie jak przykładowo haemolizyna i adhezyna P-fimbrii, które przy utracie patogenności w tej grupie serologicznej nie są spotykane.
Geny wirulencji u enterobakterii znajdują się z reguły na dużych plazmidach (ok. 60 kpz). Istnieją jednak także enterobakterie z małymi, tak zwanymi kryptowymi plazmidami, których funkcja nie została dotychczas dokładnie określona.
Ponieważ wiadomo, że w przypadku czynników wirulencji z E. coli przynajmniej częściowo mamy do czynienia z genami plazmidowymi, rodzi się potrzeba dalszych badań mających na celu znalezienie i scharakteryzowanie plazmidów enterobakterii, a w szczególności Escherichia, aby np.: polepszyć możliwości diagnozowania i terapii w przypadku zachorowań następujących w wyniku infekcji enterobakteryjnych. Plazmidy, względnie ich bakteryjni gospodarze lub odpowiednie syntetyzowane DNA mogą znaleźć zastosowanie w analityce i diagnostyce mikrobiologicznej, zastosowanie medyczne w terapii lub profilaktyce, jak również w zastosowaniach probiotycznych i związanych z fizjologią odżywiania. Ponadto plazmidy, szczególnie takie z E.coli, są znanymi wektorami ekspresyjnymi w inżynierii genetycznej, dzięki czemu powstaje także z tych powodów zainteresowanie do pogłębiania poznania właściwości tego rodzaju plazmidów.
W tym celu przeprowadzono badania genetyczno-molekularne szczepu E.coli DSM 6601. Otrzymane z tego szczepu sekwencje DNA zostały poddane analizie sekwencyjnej za pomocą programów do obsługi baz danych i porównane z będącymi do dyspozycji sekwencjami DNA pochodzącymi z innych bakterii.
Szczep DSM 6601 posiada dwa małe plazmidy o wielkości 3177 pz ewentualnie 5552 pz, które zostały oznaczone jako pMUT1 i pMUT2.
DNA mniejszego plazmidu pMUT1 został po cięciu restrykcyjnym enzymem Hind III subklonowany jako liniowy fragment w wektorze pUC18, a następnie zsekwencjonowany. Zostało to przedstawione na załączonej figurze 1. Uzyskana w ten sposób sekwencja DNA została poddana porównaniom homologii z bazą danych GenEMBL, a wyniki tych porównań zostały zaprezentowane na figurze 2.
W porównaniach tych miejsce cię cia Hind III zostało przyję te jako pozycja 1. Od pozycji 200 do 800 pz DNA plazmidu pMUT1 wykazuje znaczącą homologię z różnymi miejscami startu replikacji (origins of replication) z innych plazmidów enterobakteryjnych, zwłaszcza z plazmidów NTP1, NTP16 i CloDF13. W obszarze od pozycji 950 pz rozpoczyna się region homologiczny z plazmidem NTP16 o wielkości 570 pz, który uprzednio został wyizolowany z Salmonella typhimurium.
Ten region homologiczny obejmuje gen mobA, który jest potrzebny do mobilizacji plazmidu NTP16 mK oraz region oriT (origin of transfer). Ponadto w pozycjach od 1790 pz do 1920 pz odkryto wysoką homologię do genów parA i cer, które mają znaczenie dla stabilności i ciągłości przekazywania i rozmnażania cząsteczek plazmidowych podczas podziałów komórkowych.
PL 192 687 B1
Ponadto z sekwencji DNA plazmidu pMUT1 została odczytana sekwencja aminokwasowa i poddana analizie mają cej na celu znalezienie otwartych ramek odczytu. Analizowano 6 moż liwych ramek odczytu. Odnaleziono w sumie 5 otwartych ramek odczytu o wielkości 143, 62, 56, 49 i 48 aminokwasów.
Graficzna ilustracja tych badań została zaprezentowana na figurze 3.
Obok nieznanych do tej pory plazmidów pMUT1 i pMUT2 odkryto także ich kombinację nie znaną dotychczas z żadnego szczepu E.coli.
Występowanie plazmidów wiąże się prawdopodobnie z użytkowymi właściwościami metabolicznymi i medycznymi i/lub związanymi z fizjologią odżywiania ewentualnie probiotycznością, charakterystycznymi dla szczepu DSM 6601.
Zbadanie plazmidów umożliwiło dokładniejsze określenie i analizę enterobakterii, a w szczególności grupy Escherichia. Ponadto plazmidy te są niewątpliwie użytecznymi wektorami ekspresyjnymi do stosowania w inżynierii genetycznej.
Przedmiotem wynalazku jest plazmid charakteryzujący się tym, że ma sekwencję DNA przedstawioną na fig. 1 i jej odmiany alleliczne.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie plazmidu określonego powyżej w mikrobiologicznej analityce i/lub diagnostyce in vitro.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie plazmidu określonego powyżej jako plazmidu ekspresyjnego.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA charakteryzująca się tym, że ma sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 1.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie sekwencji DNA określonej powyżej w mikrobiologicznej analityce i/lub diagnostyce in vitro.
Poniżej wyjaśniono bliżej wynalazek za pomocą przykładów:
P r z y k ł a d 1
Izolacja plazmidów
Izolacja plazmidowego DNA przebiega w oparciu o sposób wg. Birnboim i wsp. (Birnboim, A.C. i Doly, J. (1979) Nucl.Acids Res. 7:1513-1523 Szybka procedura ekstrakcji alkalicznej sł u żąca do skriningu rekombinowanego DNA plazmidowego).
ml poż ywki LB zaszczepiano jedną kolonią bakteryjną i wytrząsano przez noc przy 37°C.
Hodowla ta była odwirowywana w ependorfówkach, roztwór znad osadu był oddzielany za pomocą pipety. Osad komórkowy roztwarzano ponownie w 100 μΐ roztworu 1 (50 mM glukoza; 10 mm EDTA, pH 8; 25 mM Tris-HCl, pH 8). Po 5 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodawano 200 μl roztworu II (0,2 N NaOH; 1% SDS), mieszano do sklarowania i odstawiano ependorfówki na lód na następne 5 minut. Następnie dodawano 150 μΐ roztworu III (3 M octan sodu, pH 4,8), krótko wstrząsano do wytrącenia DNA chromosomalnego i pozostawiano osad przez kolejne 5 minut na lodzie. Wytrącone chromosomalne DNA i resztki komórkowe oddzielano poprzez 5 minutowe odwirowywanie, a roztwór znad osadu zawierający DNA plazmidowe przenoszono do nowej probówki. W celu oczyszczenia plazmidowego DNA dodawano 50 μl fenolu i 150 μl mieszaniny chloroform / alkohol izoamylowy (24:1) i po krótkim wytrząsaniu odwirowywano przez 2 min. Fazę wodną przepipetowywano do nowych probówek. Plazmidowe DNA wytrącano 2 objętościami lodowatego etanolu i odwirowywano 10 minut. Osad przemywano 70% etanolem i suszono w Speedvac. Plazmidowe DNA rozpuszczano ponownie w 20 μl H2Obidest i przechowywano w -20°C.
P r z y k ł a d 2
Sekwencjonowanie DNA
Izolacja plazmidowego DNA przebiega w oparciu o sposób wg. F. Sanger i wsp. (Sanger, F., Nicklen, S. i Coulson, A. R. (1977) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 Sekwencjonowanie DNA z inhibitorami terminacji łańcucha).
Sekwencjonowanie DNA prowadzono przy użyciu zestawu do sekwencjonowania T7-Sequenzier-Kit oferowanego przez Pharmacia LKB.
W etapie denaturowania mieszano 8 μl (1,5 do 2 μg) plazmidowego DNA z 2 μl 2 N NaOH, krótko odwirowywano i inkubowano 10 minut w temperaturze pokojowej. DNA wytrącano przez 15 minut w -70°C za pomocą 3 μl 3 M octanu sodu, pH 4,8 oraz 7 μl H2Obidest i 60 μl lodowatego etanolu absolutnego. Wytrącone DNA odwirowywano przez 10 min, przemywano 70% etanolem i suszono.
PL 192 687 B1
Przygotowując do reakcji hybrydyzacji starterów mieszano DNA rozpuszczony w 10 μΐ H2Obidest z 2 μl buforu do hybrydyzacji starterów oraz 2 μl starterów (40 ng). Inkubowano 20 minut w 37°C, dzięki czemu mogło dojść do związania się starterów z matrycowym DNA. Mieszaninę reakcyjną schładzano przez 10 minut w temperaturze pokojowej i następnie poddawano bądź to reakcji znakowania bądź mrożono w -20°C. W reakcji znakowania do mieszaniny reakcyjnej po hybrydyzacji starterów dodawano pipetą 3 μΐ Labeling-Mix, 1 μΐ [a-P32]dATP i 2 μΐ polimerazy T7 (polimeraza T7 była rozcieńczana 1:5 przy użyciu buforu do rozcieńczeń enzymu). Podczas tego podgrzewano do 37°C świeżo przygotowane do reakcji terminacji mieszaniny sekwencjonujące (po 1 naczyniu z 2,5 μΐ G'-, A'-, T'- i C'- Mix short). Po zakończeniu reakcji znakowania dodawano po 4 μΐ mieszaniny reakcyjnej do każdej z czterech mieszanin sekwencjonujących i mieszano krótko za pomocą pipety. Reakcyjne mieszaniny terminacyjne inkubowano przez 5 min w 37°C.
W ce^ zakończenia reakcji terminacyjnej dodawano po 5 μΐ roztworu stopującego. Mieszaniny reakcyjne przenoszono następnie do inkubatora o temperaturze 95°C, denaturowano przez 2 minuty i odstawiano na tód. Po 2,5 μΐ mieszanin reakcyjnych nanoszono w kotejności 'G', 'A', 'T', 'C' na żel sekwencyjny [ 25,2 g mocznika, 22 md H2Obidest, 6 md 10 x TBE, 10 md poliakrylamidu (40%), 2 md nadsiarczanu amonu (16 mg/md), 60 μΐ TEMED]. Elektroforezę prowadzono przez 4,5 godz. przy 40 W i 1500 V.
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. Ptezmid, znamienny tym, że ma sekwencję DNA przedstawioną na fig. 1 i jej odmiany aNeNczne.
- 2. Zastosowanie ptazmidu okreśtonego w zastrz. 1 w mikrobiologicznej anaNtyce k^ub diagnostyce in vitro.
- 3. Zastosowanie ptazmidu okreśtonego w zastrz. 1 jako ptezmidu ekspresyjnego.
- 4. Sekwencja DNA, znamienna tym, że ma sekwencję nukteotydową przedstawioną na fig. 1.
- 5. Zastosowanie sekwencji DNA okreśtonej w zastrz. 4 w mikrobiologicznej anaNtyce i^ub diagnostyce in vitro.
- 6. Zastosowanie sekwencji DNA okreśtonej w zastrz. 4 jako ptazmidu ekspresyjnego
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19713543A DE19713543B4 (de) | 1997-04-02 | 1997-04-02 | Bakterielle Plasmide |
| PCT/EP1998/001720 WO1998044134A2 (de) | 1997-04-02 | 1998-04-01 | Bakterielle plasmide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL336156A1 PL336156A1 (en) | 2000-06-05 |
| PL192687B1 true PL192687B1 (pl) | 2006-11-30 |
Family
ID=7825193
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL373720A PL192699B1 (pl) | 1997-04-02 | 1998-04-01 | Plazmid i jego zastosowanie oraz sekwencja DNA i jej zastosowanie |
| PL336156A PL192687B1 (pl) | 1997-04-02 | 1998-04-01 | Plazmid i jego zastosowanie oraz sekwencja DNA i jej zastosowanie |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL373720A PL192699B1 (pl) | 1997-04-02 | 1998-04-01 | Plazmid i jego zastosowanie oraz sekwencja DNA i jej zastosowanie |
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6391631B1 (pl) |
| EP (1) | EP0975774B1 (pl) |
| JP (2) | JP2000514661A (pl) |
| KR (1) | KR100398558B1 (pl) |
| CN (2) | CN1194093C (pl) |
| AR (1) | AR010140A1 (pl) |
| AT (1) | ATE277190T1 (pl) |
| AU (1) | AU739941B2 (pl) |
| BR (1) | BR9808458A (pl) |
| CA (1) | CA2285633C (pl) |
| CO (1) | CO4790114A1 (pl) |
| CZ (2) | CZ294686B6 (pl) |
| DE (2) | DE19713543B4 (pl) |
| DK (1) | DK0975774T3 (pl) |
| DZ (1) | DZ2454A1 (pl) |
| EA (2) | EA003738B1 (pl) |
| EE (1) | EE04944B1 (pl) |
| ES (1) | ES2229492T3 (pl) |
| HK (2) | HK1026233A1 (pl) |
| HU (1) | HU228182B1 (pl) |
| IL (2) | IL132101A0 (pl) |
| NZ (1) | NZ338000A (pl) |
| PE (1) | PE96799A1 (pl) |
| PL (2) | PL192699B1 (pl) |
| PT (1) | PT975774E (pl) |
| SI (1) | SI0975774T1 (pl) |
| SK (2) | SK284928B6 (pl) |
| TR (1) | TR199902434T2 (pl) |
| TW (1) | TW567225B (pl) |
| UA (1) | UA73072C2 (pl) |
| WO (1) | WO1998044134A2 (pl) |
| ZA (1) | ZA982733B (pl) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19751242C2 (de) * | 1997-11-19 | 2001-02-08 | Pharma Zentrale Gmbh | DNA-Sequenzen aus Fimbriengenen von Escherichia coli Stamm DSM 6601 |
| EP1038035A1 (de) * | 1997-11-19 | 2000-09-27 | Pharma-Zentrale Gmbh | VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON $i(ESCHERICHIA COLI) STAMM DSM 6601 |
| DE19915772C2 (de) * | 1998-11-18 | 2001-08-30 | Pharma Zentrale Gmbh | Verfahren zur Identifizierung von Escherichia coli Stamm DSM 6601 |
| DE10155928A1 (de) * | 2001-11-15 | 2003-06-12 | Degussa | recA-negativer und rhaB-negativer Mikroorganismus |
| US7648886B2 (en) * | 2003-01-14 | 2010-01-19 | Globalfoundries Inc. | Shallow trench isolation process |
| DE10328669B4 (de) * | 2003-06-26 | 2005-12-01 | Pharma-Zentrale Gmbh | Plasmidfreier Klon des E. coli Stammes DSM 6601 |
| CN100368549C (zh) * | 2006-03-29 | 2008-02-13 | 北京未名凯拓作物设计中心有限公司 | 一种细菌质粒及其衍生质粒与应用 |
| EP2466678B1 (en) | 2009-08-10 | 2017-11-22 | LG Chem, Ltd. | Lithium secondary battery |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5843882A (en) * | 1995-04-27 | 1998-12-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antiviral proteins and peptides |
| CN1060807C (zh) * | 1995-05-25 | 2001-01-17 | 中国科学院微生物所 | 大肠杆菌中表达外源基因的质粒和牛凝乳酶原的生产方法 |
-
1997
- 1997-04-02 DE DE19713543A patent/DE19713543B4/de not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-01-04 UA UA99105881A patent/UA73072C2/uk unknown
- 1998-03-31 DZ DZ980064A patent/DZ2454A1/xx active
- 1998-04-01 SK SK1338-99A patent/SK284928B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-04-01 CA CA002285633A patent/CA2285633C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-01 HU HU0001857A patent/HU228182B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-04-01 CN CNB988044471A patent/CN1194093C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-01 NZ NZ338000A patent/NZ338000A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-04-01 CN CNB2005100059434A patent/CN100429313C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-01 DK DK98919137T patent/DK0975774T3/da active
- 1998-04-01 DE DE59812000T patent/DE59812000D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-01 SI SI9830713T patent/SI0975774T1/xx unknown
- 1998-04-01 SK SK44-2005A patent/SK284929B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-04-01 PL PL373720A patent/PL192699B1/pl unknown
- 1998-04-01 WO PCT/EP1998/001720 patent/WO1998044134A2/de active IP Right Grant
- 1998-04-01 EP EP98919137A patent/EP0975774B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-01 EA EA200000567A patent/EA003738B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-04-01 PT PT98919137T patent/PT975774E/pt unknown
- 1998-04-01 PL PL336156A patent/PL192687B1/pl unknown
- 1998-04-01 CZ CZ19993482A patent/CZ294686B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-04-01 TR TR1999/02434T patent/TR199902434T2/xx unknown
- 1998-04-01 EA EA199900893A patent/EA003700B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-04-01 AU AU72095/98A patent/AU739941B2/en not_active Ceased
- 1998-04-01 IL IL13210198A patent/IL132101A0/xx active IP Right Grant
- 1998-04-01 CZ CZ2004894A patent/CZ294867B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-04-01 KR KR10-1999-7009001A patent/KR100398558B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-04-01 ES ES98919137T patent/ES2229492T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-01 AT AT98919137T patent/ATE277190T1/de active
- 1998-04-01 BR BR9808458-5A patent/BR9808458A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-04-01 EE EEP199900445A patent/EE04944B1/xx unknown
- 1998-04-01 JP JP10541119A patent/JP2000514661A/ja active Pending
- 1998-04-01 ZA ZA982733A patent/ZA982733B/xx unknown
- 1998-04-02 PE PE1998000241A patent/PE96799A1/es not_active Application Discontinuation
- 1998-04-02 TW TW087105015A patent/TW567225B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-04-02 CO CO98018666A patent/CO4790114A1/es unknown
- 1998-04-02 AR ARP980101500A patent/AR010140A1/es active IP Right Grant
-
1999
- 1999-09-27 IL IL132101A patent/IL132101A/en not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-09-01 HK HK00105484A patent/HK1026233A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-10-02 US US09/676,974 patent/US6391631B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-05-02 JP JP2002130939A patent/JP2003000245A/ja active Pending
-
2006
- 2006-06-07 HK HK06106492.4A patent/HK1086596A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| LeBlanc et al. | Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD (9) determinant from Enterococcus faecalis | |
| Vester et al. | The importance of highly conserved nucleotides in the binding region of chloramphenicol at the peptidyl transfer centre of Escherichia coli 23S ribosomal RNA. | |
| Poolman et al. | Carbohydrate utilization in Streptococcus thermophilus: characterization of the genes for aldose 1-epimerase (mutarotase) and UDPglucose 4-epimerase | |
| JPH11137259A (ja) | 細菌同定のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた細菌の同定方法 | |
| McGovern et al. | H-NS over-expression induces an artificial stationary phase by silencing global transcription | |
| Petersohn et al. | Identification and transcriptional analysis of new members of the σB regulon in Bacillus subtilis | |
| PL192687B1 (pl) | Plazmid i jego zastosowanie oraz sekwencja DNA i jej zastosowanie | |
| Caro et al. | 5 Study of Plasmid Replication in vivo | |
| Hesman et al. | Cloning, characterization, and nucleotide sequence analysis of a Zymomonas mobilis phosphoglucose isomerase gene that is subject to carbon source-dependent regulation | |
| Valdelvira et al. | Acidic pH decreases the endonuclease activity of initiator RepB and increases the stability of the covalent RepB-DNA intermediate while has only a limited effect on the replication of plasmid pMV158 in Lactococcus lactis | |
| Kime et al. | Identifying and characterizing substrates of the RNase E/G family of enzymes | |
| JP2002517260A (ja) | 制限酵素遺伝子発見法 | |
| Dalrymple et al. | Evidence for two genetically distinct DNA primase activities specified by plasmids of the B and I incompatibility groups | |
| JP2903611B2 (ja) | 魚類病原性菌種の決定遺伝子ｄｎａおよびその用途 | |
| Fox et al. | Partial sequence analysis of the 16S-rRNA of Legionellae: taxonomic implications | |
| KR100318089B1 (ko) | 에드와드시엘라타르다16srrna의검출에사용되는프로브와그제작방법 | |
| JP2508133B2 (ja) | ビブリオ・アンギュラルム種の決定遺伝子ｄｎａ | |
| JP2570652B2 (ja) | パスツレラ・ピシシーダ種の決定遺伝子ｄｎａ | |
| Tovkach | Isolation and preliminary characterization of cryptic plasmids from Erwinia carotovora | |
| JP2991200B2 (ja) | 魚類病原性菌種の決定遺伝子ｄｎａおよびその用途 | |
| Swanson | Cloning and expression of the genes encoding bacteriophage T7 & SP6 RNA polymerase | |
| JPH044882A (ja) | ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードするｄｎａ断片 | |
| Anisimova et al. | Effect of Recombinant Protein ttRecA on Specificity, Efficiency and Accuracy of Taq DNA Polymerase in PCR | |
| Sharma | Genetic basis of the activation of the cryptic dct genes in Mesorhizobium loti | |
| Mukherjee et al. | CONTAINING THE ENTIRE BIOTIN GENES OF E. coli K121 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |