TW567225B - Bacterial plasmids pMUT1 and pMUT2 - Google Patents

Description

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本發明係有關於細菌性質體。 質體係小型、染色體外、大部分為環狀且可獨立複製的 DNA分子’其存在於幾乎所有的細菌及一些真核與粒線 體内。質體大小介於約1 · 5至3 0 0 k b間。 一般說來細菌性質體為環狀，以共價鍵閉鎖且為超螺 旋。其經常攜帶對抗抗生素或重金屬之抗藥性基因、使非 典型作用物可代謝之基因或一些種別特異性特徵基因，如 代謝特性或毒力因子。某些質體可由一細胞移轉至另一個 細胞。由於根據目前之觀點，細菌病原性也部份決定於質 體特枉’越來越多人將興趣放在了解明白質體DN A特性。 已知腸細菌科有14種主要變種及6種更多的變種，可發 展出各種不同的特性。典型實例如大腸桿菌 (Escherichia)、沙門桿菌屬（salmonella)及克雷白桿菌屬 (Klebsiella)。大腸桿菌（E.coli)為細菌遺傳學之傳統目 標。唯有於發現並顯示大腸桿菌之不同毒力因子特性時才 有可能發現普遍令人滿意的解釋為什麼這些種類型顯示對 人類及動物病原差異性，其為部份極端且範圍可由無毒性 延展至高度毒力，如近來散佈之變種即“EHEC，，。因此腸 外及腸的大腸桿菌型的一些毒力因子已被詳述之，其中部 份已完美的顯現出。病原性大腸桿菌型、血清變異型 06 : K5毒力因子，如溶血素及h纖毛黏連素已被發現， 這些因子已發現並未出現在無病原性表現之該血清變異型。 一般說來毒力基因見於腸桿菌之大型質體（約6〇 kb)。 腸桿菌也含小型、所謂隱匿質體，其功能迄今仍未確定。 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董) 567225 A7 ______B7 五、發明説明（2 )~^ ~" ~ 以大腸桿菌而論，因已知其毒力因子至少有部份亦顯示 於質體基因，因此需要更進一步研究關於腸桿菌及特別是 大肪样菌中貝骨豆之檢出及特徵描述，以增進如診斷及治療 腸桿菌感染的可能性。其質體或其細菌性載體或相關合成 之DN A可作為醫藥應用於治療或預防及於微生物學分析 或診斷之營養生理或原生物學目的。此外，有些質體，事 實上特別是大腸桿菌的質體，在基因工程中已知為表現載 體，因此基於相同的理由人們有興趣增進對此種質體特性 的知識。 為此目的進行了大腸桿菌DSM 66〇1型之分子基因研 究。利用DNA序列分析資料庫程式之助，檢視所獲得該基 因型之DN A序列，並與已存之其它細菌DN A序列比對。 DSM 660 1型含2個小型質體，大小分別為3177或 5 5 5 2 bp，各稱為 pMUTl 或 PMUT2。 將較小型的質體pMUTl之DNA次-選殖成載體1)1；(：18 的一個直線片段，以酵素欣得（Hind)In限制性融合後， 測定DNA序列。由所附圖丨中可見結果。利用類同比較法 檢視所產生DNA序列及GenEMBL資料庫；比較結果請見 圖2 〇 於此比對中，Hindlll交切點定為位置1，質體pMUT1 自位置200至800 bp的DNA顯示了與其它腸桿菌質體中 不同的複製起始位置（開始複製處）明顯的類同性，特別是 質體NTP1、NTP16及CUDF13。在位置950 bp範圍處 有一 570 bp大小的類同處始於質體NTP16，其最初為由 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 567225 A7 —— —___B7 五、發明説明（3 ) 氣傷寒桿菌（Salmonella Typhimurium)所分離出。此 相同處包含移動A-基因，其為質體NTP16之移動力所必 需，且為轉移體（oriT)之起源。此外，自位置179〇上至 1 920 bp也發現明顯與基因parA及cer類同，這段基因明 顯為相關於細胞分裂時質體分子的穩定性、持續及分佈。 其餘的DNA部份並無發現有明顯的類同。 此外，將質體pMUTl之DNA序列轉錄為胺基酸序列， 並分析有無開放錄讀架構之存在。發現有6種不同錄讀架 構可把性。在共5種大小為143、62、56、49及48之開放 錄讀架構中發現胺基酸。此分析圖表請見圖3。 大型質體PMUT2之DNA經限制酵素Sphl直線化後也同 樣的次-選殖進入載體pUC18，隨後並完成排序。dna序 列係見於圖4。將以此法所獲得〇ΝΑ序列利用 GeneEMBL資料庫程式之助檢視與已知DNa序列類同 處。結果以圖表示於圖5。質體pMUT2iDNA位置89()上 至1660 bp顯現與不同之大腸桿菌colE1質體複製部份明 顯類同。更進一步與c〇1E1質體之明顯類同發現於位置 3 800上至49 5 0 bp部份。在此所指類同為colE1質體之 移動力部份。在位置3 77〇上至498〇 bp區域發現與一溶 血性巴斯德桿菌A 1型之質體類同。此質體中所含基因在 巴斯德桿菌中可編譯為抗抗微生物蛋白質。然而，此類同 延伸至基因間部份，因此也可能與質體之移動力所需序列 有關。 所確定的2個部位顯示與其它腸桿菌性質體重要的同質 -6 -

567225 A7 —______B7 五、發明説明（4 ) 性。由此有關於原始複製部位及移動·部位，此為質體之 移動力所必需。其餘DNA段落並無發現與pMUT2重要同 質性。 同時質體PMUT2之DNA序列隨後被標入成胺基酸序 列’並分析開放錄讀架構之存在。結果同樣以圖表示於圖 3 °發現有5個順序為3 2 7、3 1 8、2 6 4、7 6及6 3個胺基酸 的開放錄讀架構。 除迄今未知質體pMUTl及pMUT2外，其結合體迄今尚 未於大腸桿菌型或其它腸桿菌中發現。 質體的發生可能有關於D S Μ 6 6 0 1型之代謝與醫藥及/ 或營養生理或原生物學可用特性。 質體之研究使腸桿菌，特別是大腸桿菌族，之分析與測 定更精確。而且這些質體本身又可作為基因工程之可靠表 現載體。 本發明現以實例作更進一步解釋： 實例1 : 質體分離。 根據奔博依（B i r n b 〇 i m)等人的方法[奔博依，A · C ·及 多力（Doly)，J_ (1979 年）核酸研究（NuqI. Acids Res.) 7: 1513-1523，一種快速強鹼萃取篩選重組質體DNA的 方法]實行質體DNA之分離。 將細菌菌落接種於3毫升LB -培養基中，並於37 Ό攪拌 過夜。將培養物置於依本朵夫（Eppendorf)管中離心，以 吸1*管移除培養基殘餘物。將細胞沉殿物以1 〇 〇 μ 1溶液 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公爱) 567225 A7 B7 五、發明説明（5 ) I[50 mM 葡萄糖、10 mM EDTA’pH 8、25 mM 翠絲 (Tris)-HCI，pH 8]重新懸浮。於室溫培育5分鐘後，加 入200μ1溶液π(〇·2 N NaOH ; 1%SDS)，混合至澄清且 將依本朵夫管理置於冰上5分鐘。再加入1 5 0 μ 1溶液 ΠΙ(3Μ醋酸鈉，pH 4.8)，短暫攪拌直到染色體DNA沉 澱凝絮，再將該沉澱物置於冰上5分鐘。將沉澱之染色體 DNA及細胞殘餘物於離心機造粒5分鐘，並將含質體DNA 之殘餘物移至新的試管。於質體D N A純化，加入5 0 μ 1驗 及150μ1氯仿/異戊醇（24 ·· 1)且於短暫攪拌後離心2分 鐘。將液相以吸量管吸至另一新試管。質體DN Α以2倍量 冰冷乙醇沉殿且離心1 〇分鐘。將成粒以7 0 %乙醇洗滌，並 於斯譬德維克（Speedvac)中乾燥。將質體DNA重新懸浮 於20μ1 H2Obidest，保存於一20〇C。 實例2 D N A排序 根據F.山葛（Sanger)等人的方法[山葛，F.，尼可廉 (Nicklen)，S·及庫森（Coulson)，A.R.( 1 977 年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463 -5467 以鏈終結抑制 劑進行DNA排序]進行DNA排序。 利用LKB醫藥公司（Pharmacia LKB)之T7-排序組合 進行DNA排序。 於變性步驟中，將8μ1(1·5至2pg)質體DNA與2μ1 2N N a Ο Η混合，短暫離心且於室溫培育1 〇分鐘。以3 μ 1 3 Μ 醋酸鈉（pH 4·8)、7μ1 H2Obidest及6 0μ1冰冷乙醇 absolute -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 發明説明 〜70 C將DN A沉澱1 5分鐘。將沉澱DNA離心1 〇分鐘，以 7 〇 %乙醇洗滌並乾燥。 於融合反應中，將變性DNA懸浮於1〇μ1 H20bidest與2μ1 融合粉末及2μ1引子（4 0ng)混合。將沉澱物於3 7°C培育 2 0分鐘，使引子與模板DN A結合。反應沉澱物於室溫冷 部10分鐘後，立即用於標示反應或冰凍於-2〇 。於標示 反應中，將3μ1標示混合物，1μΐ [a_p32]dATP及2μ1 Τ7_聚合物（將Τ7-聚合物以酵素稀釋粉末稀釋1 : 5)以吸 量管吸至融合反應沉澱物，短暫混合後於室溫培育5分 鐘。同時將為終止反應已準備好之排序混合物[每1試管含 2.5μ1 ‘G-，、‘Α，-、— 3 7 C預熱。完成標示反應後，每4 μ 1加入四種排序混合 物，以吸量管短暫地混合。讓終止反應於3 7艽培育5分 鐘。個別加入5 μΐ停止溶液以結束終止反應。將沉澱物移 入95 °C保溫箱，變性2分鐘後置於冰上。每2.5 μ1反應物 散佈於排序凝膠上[25.2克尿素、22亳升112〇151(^、6毫升 l〇x ΤΒΕ、10毫升聚丙烯醯胺（40%)、2亳升過硫酸銨 (16 毫克 / 毫升）、60μ1 TEMED]以6G，…A，，个，.c， 序列排列。以40瓦特及1 500伏特4.5小時進行電泳。 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 567225 A7 B7 五、發明説明（7 ) 圖式簡單說明 圖1 :約3kb大小的DSM 660 1型質體？^11111之核酸序列 圖式。 圖2 :質體pMUTl之限制圖式。黑色塊表發現與其它腸桿菌質 DNA序列同質處。相關限制相交位置也被標出。 圖3 :由開放錄讀架構中發現的2組質體（a) pMUTl及(b) pMUT2之圖示。 圖4 :約5kb大小的DSM 660 1型質體pMUT2之核酸序列 圖式。 圖5 :質體pMUT2之限制圖式。黑色塊表發現與其它腸桿菌質 DNA序列同質處。相關限制相交位置也被標出。 -10- 本紙張尺度適用中國國家襟準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

Claims (1)

1. 567225 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 TCCC^GTAAGATTTTCCGCTTCAAAGCGTGTCTGTATGCTGTTCTGGAGTTCTTCTGCGA 901 .........+.......................................夕.........+ 9 = 0 内、，，，广、λ，一 m·^ ^ λ ^ ^ , % Q · •，-· · …A^J i : - W 二 J 分·β‘ 二 : i S51 .............................—.............................. 1：：C CGAGCAGCGTCAGGCTCTGACTTTTTATGAATCCCGCCATGTTGAGTACGGCTTGCTGCT 1021 .........+.........+.........+.........+.........>.........— 10 3 0 · · ·' i · H· A l w · · · *‘丄：sJ· · — ‘νΛ 二 V· i J j · Nj I VJM · · ·、· ·' · y .J 108 1 .............................-.............................. IL-iC CGTACCACTTTTCGACTGTTTTGCTGCCGCTATTCrcCCGCTTGGCTmTGACGGGCAT 1141 .........♦.........♦.......................................♦ 1200 TTCTGTCAGACAACACTGTCACTGCCAAAAAACTGCCGTGCCTTTGTCGGTAATTCGAGC 1201 .........+.........♦.............................♦.........♦ 1260 TTGCTGACAGGACAGGATGTGCAAITGTTATACCGCGCATACATGCACGCTATTACAATT 1261.........+.........+.........+ -........+.........+.........♦ 1320 裝 GCCCTGGTCAGGCTTTGCCCCGACACCCATGTCAGATACGGAGCCATGTTTTATGACAAA 1321 .........+.........十.........+......... +.........+ 1380 ACGAAGTGGAAGTAATACGCGCAGGCGGGCTATCAGTCGCCCTGTTCGTCTGACGGCAGA 13 81.........+.........+........- +.......-· +.........+.........+ 1440 AGAAGACCAGGAAATCAGAAAAAGGGCTGCTGAATGCGGCAAGACCGTTTCCGGTTTTTT 1441 .........+.........+.........+.........+.........+.........+ 1500 TCGC-3C3GCAGC 丁 CTCGGTAAGAAAGTTJ^CTCACTGACTGATGA 了 CSGGTACTGAAAGA 1501.........+... +..... +......... +.........+ 1560 AGT7ATGAGACTGGGGGCGTTACAGAAA.^AACTCTTTATCGACGGCAAGCGTGTCGGGGA 1561.........十.........+.........+...... +.........+ 1620 CAGGGAGTATGCGGAGGTGCTGATCGCTATTACGGAGTATCACCGTGCCCTGTTATCCAG 1621 + - + + 1〇 3 0 GCTTATGGCAGATTAGCTTCCCGGAGAGAAAACTGTCGAAAACTGACGGTATGAACACCG 1631 -.......- +.........+--------- + -----+---------+---------+ 1740 TAAGCTCCCAAAGTGATCACCATTCGCTTTCATGCATAGCTATGCAGCGAGCTGAAACGA 1741 .........+ --......- +.........+---------+---------+---------+ 1300 TCCTGACGCATCCTTCCTGTTTTTCCGGGGTAAAACATCTCTTTTTGCGGTGTCTCGCGT 1301---------+---------+ ---------+---------+---------+---------十 1860 CAGAATCGCGTTCAGCGCGTTTCAGTGGTGCGTACAATTAAGGGATTATGGTAAATATAT 1861---------+---------+---------十---------+---------+---------+ 1320 • ·. . ·. ·Λ · ...V *广.·· . · GAGCT^TGCGATAACTTTAACTGTGAAGCGATGAACCCATTACAGGCAAAGCCAATTACT 1921---------+·-------------------------- --------------------- 198 0 -2 - 吝纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 567225 8 8 8 8 A BCD 「、申請專利範圍 CCTC-ACAGTGGTTTAGCCAGAAGCAGGGCTACCAAGACCAATGCAATAAGTAATATATCG ^931 - -------------------------------------------------------------+ 2040 TTTTGCTATCGTGCCATCCGTCGCGCTCAGTTCCATTGTGCTTTTTTAAGCTGTCGTTTT 2041 ---------+---------+---------十---------+ -：--------+---------+ 2100 TCTTACGGTATATACCGGTTTTTTATGGCGTGGTTTCTTAACTTGTTCAGCTACTGATGG 2χ〇ι--------------------1--------------------+---------+---------- 216 0 ACCC：-.?3TATCTAGGrAGTC^.CTA3CTTTGTTAGATC.-.r.---.-^TATTGCGACCACCATA 2^52. --------- -r - - - —---------— - -- -- — - — - — -r — — - 二 220 TCGGCGATCACTCTTCGATGTTGGTTTCTTGTCCAAGAGATTAGCTTTTTCAAGATCATT 2221 ...........................................................二30 GATAGCTCTCTGAACAGTCCGTACAGA^^CCCCCATACGTATGGCTAGACTTTCCATTGA 223： ...........................................................，：343 CGGATGCGGCCACTCTTGCAAACTCCACCAGTGAACGATCAGGTTAAGTAGTGTGTTAAA 2 3 41 — - -- ---->--------->---------*---------- -- - - -----^---------十 2400 GGCCACTGAAGTTAGCTTnTCTCGTnTGTATAAAAAACAATACGGTAGGCACTGCTGT 2401 .........+.........+ -..................+.........♦---------> 2460 CCAGCCAAGAGACAAACCGCCAGCTTTCCATTTATTCTTAACGGAGTAAGTCATTGATTT 2461 .........♦•讀.......+.........+---------+-------------------+ 2520 TCCTAAGCCCCAAAATATTTAAAGTATATATTATATGTATATTCATATGAATAGGGTGAC 2521 .........+.......-- +.................+.........+.........十 2530 ACTGGCGCCATTATTGTGCAACCAAAAAAGACTACTCTGAAAACGAGGAAAAGATTTTTT 2581 .........+ --.......+.........十.........+.........+---------+ 2640 CCTGCCTGAATTAGATACGGAGTTAGCGATATGAAAACCGAACAACGTCATGATCTTGTr 2S41 .........+.........+.........+.........+.........+.........+ 2700 AAAGATATTGAGGTTTTTGGCGTATCCTTGTCTCTGTTGATTTCCAGAGCGAATGAG^G 2701 .........+.........-r........-十.........十.........-h.........十 27SC TCTGTTACAATGCCATCTGGTCTAAGTCGGGAGCAGAGAAGAGCATGGGCAGCGGAGCAG 2761 . +---------十---------+..... +.........+---------+ 2S20 GCGCGCAAAATCCACAATTGAATATTGTCTCATTCTCTGAGACCTTCAACCTTTATTACA 232X 2S80 CATCCAGATATTCTGOSAAAACACTCGATAAAATCGATGATTTCATTGAGCATTTrGAAA 2 8 81 ---------+---------+---------+---------+----------κ---------+ 2 940 .^TACAATCTCTTTGGCGATCCTTTAAAAGGATATCCAGCTTGGACTGGCAAAGTATCGC 2941 ---------+---------+---------+---------h----------+---------+ 3 000 CATCGTGGAAAGTGCCTGATCATTACGAAAACAAAGAAGCTATTGAGAAGTATGCTAGAG 3〇〇l---------+---------十----+ + 3060 -3- 本紙裱尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公董) 567225 8 8 8 8 A B c D 、申請專利範園 CTAACAAATTATGGC^TGCTCATTTAGGCGATCCGGTTTTTAAAGATACGTrTCATGGGA .3061 rT......- + ——+.....….......+ ·…一3120. AATACAAGGTTTCTGACTGGGTTATTCATTTCCAGCGGCTGACACCGAACCATAT^A 3121 .........+.........^.........今.........+................. 3177 Ο 2. —種DNA序列，其具有如下所示核甞酸序列， Sphl ATCTCTAGAGTCGACCTOCAGGCATGCTCAAGGCCTGACAACCCTGTCG'rrrTTCGCCAA 1 -·--，-···♦·· ·-·-♦-···-··-♦-·····-··+-···.····十一···，···♦ 60 * CTCCTGCGAGGTAACCrCGAACATGCGCTGTAAGTrGGCGTAGCrGTCCTGCCACGCTr 61 120 GCTGCTGTTGTTCGTAGTGCCrCTGTAAGCTCrCTAATGCGCTCAGAAGCTGCTGCTCCA 121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180 TTTCGGTCATGAATCTCTTCACCCTGATAGATAAAACCGCCCAGAATCGATTCTGTGGCG 131 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240 TCTGATGAGGTTATTTGGCGCTGTACTTGATGACCTGACGATGTTGAGCGTTCTTGTACT 241.........+.........+.........+..... ♦---------十---------+ 300 CGTCGATCTTCTTCGCCCCCTGCGGAAGGATCAGGTAATACACGCTCTTGTTCTTGGAAT 301 .........+.........+.........+.........+.........+.........+ 35C CGTGAATTATCGATACGCCGGCTCCGGTCTGGCTCTTTAAGTCCTGCAGGATCTGGCTCT 2€1 .......·- +.........+.........+.........♦.........+.........+ 420 GCTCGCTGATTTCGTTCTGGCGTTCGACCACGATAGTCCCGAGATACCAAGCTACTCCAA 421---------+---------+---------十---------+---------+---------+ 430 TCAATATCGCAAACAGGATCCCACTTAATGCCAGGCTGTACAGCCATGTCATTCCGACTA 431---------+--- 十---------+---------+---------+---------+ 540 AGCGGTGTATCTGTTTrAGCrGGCTGTCGTTCTCTrCTTGGATAGCGGTCTGTATGTTCC 541 $00 C 了 GAGCTTAATTTCAAGGCCTCGGTGATACGTTrCTCGTGCTTCrCGaAATGCGTTCGCG 601------ +---------十---------+---------+----------h---------+ €60 ACGCTCGTTGCGGTAGTCTTGGCTTGCTG. CTTCGATrTGCTCTCGAACTCCCGCGCTAA SSI -------------------+---------十---------+---------+---------+ 720 ATTTAAAATCTCGCTCATA(^GC^CTCCTrrrAAGCGAATArrCGGGCCACCTGCCGGAT • 721------- -.-1--------------·-----少二----+ ----.---+ ···>--:.---+ 780-.. C.-.GC.-ATACTGATACTGGATTTGGTTTCCCGTACGACCGACAATCCGGCATCGGTAAGGT 73 二--------- +---------， ------+ ---------十---------------------+ 840 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 567225 8 8 8 8 ABCD 六、申請專利範圍 GGC-.-.-^rCACCCCTTTACGATCCGTAATTTCTCCCTGCTCAATC^AGCTGATTAGCCCTT 3 41 ---------十---------中---------+---— ----+---------+---------+ .900 TGGTAATGGCTrCCGCTGCCTGCTGTTrGTTGCGAGGAAGGTCATTAGAGGGGGTTAATG 901 ---------十---------+--------- +---------+---------η----------- 950 CTCGGCGATTAGCAGGGTCATTCGGGTCGCGTAACCCAAGCCGGTCATTGGTGAGGGTTT 961 .........♦...............：..............+-------------------+ 1020 3CCATGCGTTA.^CACGAGGCCGGTCAGCCCGATCAAAGTAAGGTTGTAGCCGTTTTCCGC 1021 -------------------+---------^---------+-------------------+ 1080 rCTC-C^TTCGATGTTCGGGAT.^ACAAAATTC.^TTC.^AGACGCCCTTTGTCCTGATGTT 10 81 - - - - I.40 GAACCCAGAGGCAGGCATACTGGTCTTTATCTAGACCGGTCATCAATGTCTGCTCCCATT 1141 .........♦.........+.............................♦.......... 1200 CATCCATCAATCGCTGCmTCGCCTTCGOGTAAATCACTCTCCTGAAAAGAGAGCACGC 1201 .........+.........♦.............................♦.........♦ 1260 CAGAGGTATAAGTTCGGGCAAATTCGCAG. CATCAATCAGCTCTTTGACGTGCrCAGGGT 1261 .........+.........♦...................十.........♦.........+ 1320 TACCCCGTAACACCGTCGCTTGTTCGCGCTGACGATCAGGGCCCAGAAGGTAATCGACAG 1321 .........+ -........+---------+.......-- +.........+.........+ 1380 GACCACTCCCGCCACCGGCACCACGACCATGAATCCTTAACGATCACGATGTTGCTCCAG 1381 .........+........- +.........+........- +---------+.......... 1440 C AG t： 7CGGCAAGATG C： TGGTCAATGCTATTGAGCACCGCTAACAACGACACCCGTTCTTG 1441.........十.........+.........+ -........+........- +.........+ 1500 CGGCGGTAAGCCATGCTGATTCAAGTAACGGGCTATTTGATTGAGGTTATTACCGATCCC 1501 .........+ --.....-- +.........+.........+.........+.........+ 1560 GCTGACCTGACGTAACAAGGTCGGGTCTACGGTaAGGCTAGCGGACGACGcCCGAGCTGT 1561 .........+.........+.........+.........十.........+.........+ 1620 ACGCGATTCGCCTAAGCCAACGGCTCGTAACCACTCGGCCAAATGCTTACGGTCACAGCG 1.62X 1 o30 TTCAAGTAGCCGCTGATGCTCCGCTTCGGTGAGTCTGAnTTGATCTCTrTGGTGCGCTT 1681.........+......—- +.........+ - —......+...........+.........+ 1740 TTCCATGAGAATCCGCTGAGAAAGTTTCGCACCCAAAGTGCGAATnTCGCAGTGGATGC 1*7 41 -........+---------+---------十---------+---------+---------+ 1800 A-^GGGGTTTCGGGGGGCGGCGAGCCCCCTGAAACAGTCACAGACGGCACCTCGAAGAgGG 18 01 ---------+ ---------+---------+---------+---------+---------+ 1860 GACGCTGTGTGTACTgrCTTAGTACAGCATCTATCGTACATCGAGGTCGCATCACGCACA 1861.........+---------+.........+---------♦---------+---------+ 1320 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 567225 8 8 8 8 ABCD 六、申請專利範圍 AACAAA^GCCCCGCAAAAGCAG(»CTGTTATCTGATATAGGTTGTlXrGTCrCACACGG·. 1321......... ..........+.................4..........+.........4. 1980 CAGC3GAAGAGGAATCCGAAGTGGTACTGGTAGTAGTArTGGATGCTGCTGACGATATTT 1331...................十.............................+.........+ 2040 TCCGCTTTGACCCAAGGCTTAAATAATCAATGCCTGTAATCAACGATCTCA-^TACGCCTT 2041 ...................+.........+...................+.........+ 2100 CGGATACCATAGCGATAAACGTATCTTGCTGGITATGGCTrGCGATGCAAATCGTAGCAT 2101 + + + - + 2X60 CACC7TTTTTATACTTTAAAACACCTGCTA.2U7ATCCATTTTCATCTAGAACACTCTTA.^ :161.........，...................-.............................. 2220 GATGTTCATTTGTTATTGTTTGTAGCGTTTGCTrTGTrrCGCTTCGAGCATACGCCTrAG 2221 .........+.........+.........+.........*.........+.........+ 2230 CTA3CTTCCGAGAAA.^AGCATCCGCATCATGACTATCTTT.\TTTAC7CGCTCAATAAATT ：281 ...........................................................♦ 2340 TGCTTAAGTCAACAAATCCCTTAAAACGAGTGGACATATTGTTAACAAAATCAGTGGCAG 2341 .................... ........................................ 2400 CATTTTTTATCCATGCnTATAGCCAAAAAAACGCTCGAAAACATTTTGGTCGTAGATAA 2401 ---------+.........+.............................+.........♦ 2460 ATACCGTATCGCCAGCAAAAACAAGAGATGCCTTACCATCAATAGAAATCATATCnTGAT 2461 ...................+.........+...................+.........+ 2520 CTACTCGAGATAGTTCTTmTGCTAAACCCATAAAAATTATTTTTCTTTCrrGATAAGT 2521 .........+.........+.........+.........+.........+.........+ 2580 TTTGAACTGGATATTGCTTCTTGTATATGGTTATACAATTGTCGTCATTATTCTTACTCA 2581 .........+.........+.........♦.........+ -........+.........+ 2640 AAACGAAAATGATTGAGTCAACTTTTGATATTAGATCCACACTGTCAAAATCAACAATTG 2641 .........+.........+.........+---------+---------+---------+ 2700 GGATATTTTCATTGCCATCACCACCAAACCCAGCATCAAACACAATGCCAGTCAG^JivACT 2701 .........+.........+.........+...................+.........+ 27€ ： TCATTTGCTCATTATCATACTGCTCAGCATCATTTAAAAATGAAATGGTGTTGGTGCGGT 2761 ...................-r---------+........+.........+.........+ 2320 CACTTAGTGTATTAACATCTGATACTATCACAACCCGATTTTCTAAATCAGATATAGTTT 2321 2380 TCTTTATCACATTATCAATAATGGACTGTTTrAGCTCACrGTCATTTTTAAGGATGGCAA 2881 -------------------+ --,-------♦.---------+---------+---------+ 2940 I TTTTATAGCTAAAAGAGTCCTTAGCACCCGCTTTACCTTTArrTTTAAAGTTAAAGTAAG j 2941 -.......-+.........+.........+---------+---------+---------+ 3000 -6 - 太紙張尺度適闱中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董) 567225 A8 B8 C8 _ D8 六、申請專利範圍 TGTGCAATGTAACATCGTTAATATCACAATCAAAATGCTTATACAGTrCTAAAAGCTCTT 3001...................+.........+---------+---------+---------+ 3060 GTGCTTTTtCTTCATTATGCTCC\AAGCATCAAGATCTtAAGGCATCGTCACrCATCATC 3061--------- +---------+---------+---------+---------+ 3120 . . .· ·.、 . . ’ · ATTCCTCTATGATTTITTtCGCGAACGTTAAATAaTCATCATGATTTATAaCTCTGATAA 3121......... +.........+.........+.........+.........+ 319C a.^tcattttcttttattaaatctttagataaaactatcaaactcaccgtcttgcgtttxt 3131 .........—.........♦...................τ.........+........... 3 24 0 C C CCTTCCATTAGCTACCACACTGTAAGTAATCTTATAGGCAGAAACATTAAATAATGAC 3241 .........+.........4-......--- +.........+.........+.........+ 3300 AATGTTGGGTTGCAGTGAATTCTTTTTGTTITGATGTGCAAAAAACCGACGATAATCAAA 3301 .........+.........+.........+.........+.........+.........+ 3360 ACX^CAA.^AAATTAACTATATTTGATGGTTTGCTTX^ATCAGT.-.^GACCAACGGCATT 3 3 61 — - —---- +--------->--------- + ------4» - - -------+---------十 34 二 ΰ ATGTACGTTGATAAAAAAGAAAGATACTCACCGGATTCTTTTTTACATGAAACGACCTTT 3421 ..................十-----------------+.........+ -........+ 3ή 3 C A.^CT.TTCTTGACACCGCACCGGAGTCTAAGTTTTTCAAAACCCATCGATACCAAATGTAT 3431 -----------------------------------------------*---------- 3 54 0 GTATAAGAACAAGTTAAAATCAAAGCCCcGCAGATCACTGACCrCAATACAGAAAATGTT 3 541 ...................♦--------------------------♦.........♦ 3500 AATCTGCTAnTGAATAGTCGAGTACGCATTGAAATTrrCCATCCGCGCCAGAACACGAA 3601 .........+.........♦.............................+.........+ 3660 GACATGGCCTTATCTAAAACAGACCATACGTTATCAATACCAGAAAAATATATTGTTATC 3S61 .........+.........+.........+.........+---------+.........+ 3720 GGTATaAAATAAAAACAACATTGATAAGAGATACATTCTAATTTTCATTTTTGTAAAATT 3721 .......-- +---------—---------+---------+---------+---------+ 3780 TCCTGTACCACGTTGATCTACTTATTCCTAAAGAAATCCATTCTCCATCTCTAACTTTCG 3 7 31 -------十-------------+--------- + ---------+---------+ 3 84 0 GCCTTCCACCACCAGAGCTTTTTTTTCCACGTTGACGCTGAATTTCAGAAGTATGTGTTT 3841 .........+.........-.........+.........+.........+.........+ 3300 GTTT^CATACTCTTCAAAGCCAAGCTCTGTAAGGTTCTTACTTGTCCACTTAGCCACAC 3 901 .........+.........+.........+... +.........+.........+ 3960 TTTTAGCAATTCCCATGACTTCGTTCTCGTCTAAAGGTGCGGAGAACTGCAGGTTGTAGG 3 961 .........+ --......- +.........+.........+---------+----------r 4020 CTTTAGCGCGTTCAATGCAGGCTTGTAGCCATTGGTCATACTGCGGCCAGCCTTGGCGGA 4021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4080 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 567225 8 8 8 8 A B c D 穴、申请專利祀園 TAGCGCGGTAAGCCCACTTGCGGGnTTATCGAAGAGGGTGCAGTTACGGCCTAAACCGT. 4 08 X------------ + -----+ +---------+ 4140 AGTCCGGCAGGATTTCGCGGTCATTGgCTGCGCCAAGGTCGAGGTAATCGGCTAACCAGT 4 141 ...................十.........+.........+.........+.........+ 4200 CAAGGGTATAGAGCTCTGGCTGCCAGACGGTGATCTGCCAGTGCAGGTGGTTCGGATTCT 4201 -------------------+---------+---------+»--------- +---------+ 4260 TGCAAATTAGCCCTGAATACCCCGCATCTGCGCCCAATnTTrACGCAGCGCATTCTCGA 4261·.----------，一；-- +-------:-·+.-··-----.-- + ------ + -----+ 4320 TGGCGGCGGCGTATTTAAGGGGGGCAGCTCGACCATCCGGCGCGGTACGTACCGCCGTAT ^ -十- + -十尋4330 GCAAGGCATACAAC\GGTGAGCATGTCCGTTCTCGGGGTTTTTGATGGTGAGTGTGGGCG 4 3 31 ♦---—-----κ - -------+ -- -- -- -- - + -- -- -- — - + — —-----+ 4440 CAGGTGCCCCCAGATCGGCCCAATCAATCGCGGCTCCGGCTCtGTCCACGTCAAAGCAAA 4441 .........+.........+.................>.........+.........+ 4500 GCC.-.GTACATGGCGTGAGGCTGATTAA.\CTGGATGTATTTTGCGAGGAGAGCACGCTCTT 4501 ...................+.........+.........+.........4..........十 4560 TACCGGCAATGCGAACACCAAACTGTAAATCATCGGAGAAGTACGGCTTGTGGGGTAACC 4561 .........+.........+.........+.............................+ 4620 GGTC3TTAAAAAGCGTTAA.\GCCTGATTATCCAAGGCTCCCAGCCTTATGGCGGGGCTGT •4621» > -------- — · · - ‘-···--··- + - -------— τ 4630 TGTTTTGCACGCTGCATGTGCTAATATCCTtTCrAGGTTrCGACCrAGCCCTGAATGTCA 4681 .........♦.........> - v-..................................... 4740 TGTCCGCTCGCCAAAGTAGAGCATGATTrCGGGGCnTGnTTTTCTGCCACTAAGTTAC 4 741 ---------+---------+--------------------------------------♦ 4800 ACCTCAACAACGGTTnTGTCATCCCCGACAATCCGTTATTCCTGCTTGlTCTCGCACGG 4801 .........+.........+.........+.........+ --.......+.........+ 4850 CTTTACGCTCATACTACTTCTTGTAGATACACTTGTCACTACATCAAGAGGTGAGATGAT 4361 --------- +---------+*---------+---------+---------+ 4920 GGCCACGATTAATATTCGGATCGATGACGAGCTGAAAAGCCGCTCTTATGCCGCACTGGA 4921 ------- +---------+---------+---------+... + 4980 aaagctgggcgtaacgccgtccgaggttctgcgccaaacactggaatatgtggcccaaag 4981 ......... +.........+.........+.........+.........+ 5040 CGGACGTTTGCCGTTCCAGCAGGTTTTGCTGACCGAG3ATGATGCC3ATTTGATGGCTAT 5041 ......... ♦.........+.....-——+.........+.........+ 5100 CGTTCGGGATCGTCTGGAAAACCCACAGGCGGGGCGTAAAGGTGTCACTGGATGAGCTAT 5101 ...................+.........+.........+........- +.........+ 515C -8- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 567225 8 8 8 8 A BCD 々、申請專利範圍 AACCTTGAATTTGATCCCCGAGCCCTGAAGAAGGAATGGCGCAAGCTCGGGGATGATGTC 5161 3220 CGTCTGCAGTTCAA.GAAAAAACTCGAGCAGGTTCTACAA.CACCCCGCGGATCGATAAAAA 5221 .........+.........+.........+.........+ ·......-- +---------+ 5230 TCGCCTGCGAGAGCTGCATGACTGCTACAAAATCAAGCTCCGTGCATCCGGTTATCGCTT 5231 .........+.........+.........+.........+.........+.........+ 5340 GGTCTATCAGGTTCGCGATCAAACCATTACGGTATTCGTGGTGGCGGTCGGTAAGGGC 5341 ---------+---------+---------+---------+--------· + ---+ 5400 GAGCGrrCTGCCGCTTACGATGCGGCCCGATAAACGCrTATAAACTCATGCCGTCACCGC 5401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5460 " · . · ·. . -.· . ' . . . . · GAG.-.-.TACCGCTGTTCGTGCGCTTGGCT^ATTGCTCCAAGCGGCGCAGTGTTGTGTTTAA 5461...................+ --...........................+.........+ 5520 GCTCTCGACTTCGTGCGCCAAGCCGGTGACTT -5521 .........^.........+.....5552 本紙張尺度適用中國國家襟準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 公告本 申請曰期 案 號 087105015 類 別 〇l>^ {%f (以上各攔由本局填註） 修正 9>年$月/>曰 A4 C4 567225 中文說明書替換本(92年8月） 專利説明書 -、稱 中 文 細菌性質體pMUTl及pMUT2 英 文 "BACTERIAL PLASMIDS pMUTl AND pMUT2丨丨 -、發明人 姓 名 國 籍 住、居所 1. 傑格黑克 4.嘉伯利布蘭-歐勒 2. 優瑞瞿蘇倪柏 5.喬根馬林克 3. 裘根斯屈勒 6.漢斯保派特 均德國 1. 德國吉伯市艾迪史丁街6號 2. 德國伯權市伊晨路6號 3. 德國柏格瑞伯克市艾麗絲伯趣街7號 4. 德國屋勒柏格市瓊斯街3號 5. 德國沙藍市保羅路11號 6. 德國哈根市羅森街102號 三、申請人 姓 名 (名稱） 國 籍 住、居所 (事4所） 代表人 姓 名 德商法馬-桑翠爾股份有限公司 德國 德國哈迪克市洛爾菲德街20號 普拉伯 -1 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

   A8 B8 C8 D8

   申請專利範圍 1. 一種D N A序列，其具有如下所示核苷酸序列 Hindi II AGCTTTTAGAGCTTGGATACCATGACCCAATGAAGCrACCTCAAAACTTTGAATGATCGA 60 1 ......... GCGGCAGGCTAAATGAAATCTTGAGATTCATTCAGTCTCGTCGTAATCTCACTATTGTAA 61 - + --12 0 AAACGAAAAAACCACCCTGGCAGGTGGTTTTTCGAAGGTTAGTTAATCCTGGCAGATTCT 121 ---b--------- + -- -- -- -- -+ 180 CT^.CCGTGGTAACAGTCTTGTGCGAGACATGTCACCAAATACTGTCCTTTCAGTGTAGC 181 .........+.........各...................十.........+......... + 240 CTCA3TTAGGCCGCCACTTCAAG^ACTCTCGTTACATCTCTCGCACATCCTGCTTACCAG 241 -- .......+.........+.......... .......... .........十.........+ 300 TGC-CrGTTGCCAGTGGCGTTAJi.GTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTC-^.GACGATAGTTAC 301.........+.........+...................+.........+.........+ 3 6.： CGGA7AAGGCGCCAGGTCGGGCTG.^CGGGGGGTTCQTGCACACAGCCCAGCTTGGA3CG 3 ο X + - + + - + 4 2 0 ^.CGACCTACACCGAACCTGAGATACCTAACAGCGTGACGTATGAGA^AGCGCCACGCTT 421----- +---------+---------+---------+---------+---------+ 480 CCCGAAGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCAC 4 81 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540 GAGGGAGCTTCCAGGGGGAAA.CGCCTGGTATCTTTATATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCAC 541 ---- +---------+---------+---------+---------+---------+ 600 CTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAAG 6Q1 ---------+------；---+---------+-----:----+---------+---------+ 660 CCTCCCGCGGAGACCCGTTCTTCTGGGATCTrTGTCTTTrGCTCACATGTTCTTTCCGGT .........+.........+_---------+.........+ -........+.........+ 720 • TTTATCCCCCGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTrGAGTGAGGrrGACACCGCrCG -721 ...................十二........-.........+ ---------+.........+ 730 ^ ^ ^ Ά ^ Λ ^ ^ ^ ^ ^ Λ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ **· ^ -n *781---------十---------+---------*---------+---------+---------+ 840 TGrC-ACATTTTCTCCTTACGCTCCTCTATGCCGTTCTGCATCCTGTCCGGATGCGTTATA 341 ...................+.........+.........>.........+.........♦ 900 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)