HU228182B1 - Bacterial plasmids - Google Patents

Description

A. találmány bakteriális plazmadókra vonatkozik.

A plazmidok kicsi, extrakromoszömáiis, legtöbbször cirkuláris és Önállóan replikálóöö DNS-raciekrláb, amelyek megtalálhatók majdnem minden bakteriamban és néhány eukariötában is_r továbbá a mitokondriumokban tordalnak elő. A plazrnidok mérete

1,5 és 30h kb között változik.

A bakteriális piazmidok rendszerint cirkulárisak, kovalens kötéssel zártak és szuperheiikáilsek ián. supercoiled, szupeuspiráiis szerkezetek!. Gyakran hordoznak antibiotikum vagy nehézfémek elleni rezisztencia géneket, géneket a nem-tipikus szubsztrátok metahoiizáiására, vagy géneket egy sor fátjspecifikus tula j vontáéhoz, mint pl. a metaboiikus sajátságok vagy a virnlencia faktorok, behány plazmád az egyik sejtből a másikba átvihető, Mivel a baktériumok patogenitása a mai nézet szerint részben a piazmidok tulajdonságaitól is függ, fokozódik az érdeklődés a piazmld-DbS tulajdonságainak felderítésére .

Az Enterobacteracese családról, melyhez 14 fÓnemzetség és 6 további nemzetség tartozik, ismert, hogy ezek eltérő tulajdonságokat tudnak kialakítani. Tipikus képevíseiöik az

Esoherrchra, Salmonelia és Xieibsieiba. Az Esoherichia coli

ÍE. coli?	klasszikus	tárgya: a baktériumok	genetikai	kutatásá-
nak. Csak	az E. coli	k h .1 ö r i b ö z Ö v italén o i a	faktorainak	a fel.fé-
dszése és	j ellemzése	tette lehetővé, hogy	álfabánosán	ké el égi-

tő magyarázatot találjanak arra, hogy ennek a fajnak a törzsei « * «« « ♦ ♦ ♦ a az emberrel, illetve állattal szemben részben rendkívül eltérő patogenítással rendelkeznek, amely az aviruieneiátöi a nagyfokú virulenciáig terjed., amint az az újabban elterjedő **BHEC’‘-nek elnevezett variáns esetében tapasztalható. így az eztrainteszfcinális valamint az íntesztínális E. coli törzsekre is leírtak már egy sor virulencia faktort, amelyeket részben kielégítően jellemeztek. A 06: Ki szero-csoport patogén E.ooli törzseinél olyan viruá.encia faktorokat találtak, mint például a haemolizin és P~fimbría-adhezín, melyek igazolhatóan ennek a szero-csoportnak az apafogén képviselőinél nem fordulnak elő.

Virulénei a-génékét az énterobaktérlomoknál rendszerint a nagy prazmídoknái (kb. 60 kb) találtak. Léteznek azonban enterobaktériumok kicsi, úgynevezett kriptikus plazmá.dokká 1 is, melyek funkcióját eddig még nem tudták biztosan meghatározni.

'Mivel ismert, hogy £. coli esetében a virulencia faktorok legalábbis részben a plazmád génjeiben is előfordulnak, ezért fennáll az igény további kutatások elvégzésére az enferobaktérrumoknál és különösen az Escherichia-nái új plazmádon megtalálására és jellemzésére, hogy például az enterobaktéríumok által okozott fertőzések utáni megbetegedéseknél a diagnosztikus és terápiás lehetőségeket megjavítsuk, A plazmidok illetve a bakteriális; hordozóik vagy a megfelelő szintetikus ELS-k a mikrobiológiai analitikában vagy diagnosztikában, az orvosi terápiában vagy megelőzésben és táplálkozásfiziológiai vagy probiotlkus célokra Is felhasználhatok. Ezentúlmanéen e; plazmidok, és bar különösen az E. coli plazmiöjaí, a géntechnológiában ismert expresszien vektorok, * * »♦ * «♦ úgyhogy esea az alapon ís az érdeklődés kcséppont j áfaan áll. o íiyenféle piazmidok tulajdonságainak -jobb megismerése.

Ehhez molekuláris genetikai vizsgálatokat végeztünk a DSM 6601 E. coll törzzsé:.!. Az ebből a törzsből kapott DNS-szekvenciákat a d a t b a n k - p r o g r ammo k segíts é g évei s z 8 kven ciaanalizisnek vetettük alá, és más baktériumok már ismert DNS~ s z e k venc1 á v a1 összehasonlítottuk.

A DSM 6601 törzs tartalmaz két kisméretű, egy 3177 bp illetve egy 5552 bp nagyságú plazmádét, melyeket pbOTl-gyei és pbüT2 - vei. j elöl tünk.

A kisebb pdüTl plazmád DNS-ét Hindiil restrikciós enzimmel végzett hasítás után a pOCIS vektorba szubkiőnoztuk, ezt követően a DKS-szekvenciát meghatároztuk, mely az 1. ábrán látható. Az igy-kapott DNS-szekvenciát összehasonlítottuk a GenSMöL adatbankkal, hogy a homoiőgiákat megállapítsuk; ennek a szembeállításnak az eredményér a 2. ábrán mutatjuk be.

Ehhez az összehasonliráshoz a Hindii! hasi. tóhelye t jelöltük meg mint 1-es pozíciót. A. 200-as pozíciótól a 300-as pozíciójú bp-ig terjedő szakasz a pNúTl plazmád DNS—e szignifikáns homoléeiákat mutat más enterobakteriáíis piazmidok különböző rednpiikáit kezdőhelyeívei (repiikácíőa origók), pontosabban az NTP1, NTrl 6 és GioDFIO piazmidokkai. A 9S0-es: pozíciójú bp-től kezdődő 570 bp tartomány magasfokú. homoiögiát mutat az NGDI6 plazmáddal, melyet korábban, a Salmoneila typhimuríum-böl izoláltak. Ez a homológra felöleli a mobA-gént, amely az NT Pl 6' plazmrd mobilizálhatóságához szükséges, valamint a transzfer origóját (ori7), Ezenkívül az 1790—es pozíciójú bp—tői az 1020~ *«♦* as pozíciójú bp-ig terjedő szakaszét) szignifikáns hornológiát.

taráztunk a parA és cer génekkel, amelyek a plazmrd-molekuiák stabilé kásáér t, folytonos továbbadásáért ás elosztásáért felelősek a sej1osztódás során. A többi DNS—

-régióban nem. tudtunk szignifikáns homológ!át azonosítani.

Ezentúlraenően a pMÜTl piazmid DhS-szekvenoiáját egy amínosav—·szekvenciával is körülírtuk, és nyílt leolvasási keretek meglétére analizáltuk. Hat különböző leolvasási keret lehetőséget vizsgál tank meg . összesen öt nyílt leolvasási keretet találtunk, melyek .143 _f 61, 56, 49 és 68 amznosavfeől álltak. Ennek .n analízisnek egy grafikus ábrázolását adjuk a 3. ábrában.

A nagyobbik pMUT2 plazmád DOS-et ötön restrikciós enzimes hasítással linearizáltuk, éppenúgy a pUCrö-ban szubklónoztuk és végül teljesen szekvenáu.tuk. A DES-szekvenoiát a 4. ábrán mutatjuk be. .Az így-kapott ON^:S-szekvenciát a GenEMSL adatbankprogramm segítségével a már ismert DNS-stekvenoiákkal összehasonlítva a homológiára megvizsgáltuk. Az eredményt az 5, ábrán grafikusan ábrázoltuk. A pMUTz plazmád DKS-e szignifikáns homológ-iát mutat az £. coli különböző ColSl piazmidjsznak replikáciös régiójával a 890-es pozíciója bp és az 1660-as ροζ iclójú bo között, Egy további szrgnrfikáns homológra 1 a Iáitható a 388 ·· 4 950 bp közötti régióban. Ennélfogva szóba jönnek a CoiEl-plazmidok mobxiizáciös régióival való homológiák. A 3770 - 4980 bp közötti régióban a Pasteurelia-haemolytiea Al törzsének egyik piazmidjávai való homolögíáf találtunk. Ezen a plazmádon találhatók azok a gének, amelyek a Pasteurella-nál az antimikr obi ális rezisztencia-fehér jókét kódolják. A bomoiógd.a ♦ « «♦ kiterjed még a gének közötti területekre is, úgy hogy valószínűleg olyan -szekvenciákról is sző van, amelyek a plazmid .mobilizálhatóságához szükségesek.

Két régiét azonosítottunk, amelyek szignifikáns homológ1 á t matatnak más enterobakteriális piazminokkal „ Szék a replikáorós origó régiói és a mob-régiök, amelyek a plazmád. mobilizálhatóságához szükségesek. A. ρΜοΤζ plazmád más DNS-hasí.fásaira semmilyen szignifikáns homológiát nem tudtunk azonosítani..

A pbKii2 plazmád DNS-szekvenoiáját is ezt követően egy aminosav-szekvenciá val körülírtuk, és: nyitott leolvasási keretek meglétére analizáltuk. A kapott, eredményt szintén grafikusan ábrázoltuk a 3. ábrán. Az aminosav-szekveneiában öt nyílt leolvasást keretet találtunk, nagyság szerint 327 , 313, 264, 75 és aminosavval.

Az eddig ismeretlen pMUTl é-s pMÖT2 piazmídok mellett azok kombinációját sem találtuk meg eddig egyetlen E. coli törzsben vagy más énterobaktériumban sem.

A plazmidok előfordulása valószínűleg összefüggésben áll a

Dob 6601 törzs metaboiikus és orvosi és/vagy táplálkozásfiziológiai illetve probiotikus úton felhasználható tulajdonsag a i v a 1.

A plazmidok vizsgálatát az enterobaktériumok és különösen az Sscherlobia-csoport pontosabb meghatározása és analízise tette lehetővé. Ezentúimenöen ezek a plazmidok mint kedvező expressziös vektorok a géntechnológiában is ajánlhatók.

Az alábbiakban ismertetjük az ábrákat:

1. ábra: bemutatja a OSM €601 ábrás pMOTl körülbelül 3 kb méretű plazmádjának nukleotid-szekvenciáját.

2. ábra: a pMUTl plazmid restrikciós térképe. A fekete megvastágított körivek a megtalált DdS-szekvencia-homo.!ögiákat szimbolizálják más enterobaktérrumok piazmidjainak DbS-szekrémóléival. A releváns restrikciós hasítási helyek pozícióit megadtak .

3. ábra; bemutatja a pMa'll giazmiora (a) és pbDTz plazmádra (ib megtalált nyílt leolvasási, kereteket, A nyílt leolvasási keretek nagyságát is megadtuk.

1. ábra: bemutatja a DSb 6601 törzs pM0T2 körülbelül 5 kb méretű. p1acmiójának nukiectiu-stek v e nóráját.

5. ábra: a pbiliz plazmid restrikciós térképe. A rekete megvastagított körívek a megtalált DdS-szekvenoia-homclógiák.at szimbolizálják más ént e roba k tér lomok plazmidjain.sk DÓS-szekvenciái val. A releváns restrikciós hasítási helyek pozícióit megad te k.

Az alábbi példákban közelebbről ismertetjük a találmányt.

1, példa: FIa2aaid-izoláXás

A plszmid-'DóS izolálását Bimbóim és munkatársai eljárására. támaszkodva végeztük (Bimbóim A, Cd és boly J. : buci. Acids Rés. . .. 1513-1523 .(.197 9) : Egy gyors aikálikus extrakciös eljárás rekombínáns plazmrd-Ddu szkrinéi énére}.

Ml LB-tápkozeget egy baktérium-kolóniával .megfertőztünk, és· egy éjszakán át 37^cC~on rásattuk, Ezt a. tenyészetet egy Eppendorf-edényben ieeentrifugattuk, és a maradék tápközeget pipettával eitávolitottuk. A sejtmaradékot 100 μΐ I-es oldattal iáö' glükóz; 10 md BDTA, pH 8; 25 mb ’Tris-HGi, pH 80 reszuszpendáltuk. öt perces szobahőmérsékleten való ínkubáiás után 200 μΐ Il-es oldatot (0,2 H tfeöfí; 1% 5DS) adtunk hozzá, £eitisztuláslg keverhettük, és hagytuk az Eppendorf-edényben meg további 5 percen át jégen állni. Ezután 150 μ! 111-as oldatot 13 k da-acetát, pH 4,8) adtunk hozzá, összeráztuk amíg a kromoszómális DNS pelyhesen kivált, és a csapadékot mégegyszer 5 percre jégre tettük, A kivált kromoszómáris DNS-t és a sejtmaradékot 5 porcig cen.trifagában pelretártuk, és a felüiuszőt a plazmid-DNS-sel egy űj edénybe átvittük. Λ plazmád-DNS tisztításához 80 ni zeneit és ISO μΐ kloroform/izoaml.l-aikohoit (24; lí adtunk hozzá, és révig ideig tartó rázás utál; 2 percig ieeentrífugái tűk. A vizes fázist oqy új edénybe ázpipettáztuk, A piazmid-DNS-t 2 térfogatnyi jéghideg etanollaí kicsaptuk és percig centríregéltük. A perieket 70 %~os etanollaí mostuk és Speedvac készülékben szárítottuk. A plazmád-DNS— t 20 μ;.

bideszti1 iáit Fbö-ban reszuszpendáltűk és ~20^öC-on tároltuk.

2. példa: DNS-szekvenálás

A DNS-szekvenálást Sanger F. és munkatársai eljárása szerint végeztük {Sanger Ft, Nlckl.su S, és Conison A.B.; Proc. Natl, Bead. Scl. DSA jh, 5163-5467 ilS7?s - DdS-szekvenárás .1 á n o -1 e rmi n a c r ö s i n h ib i to r o k ka 1J .

A DNS- szekvenáiást T?-szekvenáló kit segítségével végeztük ígyártó: Pharmacia hKS) .

A. denaturáló lépéshez 8 ni (1,5 ·· 2 ug) plazmid-DKS-t 2 μΐ 2 K baOH-dai összekevertünk, rövid ideig centrifugáltuk, és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáítuk, A DN'S-t 3 μΐ t? ba-acefátf al, pH 4,8 vaianlat: 7 p.l bidesztiilálf víz zel és 60 pl jéghideg abszolút etanollal 15 percen, keresztül ---?QdC-en kicsaptuk. A kivált DbS-t 10 percig centrifugáltuk, 70%-os etanollal mostuk és szárítottak,

Az anneáló íOsszeforrasztö) reakcióhoz a denaturált DNS-t 10 μΐ bióesztillált vízben szuszpendáitűk, és 2 μΐ anneáló pufferrel és £ ni primőrrel H0 ng) összekevertük, Az elegyet 20 percig 3?'^:'C-cn inkubáítuk, úgy hogy a primer kötődése a templát-DbS-hez végbemenessen. A reakcióterméket 10 perc alatt szobahőmérsékletre lehűtöttok, és ezután vagy azonnal a jelzési reakcióhoz felhasználtuk, vagy -zö^C-on tároltuk.

A jelzése reakcióhoz bepioettáztunk 3 pl jelző-keveréket, 1 μΐ [a-P'd ciATF-t és 2 pl T7-polrmerázt ía ?7-poilmerázt 1:5 arányban enzrmhigitö-pufférrel meghigitottuk) az anneáló reakciőedénybe, és rövid ideig tartó kevertetés után S percig szobahőmérsékleten inkubáítuk. Ezidö alatt a terminációs reakcióhoz már előkészített szekvenálö keverékeket {egy-egy reakciőedénybe 2,5 pl 'δ'-, Ά'~, 'Τ’- és *C’-M.ix -et”short^!’í 3?°C-on előmelegítettük. A jelzési reakció lejátszódása után minden esetben, ebből 4 ui~t adtunk a négy szekvenáló keverékhez, és kis ideig a pipettával összekevertük. A terminációs reakciókat 5 perces 37^cC-on. történő inkubáiássai végeztek. A terminációs; reakciók befejezéséhez 5 pl stop-oldatot adtunk a reakcióelegyekhez. Majd a termékeket egy ő5^cC~os inkubátorba át vittük, 2 percig denaturáltuk és ezután jégre tettük. Minden egyes reakcióélégyből 2,5 yi~t felvittünk egy szekvenáló gélre [25,2 g karbamid, 22 ovi bidesztilléit váz, 6 x 10 mi poliakriiamid HOé-osi, 2 ml ammónium-perszulfát ;1C mg/mi, 60 μΐ TEMED) a ^!G', ^ΓΑ', Γη 'C sorrendben. Az eiektroforézist 40 batt és 1300 Volt-nál 4,5 órán át végeztük.

Claims (6)

1. 3.. Plazmád, amely as 1. ábra szerinti DHS-szekvenciával rendelkezik.
2. 2. Plazmád, amely a 4. ábra szerinti DNS-szekvenciával rendelkezik.
3. 3. OH-S szekvencia, amely az 1. ábra szerinti nukieotidsorrenddel rendelkezik.
4. 4. DNS szekvencia, amely a 4. ábra szerinti nukleotid-sorrenddel rendelkezik,
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti plazmád vagy DNS-szekvencia alkalmazása mikrobiológiai analitikában és/vagy diagnosztikában felhasználható készítmény előállítására.
6. 6. áz 1-4. igénypontok bármelyike szerinti plazyrad vagy DNS-szekvencía alkalmazása expresszibe vektorként.