SK284928B6 - Plazmid pozostávajúci zo sekvencie DNA, sekvencia DNA a jeho použitie - Google Patents

Abstract

Plazmid, ktorý má nukleotidovú sekvenciu zobrazenú na obrázku 1 a jeho použitie ako expresného vektora v mikrobiologickej analytike a/alebo diagnostike.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka bakteriálneho plazmidu obsahujúceho sekvenciu DNA, sekvencie DNA a jeho použitia.

Doterajší stav techniky

Plazmidy sú malé, extrachromozómové, prevažne cirkuláme a samostatne sa replikujúce molekuly DNA, ktoré sa vyskytujú skoro vo všetkých baktériách a tiež v niektorých eukaryotoch, ako aj v mitochondriách. Veľkosť plazmidov sa pohybuje medzi približne 1,5 až 300 kb.

Bakteriálne plazmidy sú spravidla cirkulámc, kovalentne uzatvorené a superšpiralizované. Často sú nositeľmi génov rezistencie proti antibiotikám alebo ťažkým kovom, génov na metabolizáciu netypických substrátov alebo génov pre rad typovo špecifických charakteristík, ako sú metabolické vlastnosti alebo faktory virulencie. Niektoré plazmidy môžu byť prenášané z jednej bunky do inej bunky. Pretože podľa dnešnej mienky je patogenita baktérií podmienená čiastočne tiež vlastnosťami plazmidov, pretrváva stupňujúci sa záujem na objasnení vlastností plazmidovej DNA.

O čeľadi Enterobacteriaceae, ku ktorému patrí 14 hlavných rodov a 6 ďalších rodov je známe, že môžu vytvárať rôzne vlastnosti. Typickými príkladmi sú Escherichia, Salmonella a Klebsiella. Escherichia coli (E. coli) je klasickým objektom bakteriálnej genetiky. Až nájdenie a charakteristika rôznych virulentných faktorov E. coli umožnilo nájsť všeobecne uspokojujúce vysvetlenia toho, že kmene tohto typu majú čiastočne extrémne odlišnú patogenitu u ľudí, pripadne u zvierat, ktorá siaha od avirulencie až po virulenciu vysokého stupňa, ako v prípade najnovšie sa rozširujúceho variantu označeného ako „EHEC”. Takto bol opísaný už rad virulentných faktorov extraintestinálnych ako aj intestinálnych kmeňov E. coli, ktoré sú sčasti dobre charakterizované. Pri patogénnych kmeňoch E. coli sérovej skupiny O6:K5 boli nájdené virulentné faktory ako napríklad hemolyzíny a P-fimbrioadhczíny, ktoré sa preukázateľne nevyskytujú pri nepatogénnych zástupcoch tejto sérovej skupiny.

Virulentné gény sú pri enterobaktériách nachádzané spravidla na veľkých plazmidoch (cca 60 kb). Existujú ale tiež enterobaktérie s malými, takzvanými kryptickými plazmidmi, ktorých funkciu nebolo možné doteraz ešte s určitosťou stanoviť.

Pretože je známe, že v prípade E. coli sa virulentné faktory čiastočne nachádzajú tiež v plazmidových génoch, vzniká týmto potreba ďalšieho skúmania s cieľom nájsť a charakterizovať plazmidy pri enterobaktériách a najmä u Escherichie, aby sa napríklad zlepšili možnosti diagnostiky a liečby ochorení spôsobených infekciou enterobaktériami. Plazmidy, prípadne ich bakteriálne nosiče alebo zodpovedajúca syntetizovaná DNA, môžu nájsť uplatnenie v mikrobiologickej analytike alebo diagnostike, v medicíne v liečbe alebo profylaxii. Okrem toho sú plazmidy, a najmä plazmidy E. coli, známe ako expresné vektory v génovej technológii, takže aj z tohto dôvodu vzniká záujem o lepšie poznanie vlastnosti týchto plazmidov.

Podstata vynálezu

S týmto cieľom bol uskutočnený molekulámogenetický výskum s kmeňom E. coli DSM 6601. Sekvencie DNA, ktoré obsahuje tento kmeň, boli pomocou databázo vých programov podrobené sekvenčnej analýze a porovnané so sekvenciami DNA iných baktérií, ktoré už boli k dispozícii.

Kmeň DSM 6601 obsahuje dva malé plazmidy s veľkosťou 3177, pripadne 5552 bp, ktoré boli označené ako pMUTl, respektíve pMUT2.

DNA menšieho plazmidu pMUTl bola po reštrikčnom štiepení s enzýmom HindlII subklonovaná ako lineárny fragment do vektora pUC18, následne bola identifikovaná sekvencia DNA. Táto je znázornená na priloženom obrázku 1. Takto získaná sekvencia DNA bola podrobená homologickému porovnaniu s databázou GenEMBL. Výsledky tohto porovnania znázorňuje obrázok 2.

Na toto porovnanie bolo reštrikčné miesto enzýmu HindlII určené ako pozícia 1. Od pozície 200 až po 800 bp vykazuje DNA plazmidu pMUTl signifikantné homológie s rôznymi počiatkami replikácie (origins of replication) iných entero-bakteriálnych plazmidov, špeciálne plazmidov NTP1, NTP16 a CloDF13. V oblasti pozície 950 bp začína 570 bp veľká homológia s plazmidom NTP16, ktorý bol pôvodne izolovaný zo Salmonelly typhimurium. Táto homológia zahŕňa mobA-gén, ktorý je potrebný na mobilizáciu plazmidu NTP16, ako aj počiatok transferu origin of transfer (oriT). Okrem toho boli od pozície 1790 až po 1920 bp nájdené signifikantné homológie s génmi parA a cer, ktoré majú význam pre stabilitu a kontinuálny prenos a rozdelenie plazmidových molekúl pri delení buniek. Pre ostatné oblasti DNA nebola identifikovaná žiadna signifikantná homológia.

Ďalej bola sekvencia DNA plazmidu pMUTl prepísaná do aminokyselinovej sekvencie a bola preskúmaná na prítomnosť otvorených čítacích rámcov. Bolo analyzovaných 6 rôznych možností čítacích rámcov. Bolo nájdených celkom 5 otvorených čítacích rámcov s veľkosťou 143, 62, 56, 49 a 48 aminokyselín. Grafické znázornenie analýzy je na obrázku 3.

Okrem doteraz neznámych plazmidov pMUTl a pMUT2 nebola ani ich kombinácia v žiadnych kmeňoch E. coli alebo iných enterobaktériách doteraz nájdená.

Výskyt plazmidov má pravdepodobne súvislosť s metabolickými a medicínskymi vlastnosťami kmeňa DSM 6601.

Skúmanie plazmidov umožňuje presnejšie určenie a analýzu enterobaktérií a najmä skupiny Escherichia. Okrem toho sa ponúkajú tieto plazmidy ako vhodné vektory expresie pre génovú technológiu.

Následne bude vynález bližšie objasnený pomocou príkladov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje nukleotidovú sekvenciu približne 3 kb veľkého plazmidu pMUTl kmeňa DSM 6601.

Na obrázku 2 je znázornená reštrikčná mapa plazmidu pMUTl. Čierne zvýraznenia symbolizujú nájdené homológie sekvencií DNA so sekvenciami DNA plazmidov iných enterobaktérií. Pozície relevantných reštrikčných miest sú udané. Na tomto obrázku sú menovite znázornené nasledovné homológie:

- homológia s parA-génom plazmidu CoIEl,

- homológia s replikačnými oblasťami plazmidov pNTPl, pNTPlô a CloDF13,

- homológia s plazmidom pNTP16 (oriTa mobA).

Na obrázku 3 sú znázornené otvorené čítacie rámce nájdené pri obidvoch plazmidoch pMUTl (a) a pMUT2 (b). Veľkosť otvorených čítacích rámcov je uvedená.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia plazmidu

Izolácia plazmidovej DNA prebehla na základe spôsobu Bimboim et al. (Bimboim, A. C. a Doly, J. (1979) Nucl. Acids Res. 7:1513-1523 A rapid alkaline extraction procedúre for screening recombinant plasmid DNA).

ml LB-média sa očkuje bakteriálnou kolóniou a pretrepáva sa cez noc pri 37 °C. Táto kultúra sa v Eppendorfovej skúmavke scentrifuguje, zvyšok média sa odstráni pipetou. Bunkový sediment sa resuspenduje so 100 pl roztoku I (50 mM glukóza; 10 mM EDTA, pH 8; 25 mM Tris-HC1, pH 8). Po 5 minutách inkubácie pri izbovej teplote sa pridá 200 μΐ roztoku II (0,2 N NaOH; 1 % SDS), mieša sa až do vyčírenia a Eppendorfova skúmavka sa nechá ďalších 5 minút stáť na ľade. Potom sa k tomu pridá 150 μΐ roztoku III (3 M octan sodný, pH 4,8), krátko sa pretrepe až kým sa chromozomálna DNA nevyzráža do vločiek a usadenina sa nechá ešte raz 5 minút na ľade. Vyzrážaná chromozomálna DNA a zvyšky buniek sa centrifugujú v centrifúge 5 minút a supematant s plazmidovou DNA sa premiestni do novej nádoby. Na vyčistenie DNA plazmidu sa pridá 50 μΐ fenolu a 150 μΐ chloroformu/izoamylalkoholu (24 : 1) a po krátkom pretrepaní sa 2 minúty scentrifuguje. Vodná fáza sa prepipetuje do novej nádoby. Plazmidová DNA sa vyzráža s 2 objemami ľadovo studeného etanolu a 10 minút sa scentrifuguje. Pelet sa premyje so 70 % etanolom a vysuší sa v exikátore. Plazmidová DNA sa rozsuspenduje v 20 μΐ H₂O_redest a uchováva sa pri -20 °C.

Príklad 2

Sekvenovanie DNA

Sckvcnovanie DNA prebehlo na základe spôsobu od F. Sangera et al. (Sanger, F., Nicklen, S. a Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 DNA sequencing with chain terminating inhibitors).

Sekvenovanie DNA prebehlo s T7-sekvenačným kitom firmy Phamacia LKB.

Na denaturačný krok sa premieša 8 μΐ (1,5 až 2 pg) plazmidovej DNA s 2 μΐ 2 N NaOH, krátko sa scentrifuguje a 10 minút sa inkubuje pri izbovej teplote. DNA sa zráža s 3 μΙ 3 M octanu sodného, pH 4,8, ako aj s 7 μΐ H₂O_redest a so 60 μΐ ľadovo studeného etanolu_abso]útny 15 minút pri teplote -70 °C. Vyzrážaná DNA sa 10 minút centrifuguje, premyje sa so 70 % etanolom a vysuší sa.

Na anelačnú reakciu sa denaturovaná DNA suspenduje v 10 μΐ H₂O_rcdcst a zmieša sa s 2 μΐ anelačného tlmivého roztoku a s 2 μΐ primeru (40 ng). Zmes sa inkubuje 20 minút pri 37 °C, takže môže nastať naviazanie primeru na templátovú DNA. Reakčná zmes sa ochladzuje 10 minút pri izbovej teplote, a potom sa alebo hneď použije na Labelling-reakciu, alebo sa zmrazí pri -20 °C. Na Labellingreakciu sa do anelačnej reakčnej zmesi napipetujú 3 μΐ Labelling-mixu, 1 μΐ [a-P³²]dATP a 2 μΐ T7-polymerázy (T7-polymeráza bola zriedená v pomere 1 : 5 s enzýmovým zrieďovacím tlmivým roztokom) a po krátkom miešaní sa 5 minút inkubuje pri izbovej teplote. Počas toho sa na terminačnú reakciu už pripravené sekvenačné mixy (vždy 1 nádoba s 2,5 μΐ ‘G’-, ‘A’-, ‘T’- a ‘C’-mix “short”) predhrejú pri 37 °C. Po prebehnutí Labelling-reakcie sa z toho vždy 4 μΐ pridajú k tým štyrom sekvenačným mixom a krátko sa premiešajú pipetou. Terminačné reakcie sa inkubujú 5 minút pri 37 °C. Na ukončenie terminačných reakcií sa pridá vždy po 5 μΐ stop-roztoku. Usadeniny sa teraz prevedú do inkubátora pri 95 °C, 2 minúty sa denaturujú a potom sa dajú na ľad. Vždy po 2,5 μΐ reakcií sa nanesie na sekvenčný gél [25,2 g močoviny, 22 ml H₂O_redest, 6 ml ΙΟχ TBE, 10 ml polyakrylamidu (40 %), 2 ml peroxosíranu amónneho (16 mg/ml), 60 μΐ TEMED] v poradí ‘G’, ‘A’, ‘T’, ‘C’. Elektroforéza prebieha pri 40 Wattoch a 1500 Voltoch 4,5 hodiny.

Claims (4)

1. Plazmid pozostávajúci zo sekvencie DNA znázornenej na obrázku 1.

2. Sekvencie DNA s nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obrázku 1.

3. Plazmid alebo sekvencia DNA podľa nároku 1 alebo 2 na použitie v mikrobiologickej analytike a/alebo diagnostike.

4. Plazmid alebo sekvencia DNA podľa nároku 1 alebo 2 na použitie ako expresné vektory.