DE19915772C2 - Verfahren zur Identifizierung von Escherichia coli Stamm DSM 6601 - Google Patents

Verfahren zur Identifizierung von Escherichia coli Stamm DSM 6601

Info

Publication number
DE19915772C2
DE19915772C2 DE19915772A DE19915772A DE19915772C2 DE 19915772 C2 DE19915772 C2 DE 19915772C2 DE 19915772 A DE19915772 A DE 19915772A DE 19915772 A DE19915772 A DE 19915772A DE 19915772 C2 DE19915772 C2 DE 19915772C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
atg
cga
seconds
ata
identification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE19915772A
Other languages
English (en)
Other versions
DE19915772A1 (de
Inventor
Joerg Hacker
Gabriele Blum-Oehler
Ulrich Sonnenborn
Juergen Schultze
Juergen Malinka
Hans Proppert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pharma Zentrale GmbH
Original Assignee
Pharma Zentrale GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP1998/007398 external-priority patent/WO1999025870A1/de
Application filed by Pharma Zentrale GmbH filed Critical Pharma Zentrale GmbH
Publication of DE19915772A1 publication Critical patent/DE19915772A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE19915772C2 publication Critical patent/DE19915772C2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Escherichia-coli-(E. coli)Stamm DSM 6601.
Escherichia coli ist ein gramnegatives Bakterium, das in der menschlichen und tierischen Darmflora, aber auch extra­ intestinal vorkommt. E. coli ist heute unter den mikrobiellen Klonierungssystemen der Gentechnik der wichtigste Wirts­ organismus zur Expression heterologer Proteine sowie zur Klonierung und DNA-Amplifikation.
E. coli tritt in zahlreichen Varianten auf, die sich hinsicht­ lich der Kapselantigene (K-Antigene), Oberflächenantigene (O-Antigene) und Flagellenantigene (H-Antigene) unter­ scheiden und daher in zahlreiche serologische Typen unter­ teilt werden können. Die Einordnung nach den Serotypen besagt allerdings nichts über die unterschiedliche Virulenz der Erreger. Vertreter ein- und desselben Serotyps können sowohl im menschlichen als auch im tierischen Körper un­ terschiedliches Pathogenitätspotential besitzen, das im Ex­ tremfall von avirulent bis hochgradig pathogen reichen kann. Bekannt ist, daß der E.-coli-Stamm DSM 6601 als nicht human- oder tierpathogen bewertet wird.
Es besteht daher noch ein Bedarf an Verifizierungsmetho­ den für nichtpathogene E.-coli-Stämme. Die Serotypisie­ rung als alleinige Methode zur Beurteilung, ob ein E.-coli- Stamm pathogen oder nichtpathogen ist, reicht nicht aus. Es wurde bereits darauf hingewiesen, daß unter dem gleichen Serotyp sowohl pathogene als auch nichtpathogene Varian­ ten auftreten. Für diagnostische und therapeutische Zwecke in der Medizin, aber auch für den Einsatz zu gentechnologi­ schen Zwecken ist es daher wünschenswert, einzelne Stämme zweifelsfrei identifizieren zu können.
Erfindungsgemäß wird nunmehr ein Verfahren zur Identi­ fizierung von E.-coli-Stamm DSM 6601 vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in einer PCR-Reaktion be­ stimmte Primerpaare aus den Plasmiden bzw. den fimA- und focA-Sequenzen der Bakterien-DNA eingesetzt werden.
Die PCR (Polymerase chain reaction) ist ein Verfahren, bei dem es gelingt, einige wenige Moleküle einer beliebigen genomischen DNA-Sequenz in kürzester Zeit in vitro um Faktoren von 106 bis 108 zu vermehren. Das erfindungsge­ mäße Nachweisverfahren ist angelehnt an das von R. K. Saiki et al. in Science 239: 487491 (1988) beschriebene Ver­ fahren.
Zur Durchführung der PCR werden Primer, das sind Oli­ gonucleotide benötigt, die in der Regel eine Länge von etwa 15 bis 30 Nucleotiden aufweisen und deren Sequenzen zu den Anfangs- bzw. Endsequenzen der Schwesterstränge der zu amplifizierenden DNA komplementär sind.
Zunächst wird die Doppelstrang-DNA der zu amplifizie­ renden Sequenz durch Erwärmen denaturiert, so daß sie sich in Einzelstränge auftrennt. Über den als Template oder Ma­ trize bezeichneten einzelsträngigen Bereich der Nuclein­ säure wird der komplementäre Strang im späteren Verlauf gebildet. Nach der Denaturierung durch Erwärmen kühlt man das Gemisch mit den Primern ab, wobei die Primernu­ cleotide an den Enden der Einzelstrang-DNA hybridisieren und dadurch eine Wiedervereinigung der ursprünglichen DNA-Einzelstränge verhindern. Daran anschließend setzt man nach Erhöhung der Temperatur ein Gemisch der vier DNA-typischen Nucleotid-5'-triphosphate und eine tempe­ raturstabile DNA-Polymerase zu. Als besonders geeignet hat sich die Taq-Polymerase aus dem extrem thermophilen Organismus Thermus aquaticus erwiesen, die auch eine kurzzeitige Erhitzung auf über 95°C übersteht. Bei 72°C wird durch die Polymerase der DNA-Einzelstrang zwischen den beiden mit Primern besetzten Enden zum Doppelstrang ergänzt.
Die drei Verfahrensschritte, nämlich Hitzedenaturierung, Primerannealing und Polymerisation, können solange wie­ derholt werden, bis der Ansatz erschöpft ist. Da bei jedem Einzelschritt eine Verdopplung der DNA-Menge stattfindet, erreicht man nach etwa 20 Zyklen theoretisch einen Ver­ mehrungsfaktor von etwa 106.
Bei der vorliegenden Erfindung werden als Primerpaare solche aus der fimA-Sequenz mit der Bezeichnung Muta 1 und 2 (Abb. 1) und solche aus der focA-Sequenz mit der Be­ zeichnung Muta 3 und 4 (Abb. 2) des Stammes DSM 6601 eingesetzt. Diese DNA-Sequenzen weisen eine teilweise Übereinstimmung mit Genen anderer Enterobakterien auf, aber andererseits gibt es an einigen Positionen Basen, die dort bei anderen Enterobakterien bisher nicht beobachtet werden konnten.
Die weiteren Primerpaare Muta 5 und 6 (Abb. 3), Muta 7 und 8 sowie Muta 9 und 10 (Abb. 4) wurden aus den DNA- Sequenzen der Plasmide pMUT 1 (Abb. 5) und pMUT 2 (Abb. 6) des Stammes DSM 6601 ausgewählt. Diese Pri­ merpaare weisen ebenfalls eine Nucleotidsequenz auf, die bisher bei Enterobakterien so nicht vorgefunden wurde.
Die Sequenzen der Primer Muta 1 bis Muta 10 sind in den beigefügten Abb. 1 bis 4 im Detail dargestellt.
Die Erfindung wird im folgenden anhand des Beispiels näher erläutert:
Eine Kolonie von E.-coli-Stamm DSM 6601 wird von ei­ ner Agarplatte abgeimpft und in 100 µl bidestilliertem Was­ ser suspendiert. Diese Suspension wird 10 min auf 95°C er­ wärmt und anschließend auf Eis abgekühlt. 1 µl der Bakte­ riensuspension wird als Template-DNA für die PCR ver­ wendet.
Daran anschließend wird folgender PCR-Reaktionsansatz in ein PCR-Reaktionsgefäß einpipettiert:
28 µl H2Obidest10 µl 5 × PCR-Puffer
8 µl 1,25 mM dNTPs
je 1 µl Primer (0,5 µg/µl)
1 µl Template
1 µl Taq-Polymerase (1 U/µl).
Für die PCR-Reaktion wurden folgende Bedingungen ge­ wählt:
  • a) 3 min 95°C (Denaturieren)
  • b) 45 s bei 95°C (Denaturieren)
  • c) 45 s bei 58°C (Annealing der Primer)
  • d) 45 s bei 72°C (Reaktionstemperatur der Taq-Poly­ merase).
Die Schritte b. bis d. werden mindestens 20 mal wieder­ holt.
Die Endprodukte können dann beispielsweise zur Identi­ fizierung von Escherichia-coli-Stamm DSM 6601 angewen­ det werden oder auch in an sich bekannter Weise sequenziert und zur Überprüfung von entsprechend hergestellten DNA- Sequenzen aus zu untersuchenden E.-coli-Stämmen einge­ setzt werden.

Claims (4)

1. Oligonukleotide der Formeln
5'-ATA CTA CGA CGG TAA ATG GT-3'
5'-ATG CTA CCG ATA CTG ATG TA-3'
5'-CCA CGG TTA GGT GTG GTA CAG-3'
5'-TGG TAT TGC CAA CGC CGA ACG-3'
5'-AAC TGT GAA GCG ATG AAC CC-3'
5'-GAT AGC TCT CTG AAC AGT CC-3'
5'-CAT CCG GTT ATC GCT TGG-3'
5'-GTG AGA TGA TGG CCA CGA TT'-3'
5'-GCG AGG TAA CCT CGA ACA TG-3'
oder
5'-CGT GAA TTA TCG ATA CGC CG-3'
2. Verwendung der Oligonukleotide gemäß Anspruch 1 als Primer/Primerpaare zur Identifizierung von E. coli DSM 6601
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Primerpaare entsprechend Anspruch 1 in einer PCR-Reaktion eingesetzt werden, die bei folgenden Temperaturen durchgeführt wird:
  • a) 3 Minuten bei 95°C
  • b) 45 Sekunden bei 95°C
  • c) 45 Sekunden bei 58°C
  • d) 45 Sekunden bei 72°C
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte b) bis d) mindestens 20 mal wiederholt werden.
DE19915772A 1998-11-18 1999-04-08 Verfahren zur Identifizierung von Escherichia coli Stamm DSM 6601 Expired - Fee Related DE19915772C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP1998/007398 WO1999025870A1 (de) 1997-11-19 1998-11-18 Verfahren zur identifizierung von escherichia coli stamm dsm 6601

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE19915772A1 DE19915772A1 (de) 2000-05-25
DE19915772C2 true DE19915772C2 (de) 2001-08-30

Family

ID=8167135

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19915772A Expired - Fee Related DE19915772C2 (de) 1998-11-18 1999-04-08 Verfahren zur Identifizierung von Escherichia coli Stamm DSM 6601

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE19915772C2 (de)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998044134A2 (de) * 1997-04-02 1998-10-08 Pharma-Zentrale Gmbh Bakterielle plasmide
WO1999025869A1 (de) * 1997-11-19 1999-05-27 Pharma-Zentrale Gmbh Dna-sequenzen aus fimbriengenen des escherichia coli-stamms dsm 6601
WO1999025870A1 (de) * 1997-11-19 1999-05-27 Pharma-Zentrale Gmbh Verfahren zur identifizierung von escherichia coli stamm dsm 6601

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998044134A2 (de) * 1997-04-02 1998-10-08 Pharma-Zentrale Gmbh Bakterielle plasmide
WO1999025869A1 (de) * 1997-11-19 1999-05-27 Pharma-Zentrale Gmbh Dna-sequenzen aus fimbriengenen des escherichia coli-stamms dsm 6601
WO1999025870A1 (de) * 1997-11-19 1999-05-27 Pharma-Zentrale Gmbh Verfahren zur identifizierung von escherichia coli stamm dsm 6601

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chem. Abstr. 103 (1985) 82516e (Gene 34 (1985) 187-196) *
Chem. Abstr. 107 (1987) 128098h (FEMS Microbiol. Lett. 41 (1987) 229-235) *
Chem. Abstr. 108 (1988) 125389p (J. Bacteriol. 169(1987) 5831-5834) *
Chem. Abstr. 116 (1992) 188779b (Microb. Pathog. 9 (1990) 331-343) *
Chem. Abstr. 119 (1993) 218655q (J. Vet. Med. Sci.55 (1993) 395-400) *
Chem. Abstr. 123 (1995) 254005u (Microbiology (Reading, U.K.) 141 (1995) 221-228) *
Chem. Abstr. 129 (1998) 328063j (J. Mol. Evol. 47 (1998) 258-267) *

Also Published As

Publication number Publication date
DE19915772A1 (de) 2000-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6251610B1 (en) Method for sequencing both strands of a double stranded DNA in a single sequencing reaction
DE69527171T2 (de) Strangverdrängungsamplifikation unter Verwendung von thermophilen Enzymen
DE69022291T2 (de) Verfahren zur Beherrschung von Kontamination der Nukleinsäure-Amplifikation.
DE69113261T3 (de) Hybridizierungssonden von dem abstand zwischen den 16s und 23s rna genen und nachweis von nicht-viralen mikroorganismen.
DE60034878T2 (de) Verfahren zur Amplifizierung einer Nukleinsäuresequenz unter Verwendung eines chimären Primers
DE60131284T2 (de) Methode zum nachweis von mikroorganismen
Chen et al. Universal primers for amplification of mitochondrial small subunit ribosomal RNA-encoding gene in scleractinian corals
CA2151036A1 (en) Improved method for amplification of targeted segments of nucleic acid using nested polymerase chain reaction
DE19822108A1 (de) Verfahren zur Detektion von Mikroorganismen in Produkten, insbesondere in Arzneimitteln und Kosmetika
EP0739988B1 (de) Verfahren zur Gattungs- und speziesspezifische Identifizierung von Legionellen
Collins et al. Theileria parva ribosomal internal transcribed spacer sequences exhibit extensive polymorphism and mosaic evolution: application to the characterization of parasites from cattle and buffalo
CN100379861C (zh) 核酸扩增或检测用试剂的稳定化方法和保存方法
Blais et al. Comparative analysis of yadA and ail polymerase chain reaction methods for virulent Yersinia enterocolitica
DE19915772C2 (de) Verfahren zur Identifizierung von Escherichia coli Stamm DSM 6601
EP1038035A1 (de) VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON $i(ESCHERICHIA COLI) STAMM DSM 6601
DE69431240T2 (de) Verfahren zur ampflifizierung und zum nachweis bestimmter nukleinsäuresequenzen mittels thermostabiler enzyme
EP1565576A2 (de) Verfahren zur detektion von mikroorgasnismen in pharmazeutischen produkten
DE102015012691A1 (de) Verfahren zum quantitativen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae
Iqbal et al. Detection of Yersinia pestis by pesticin fluorogenic probe-coupled PCR
Yuk et al. Human but not ovine isolates of Bordetella parapertussis are highly clonal as determined by PCR-based RAPD fingerpringting
KR101509071B1 (ko) 마이크로시스티스속 균주의 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 마이크로시스티스속 균주의 탐지방법
CN113416743A (zh) 核酸分子、PCR引物对及用于检测禽毛滴虫rpoB基因的试剂盒
DE69626032T2 (de) Modifizierung von oligonukleotid-primer-sequenzen zum manipilieren der zugabe von nicht-template-nukleotiden
Kiuchi et al. Phylogenetic analysis of the Erysipelothrix rhusiopathiae and Erysipelothrix tonsillarum based upon 16S rRNA
US20180030508A1 (en) Nucleic acid amplification reaction method, reagent set, and method of using reagent set

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8181 Inventor (new situation)

Free format text: HACKER, JOERG, PROF. DR., 97218 GERBRUNN, DE BLUM-OEHLER, GABRIELE, DR., 97072 WUERZBURG, DE SONNENBORN, ULRICH, DR., 44799 BOCHUM, DE SCHULTZE, JUERGEN, DR., 14558 BERGHOLZ-REHBRUECKE, DE MALINKA, JUERGEN, 59379 SELM, DE PROPPERT, HANS, 58095 HAGEN, DE

D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee