EA003700B1 - Бактериальные плазмиды - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к плазмидам и соответственно последовательностям ДНК с представленными на фиг. (1) или (4) последовательностями нуклеотидов и их применению.

Description

Изобретение относится к бактериальным плазмидам.

Плазмиды представляют собой маленькие, внехромосомные, в большинстве круговые и самореплицирующиеся молекулы ДНК, которые присутствуют почти во всех бактериях и также в некоторых эукариотах и в митохондриях. Размер плазмид вирьирует примерно от 1,5 до 300 тысяч пар нуклеодов (т.п.н.).

Бактериальные плазмиды являются, как правило, круговыми, ковалентно замкнутыми и закрученными в суперспираль. Часто они несут гены резистентности против антибиотиков или тяжелых металлов, гены для метаболизации нетипичных субстратов или гены ряда видоспецифических характеристик, например метаболические свойства или факторы вирулентности. Некоторые плазмиды могут быть перенесены из одной клетки в другую клетку. Поскольку в настоящее время патогенность бактерий обусловлена частично также свойствами плазмид, то возрастает интерес к объяснению свойств плазмидных ДНК.

Из характеристик семейства Еп1етоЬас1епасеае, к которому относятся 14 главных видов и 6 других видов, известно, что они могут приобретать различные свойства. Типичными примерами являются ЕксйепсЫа, 8а1топе11а и К1еЬк1е11а. ЕксйепсЫа со11 (Е. со11) представляет собой классический объект генетики бактерий. Только открытие и характеристика различных факторов вирулентности Е. сой позволили найти в общем удовлетворительное объяснение тому, что штаммы этого вида обнаруживают отчасти крайне различную патогенность для человека и животных, которая варьируется от авирулентности до высокой вирулентности, как в случае с распространяющимися в последнее время вариантами, называемыми «ЕНЕС». Таким образом, описан ряд факторов вирулентности как для экстраинтестинальных, так и для интестинальных штаммов Е.со11, которые отчасти хорошо охарактеризованы. Для патогенных штаммов Е.сой серогруппы 06:К5 обнаружены такие факторы вирулентности, как, например, гемолизин и Р-фимбринадгезин, которые не встречаются у непатогенных представителей этой серогруппы.

Гены вирулентности, как правило, обнаружены у энтеробактерий на больших плазмидах (около 60 тысяч пар нуклеоитдов). Существуют также энтеробактерии с небольшими, так называемыми криптическими плазмидами, функция которых до сих пор еще окончательно не определена.

Если известно, что факторы вирулентности Е.соН присутствуют, по меньшей мере, также частично в генах плазмид, то появляется необходимость в дальнейших исследованиях для обнаружения и характеристики плазмид у энтеробактерий и, в частности, у ЕксЕепсЫа. например, для улучшения диагностических и терапевтических возможностей при заболеваних, вызы ваемых заражением энтеробактериями. Плазмиды и, соответственно, их бактериальные носители или соответствующие синтезированные ДНК можно применять в микробиологической аналитике или диагностике, в терапии или профилактике, и также для физиологии питания или пробиотических целей. Кроме того, плазмиды, в частности от Е. со11, являются известными векторами экспрессии в генной инженерии, поэтому по этой причине также существует интерес, касающийся исследования свойств подобных плазмид.

Кроме этого, были проведены молекулярно-генетические исследования со штаммами Е.сой Ό8Μ 6601. Полученные из этого штамма последовательности ДНК подвергали анализу секвенирования ДНК с помощью программ банка данных и сравнивали с уже имеющимися последовательностями ДНК других бактерий.

Штамм Ό8Μ 6601 имеет две маленькие плазмиды размером 3177 и соответственно 5552 пар нуклеотидов (Ьр), которые обозначены рМиТ1 и соответственно рМИТ2.

После рестрикционного расщепления ДНК меньшей плазмиды рМИТ1 субклонировали с ферментом ΗίηάΙΙΙ в качестве линейного фрагмента в вектор риС18, присоединив затем последовательность ДНК. Это очевидно из приведенной иллюстрации 1. Полученную таким образом последовательность ДНК подвергали гомологичному сравнению с банком данных СепЕМВЬ. Результаты этого противопоставления изображены на фиг. 2.

Для сравнения место разреза ΗίηάΙΙΙ обозначено как позиция 1. От позиции 200 - 800 пар нуклеотидов ДНК плазмиды рМИТ1 имеет характерные гомологии различных мест начала редупликации (начала репликации) другой энтеробактериальной плазмиды, специально для плазмид ИТР1, ИТР 16 и СЮЭГ13. В регионе позиции 950 пар нуклеотидов начинается гомология к плазмиде ИТР16 величиной 570 пар нуклеотидов, которую первоначально выделяли из 8а1шопе11а 1ур1итипит. Эта гомология охватывает ген тоЬА, который необходим для мобилизируемости плазмиды ИТР 16, а также начала переноса (опТ). Кроме того, от позиции 1790-1920 пар нуклеотидов обнаружены характерные гомологии к генам рагА и сег, которые важны для стабильности и непрерывного воспроизведения и распределения плазмидных молекул при делении клеток. Для обычных областей ДНК никто не мог идентифицировать характерные гомологии.

Кроме того, описана последовательность ДНК плазмиды рМИТ1 в последовательности аминокислот и проведен анализ на наличие открытых читаемых астеров. Исследовано 6 различных возможностей читаемых астеров. Обнаружено всего 5 открытых читаемых астеров величиной 143, 62, 56, 49 и 48 аминокислот.

Графическое изображение анализа представлено на фиг. 3.

ДНК большей плазмиды рМиТ2 после линеаризации с рестрикционным энзимом 8рЫ также субклонировали в вектор рИС18, и затем полностью секвенировали. Последовательность ДНК представлена на фиг. 4. Полученную таким образом последовательность ДНК исследовали с помощью программы банка данных СеиЕМВЬ на гомологию к уже известным последовательностям ДНК. Результат графически изображен на фиг. 5. У ДНК плазмиды рМиТ2 обнаружена характерная гомология к области репликации различных Со1Е1-плазмид от Е.со11 в позиции от 890 до 1660 пар нуклеотидов. Другая характерная гомология к Со1Е1-плазмиде находится в регионе позиции от 3800 до 4950 пар нуклеотидов. Здесь речь идет о гомологии к области мобилизации Со1Е1-плазмиды. В регионе позиции от 3770 до 4980 пар нуклеотидов обнаружены гомологии к плазмиде штамма А1 Рак!еиге11а Баето1уйса. На этой плазмиде расположены гены, которые у Рак!еиге11а кодируют белки антимикробной резистентности. Тем не менее, гомология распространяется на интергенную область таким образом, что возможно речь идет о последовательностях, которые необходимы для мобилизируемости плазмиды.

Идентифицированы два региона, имеющие характерные гомологии с другими энтеробактериальными плазмидами. При этом речь идет о регионе начала репликации и шоЬ-регионе, которые необходимы для мобилизируемости плазмиды. Для рМИТ 2 не удалось идентифицировать характерную гомологию для обычного участка ДНК.

Далее описана также последовательность ДНК плазмиды рМиТ2 в последовательности аминокислот и проведен анализ на наличие открытых читаемых астеров. Результат графически представлен на фиг. 3. Обнаружено 5 открытых читаемых астеров с последовательностью аминокислот размером порядка 327, 318, 264, 76 и 63 аминокислот.

Наряду с неизвестными до сих пор плазмидами рМИТ1 и рМНТ2, также до сих пор не найдена комбинация в штаммах Е.соБ или других энтеробактериях.

Возможно, наличие плазмид связано с метаболическими и медицинскими свойствами и/или свойствами физиологии питания и, соответственно, пробиотическими свойствами штамма Ό8Μ 6601.

Исследование плазмид позволяет более точно определять и анализировать энтеробактерии и, в частности, группу ЕксйепсЫа. Кроме того, эти плазмиды предоставляют несомненные векторы экспрессии для генной инженерии.

В дальнейшем изобретение поясняется подробно с помощью примеров:

Пример 1. Изоляция плазмиды.

Изоляцию плазмиды ДНК осуществляют по методу В1гпЬо1т е! а1. (В1гпЬо1ш, А.С. апй Эо1у, 1. (1979) Ыис1. Ас1йк Век. 7:1513-1523 Методика быстрой экстракции щелочи для скрининга рекомбинантных плазмид ДНК).

В колонию бактерий засевают 3 мл среды ЬВ и взбалтывают в течение ночи при 37°С. Эту культуру центрифугируют в специальной емкости, остаток среды удаляют с помощью пипетки. Осадок клеток ресуспендируют со 100 мкл раствора I (50 мМ глюкозы; 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, рН 8; 25 мМ ТпкНС1, рН 8). Через 5 мин инкубации при комнатной температуре добавляют 200 мкл раствора II (0,2 Н ЫаОН; 1 % додецилсульфат натрия), перемешивают до просветления и помещают специальную емкость на следующие 5 мин на лед. Далее добавляют 150 мкл раствора III (3 М ацетата натрия, рН 4,8), непродолжительное время взбалтывают до выпадения хромосомальной ДНК в виде хлопьев и помещают осадок еще раз на 5 мин на лед. Выпавшую хромосомальную ДНК и остатки клеток разделяют 5 мин в центрифуге и избыток плазмидной ДНК отводят в новый сосуд. Для очистки плазмидной ДНК добавляют 50 мкл фенола и 150 мкл хлороформа/изоаминоспирта (24:1) и после недолгого взбалтывания центрифугируют в течение 2 мин. Водную фазу добавляют в новый сосуд с помощью пипетки. Плазмидная ДНК выпадает в осадок после добавления 2 объемов ледяного этанола и центрифугирования в течение 10 мин. Осадок промывают 70%-ным этанолом и высушивают в скоростном вакууме. Плазмидную ДНК ресуспендируют в 20 мкл НОбиддоталлят и хранят при -20°С.

Пример 2. Секвенирование ДНК.

Секвенирование ДНК осуществляют по методу Е.8апдег е! а1. (8апдег, Р., МсИеп, 8. апй Сои1коп. А.В. (1977) Ргос. ΝοΙί. Асай. 8ск США 74: 5463-5467 Секвенирование ДНК с помощью ингибиторов терминации цепи).

Секвенирование ДНК осуществляют с помощью набора для секвенирования Т7 фирмы РБатас1а ЬКВ.

Для стадии денатурации смешивают 8 мкл (от 1,5 до 2 мкг) плазмидной ДНК с 2 мкл 2 Н ЫаОН, непродолжительное время центрифугируют и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. ДНК выпадает в осадок после добавления 3 мкл 3 М ацетата натрия, рН 4,8, а также 7 мкл Н₂Об_{идистиллят} и 60 мкл ледяного чистого этанола в течение 15 мин при 70°С. Выпавшую ДНК центрифугируют в течение 10 мин, промывают 70 % этанолом и высушивают.

Для реакции отжига денатурированную ДНК суспендируют в 10 мкл Н2Обидистиллят и смешивают с 2 мкл буфера для отжига и 2 мкл праймера (40 нг). Осадок инкубируют в течение 20 мин при 37°С таким образом, что может происходить связывание праймера на матрице ДНК. Осадок реакции охлаждают в течение 10 мин при комнатной температуре и затем либо используют сразу для реакции маркировки, либо замораживают при -20°С. Для реакции маркировки в осадок реакции отжига с помощью пипетки добавляют 3 мкл смеси маркировки, 1 мкл [α-Р³²] дАТФ и 2 мкл Т7-полимеразы (Т7полимеразу разбавляют в соотношении 1:5 буфером с энзимом разбавления) и после недолгого перемешивания инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Тем временем для реакции терминации подогревают уже приготовленные смеси для секвенирования (по 1 сосуду с 2,5 мкл '6'-, 'А'-, 'Т'- и ’С'-смесями, коротко) при 37°С. По истечении реакции маркировки добавляют соответственно 4 мкл от этой смеси к четырем смесям секвенирования и смешивают непродолжительное время с помощью пипетки. Реакцию терминации инкубируют в течение 5 мин при 37°С. По окончании реакции терминации добавляют по 5 мкл «останавливающего»-раствора. Теперь осадки отводят в инкубатор с температурой 95°С, денатурируют в течение 2 мин и затем помещают на лед. На гель секвенирования наносят по 2,5 мкл реакции [25,2 г мочевины, 22 мл Н₂О_{бидистиллят}, 6 мл 10 х ТВЕ, 10 мл полиакриламида (40 %), 2 мл персульфата аммония (16 мг/мл), 60 мкл ΤΕΜΕΌ] в последовательности '6', 'А', 'Т', 'С'. Электрофорез осуществляют при 40 Вт и 1500 В в течение 4,5 ч.

Claims (8)

1. Плазмида, имеющая нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 1.

2. Последовательности ДНК с или из представленных на фиг.1 последовательностей нуклеотидов.

3. Применение плазмиды по пп.1-2 в микробиологической аналитике и/или диагностике.

4. Применение последовательностей ДНК по пп.1-2 в микробиологической аналитике и/или диагностике.

5. Применение плазмиды по пп.1-2 для медицинских целей и/или целей физиологии питания и соответственно пробиотических целей.

6. Применение последовательностей ДНК по пп.1-2 для медицинских целей и/или целей физиологии питания и соответственно пробиотических целей.

7. Применение плазмиды по пп.1-2 в качестве вектора экспрессии.

8. Применение последовательностей ДНК по пп.1-2 в качестве векторов экспрессии.

Н1ЯЙ111 АССТТТГАбАССТТаОАТАССАТбАСССААТСААбСТАССТСААААСТТТСААТаАТССА вСабСАСССТАААТвАААТСТТвАаАТТСАТТСАОТСТСОТССТААТСТСАСТАТТаТАА

120

121

161

241

301

180

240

СТСАОТТАССССОССАСТТСААвААСТСТССТТАСАТСТСТСВСАСАТССТССТТАССАС

300

ТОСССетТСССАбТОвСвТТААОТССтетСТТАССОООТтеСАСТСААОАСОАТАаТТАС .........+.........+......... +---------+ 360

361

ССаАТААввССССАвеТССаЗСТСААССОООвОТТССТОСАСАСАвСССАвСТТССАбСС

---------♦---------4---------4-.-.-..-.4---------4------...4 420

421

ААСОАССТАСАССаААССТаАСАТАССТААСАССаТСАСВТАТОАбАААбССССАСССТТ

......---------:.-.-4----.-..-4-.-------*---------------* 480

481

541

601

СССОААОАОАААООСОСАСАаОТАТСССаТААвСООСАаООТСОСААСАОвАОАССССАС

-4---------4-------.-4------.--4--.-----.4-------.-4 540

ОАОааАССТТССАОООа<ЗАААССССТО<ЗТАТСТТТАТАТАСТССТСТСаСаТТТССССАС

СТСТОАСТТСА6СеТС(ЗАТГТГГОТбАТеСТС(ЗТСА<3<36ОвСС0вА<ЗССТАТС<ЗАААААв

600

660

661

ССТСССССОвАОАССССТТСТТСТСбОАТСТТТОТСТТТТОСТСАСАТСТТСТТТССЗбТ

720

721

ТТТАТСССССОАТТСТаТвСАТААССвТАТТАССаССТТТСАОТСАОСТбАСАССОСТаЗ

781

841

780

ССаСАСТСаААССАСССАССаТАОСаАСГГСАСТСА13СаАвОААС5СС<ЗААОАаАОААТТТА

840 ·+ 900

901

ТСССаОТААвАТТТТССаСТТСАААвСОТОТСТОТАТа СТОТТ СТ60АОТТСТТ ста СОА --------- +---------♦- - -+------------— +---------♦ 960

961 оттсатсаАстхтстсАСАСАтавсоасстдтт сот соосаттс аотс сстссасгггтт

1021

1081

1141

1201

1261

1321

1020

СВАвСАвСОТСАСаСТСтаАСТтТАТОААТСССОССА'ТОТТОАСТАСвССТГССТССТ

1080

......... ♦ ---...... *---------*.........+ 1140

СОТАССЛСТТТТСОАСТОТТТТССТСССОСТАТТСТаССССТГСССТГТТГОАСОавСАТ .-.-..-..4....----.4.-.-..-.-4--...-----------...4--------.4 ₁₂₀₀

ТТСТСТСАаАСААСАСТОТСАСТСССААААААСТССССТОССТТТаТСаСТААТТСбАвС ...................♦—.................*...................+ 1260

ТПЗСТаАСАаОАСАввАТОТвСААТГОТТАТАССвСаСАТАСАТССАСаСТАТТАСААТТ

1320 аСССТаОТСАВвСТТГОССССаАСАСССАТОТСАОАТАСООАаССАТвТТТТАТОАСААА

1380

1381

1441

АСОААСТСОААаТААТАСвСвСАбвСавССТАТСАОТСССССТОТТСетСТаАСОССАбА

---------4---------4.........4.........4.........4.... 4 144₀

АОААОАССАСОАААТСАВАААААОСССТССТОААТбСССЗСААОАССаТТТССоагПТТТ .........♦---------+-..... *---------+.... ♦ .......♦ 1500

1501

1561

1621

ТССввССССАвСТСТСООТААвАААОТТААСТСАСТОАСТвАТОАТССвСТАСТбАААвА

1560

1620

1681

САВООАСТАТвСвЗАООТаСТОАТСеСТАТТАСвОАСТАТСАССаТОСССТОТТАТССАв

ССТТАТОСгСАаАТТАвСТТСССбвАОАаААААСТОТСОААААСТОАСвОТАТаААСАССС

1741

1801

1680

1740

ТААОСТСССАААвТОАТСАССАТТСССТТТСАТОСАТАОСТАТССАОСОАССТОАААСОА

1800

ТССТСАСвСАТССТТССТОТТТТТССвССОТААААСАТСТСТТТТТССОвТаТСТСаСЭТ

.....----4.----.---4------.--4---...---4-------------------- 1860

1861

1921

САСААТСССОТТСАССССОТТГСАЭТСОТбСвТАСААТТААвЭСАТТАТОСТАААТАТАТ ---------+---------♦---------+....... 4... ♦ 1920

ОАОСТАТаСЗАТААСТТТААСТЗтеААССОАТЗААСССАТТАСАОаСАААСССААТТАСТ

1980

1981

2041

ССТОАСАбТСОТТТАОССАЙАДССАОввСТАССААОАССААТвСААТААОТААТАТАТСб --..-----4---------4---.-.-.-4---------4-.----.--4---------4 2040

ТГТТОСТАТСОТвССАТССОТСОСССТСАвТТССАТТОТССТТТТТТААССТОТСОТТТТ

---------.4------.---4---------+---------+---------+---------+

2100

2101

2160

АСССАТОТАТСТАООТАСТСААСТАССТТТвТТАОАТСАТААААТАТТОССЗАССАССАТА ---------+---------+---------♦---------+---------+---------♦ 2220

2221

2280

ОАТАССТСТСТаААСАаТССОТАСАвАААСССССАТАСОТАТСССТАаАСТТТССАТТОА ---.---.-+-.----.-.4----..---+-.------.--₊------ —- + 2340

2161

2281

2341

СаСАТвСввССАСТСТТЗСАААСТССАССАСТвААССАТСАССТТААвТАСТСТСТГААА

2400

ЗрЫ

АТСТСТАбАвТССАССТвСАввСАТвСТСААвСССТвАСААСССТСТСОТТТТТССССАА

1.........+.........*.........+...................*.......... 60

2401

2460

2461

ССАЗССААСАОАСАААССвССАССГТТССАТТГАТТСТГААСООАСТААаТСАТТОАТТТ

СТССТбСвАваТААССТСвААСАТвСССТСТААСТТввССТАвСТвТССТСССАСвСТТ .........+........-+-----------------*---------*.........* 120

2521

ТССТААбССССААААТАТТТАААОТАТАТАТТАТАТетАТАТТСАТАТаААТАСвОТОАС

2520

2580

121

ССТССТСТТСТТСвТАбТСССТСТСТААОСТСТСТААТССССТСАвААССТССТССТССА

180

2581

АСТбССаССАТТАТТСТОСААССААААААОАСТАСТСТЗААААССАСЗаААААаАТттТ

181

ТТТСССТСАТаААТСТСТТСАСССТОАТАаАТААААССОСССАбААТССАТТСТСТООСе

240

2641

2701

2761

2640

ССТСССТСААТТАОАТАСОСАСТТАОССЗАТАТОААААССОААСААСЭТСАТСАТСТТбТТ ---------♦-------------------*---------.......♦---------+ 2700

АААОАТАТТаАССТТТТТавССТАТССТТСТСТСТСТТСАТТТССАСАСССААТбАСААС тстаттАСААтассАтстсатстААбтссооАосАСАаААаАССАТоассАссааАасАа

2760

2820

2821

ОСОСССААААТССАСААТТСААТАТТатСТСАТТСТСТаАОАССТТСААССТТТАТТАСА

2880

2881

САТССАСАТАТТСТвСАААААСАСТССАТААААТССАТвАТТТСАТТвАССАТТТТСААА

2940

2941

ААТАСААТСТеТТТСССаАТССТТТААААООАТАТССАССТТааАСТОССАААСТАТСбС ---------4---------4__-------4--------------------₊---------4 3000

3001

САТСвТввАААСТОССТвАТСАТТАС<ЗААААСАААвАА6СТАТГвАОААвТАТвСТАвАв

3060

241

301

3061

3120

3121

ААТАСААОСТТГСТОАСТОаСТТАТТСАТТТССАСССССТаАСАССаААССАТАТАА .........♦-... +......... ♦.......3177

Фиг. 1. Изображение последовательности нуклеотидов плазмиды рМиТ1 штамма Ώ8Μ 6601 величиной примерно 3 тысячи пар нуклеотидов.

Фиг. 2. Рестрикционная карта плазмиды ρΜϋΤΙ. Черные полосы символизируют обнаруженные гомологии последовательности ДНК к последовательностям ДНК плазмид других энтеробактерий. Показаны позиции релевантных мест рестрикции.

Ζ]С] 62 49 48 ι Ιη 1-----------1| 1 |1 1 1] 56 Д Д—Ι| ή 143 1,000 2.000 . 3, 000 63 318 76 Ζ64 1 · г~~ίρ~ 32? 1--М—0-1=------- 1----------

1,0(10 2.000 3,000 4.000 5.000

Фиг. 3. Изображение обнаруженных для обеих плазмид ρΜϋΤΙ (а) и ρΜυΤ2 (Ь) открытых читаемых астеров. Величина открытых читаемых астеров представлена.

ТСТвАТвАвбТТАТТТвОСвСТвТАСТТСАТСАССТвАСвАТвТТвАОСвТТСТТвТАСТ .........+......... 4 300 сатссАтсттст

360

361

421

481

СвТОААТТАТССАТАСвССваСТСССаТСТСвСТСТТТААСТССТвСАвбАТСТввСТСТ ---------4--------------------------------------------------+ 420

ОСТСвСТвАТТТСвТТСтавСвТТССАССАСвАТАСТСССбАСАТАССААвСТАСТССАА ---------4---------4---------4-------------------4.--------₊ 480

ТСААТАТСССАААСАООАТСССАСТТААТбССАЖЗСТОТАСАСССАТСТСАТТССОАСТА

540

541

АвСввТвТАТСТвТТГТАвСТввСТСТСвТТСТСТТСТТввАТАвСввТСТвТАТвТТСС ...............+.................... .............---* 600

601

661

СТСАаСТТААТТТСААООССТССбТОАТАСОТТТСТССЗТОСТТСТССаААТСССТТСОСб

660

АСвСТСвТТвСввТАвТСТГввСТТвСТС.СТТСОАТТТвСТСТСвААСТСССвСвСТАА .........♦.........+.........+......... +.........+ 720

721

АТТТААААТСТСвСТСАТАСАвСАСТССТТТТААвСОААТАТГСвввССАССТвСССОАТ

-------------------*--------------------......-----₊ 780

САбаЛТАСТаАТАСТаОАТТТСОТТТССССТАССАССОАСААТССОССАТСССТААССТ

781

841 ввОАААТСАССССТТТАСвАТССОТААТТТСТСССТССТСААТСААвСТОАТТАвСССТТ

901

840

ТввТААТввСТТССбСТвССТвСТОТТТОТТвСаАваААбОТСАТТАвАвввввТГААТв

961

900

СТСОбСОАТТАОСАвветСАТТСвООТСОСОТААСССААОССбСТСАТПЗбТОАОООТТТ

1021

1061

1141

1201

1261

1321

1381

1441

960

1020

1080

ТСТОСААТТСвАТвТТСвввАТААСААААТТСААТТСААаАСвСССТТТвТССТвАТаТТ --------------------4·---------♦----------------.--4-..------4. 1140

ОААСССАСАввСАОаСАТАСТОбТСТТТАТСТАОАССебТСАТСААТаТСТВСТСССАТТ ....-----+-........+---------+---------+---------+--------- + 1200

САТССАТСААТСаСТвСТТТТССССТТСввСТААКТСАСТСТССТСААААСАСАССАСвС

САвАввТАТААвТТСССвСАААТТСвСАв. САТСААТСАвСТСТТТвАСОТССТСАввОТ

ОАССАСТССССССАСССвСАССАСОАССАТвААТССТТААСвАТСАСвАТСТТССТССАб

САвСТСввСААОАТвЬТввТСААТвСТАТТвАвСАССвСТААСАЛСвАСАСССвТТСТТв

1501

1561

1621

1260

1320

1380

1440

1500

СваСбСТААвССАТвСТвАТТСААаТААСОввСТАТТТСАТТСАСвТТАТТАСССАТССС аСТСАССТСАСОТААСААваТСОаЗТСТАСССТаАввеТАОСССАССАССсССаАССТСТ

АСвСвАТТСвССТААбССААСввСТСвТААССАСТСВвССАААТвСТТАССЭТСАСАвСв

1681

1741

1560

1620

1680

ТТСААвТАСССвСТвАТОСТССвСТТСввТСАвТСТвАТТТТСАТСТСТТТвбТССССТТ

---------+---------4---------♦---------+---------♦---------♦ 1740

ТТССАТОАСААТССС СТвАвАААОТТТ Св САСССАААСТССС5ААТТТТСОСАСТСОАТСС ---------4.-.---------_-------------------------4. 1800

1801

ААОвООТТТСвбвОввСбвСаАССССССГСАААСАОТСАСАСАСОаСАССТССУимЗАдОа

1861

1921

1860 вАСвСТвТвТвТАСТдгСТТАбТАСАвСАТСТАТСвТАСАТСвАвбТСвСАТСАСССАСА

1920

ААСАААААОССССаСААААаСАСввСТСТТАТСТаАТАТАввТГвТТТТвТСТСАСАСвв ---------₊---------♦---------♦---------4.---------₊---------₊ 1980

1981

2041

САбСаОААОАОвААТСССААСТваТАСТОСТАвТАСТАТГСаАТССТССТОАССАТАТТГ

2040

ТССвСТТТОАСССААввСТТАААТААТСААТвССТвТААТСААСвАТСТСААТАСвССТТ

---------4-------------------------------------------------4 2100

2101

СввАТАССАТАОСвАТАААСОТАТСТТвСТввТТАТввСТТвСвАТвСАААТСвТАваАТ

---------4.--..-.---4-------.-4---------4---------4---------+ 2160

САССТТТПТАТАСТГТААААСАССТвСТАААТАТССАТТТТСАТСТАОААСАСТСТТАА ..---.-.4.-- — ------------..-.4...-...-..4..-..-----4....---..-4. 2220

2221

2280

СТАОСТТССвАОАААААвСАТССвСАТСАТОАСТАТСТТТАТТТАСТСвСТСААТАААТТ ---------♦-------.-------------------4..........4......... 2340

2161

2281

ТССТТААОТСААСАААТСССТГААААССАбТСОАСАТАТТСТТААСААААТСАаТСаСАС ²³⁴¹ -........♦.......---------*.........*.........-.......-- + 2400

САТТГГТТАТССАТССТТТАТАОССАААААААСбСТСОААААСАТТТТСаТСаТАСАТАА 2401 ---------*-------------------------+ ---------₊ 2460

АТАССаТАТСеССАвСАААААСААОАОАТаССТТАССАТСААТАОАААТСАТАТСТТвАТ 2461 .........♦.........*.........+.........♦......... +2520

СТАСТСОАСЛТАСТТСТТТТТТССТАААСССАТАААААТТА'ПТТТСТТТСТТСАТААвТ 2521 .... ♦.........*.........+.........*.........+.........+2580

ТТТСААСТООАТАТТОСТТСТТСТАТАТСЭТТАТАСААТТОТСОТСАТТАТТСТТАСТСА 2581 .........♦.......-- +.........+......... ♦ 2840

АААСОААААТвАТТСАвТСААСТТГТаАТАТТАОАТСеАСАСТаТСААААТСААСААТТа

2641 -------- ----------------+-:-------*---------«. 2700

6САТАТТТТСАТТОССАТСАССАССАААСССА<ЗСАТСАААСАСААТСССАСТСАСАААСТ 2701 .........+.........♦.........♦......... +2760

ТСАТТГаСТСАТТАТСАТАСТССТСАССАТСАТТТАААААТСАААТаотаТТаотаСОСТ 2761 .........+.........♦.........+......... *.........42820

САСТТАЗТОТАТТААСАТСТСАТАСТАТСАСААССССАТТТТСТАААТСАОАТАТАОТТТ 2621 ---------+---------+-------------------*---------♦---------+ 2880

ТСТТТАТСАСАТТАТСААТААТООАСТСТТТТАбСТСАСТОТСАТТТТТААОСАТбССАА 2В81 --------- + ---------+---------+—--------------+---------* 2940 ‘ГГГГАТАССТААААОАетССТТАОСАСССаСТГГАССТТТАТТТТТАААОТТАААОТААС

2941 ......... +.........+ 3000

ТСТаСААТОТААСАТСЗТТААТАТСАСААТСААААТОСТТАТАСАСТТСТААААбСТСТТ

3001 ---------+-------------------♦---------+---------+--------- 3060

ОТвСТТТТБСТТСАТГАТССТССАААОСАТСААСАТСТЬААОбСАТССТСАСТСАТСАТС

3061 .........+... +...................♦.........-г 3120

АТТССТСТАТСАТГГТТТйСОССААССТТАААТАаТСАТСАТСАПТАТАаСТСТСАТАА

3121........-♦-------------------+-........♦.........♦ 3180

ААТСАТТТТСТТТТАТТАААТСТГТАЗАТААААСТАТСАААСТСАССетСТТаСОТТТГГ

3181 .........*.............................♦......... *3240

ССССТГССАТТАОСТАССАСАСТСТААОТААТСТТАТАвОСАаАААСАТТАААТААТСАС

3241 ---------+-----------------------------* 3300

4681

4741

4801

4861

4921

4981

4740

4800 · + 4860

СТТТАСвСТСАТАСТАСТТСТТаТАбАТАСАСТТвТСАСТАСАТСААбАааТСАСАТОАТ

4920 вОССАСбАТТААТАТТССЗАТСОАТСАСОАССТСААААОССССТСТТАТОССОСАСТСОА .........*.....----+.........♦.........♦.........♦.........+ 4980

5041

5101

АААаСТвСбСбТААСаССЗТССЗАССТТСТСС13ССАААСАСТСЗААТАТатсЮСССАААС ---------»--------------------+---------+---------₊ 5040

С8ТТСОС<ЗАТСбТСТ<ЗОААААСССАСАСвСавОбССТАААдСТ<ЗТСАСТа<5АТ<ЗАОСТАТ

5100

5160

5161

5221

5281

ААССТТОААТТТОАТССССОАОСССТСААбААООААТСВСССААЗСТССЗаОАТОАТСТС ------------------------------------+.........+........-+ 5220

СОТСТОСАСТТСААаААААААСТССАвСАввТТСТАСААСАССССасевАТСОАТААААА

5280

ТСаССТбСвАОАвСТЗСАТЗАСТЗСТАСААААТСААвСГССетЗСАТСССаТТАТСвСТТ .........♦..... *---------------------------------------+ 5340

5341

5401

ОСТСТАТСАООТТСвССАТСАААССАТТАСОетАТТССТГСОТООСааТССаТААваОС

ОАвСаТГСТСССвСТТАССАТОСаеСССеАТАААСОСТТАТАААСТСАТбСССТСАССаС

5461

5400

5460

5520

3301 ......... +---------+.........*...................* 3360

АСАААСААААААТТААСТАТАТТТаАТОСТТТаСТТАААТСАОТАААОАССААСаОСАТТ

3361 -------------------------+.........+................♦ 3420

АТОТАССТТСАТААААААСАААОАТАСТСАССОбАТТСТТТТТТАСАТвАААСОАССТТТ

3421 —......+---------+-..... +......... +.........♦ 3480

ААСТТТСТГОАСАССеСАССвСАСТСТААетТГТТСААААСССАТСОАТАССАААТОТАТ

3481 .........*.........*.........*.........*...................* 3540 аТАТААвААСААбТТААААТСАААасССсОСАСАТСАСТСАССТСААТАСАСААААТОТТ

3541 .........*......... * 3600

ААТСТбСТАТГТбААТАаТСаАЭТАСССАТТОАААТТТТССАТССССаССАОААСАСОАА

3601 -------------------+----—---+---------♦------------------.₊ з$бо аАСАТОбССТТАТСТААААСАвАССАТАСбТТАТСААТАССАбАААААТАТАТТСТГАТС

3661 ---------+------------------- ---------₊ 3720

ОСТАТаАААТАААААСААСАТТОАТААОАОАТАСАТТСГААТТТТСАТТТТТОТААААТТ

3721 --------------*------_.«+------··-+ 3780

ТССТОТАССАСОТТСАТСТАСТТАТТССТАААСАААТССАТТСТССАТСТСТААСТТТСа

3781 ---------♦---------- ---------*---------+-------------------- 3840

СССТТССАССАССАаАбСТТТГГТТТССАСОТТвАСаСТаААТТТСАОААаТАТОТвТТТ

3841 .........♦.........+--.......+---------*........- +.........+ 3900

СТТТААСАТАСТСТТСАААбССААеСТСТОТААОбТТСТТАСТТаТССАСТТАОССАСАС

3901 ------.--+---------+----..---₊---------♦ ---------+ _Э9£0

ТТТТАССААТТСССАТОАСТТСбТТСТСОТСТАААООТССгаСАСААСТССАОаТТаТАОб

3961 ---------♦------------------· +---------+ -..... +---------+ 4020

СТТТАОСеСбТТСААТЗСАвОСТГ6ТАСССАТТО<ЗТСАТАСТССОаССАбССТТО<ЗСЗ<ЗА

4021 ---------♦---------+------------+-------·- +---------₊ 4080

ТАвСбС6<ЗТААаСССАСТТаСОа»ТТГГАТС<ЗАА6АСОвТОСАетТАС5(ЗССТАААССет

4081 ----------------+-------------------+---------♦---------+ 4140

АСТССОССАОаАТГГССССбТСАТТОдСТСССССААСвТСеАОбТААТСООСТААССАСТ

4141---------*---------+-------------------♦---------+---------♦ 4200

СААСбСТАТАОАаСТСТв6СТОССАбАСббТаАТСТ(ЗССАбТ<ЗСА<3<ЗТ®ЗТТСв<ЗАТТСТ

4201 -------------------+-------------------+-... * 4260

ТОСАААТТАССССТСААТАССССССАТСТОСССССААТТТТТТАСССАСЗСССАТТСТСОА

4261 ---------*... - +.........*......... +.........♦ 4320

ТООССбСбвСОТАТТТААвОСКЗСОСАбСТССАССАТСССССССОаТАСОТАССССССТАТ

4321 .........+--.....— ♦.........+... +.........+ 4380

6СААТССАТАСЛАСАвОТ(5АвСАТОТСС6ТТСТСввветТТГТаАТСОТОАвТОТОб<ЗСО

4381 -----------♦---------+-----------------------------+ 4440

САбвТОСССССАВАТССЗОСССААТСААТОЗСОбСТССООСТССОТССАСбТСАААвСААА

4441 ---------₊-----------------₊----------------₊ 4500 вССАвТАСАТвваЗТОАвОСТОАТГАААСТОаАТОТАТТТТОСОАваАОАвСАСвСГСТТ

4501 —-------------------------₊---------+---------+ 4560

ТАССООСААТаССЗААСАССАААСТСТАААТСАТСОвАвААвТАСОаСТТвТеаСОТААСС

4561 -------------------♦---------*---------+---------♦---------+ 4620 <ЗОТСвТТААААА8СОТТАААеССТаАТТАТССААТССТСССАаССТТАТОвСавбаСТ(ЗТ

4621 ---------------+-........+.......-------------------♦ 4680 (ЗСТСТСаАСТТСОТвСЗССААаССОвТОАСТГ --------------*.-----5552

Фиг. 4. Изображение последовательности нуклеотидов плазмиды рМиТ2 штамма Э8М 6601 величиной примерно 5 тысяч пар нуклеотидов

5521

Фиг. 5: Рестрикционная карта плазмиды рМиТ2. Черные полосы символизируют обнаруженные гомологии последовательности ДНК к последовательностям ДНК плазмид других энтеробактерий. Позиции релевантных мест рестрикции представлены.