KR20010005924A - 박테리아 플라스미드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 도 1 또는 도 4에 도시된 누클레오티드 서열을 갖는 플라스미드 및 DNA-서열 및 이것의 용도에 관한 것이다.

Description

박테리아 플라스미드 {BACTERIAL PLASMIDS}

플라스미드는 거의 모든 박테리아 및 몇몇 진핵 생물 그리고 미토콘트리아에 존재하는, 작고 염색체외이며 대부분 환형인 자기 복제 DNA-분자이다. 플라스미드의 크기는 약 1.5 내지 300 kb 사이에서 다양하다.

박테리아 플라스미드는 일반적으로 환형이고 공유 결합하며 수퍼코일 구조이다. 상기 박테리아 플라스미드는 항생 물질 또는 중금속에 대한 저항 유전자, 비전형적(untypical) 물질 대사를 위한 유전자 또는 대사 특성 또는 독성 인자와 같은 일련의 종특유의 형질에 대한 유전자를 갖는다. 몇몇 플라스미드는 하나의 세포에서 다른 세포로 전달될 수 있다. 박테리아의 질병 유발력이 오늘날의 시각에서는 부분적으로 플라스미드의 특성에서 기인하기 때문에, 플라스미드-DNA 특성을 밝히는 데에 대한 관심이 점점 늘고 있다.

14개의 주요 속 및 그밖의 6개의 속이 속한 장내세균과에서는, 상기 장내세균이 상이한 특성을 형성할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 전형적인 예는 대장균, 살모넬라균 및 클레브시엘라속(Klebsiella)이다. 대장균(E.coli)은 박테리아 유전학의 고전적인 대상이다. 대장균의 다양한 독성 인자의 발견 및 형질 분석은, 상기 종의 목(phylum)이 새로이 확산된, "EHEC"로 일컬어지는 종류의 경우에서와 같이, 비전염성으로부터 높은 등급의 전염성까지 이르는, 부분적으로 극단적으로 상이한 인체 질병 유발성 또는 동물 질병 유발성을 가진다는 것에 대한 일반적으로 만족스러운 설명을 가능하게 한다. 따라서, 소화관외 및 소화관의 대장균-문에 대해 이미 부분적으로 우수하게 형질 분석이 된 일련의 독성 인자가 설명되었다. 혈청-그룹(Sero-Group) O6:K5의 병인성 대장균-문에 대해서는 예를 들어, 상기 혈청-그룹의 비병인성 제재에서는 확실히 나타나지 않는 용혈소(Haemolysine) 및 P-핌브리에나드헤신(Fimbrienadhaesine)과 같은 독성 인자가 발견되었다.

독성 유전자는 장내세균에서 일반적으로 큰 플라스미드(약 60 kb)로 발견된다. 그러나, 소형의 소위 크립토 플라스미드를 갖는 장내세균도 있으며, 그것의 기능은 지금까지 아직 확실히 알려지지 않았다.

이에 대해, 대장균의 경우 독성 인자가 적어도 부분적으로 플라스미드의 유전자에도 존재한다는 것이 알려졌으며, 따라서 예를 들어 장내세균에 의한 감염에 따른 질병시의 진단 및 치료 가능성을 향상시키기 위해, 장내세균 및 특히 대장균의 플라스미드를 발견하고 형질을 분석하기 위한 지속적인 연구가 필요하다. 플라스미드 또는 그것의 박테리아 운반체 또는 상응하는 합성 DNA는 미생물학적 분석 화학 또는 진단학에 그리고 의학적인 치료 또는 예방에 그리고 영양 생리학 또는 선생물학적(probiotic) 목적으로도 사용될 수 있다. 또한, 플라스미드 특히 대장균의 플라스미드는 유전 공학에서 공지된 발현 벡터(expression vector)여서, 이러한 이유로 인해서도 이러한 종류의 플라스미드의 특성에 대한 지식 향상에 관심이 있다.

본 발명은 박테리아 플라스미드에 관한 것이다.

도 1은, DSM 6601문의 약 3 kb 크기의 pMUT1 플라스미드의 누클레오티드 서열이며,

도 2는 pMUT1 플라스미드의 제한카드이고, 검정색 띠는 다른 장내세균의 DNA-서열에 대한 발견된 DNA-서열 상동을 의미하며, 관련된 제한 교점의 위치가 제시된다.

도 3은 2개의 플라스미드 pMUT1(a) 및 pMUT2(b)에 대한 발견된 미해결 해독구조이며,

도 4는 DSM 6601문의 약 5 kb 크기의 플라스미드의 누클레오티드 서열이고,

도 5는 pMUT2 플라스미드의 제한카드이고, 검정색 띠는 다른 장내세균의 플라스미드의 DNA-서열에 대한 발견된 DNA-서열 상동을 의미하며, 관련된 제한 교점의 위치가 제시된다.

이를 위해 대장균-문 DSM 6601에 의한 분자 유전학적 연구가 실행되었다. 상기 대장균-문으로부터 획득한 DNA-서열은 데이터 뱅크 프로그램의 도움으로 DNA-서열 분석이 이루어졌으며 다른 박테리아의 이미 존재하는 DNA-서열과 비교되었다.

DSM 6601문은 3177 또는 5552 bp의 크기를 갖는 2개의 소형 플라스미드를 가지며, 상기 플라스미드는 pMUT1 또는 pMUT2로 표기되었다.

작은 pMUT1 플라스미드의 DNA는 선상 단편(linear fragment)로서 효소 HindⅢ에 의한 절단 후 벡터 pUC18로 서브클론(subclon)되고, 그 다음 DNA-서열이 검출되었다. 이것은 첨부한 도 1에 나타난다. 이렇게 획득된 DNA-서열과 GenEMBL-데이터뱅크와의 상동(homology)-비교를 실행했다; 상기 비교 결과는 도 2에 나타난다.

이러한 비교를 위해 HindⅢ-교점이 위치 1로서 결정된다. 200 내지 800bp 위치에서 pMUT1 플라스미드의 DNA는 다른 장내세균 플라스미드의 여러 복제 개시점(origins of replication), 특히 플라스미드 NTP1, NTP16 및 CloDF13에 대한 완전 상동을 나타낸다. 950bp 위치 영역에서는 원래 살모넬라 티피머리움 (typhimurium)으로부터 분리된 플라스미드 NTP16에 대한 570bp 크기의 상동이 시작된다. 이러한 상동은 플라스미드 NTP16의 활동성에 있어 필수적인 mobAGen 및 전달 개시점(origin of transfer(oriT))을 포함한다. 또한 1790 내지 1920bp 위치에서는 세포 분열시 플라스미드 분자의 안정성 및 연속적인 전달 그리고 분열을 위해 중요한 parA 및 cer 유전자에 대한 완전 상동이 발견되었다. 나머지 DNA-영역에 대해서는 완전 상동이 식별되지 않는다.

또한, pMUT1 플라스미드의 DNA-서열이 아미노산-서열로 새로 기록되었고 미해결 해독구조(reading frame)의 존재가 분석되었다. 6개의 상이한 해독구조 가능성이 조사되었다. 전체적으로 143, 62, 56, 49 및 48 아미노산 크기를 갖는 5개의 미해결 해독구조가 발견될 수 있었다. 상기 분석의 그래픽이 도 3에 도시된다.

큰 pMUT2 플라스미드의 DNA는 제한 효소 SphⅠ으로의 선상(linear)화 후 역시 벡터 pUC18로 서브클론되고, 그 다음 완전히 서열화되었다. 상기 DNA-서열은 도 4에 제시된다. 이렇게 획득횐 DNA-서열은 GenEMBL-데이터뱅크 프로그램의 도움으로 이미 공지된 DNA-서열에 대한 상동이 조사되었다. 그 결과는 도 5의 그래픽에 도시된다. pMUT2 플라스미드의 DNA는 890 내지 1660bp 위치에서 대장균의 상이한 ColE1-플라스미드의 레플리콘(replicon) 영역에 대해 완전 상동을 나타낸다. ColE1-플라스미드에 대한 다른 완전 상동은 3800 내지 4950bp 위치 영역에서 존재한다. 이 경우에는 ColE1-플라스미드의 활동 영역에 대한 상동이 다루어진다. 3770 내지 4980bp 위치 영역에서는 파스퇴렐라속(Pasteurella)-면역용혈체 (haemolytica)-문 A1의 플라스미드에 대한 상동이 발견되었다. 상기 플라스미드에는 파스퇴렐라에서 항균 내성 단백질에 대해 코드화되는 유전자가 존재한다. 그러나, 유전자간 영역에서 상동이 이루어져서, 플라스미드의 활동성에 필수적인 서열도 다루어질 수 있다.

다른 장내세균 플라스미드에 대한 완전 상동을 갖는 2개의 영역이 식별되었다. 이 경우에는 플라스미드의 활동성에 필수적인 복제 개시점-영역 및 mob-영역이 다루어진다. pMUT2에 있어서는 나머지 DNA-섹션에 대해 완전 상동이 식별될 수 없었다.

그 다음, pMUT2 플라스미드의 DNA-서열은 아미노산-서열로 새로 기록되었고 미해결 해독구조의 존재가 분석되었다. 그 결과는 도 3에 역시 그래픽으로 도시된다. 327, 318, 264, 76 및 63 아미노산 크기 배열에서 5개의 아미노산-서열의 미해결 해독구조가 발견되었다.

지금까지 공지된 pMUT1 및 pMUT2 플라스미드 외에 상기 플라스미드의 조합은 지금까지 대장균-문 또는 다른 장내세균에서 발견되지 않았다.

플라스미드의 존재는 대사적(metabolic) 및 의학적 및/또는 영양 생리학적 또는 선생물학적으로 이용될 수 있는 DSM 6601문 특성과 관련된다.

플라스미드 연구는 장내세균 및 특히 대장균-그룹의 정확한 결정 및 분석을 가능하게 한다. 또한, 상기 플라스미드는 유전 공학에 대한 미해결 발현 벡터를 제공한다.

실시예 1:

플라스미드-분리

플라스미드-DNA 분리는 번보임(Birnboim) 등의 문헌(Birnboim, A.C 및 Doly, J(1979) Nucl.Acids Res. 7:1513-1523, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA)에 기재된 방법에 의존하여 수행하였다.

3 ml LB-배지에 박테리아 군체를 주입하고 37℃에서 밤새 교반한다. 상기 배양된 조직을 Eppendorf 용기에서 원심 분리하고, 배지 잔류물은 피펫으로 제거한다. 세포 침전물을 100μl 용액(Ⅰ)(50mM 포도당; 10mM EDTA, pH 8; 25mM Tris-HCI, pH 8)으로 재현탁(resuspend)한다. 실온에서 5분간의 반응 후 200μl 용액(Ⅱ)(0.2 N NaOH; 1% SDS)을 첨가하고 맑아질 때까지 혼합하며 Eppendorf 용기를 얼음에 5분간 놓는다. 그런 다음, 150μl 용액(Ⅲ)(3M 나트륨-초산염, pH 4.8)을 첨가하고 염색체 DNA가 양털 형태(flock)를 형성하며 분리될 때 까지 교반하고 상기 혼합물을 다시 한번 5분간 얼음에 놓는다. 분리된 염색체 DNA 및 세포 잔류물을 5분간 원심 분리로 결정화하고 플라스미드-DNA를 갖는 결정을 새로운 용기로 옮긴다. 플라스미드-DNA를 소독하기 위해 50μl 페놀 및 150 μl 클로로포름/이소아밀알콜(24:1)을 첨가하고 교반한 후 2분간 원심 분리한다. 묽은 상(phase)을 피펫으로 새로운 용기로 옮긴다. 플라스미드-DNA는 2개의 체적으로 차가운 에탄올에서 분리하고 10분간 원심 분리한다. 상기 결정은 70% 에탄올로 세척하고 Speedvac에서 건조시킨다. 플라스미드-DNA를 20μl H₂O_bidest에서 재현탁하고 -20℃에서 보관한다.

실시예 2:

DNA-서열화

DNA-서열화를 에프 상거(F.Sanger) 등의 문헌[Sanger, F., Nicklen, S. 및 Coulson, A.R.(1977) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74: 5463-5467, DNA sequencing with chain terminating inhibitors]에 기재된 방법에 의존하여 수행하였다.

상기 DNA-서열화를 파마시아(Pharmacia) LKB사의 T7-서열화-키트에 의해 수행하였다.

변성 단계를 위해 8μl(1.5 내지 2μg)의 플라스미드-DNA와 2μl의 2 N 수산화나트륨을 혼합하고 원심분리하여 10분간 실온에서 반응시킨다. DNA를 3μl의 3M 나트륨-초산염, pH 4.8 및 7μl의 H₂O_bidest그리고 60μl의 차가운 무수 에탄올에서 -70℃로 15분간 침전시킨다. 침전된 DNA를 10분간 원심 분리하고 70%의 에탄올로 세척하며 건조시킨다.

어니일링(annealing)-반응을 위해 10μl의 H₂O_bidest에서 변성된 DNA를 현탁하고 2μl의 어니일링-완충액 및 2μl의 프라이머(40ng)와 혼합한다. 상기 혼합물을 20분간 37℃에서 반응시켜, 프라이머를 주형(template)-DNA에 연결한다. 상기 반응 혼합물을 10분간 실온에서 냉각한 다음 곧바로 라벨링(labelling)-반응에 사용하거나 -20℃에서 냉각한다. 라벨링-반응을 위해 3μl의 라벨링-혼합물, 1μl[α-P³²]dATP 및 2μl의 T7-폴리머라제(polymerase)(T7-폴리머라제는 효소 희석 완충액과 1:5로 희석된다)를 어니일링-반응 혼합물에 첨가하고 혼합한 후 5분간 실온에서 반응시킨다. 그 동안, 종결 반응을 위해 준비된 서열 혼합물(2.5 μl의 'G'-, 'A'-혼합물, 'T'-혼합물 및 'C'-혼합물 "short"를 갖는 각각 하나의 용기)을 37℃로 미리 가열한다. 라벨링-반응이 진행된 후 상기 라벨링-반응 용액 중 4μl를 각각의 서열 혼합물에 첨가하여 혼합한다. 상기 종결 반응을 37℃에서 5분간 유지한다. 종결 반응을 종료하기 위해 각각 5μl의 종료-용액이 첨가한다. 상기 혼합물을 95℃의 인큐베이터로 옮기고 2분간 변성시킨 다음 얼음에 놓는다. 각각 2.5μl의 반응 용액을 서열 교화체(gel)[25.2g의 요소, 22 ml의 H₂O_bidest, 6 ml의 10× TBE, 10 ml의 폴리아크릴아미드(40%), 2 ml의 과황산암모늄(16 mg/ml), 60μl의 TEMED]에 'G', 'A', 'T', 'C'의 순서로 제공한다. 전기영동은 40 와트 및 1500 볼트로 4.5 시간동안 실행한다.

Claims (7)

1. 도 1에 도시된 DNA-서열 및 이것의 대립유전자 변이체를 갖는 플라스미드.
2. 도 4에 도시된 DNA-서열 및 이것의 대립유전자 변이체를 갖는 플라스미드.
3. 도 1에 도시된 누클레오티드 서열을 갖거나 이 누클레오티드 서열로 구성된 DNA-서열.
4. 도 4에 도시된 누클레오티드 서열을 갖거나 이 누클레오티드 서열로 구성된 DNA-서열.
5. 미생물학적 분석학 및/또는 진단학에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 4항에 따른 플라스미드 또는 DNA-서열의 용도.
6. 의학적 및/또는 영양 생리학적 또는 선생물학적 목적으로 사용하기 위한 제 1항 내지 제 4항의 플라스미드 또는 DNA-서열의 용도.
7. 발현 벡터로서 사용하기 위한 제 1항 내지 제 4항에 따른 플라스미드 또는 DNA-서열의 용도.