JP2000514661A - 細菌性プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、図（１）又は（４）中に記載のヌクレオチド列を有するプラスミドもしくはＤＮＡ配列並びにその使用に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌性プラスミド 本発明は、細菌性プラスミドに関するものである。 プラスミドは、染色体外の主として環状で自己複製する小さなＤＮＡ分子であ り、ほとんど全ての細菌あるいはまたいくつかの真核生物並びにミトコンドリア の中に存在している。プラスミドの大きさは、約1.5〜300ｋｂの間で変動する。 細菌性プラスミドは、通常、環状で共有結合して閉じており、かつ超らせんに なっている。これらは、多くの場合、抗生物質又は重金属に抵抗性の遺伝子、非 典型的基質の代謝のための遺伝子又は一連の種特異的特徴、例えば代謝特性又は 病原性因子のための遺伝子を有している。多くのプラスミドは、１つの細胞から 別の細胞へ転写することもできる。細菌の病原性は、今日の見解によればプラス ミドの性質によっても部分的に左右されるので、プラスミド−ＤＮＡの性質の解 明に関して、重要性がより一層大きなものになっている。 腸内細菌科については、１４の主属と６の別種が含まれるが、これらは、種々 の性質を発達させることができることは公知である。代表的な例は、大腸菌（Es cherichia）、サルモネラ菌（Salmonella）及び 肺炎桿菌（Klebsiella）である。大腸菌（E.coli）は、バクテリア遺伝学の古典 的対象である。ようやく、大腸菌E.coliの種々の病原性因子の発見と特性決定に より、前記の種類の菌株が、最近広がった「EHEc」として公知の変種の場合のよ うに無毒性から高度な毒性にまで達する部分的に極端に異なるヒトもしくは動物 病原性を示すことについての一般に満足のいく説明を見出すことが可能になった 。それで、腸管外並びに腸内の大腸菌E.coli株については、部分的に十分に特性 決定されている一連の病原性因子が既に記載されている。血清グループ０６：Ｋ ５の病原性大腸菌E.coli株については、例えば前記の血清グループの非病原性の 代表の場合には明らかに生じない溶血及び うな病原性が見出された。 ビルレンス遺伝子は、腸内細菌の場合には、通常大きなプラスミド（約60ｋｂ ）上に見出される。あるいはまた、小さな、いわゆる潜在プラスミドを有する腸 内細菌も存在しているが、その機能は、これまでにまだ確定できてはいなかった 。 大腸菌の場合には、病原性因子が少なくとも部分的にプラスミドの遺伝子中に も存在していることは公知であるので、従って例えば腸内細菌による感染後の疾 患の際の診断及び治療法を改善するために腸内細菌、殊に大腸菌E.coliの場合の プラスミドの発見及び特 性決定のための他の試験に対する要求がある。プラスミドもしくはその細菌担体 又は相応する合成ＤＮＡは、微生物学的分析又は診断の際、医学的には治療又は 子防の際並びに栄養生理学的又は共生目的に使用することができる。その上更に 、プラスミド、詳細には殊に大腸菌E.coliのプラスミドは、遺伝子工学における 公知の発現ベクターであるので、前記の理由からも、この種のプラスミドの性質 の訂正された知識は重要である。 更に、大腸菌E.C0li株DSM 6601を用いる分子遺伝学的試験が実施された。この 菌株によって得られるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列分析のデータバンクプログラム を用いて取出され、既に存在する別の細菌のＤＮＡ配列と比較されている。 前記菌株DSM 6601は、pMUT1もしくはpMUT2と呼称された3177もしくは5552ｂＰ の大きさの２種の小さなプラスミドを有している。 より小さい方のプラスミドpMUT1のＤＮＡは、酵素HindlIIIを用いる制限切断 後に、ベクターpUC18中の線状フラグメントとしてサブクローニングされ、引き 続き、ＤＮＡ配列が決定された。これは、添付図１から明らかである。こうして 得られたＤＮＡ配列を、GenEMBL−データバンクを用いて相同性を比較したが、 前記の対比の結果は、図２から明らかである。 前記の比較のために、HindIII−切断部位を１位と 定めた。200〜800ｂＰ位で、プラスミドpMUT1のＤＮＡは、別の腸内細菌のプラ スミドの種々の重複出発地点（重複起点）、特にプラスミドNTP1、NTP16及びClo DF13に対する有意相同性を示している。950ｂＰ位の領域では、もともとサルモ ネラチフィムリウム（Salmonella typhimurium）から単離しておいたプラスミド NTP16に対する570ｂＰの大きさの均一性が開始している。前記の相同性には、プ ラスミドNTP16の可動性にとって必要であるmobA-Gen、伝達起点(oriT)が含まれ ている。その上更に、1790〜1920bp位から、遺伝子parA及びcerに対する有意相 同性が見出されたが、これは、細胞分裂の際の安定性及び連続的な情報伝達及び プラスミド分子の分布にとって重要である。その他のＤＮＡ領域については、有 意相同性を確認することはできなかった。 その上更に、プラスミドpMUT1のＤＮＡ配列を、アミノ酸配列中に書き換え、 開いた読み取り枠の存在を分析した。６つの異なる読み取り枠の可能性を試験し た。１４３、６２、５６、４９及び４８のアミノ酸の大きさを有する全部で５つ の開いた読み取り枠を見出すことができた。分析図は、図３中に図示してある。 より大きなプラスミドpMUT2のＤＮＡを、制限酵素SphIを用いる線状化後に同 様にベクターpUC18中にサブクローニングし、引き続き、完全に順序付けした。 ＤＮＡ配列は、図４から明らかである。こうして得ら れたＤＮＡ配列を、遺伝子EMBL-データバンクプログラムを用いて、既に公知の ＤＮＡ配列に対する相同性について試験した。結果は、図５中に図示してある。 プラスミドpMUT2のＤＮＡは、890〜1660ｂＰ位中で大腸菌E.coliの種々のColE1 −プラスミドのレプリコン領域に対する有意相同性を示している。ColE1プラス ミドに対するもう１つの有意相同性は、3800〜4950ｂＰ位の領域に存在している 。この場合、ColE1−プラスミドの可動領域に対する相同性が重要である。3770 〜4980ｂｐ位の領域中には、パスツレラ−ヘモリチカ株A1のプラスミドに対する 相同性が見出された。前記のプラスミド上には、パスツレラ属の場合に抗菌性耐 性蛋白質についてコードする遺伝子が存在している。しかしながら、相同性は、 遺伝子間領域に亘って延在しているので、プラスミドの可動性にとって必要であ る配列が重要であることもある。 別の腸内細菌プラスミドに対する有意相同性を有する２つの領域を確認した。 この場合、プラスミドの可動性にとって必要である複製領域の起点及びmob−領 域が重要である。pMUT2については、その他のＤＮＡ断片にとって、有機相同性 を確認することができなかった。 また、プラスミドpMUT2のＤＮＡ配列を、引き続きアミノ酸配列中に書き換え 、開いた読み取り枠の存在を分析した。結果は、図３中に同様に図示してある。 ３２７、３１８、２６４、７６及び６３のアミノ酸の大きさでのアミノ酸配列を 有する５つの開いた読み取り枠が見出された これまでに知られていないプラスミドpMUT1及びPMUT2以外に、これらの組合せ 物も、これまで、E.coli菌株又は別の腸内細菌中に見出されていない。 プラスミドの存在は、菌株DSM 6601の代謝及び医薬及び／又は栄養生理学もし くは共生に利用可能な性質に関連していることもある。 プラスミドの試験は、腸内細菌、殊に大腸菌属のより詳細な決定及び分析を可 能にする。その上更に、前記プラスミドは、遺伝子工学にとって懸念されない発 現ベクターとして提供されている。 以下に本発明を実施例に基づき詳細に説明する： 例 １： プラスミド単離 プラスミド−ＤＮＡの単離を、Birnboim他（Birnboim，A.C.及びDoly，J.(197 9)Nucl．Acid Res．7:1513〜1523 A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmidDNA）に基づいて行った。 ＬＢ−培地３ｍｌに、細菌コロニーを接種し、かつ３７℃で一晩振盪させる。 この培養物をエッペンドル フ容器中で遠心分離し、培地残分をピペットで除去する。細胞沈殿物を、溶液Ｉ （グルコース５０ｍＭ；ＥＤＴＡ１０ｍＭ、ｐＨ８；トリス−ＨＣｌ２５ｍＭ、 ｐＨ８）１００μｌで再懸濁させる。室温で５分間の培養後に、溶液ＩＩ（Ｎａ ＯＨ０．２Ｎ；ＳＤＳ１％）２００μｌを添加し、清澄になるまで混合し、かつ エッペンドルフ容器を更に５分間氷の上に放置する。次に、溶液ＩＩＩ（Ｎａ− アセテート０．２Ｍ、ｐＨ４．８）１５０μｌを添加し、染色体ＤＮＡをフレー ク上に沈澱するまで振盪し、かつ該沈殿物を再度５分間氷の上に放置する。沈澱 した染色体ＤＮＡ及び細胞残分を遠心分離器中で５分間ペレット化し、かつプラ スミド−ＤＮＡを有する上清を、新たな容器の中に移送する。プラスミド−ＤＮ Ａの精製のために、フェノール５０μｌ及びクロロホルム／イソアミルアルコー ル（２４：１）１５０μｌを添加し、かつ短時間の振盪後に２分間遠心分離する 。水相を新たな容器の中にピペットで入れる。プラスミド−ＤＮＡを、２用量の 氷冷却したエタノールで沈澱させ、かつ１０分間遠心分離する。ペレットを、７ ０％のエタノールで洗浄し、かつ高速真空（speedvac）中で乾燥させる。プラス ミド−ＤＮＡをＨ₂Ｏ_bindest２０ｍｌ中で再懸濁させ、かつ−２０℃で保存する 。 例 ２： ＤＮＡ−配列化 ＤＮＡ−配列化を、F．Sanqer他（sanqer，F.、Nicklen，S．及びCoulson，A ．R.(1977)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74．:5463〜5467のDNA sequencing wit h chain terminating inhibitors）に基づいて行った。 ＤＮＡ配列化を、Firma Pharmacia LKB社のＴ７−配列化キットを用いて行っ た。 変性工程のために、プラスミド−ＤＮＡ８μｌ（１．５〜２μｇ）を２ＮのＮ ａＯＨ２μｌと混合し、短時間速心分離し、１０分間室温で培養する。ＤＮＡを 、３ＭのＮａ−アセテート３μｌ、ｐＨ４．８並びにＨ₂Ｏ_bidest７μｌ及び氷 冷却したエタノール_absolut６０μｌを用いて−７０℃で１５分間沈澱させる。 沈澱したＤＮＡを１０分間遠心分離し、７０％のエタノールで洗浄し、かつ乾燥 させる。 アニーリング反応のために、変性したＤＮＡをＨ₂Ｏ_bidest１０μｌ中で懸濁 させ、かつアニーリング緩衝液２μｌ及びプライマー２μｌ（４０ｎｇ）と混合 する。沈殿物を３７℃で２０分間培養すると、鋳型ＤＮＡへのプライマーの結合 を行うことができる。反応バッチを室温で１０分間冷却し、次に標識化反応のた めに直ちに使用するか又は−２０℃で凍結させる。標識化反応のために、標識混 合物（Labelling-Mix）３μｌ、［α−Ｐ³²］dATP１μｌ及びＴ７−ポリ メラーゼ（Ｔ７−ポリメラーゼを酵素希釈緩衝液で１：５希釈）２μｌを、アニ ーリング反応バッチ中にピペットで入れ、かつ短時間の混台後に、室温で５分間 培養する。この間に、停止反応のために既に用意した配列剤混合物（２．５μｌ を有する各容器１個を「略して」'Ｇ'−Ｍｉｘ、'Ａ'−Ｍｉｘ、'Ｔ'−Ｍｉｘ及 び'Ｃ'−Ｍｉｘ）を３７℃で予備昇温させる。標識化反応の経過後に、それぞれ その４μｌを４種の配列化剤混合物に添加し、かつピペットで短時間混合する。 停止反応物を３７℃で５分間培養する。停止反応の終了のために、それぞれ５μ ｌの停止溶液を添加する。こうして各バッチを９５℃で培養器の中に移送し、２ 分間変性させ、次に氷の上に置いた。反応物それぞれ２．５μｌを、配列化ゲル ［尿素２５．２ｇ、Ｈ₂Ｏbidest２２ｍｌ、１０×ＴＢＥ６ｍｌ、ポリアクリル アミド（４０％）１０ｍｌ、過硫酸アンモニウム（１６ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ、Ｔ ＥＭＥＤ６０μｌ］の上に、'Ｇ'、'Ａ'、'Ｔ'、'Ｃ'の順序で載せる。電気泳動 を４０ワット及び１５００ボルトで４．５時間行う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ユルゲン シュルツェ ドイツ連邦共和国 ベルクホルツ―レーブ リュッケ アリス―ブロッホ―シュトラー セ ７ (72)発明者 ガブリエレ ブルム−エーラー ドイツ連邦共和国 ヴュルツブルク ゲー テシュトラーセ ３ (72)発明者 ユルゲン マリンカ ドイツ連邦共和国 ゼルム パウルスヴィ ーゼ 11 (72)発明者 ハンス プロッパート ドイツ連邦共和国 ハーゲン ローゼンシ ュトラーセ 102

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 図 １：ＤＳＭ6601菌株の約3kbの大きさのプラスミドpMUT1の ヌクレオチド配列図 中に記載のＤＮＡ配列を有するプラスミド及びその対立変異種。 ２． 図 ４：DSM6601菌株の約５kbの大きさのプラスミドpMUT2のヌクレオチド 配列図 中に記載のＤＮＡ配列を有するプラスミド及びその対立変異種。 ３．図１中に記載のヌクレオチド列を有するか又はこれからなるＤＮＡ配列。 ４．図４中に記載のヌクレオチド列を有するか又はこれからなるＤＮＡ配列。 ５．微生物学的分析及び／又は診断における、請求項１から４までのいずれか１ 項に記載のプラスミド又はＤＮＡ配列の使用。 ６．医学的目的及び／又は栄養生理学的目的もしくは共生目的のための、請求項 １から４までのいずれか１項に記載のプラスミド又はＤＮＡ配列の使用。 ７．発現ベクターとしての、請求項１から４までのいずれか１項に記載のプラス ミド又はＤＮＡ配列の使用。