EA003738B1 - Бактериальные плазмиды - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к плазмиде и последовательности ДНК с представленной на фиг. 2 последовательностью нуклеотидов и ее применению.

Description

Изобретение относится к бактериальным плазмидам.

Плазмиды представляют собой маленькие, внехромосомные, в большинстве круговые и самореплицирующиеся молекулы ДНК, которые присутствуют почти во всех бактериях и также в некоторых эукариотах и в митохондриях. Размер плазмид вирьирует примерно от 1,5 до 300 тысяч пар нуклеодов (т.п.н.).

Бактериальные плазмиды являются, как правило, круговыми, ковалентно замкнутыми и закрученными в суперспираль. Часто они несут гены резистентности против антибиотиков или тяжелых металлов, гены для метаболизации нетипичных субстратов или гены ряда видоспецифических характеристик, например метаболические свойства или факторы вирулентности. Некоторые плазмиды могут быть перенесены из одной клетки в другую клетку. Поскольку в настоящее время патогенность бактерий обусловлена частично также свойствами плазмид, то возрастает интерес к объяснению свойств плазмидных ДНК.

Из характеристик семейства Еп1етоЬас1епасеае, к которому относятся 14 главных видов и 6 других видов, известно, что они могут приобретать различные свойства. Типичными примерами являются ЕксйепсЫа, 8а1шопе11а и К1еЬ§1е11а. ЕксйепсЫа сой (Е. сой) представляет собой классический объект генетики бактерий. Только открытие и характеристика различных факторов вирулентности Е. сой позволили найти в общем удовлетворительное объяснение тому, что штаммы этого вида обнаруживают отчасти крайне различную патогенность для человека и животных, которая варьируется от авирулентности до высокой вирулентности, как в случае с распространяющимися в последнее время вариантами, называемыми «ЕНЕС». Таким образом, описан ряд факторов вирулентности как для экстраинтестинальных, так и для интестинальных штаммов Е.сой, которые отчасти хорошо охарактеризованы. Для патогенных штаммов Е. сой серо-группы 06:К5 обнаружены такие факторы вирулентности, как, например, гемолизин и Р-фимбринадгезин, которые не встречаются у непатогенных представителей этой серогруппы.

Гены вирулентности, как правило, обнаружены у энтеробактерий на больших плазмидах (около 60 тысяч пар нукпеоитдов). Существуют также энтеробактерий с небольшими, так называемыми криптическими плазмидами, функция которых до сих пор еще окончательно не определена.

Если известно, что факторы вирулентности Е.сой присутствуют по меньшей мере также частично в генах плазмид, то появляется необходимость в дальнейших исследованиях для обнаружения и характеристики плазмид у энтеробактерий и, в частности, у ЕксйепсЫа, например, для улучшения диагностических и терапевтических возможностей при заболеваниях, вы зываемых заражением энтеробактериями. Плазмиды и, соответственно, их бактериальные носители или соответствующие синтезированные ДНК можно применять в микробиологической аналитике или диагностике, в терапии или профилактике, и также для физиологии питания или пробиотических целей. Кроме того плазмиды, в частности от Е. сой, являются известными векторами экспрессии в генной инженерии, поэтому по этой причине также существует интерес, касающийся исследования свойств подобных плазмид.

Кроме этого, были проведены молекулярно-генетические исследования со штаммами Е. сой Ό8Μ 6601. Полученные из этого штамма последовательности ДНК подвергали анализу секвенирования ДНК с помощью программ банка данных и сравнивали с уже имеющимися последовательностями ДНК других бактерий.

Штамм Ό8Μ 6601 имеет маленькую плазмиду размером 5552 пар нуклеотидов (Ьр), которая обозначена рМиТ2.

ДНК плазмиды рМИТ2 после линеаризации с рестрикционным энзимом 8рй1 также субклонировали в вектор рИС18, и затем полностью секвенировали. Последовательность ДНК представлена на фиг. 2. Полученную таким образом последовательность ДНК исследовали с помощью программы банка данных ОепЕМВЬ на гомологию к уже известным последовательностям ДНК. Результат графически изображен на фиг. 3. У ДНК плазмиды рМИТ2 обнаружена характерная гомология к области репликации различных Со1Е1-плазмид от Е. сой в позиции от 890 до 1660 пар нуклеотидов. Другая характерная гомология к Со1Е1-плазмиде находится в регионе позиции от 3800 до 4950 пар нуклеотидов. Здесь речь идет о гомологии к области мобилизации Со1Е1-плазмиды. В регионе позиции от 3770 до 4980 пар нуклеотидов обнаружены гомологии к плазмиде штамма А1 Ра81еите11а йаешо1у!1са. На этой плазмиде расположены гены, которые у РаЧеиге11а кодируют белки антимикробной резистентности. Тем не менее, гомология распространяется на интергенную область таким образом, что возможно речь идет о последовательностях, которые необходимы для мобилизируемости плазмиды.

Идентифицированы два региона, имеющие характерные гомологии с другими энтеробактериальными плазмидами. При этом речь идет о регионе начала репликации и тоЬ-регионе, которые необходимы для мобилизируемости плазмиды. Для рМИТ 2 не удалось идентифицировать характерную гомологию для обычного участка ДНК.

Далее описана также последовательность ДНК плазмиды рМИТ2 в последовательности аминокислот и проведен анализ на наличие открытых читаемых астеров. Результат графически представлен на фиг. 1. Обнаружено 5 открытых читаемых астеров с последовательно стью аминокислот размером порядка 327, 318, 264, 76 и 63 аминокислот.

Наряду с неизвестной до сих пор плазмидой рМиТ2, также до сих пор не найдена комбинация в штаммах Е. сой или других энтеробактериях.

Возможно, наличие плазмид связано с метаболическими и медицинскими свойствами и/или свойствами физиологии питания и, соответственно, пробиотическими свойствами штамма И8М 6601.

Исследование плазмид позволяет более точно определять и анализировать энтеробактерии и, в частности, группу ЕксйепсЫа. Кроме того, эта плазмида предоставляет несомненный вектор экспрессии для генной инженерии.

В дальнейшем изобретение поясняется подробно с помощью примеров.

Пример 1. Изоляция плазмиды.

Изоляцию плазмиды ДНК осуществляют по методу В1тпЬо1т е1 а1. (В1тпЬо1т, А. С. апб Ио1у, 1. (1979) Ииск Аабк Век. 7:1513-1523 Методика быстрой экстракции щелочи для скрининга рекомбинантных плазмид ДНК).

В колонию бактерий засевают 3 мл среды ЬВ и взбалтывают в течение ночи при 37°С. Эту культуру центрифугируют в специальной емкости, остаток среды удаляют с помощью пипетки. Осадок клеток ресуспендируют со 100 мкп раствора I (50 мМ глюкозы; 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, рН 8; 25 мМ ТгБНС1, рН 8). Через 5 мин инкубации при комнатной температуре добавляют 200 мкл раствора II (0,2 Н ИаОН; 1 % додецилсульфат натрия), перемешивают до просветления и помещают специальную емкость на следующие 5 мин на лед. Далее добавляют 150 мкл раствора III (3 М ацетата натрия, рН 4,8), непродолжительное время взбалтывают до выпадения хромосомальной ДНК в виде хлопьев и помещают осадок еще раз на 5 мин на лед. Выпавшую хромосомальную ДНК и остатки клеток разделяют 5 мин в центрифуге и избыток плазмидной ДНК отводят в новый сосуд. Для очистки плазмидной ДНК добавляют 50 мкл фенола и 150 мкл хлороформа/изоаминоспирта (24:1) и после недолгого взбалтывания центрифугируют в течение 2 мин. Водную фазу добавляют в новый сосуд с помощью пипетки. Плазмидная ДНК выпадает в осадок после добавления 2 объемов ледяного этанола и центрифугирования в течение 10 мин. Осадок промывают 70%-ным этанолом и высушивают в скоростном вакууме. Плазмидную ДНК ресуспендируют в 20 мкл 1БО ., и хранят при -20°С.

Пример 2. Секвенирование ДНК.

Секвенирование ДНК осуществляют по методу Р.8апдег е1 а1. (8апдег, Р., №ск1еп, 8. апб Сои1коп. А.В. (1977) Ргос. №16. Асаб. 8ск США 74: 5463-5467 Секвенирование ДНК с помощью ингибиторов терминации цепи).

Секвенирование ДНК осуществляют с помощью набора для секвенирования Т7 фирмы Рйаташа БКВ.

Для стадии денатурации смешивают 8 мкл (от 1,5 до 2 мкг) плазмидной ДНК с 2 мкл 2 Н №1ОН. непродолжительное время центрифугируют и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. ДНК выпадает в осадок после добавления 3 мкл 3 М ацетата натрия, рН 4,8, а также 7 мкл Н₂О_{бидистиллят} и 60 мкл ледяного чистого этанола в течение 15 мин при 70°С. Выпавшую ДНК центрифугируют в течение 10 мин, промывают 70% этанолом и высушивают.

Для реакции отжига денатурированную ДНК суспендируют в 10 мкл Н2О_бвдистиллят и смешивают с 2 мкл буфера для отжига и 2 мкл праймера (40 нг). Осадок инкубируют в течение 20 мин при 37°С таким образом, что может происходить связывание праймера на матрице ДНК. Осадок реакции охлаждают в течение 10 мин при комнатной температуре и затем либо используют сразу для реакции маркировки, либо замораживают при -20°С. Для реакции маркировки в осадок реакции отжига с помощью пипетки добавляют 3 мкл смеси маркировки, 1 мкл [α-Р³²] дАТФ и 2 мкл Т7-полимеразы (Т7полимеразу разбавляют в соотношении 1:5 буфером с энзимом разбавления) и после недолгого перемешивания инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Тем временем для реакции терминации подогревают уже приготовленные смеси для секвенирования (по 1 сосуду с 2,5 мкл 'О'-, 'А'-, 'Т'- и ’С'-смесями, коротко) при 37°С. По истечении реакции маркировки добавляют соответственно 4 мкл от этой смеси к четырем смесям секвенирования и смешивают непродолжительное время с помощью пипетки. Реакцию терминации инкубируют в течение 5 мин при 37°С. По окончании реакции терминации добавляют по 5 мкл «останавливающего»-раствора. Теперь осадки отводят в инкубатор с температурой 95°С, денатурируют в течение 2 мин и затем помещают на лед. На гель секвенирования наносят по 2,5 мкп реакции [25,2 г мочевины, 22 мл Н₂О_{бидистиллят} 6 мл 10 х ТВЕ, 10 мл полиакриламида (40%), 2 мл персульфата аммония (16 мг/мл), 60 мкл ТЕМЕИ] в последовательности '0', 'А', 'Т', 'С'. Электрофорез осуществляют при 40 Вт и 1500 В в течение 4,5 ч.

Claims (8)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Плазмида, имеющая нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 2.
2. 2. Последовательности ДНК с или из представленных на фиг. 2 последовательностей нуклеотидов.
3. 3. Применение плазмиды по пп.1-2 в микробиологической аналитике и/или диагностике.
4. 4. Применение последовательностей ДНК по пп.1-2 в микробиологической аналитике и/или диагностике.
5. 5. Применение плазмиды по пп.1-2 для медицинских целей и/или целей физиологии питания и соответственно пробиотических целей.
6. 6. Применение последовательностей ДНК по пп.1-2 для медицинских целей и/или целей физиологии питания и соответственно пробиотических целей.
7. 7. Применение плазмиды по пп.1-2 в качестве вектора экспрессии.
8. 8. Применение последовательностей ДНК по пп.1-2 в качестве векторов экспрессии.