SK284929B6 - Plazmid pozostávajúci zo sekvencie DNA, sekvencia DNA a jeho použitie - Google Patents

Abstract

Plazmid alebo sekvencia DNA s nukleotidovými úsekmi zobrazenými na obrázku 1 a ich použitie ako expresných vektorov v mikrobiologickej analytike a/alebo diagnostike.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka bakteriálneho plazmidu obsahujúceho sekvenciu DNA, sekvencie DNA a jeho použitia.

Doterajší stav techniky

Plazmidy sú malé, extrachromozómové, prevažne cirkuláme a samostatne sa replikujúce molekuly DNA, ktoré sa vyskytujú skoro vo všetkých baktériách a tiež v niektorých eukaryotoch, ako aj v mitochondriách. Veľkosť plazmidov sa pohybuje medzi približne 1,5 až 300 kb.

Bakteriálne plazmidy sú spravidla cirkuláme, kovalentne uzatvorené a superšpiralizované. Často sú nositeľmi génov rezistencie proti antibiotikám alebo ťažkým kovom, génov na metabolizáciu netypických substrátov alebo génov pre rad typovo špecifických charakteristík, ako sú metabolické vlastnosti alebo faktory virulencie. Niektoré plazmidy môžu byť prenášané z jednej bunky do inej bunky. Pretože podľa dnešnej mienky je patogenita baktérii podmienená čiastočne tiež vlastnosťami plazmidov, pretrváva stupňujúci sa záujem na objasnení vlastností plazmidovej DNA.

O čeľadi Enterobacteriaceae, ku ktorému patrí 14 hlavných rodov a 6 ďalších rodov je známe, že môžu vytvárať rôzne vlastnosti. Typickými príkladmi sú Escherichia, Salmonella a Klebsiella. Escherichia coli {E. coli) je klasickým objektom bakteriálnej genetiky. Až nájdenie a charakteristika rôznych virulentných faktorov E. coli umožnilo nájsť všeobecne uspokojujúce vysvetlenia toho, že kmene tohto typu majú čiastočne extrémne odlišnú patogenitu u ľudí prípadne pri zvieratách, ktorá siaha od avirulencie až po virulenciu vysokého stupňa, ako v prípade najnovšie sa rozširujúceho variantu označeného ako “EHEC”. Takto bol opísaný už rad virulentných faktorov extraintestinálnych ako aj intestinálnych kmeňov E. coli, ktoré sú sčasti dobre charakterizované. Pri patogénnych kmeňoch E. coli sérovej skupiny O6:K5 boli nájdené virulentné faktory ako napríklad hemolyzíny a P-fimbrioadhezíny, ktoré sa preukázateľne nevyskytujú pri nepatogénnych zástupcoch tejto sérovej skupiny.

Virulentné gény sú pri enterobaktériách nachádzané spravidla na veľkých plazmidoch (cca 60 kb). Existujú ale tiež enterobaktérie s malými takzvanými kryptickými piazmidmi, ktorých funkciu nebolo možné doteraz ešte s určitosťou stanoviť.

Pretože je známe, že v prípade E. coli sa virulentné faktory čiastočne nachádzajú tiež v plazmidových génoch, vzniká týmto potreba ďalšieho skúmania na účely nájdenia a charakteristiky plazmidov pri enterobaktériách a najmä pri Escherichie, aby sa napríklad zlepšili možnosti diagnostiky a liečby ochorení spôsobených infekciou enterobaktériami. Plazmidy, prípadne ich bakteriálne nosiče alebo zodpovedajúca syntetizovaná DNA môžu nájsť uplatnenie v mikrobiologickej analytike alebo diagnostike, v medicíne v liečbe alebo profylaxii. Okrem toho sú plazmidy, a najmä plazmidy E. coli, známe ako expresné vektory v génovej technológii, takže aj z tohto dôvodu vzniká záujem o lepšie poznanie vlastností týchto plazmidov.

Podstata vynálezu

S týmto cieľom bol uskutočnený molekulámogenetický výskum s kmeňom E. coli DSM 6601. Sekvencie DNA, ktoré obsahuje tento kmeň, boli pomocou databázo vých programov podrobené sekvenčnej analýze a porovnané so sekvenciami DNA iných baktérií, ktoré už boli k dispozícii.

Kmeň DSM 6601 obsahuje dva malé plazmidy s veľkosťou 3177, prípadne 5552 bp, ktoré boli označené ako pMUTl, respektíve pMUT2.

DNA väčšieho plazmidu pMUT2 bola po linearizácii s reštrikčným enzýmom Sphl subklonovaná do vektora pUC18 a následne úplne sekvenovaná. Sekvencia DNA je znázornená na obrázku 1. Takto získaná sekvencia DNA bola pomocou databázového programu GenEMBL preskúmaná na homológie s už známymi sekvenciami DNA. Výsledok je graficky znázornený na obrázku 2. DNA plazmidu pMUT2 má signifikantné homológie s replikačnou oblasťou rôznych plazmidov CoIEl E. coli na pozícii 890 až 1660 bp. Ďalšia signifikantná homológia s piazmidmi CoIE1 sa nachádza v oblasti od pozície 3800 až 4950 bp. Tu ide o homológie s mobilizačnou oblasťou plazmidov CoIE1. V oblasti pozície 3770 až 4980 bp boli nájdené homológie s jedným plazmidom kmeňa Pasteurellahaemolytica Al. Na tomto plazmide sa nachádzajú gény, ktoré pri Pasteurelly kódujú antimikrobiálne rezistentné proteíny. Homológia sa ale rozprestiera ccz intergénovú oblasť, takže možno ide tiež o sekvencie, ktoré sú potrebné na mobilizáciu plazmidu.

Boli identifikované dve oblasti, ktoré majú signifikantné homológie s inými enterobakteriálnymi piazmidmi. Pritom ide o oblasti origin of replicalion a oblasti mob, ktoré sú potrebné na mobilizáciu plazmidov. Pri pMUT2 nebola pre ostatné úseky DNA identifikovaná žiadna signifikantná homológia.

Sekvencia DNA plazmidu pMUT2 bola následne tiež prepísaná do aminokyselinovej sekvencie a preskúmaná na prítomnosť otvorených čítacích rámcov. Výsledok je tiež graficky znázornený na obrázku 3. Bolo nájdených 5 otvorených čítacích rámcov s aminokyselinovými sekvenciami s veľkosťami od 327, 318, 264, 76 a 63 aminokyselín.

Okrem doteraz neznámych plazmidov pMUTl a pMUT2 nebola ani ich kombinácia v žiadnych kmeňoch E. coli alebo iných enterobaktériách doteraz nájdená.

Výskyt plazmidov má pravdepodobne súvislosť s metabolickými a medicínskymi vlastnosťami kmeňa DSM 6601.

Skúmanie plazmidov umožňuje presnejšie určenie a analýzu enterobaktérií a najmä skupiny Escherichia. Okrem toho sa ponúkajú tieto plazmidy ako vhodné expresné vektory pre génovú technológiu.

Následne bude vynález bližšie objasnený pomocou príkladov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje nukleotidovú sekvenciu približne 5 kb veľkého plazmidu pMUT2 kmeňa DSM 6601.

Na obrázku 2 je znázornená reštrikčná mapa plazmidu pMUT2. Čierne zvýraznenia symbolizujú nájdené homológie sekvencií DNA so sekvenciami DNA plazmidov iných enterobaktérií. Pozície relevantných reštrikčných miest sú udané. Na tomto obrázku sú menovite znázornené nasledovné homológie:

- homológia s mobilizačnou oblasťou plazmidov CoIEl,

- homológia s replikačnými oblasťami rôznych plazmidov CoIEl.

Na obrázku 3 sú znázornené otvorené čítacie rámce nájdené pri obidvoch plazmidoch pMUTl (a) a pMUT2 (b). Veľkosť otvorených čítacích rámcov je uvedená.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia plazmidu

Izolácia plazmidovej DNA prebehla na základe spôsobu Bimboim et al. (Bimboim, A. C. a Doly, J. (1979) Nucl. Acids Res. 7:1513-1523 A rapid alkaline extraction procedúre for screening recombinant plasmid DNA).

ml LB-média sa očkuje bakteriálnou kolóniou a pretrepáva sa cez noc pri 37 °C. Táto kultúra sa v Eppendorfovej skúmavke scentrifuguje, zvyšok média sa odstráni pipetou. Bunkový sediment sa resuspenduje so 100 μΐ roztoku I (50 mM glukóza; 10 mM EDTA, pH 8; 25 mM TrisHC1, pH 8). Po 5 minútach inkubácie pri izbovej teplote sa pridá 200 μΐ roztoku II (0,2 N NaOH; 1 % SDS), mieša sa až do vyčírenia a Eppendorfova skúmavka sa nechá ďalších 5 minút stáť na ľade. Potom sa k tomu pridá 150 μΐ roztoku III (3 M octan sodný, pH 4,8), krátko sa pretrepe, až kým sa chromozomálna DNA nevyzráža do vločiek a usadenina sa nechá ešte raz 5 minút na ľade. Vyzrážaná chromozomálna DNA a zvyšky buniek sa centrifugujú v centrifúge 5 minút a supematant s plazmidovou DNA sa premiestni do novej nádoby. Na vyčistenie DNA plazmidu sa pridá 50 μΐ fenolu a 150 μΐ chloroformu/izoamylalkoholu (24:1) apo krátkom pretrepaní sa 2 minúty scentrifuguje. Vodná fáza sa prepipetuje do novej nádoby. Plazmidová DNA sa vyzráža s 2 objemami ľadovo studeného etanolu a 10 minút sa scentrifuguje. Pelet sa premyje so 70 % etanolom a vysuší sa v exikátore. Plazmidová DNA sa rozsuspenduje v 20 μΐ H₂O_redest a uchováva sa pri -20 °C.

Príklad 2

Sekvenovanie DNA

Sekvenovanie DNA prebehlo na základe spôsobu od F. Sangera et al. (Sanger, F., Nicklen, S. a Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 DNA sequencing with chain terminating inhibitors).

Sekvenovanie DNA prebehlo s T7-sekvenačným kitom firmy Phamacia LKB.

Na denaturačný krok sa premieša 8 μΐ (1,5 až 2 pg) plazmidovej DNA s 2 μΐ 2 N NaOH, krátko sa scentrifuguje a 10 minút sa inkubuje pri izbovej teplote. DNA sa zráža s 3 μΐ 3 M octanu sodného, pH 4,8 ako aj s 7 μΐ H₂O_redest a so 60 μΐ ľadovo studeného etanolu_ateOiútny 15 minút pri teplote -70 °C. Vyzrážaná DNA sa 10 minút centrifuguje, premyje sa so 70 % etanolom a vysuší sa.

Na anelačnú reakciu sa denaturovaná DNA suspenduje v 10 μΐ H₂O_rcdest a zmieša sa s 2 μΐ anelačného tlmivého roztoku a s 2 μΐ primeru (40 ng). Zmes sa inkubuje 20 minút pri 37 °C, takže môže nastať naviazanie primeru na templátovú DNA. Reakčná zmes sa ochladzuje 10 minút pri izbovej teplote, a potom sa alebo hneď použije na Labelling-reakciu alebo sa zmrazí pri -20 °C. Na Labelling-reakciu sa do anelačnej reakčnej zmesi napipetujú 3 μΐ Labelling-mixu, 1 μΐ [a-P³²]dATP a 2 μΐ T7-polymerázy (T7-polymeráza bola zriedená v pomere 1 : 5 s enzýmovým zrieďovacím tlmivým roztokom) a po krátkom miešaní sa 5 minút inkubuje pri izbovej teplote. Počas toho sa pre terminačnú reakciu už pripravené sekvenačné mixy (vždy 1 nádoba s 2,5 μΐ ‘G’-, ‘A’-, ‘T’- a ‘C’-mix “short”) predhrejú pri 37 °C. Po prebehnutí Labelling-reakcie sa z toho vždy 4 μΐ pridajú k tým štyrom sekvenačným mixom a krátko sa premiešajú pipetou. Terminačné reakcie sa inkubujú 5 minút pri 37 °C. Na ukončenie terminačných reakcií sa pridá vždy po 5 μΐ stop-roztoku. Usadeniny sa teraz prevedú do inkubátora pri 95 °C, 2 minúty sa denaturujú a potom sa dajú na ľad. Vždy po 2,5 μΐ reakcií sa nanesie na sekvenčný gél [25,2 g močoviny, 22 ml H₂O_redest, 6 ml ΙΟχ TBE, 10 ml polyakrylamidu (40 %), 2 ml peroxosíranu amónneho (16 mg/ml), 60 μΐ TEMED] v poradí ‘G’, ‘A’, ‘T’, ‘C’. Elektroforéza prebieha pri 40 Wattoch a 1500 Voltoch 4,5 hodiny.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Plazmid pozostávajúci zo sekvencie DNA znázornenej na obrázku 1.
2. 2. Sekvencie DNA s nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obrázku 1.
3. 3. Plazmid alebo sekvencia DNA podľa nároku 1 alebo 2 na použitie v mikrobiologickej analytike a/alebo diagnostike.
4. 4. Plazmid alebo sekvencia DNA podľa nároku 1 alebo 2 na použitie ako expresné vektory.