JP2003000245A - 細菌性プラスミド - Google Patents
細菌性プラスミドInfo
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- dna
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- plasmids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 大腸菌の場合，病原性因子がプラスミドの遺
伝子中に存在するので、感染後の疾患の診断・治療法に
は，プラスミドの発見，特性の決定が必要であり，その
特性配列を提供する。 【解決手段】 特定のヌクレオチド配列を有する細菌性
プラスミドもしくはＤＮＡ配列，及びその分析および診
断における使用を提供する。
伝子中に存在するので、感染後の疾患の診断・治療法に
は，プラスミドの発見，特性の決定が必要であり，その
特性配列を提供する。 【解決手段】 特定のヌクレオチド配列を有する細菌性
プラスミドもしくはＤＮＡ配列，及びその分析および診
断における使用を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細菌性プラスミド
に関するものである。
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】プラスミドは、染色体外の主として環状
で自己複製する小さなＤＮＡ分子であり、ほとんど全て
の細菌あるいはまたいくつかの真核生物並びにミトコン
ドリアの中に存在している。プラスミドの大きさは、約
１．５〜３００ｋｂの間で変動する。
で自己複製する小さなＤＮＡ分子であり、ほとんど全て
の細菌あるいはまたいくつかの真核生物並びにミトコン
ドリアの中に存在している。プラスミドの大きさは、約
１．５〜３００ｋｂの間で変動する。
【０００３】細菌性プラスミドは、通常、環状で共有結
合して閉じており、かつ超らせんになっている。これら
は、多くの場合、抗生物質又は重金属に抵抗性の遺伝
子、非典型的基質の代謝のための遺伝子又は一連の種特
異的特徴、例えば代謝特性又は病原性因子のための遺伝
子を有している。多くのプラスミドは、１つの細胞から
別の細胞へ転写することもできる。細菌の病原性は、今
日の見解によればプラスミドの性質によっても部分的に
左右されるので、プラスミド−ＤＮＡの性質の解明に関
して、重要性がより一層大きなものになっている。
合して閉じており、かつ超らせんになっている。これら
は、多くの場合、抗生物質又は重金属に抵抗性の遺伝
子、非典型的基質の代謝のための遺伝子又は一連の種特
異的特徴、例えば代謝特性又は病原性因子のための遺伝
子を有している。多くのプラスミドは、１つの細胞から
別の細胞へ転写することもできる。細菌の病原性は、今
日の見解によればプラスミドの性質によっても部分的に
左右されるので、プラスミド−ＤＮＡの性質の解明に関
して、重要性がより一層大きなものになっている。
【０００４】腸内細菌科については、１４の主属と６の
別種が含まれるが、これらは、種々の性質を発達させる
ことができることは公知である。代表的な例は、大腸菌
（Escherichia）、サルモネラ菌（Salmonella）及び肺
炎桿菌（Klebsiella）である。大腸菌（E.coli）は、バ
クテリア遺伝学の古典的対象である。ようやく、大腸菌
E.coliの種々の病原性因子の発見と特性決定により、前
記の種類の菌株が、最近広がった「EHEC」として公知の
変種の場合のように無毒性から高度な毒性にまで達する
部分的に極端に異なるヒトもしくは動物病原性を示すこ
とについての一般に満足のいく説明を見出すことが可能
になった。それで、腸管外並びに腸内の大腸菌E.coli株
については、部分的に十分に特性決定されている一連の
病原性因子が既に記載されている。血清グループＯ６：
Ｋ５の病原性大腸菌E.coli株については、例えば前記の
血清グループの非病原性の代表の場合には明らかに生じ
ない溶血及びｐ−フィンブリエ癒着（P-Fimbrienadheas
ine）のような病原性が見出された。
別種が含まれるが、これらは、種々の性質を発達させる
ことができることは公知である。代表的な例は、大腸菌
（Escherichia）、サルモネラ菌（Salmonella）及び肺
炎桿菌（Klebsiella）である。大腸菌（E.coli）は、バ
クテリア遺伝学の古典的対象である。ようやく、大腸菌
E.coliの種々の病原性因子の発見と特性決定により、前
記の種類の菌株が、最近広がった「EHEC」として公知の
変種の場合のように無毒性から高度な毒性にまで達する
部分的に極端に異なるヒトもしくは動物病原性を示すこ
とについての一般に満足のいく説明を見出すことが可能
になった。それで、腸管外並びに腸内の大腸菌E.coli株
については、部分的に十分に特性決定されている一連の
病原性因子が既に記載されている。血清グループＯ６：
Ｋ５の病原性大腸菌E.coli株については、例えば前記の
血清グループの非病原性の代表の場合には明らかに生じ
ない溶血及びｐ−フィンブリエ癒着（P-Fimbrienadheas
ine）のような病原性が見出された。
【０００５】ビルレンス遺伝子は、腸内細菌の場合に
は、通常大きなプラスミド（約60ｋｂ）上に見出され
る。あるいはまた、小さな、いわゆる潜在プラスミドを
有する腸内細菌も存在しているが、その機能は、これま
でにまだ確定できてはいなかった。
は、通常大きなプラスミド（約60ｋｂ）上に見出され
る。あるいはまた、小さな、いわゆる潜在プラスミドを
有する腸内細菌も存在しているが、その機能は、これま
でにまだ確定できてはいなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】大腸菌の場合には、病
原性因子が少なくとも部分的にプラスミドの遺伝子中に
も存在していることは公知であるので、従って例えば腸
内細菌による感染後の疾患の際の診断及び治療法を改善
するために腸内細菌、殊に大腸菌E.coliの場合のプラス
ミドの発見及び特性決定のための他の試験に対する要求
がある。プラスミドもしくはその細菌担体又は相応する
合成ＤＮＡは、微生物学的分析又は診断の際、医学的に
は治療又は予防の際並びに栄養生理学的又は共生目的に
使用することができる。その上更に、プラスミド、詳細
には殊に大腸菌E.coliのプラスミドは、遺伝子工学にお
ける公知の発現ベクターであるので、前記の理由から
も、この種のプラスミドの性質の訂正された知識は重要
である。
原性因子が少なくとも部分的にプラスミドの遺伝子中に
も存在していることは公知であるので、従って例えば腸
内細菌による感染後の疾患の際の診断及び治療法を改善
するために腸内細菌、殊に大腸菌E.coliの場合のプラス
ミドの発見及び特性決定のための他の試験に対する要求
がある。プラスミドもしくはその細菌担体又は相応する
合成ＤＮＡは、微生物学的分析又は診断の際、医学的に
は治療又は予防の際並びに栄養生理学的又は共生目的に
使用することができる。その上更に、プラスミド、詳細
には殊に大腸菌E.coliのプラスミドは、遺伝子工学にお
ける公知の発現ベクターであるので、前記の理由から
も、この種のプラスミドの性質の訂正された知識は重要
である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】更に、大腸菌E.coli株DS
M ６６０１を用いる分子遺伝学的試験が実施された。こ
の菌株によって得られるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列分析
のデータバンクプログラムを用いて取出され、既に存在
する別の細菌のＤＮＡ配列と比較されている。
M ６６０１を用いる分子遺伝学的試験が実施された。こ
の菌株によって得られるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列分析
のデータバンクプログラムを用いて取出され、既に存在
する別の細菌のＤＮＡ配列と比較されている。
【０００８】前記菌株DSM ６６０１は、ｐＭＵＴ１もし
くはｐＭＵＴ２と呼称された３１７７（配列番号１）も
しくは５５５２ｂｐ（配列番号２）の大きさの２種の小
さなプラスミドを有している。
くはｐＭＵＴ２と呼称された３１７７（配列番号１）も
しくは５５５２ｂｐ（配列番号２）の大きさの２種の小
さなプラスミドを有している。
【０００９】より小さい方のプラスミドｐＭＵＴ１のＤ
ＮＡは、酵素HindIIIを用いる制限切断後に、ベクター
ｐＵＣ１８中の線状フラグメントとしてサブクローニン
グされ、引き続き、ＤＮＡ配列が決定された。これは、
添付図１から明らかである。こうして得られたＤＮＡ配
列（配列番号１）を、GenEMBL−データバンクを用いて
相同性を比較したが、前記の対比の結果は、図２から明
らかである。
ＮＡは、酵素HindIIIを用いる制限切断後に、ベクター
ｐＵＣ１８中の線状フラグメントとしてサブクローニン
グされ、引き続き、ＤＮＡ配列が決定された。これは、
添付図１から明らかである。こうして得られたＤＮＡ配
列（配列番号１）を、GenEMBL−データバンクを用いて
相同性を比較したが、前記の対比の結果は、図２から明
らかである。
【００１０】前記の比較のために、HindIII−切断部位
を１位と定めた。２００〜８００ｂｐ位で、プラスミド
ｐＭＵＴ１のＤＮＡは、別の腸内細菌のプラスミドの種
々の重複出発地点（重複起点）、特にプラスミドＮＴＰ
１、ＮＴＰ１６及びＣｌｏＤＦ１３に対する有意相同性
を示している９５０。ｂｐ位の領域では、もともとサル
モネラチフィムリウム（Salmonella typhimurium）から
単離しておいたプラスミドＮＴＰ１６に対する５７０ｂ
ｐの大きさの均一性が開始している。前記の相同性に
は、プラスミドＮＴＰ１６の可動性にとって必要である
mobA-Gen、伝達起点（ｏｒｉＴ）が含まれている。その
上更に、１７９０〜１９２０ｂｐ位から、遺伝子ｐａｒ
Ａ及びｃｅｒに対する有意相同性が見出されたが、これ
は、細胞分裂の際の安定性及び連続的な情報伝達及びプ
ラスミド分子の分布にとって重要である。その他のＤＮ
Ａ領域については、有意相同性を確認することはできな
かった。
を１位と定めた。２００〜８００ｂｐ位で、プラスミド
ｐＭＵＴ１のＤＮＡは、別の腸内細菌のプラスミドの種
々の重複出発地点（重複起点）、特にプラスミドＮＴＰ
１、ＮＴＰ１６及びＣｌｏＤＦ１３に対する有意相同性
を示している９５０。ｂｐ位の領域では、もともとサル
モネラチフィムリウム（Salmonella typhimurium）から
単離しておいたプラスミドＮＴＰ１６に対する５７０ｂ
ｐの大きさの均一性が開始している。前記の相同性に
は、プラスミドＮＴＰ１６の可動性にとって必要である
mobA-Gen、伝達起点（ｏｒｉＴ）が含まれている。その
上更に、１７９０〜１９２０ｂｐ位から、遺伝子ｐａｒ
Ａ及びｃｅｒに対する有意相同性が見出されたが、これ
は、細胞分裂の際の安定性及び連続的な情報伝達及びプ
ラスミド分子の分布にとって重要である。その他のＤＮ
Ａ領域については、有意相同性を確認することはできな
かった。
【００１１】その上更に、プラスミドｐＭＵＴ１のＤＮ
Ａ配列を、アミノ酸配列中に書き換え、開いた読み取り
枠の存在を分析した。６つの異なる読み取り枠の可能性
を試験した。１４３、６２、５６、４９及び４８のアミ
ノ酸の大きさを有する全部で５つの開いた読み取り枠を
見出すことができた。分析図は、図３中に図示してあ
る。
Ａ配列を、アミノ酸配列中に書き換え、開いた読み取り
枠の存在を分析した。６つの異なる読み取り枠の可能性
を試験した。１４３、６２、５６、４９及び４８のアミ
ノ酸の大きさを有する全部で５つの開いた読み取り枠を
見出すことができた。分析図は、図３中に図示してあ
る。
【００１２】より大きなプラスミドpMUT2のＤＮＡ（配
列番号２）を、制限酵素SphIを用いる線状化後に同様に
ベクターｐＵＣ１８中にサブクローニングし、引き続
き、完全に順序付けした。ＤＮＡ配列は、図４から明ら
かである。こうして得られたＤＮＡ配列を、遺伝子EMBL
-データバンクプログラムを用いて、既に公知のＤＮＡ
配列に対する相同性について試験した。結果は、図５中
に図示してある。プラスミドｐＭＵＴ２のＤＮＡは、８
９０〜１６６０ｂｐ位中で大腸菌E.coliの種々のＣｏｌ
Ｅ１−プラスミドのレプリコン領域に対する有意相同性
を示している。ＣｏｌＥ１プラスミドに対するもう１つ
の有意相同性は、３８００〜４９５０ｂｐ位の領域に存
在している。この場合、ＣｏｌＥ１−プラスミドの可動
領域に対する相同性が重要である。３７７０〜４９８０
ｂｐ位の領域中には、パスツレラ−ヘモリチカ株A1のプ
ラスミドに対する相同性が見出された。前記のプラスミ
ド上には、パスツレラ属の場合に抗菌性耐性蛋白質につ
いてコードする遺伝子が存在している。しかしながら、
相同性は、遺伝子間領域に亘って延在しているので、プ
ラスミドの可動性にとって必要である配列が重要である
こともある。
列番号２）を、制限酵素SphIを用いる線状化後に同様に
ベクターｐＵＣ１８中にサブクローニングし、引き続
き、完全に順序付けした。ＤＮＡ配列は、図４から明ら
かである。こうして得られたＤＮＡ配列を、遺伝子EMBL
-データバンクプログラムを用いて、既に公知のＤＮＡ
配列に対する相同性について試験した。結果は、図５中
に図示してある。プラスミドｐＭＵＴ２のＤＮＡは、８
９０〜１６６０ｂｐ位中で大腸菌E.coliの種々のＣｏｌ
Ｅ１−プラスミドのレプリコン領域に対する有意相同性
を示している。ＣｏｌＥ１プラスミドに対するもう１つ
の有意相同性は、３８００〜４９５０ｂｐ位の領域に存
在している。この場合、ＣｏｌＥ１−プラスミドの可動
領域に対する相同性が重要である。３７７０〜４９８０
ｂｐ位の領域中には、パスツレラ−ヘモリチカ株A1のプ
ラスミドに対する相同性が見出された。前記のプラスミ
ド上には、パスツレラ属の場合に抗菌性耐性蛋白質につ
いてコードする遺伝子が存在している。しかしながら、
相同性は、遺伝子間領域に亘って延在しているので、プ
ラスミドの可動性にとって必要である配列が重要である
こともある。
【００１３】別の腸内細菌プラスミドに対する有意相同
性を有する２つの領域を確認した。この場合、プラスミ
ドの可動性にとって必要である複製領域の起点及びmob
−領域が重要である。ｐＭＵＴ２については、その他の
ＤＮＡ断片にとって、有機相同性を確認することができ
なかった。
性を有する２つの領域を確認した。この場合、プラスミ
ドの可動性にとって必要である複製領域の起点及びmob
−領域が重要である。ｐＭＵＴ２については、その他の
ＤＮＡ断片にとって、有機相同性を確認することができ
なかった。
【００１４】また、プラスミドｐＭＵＴ２のＤＮＡ配列
を、引き続きアミノ酸配列中に書き換え、開いた読み取
り枠の存在を分析した。結果は、図３中に同様に図示し
てある。３２７、３１８、２６４、７６及び６３のアミ
ノ酸の大きさでのアミノ酸配列を有する５つの開いた読
み取り枠が見出された。
を、引き続きアミノ酸配列中に書き換え、開いた読み取
り枠の存在を分析した。結果は、図３中に同様に図示し
てある。３２７、３１８、２６４、７６及び６３のアミ
ノ酸の大きさでのアミノ酸配列を有する５つの開いた読
み取り枠が見出された。
【００１５】これまでに知られていないプラスミドｐＭ
ＵＴ１及びｐＭＵＴ２以外に、これらの組合せ物も、こ
れまで、E.coli菌株又は別の腸内細菌中に見出されてい
ない。
ＵＴ１及びｐＭＵＴ２以外に、これらの組合せ物も、こ
れまで、E.coli菌株又は別の腸内細菌中に見出されてい
ない。
【００１６】プラスミドの存在は、菌株ＤＳＭ ６６０
１の代謝及び医薬及び／又は栄養生理学もしくは共生に
利用可能な性質に関連していることもある。
１の代謝及び医薬及び／又は栄養生理学もしくは共生に
利用可能な性質に関連していることもある。
【００１７】プラスミドの試験は、腸内細菌、殊に大腸
菌属のより詳細な決定及び分析を可能にする。その上更
に、前記プラスミドは、遺伝子工学にとって懸念されな
い発現ベクターとして提供されている。
菌属のより詳細な決定及び分析を可能にする。その上更
に、前記プラスミドは、遺伝子工学にとって懸念されな
い発現ベクターとして提供されている。
【００１８】
【実施例】以下に本発明を実施例に基づき詳細に説明す
る： 例 １： プラスミド単離 プラスミド−ＤＮＡの単離を、Birnboim他（Birnboim,
A. C.及びDoly, J.（１９７９） Nucl. Acid Res. ７：
１５１３〜１５２３ A rapid alkaline extraction pro
cedure for screening recombinant plasmid DNA）に基
づいて行った。
る： 例 １： プラスミド単離 プラスミド−ＤＮＡの単離を、Birnboim他（Birnboim,
A. C.及びDoly, J.（１９７９） Nucl. Acid Res. ７：
１５１３〜１５２３ A rapid alkaline extraction pro
cedure for screening recombinant plasmid DNA）に基
づいて行った。
【００１９】ＬＢ−培地３ｍｌに、細菌コロニーを接種
し、かつ３７℃で一晩振盪させる。この培養物をエッペ
ンドルフ容器中で遠心分離し、培地残分をピペットで除
去する。細胞沈殿物を、溶液Ｉ（グルコース５０ｍＭ；
ＥＤＴＡ１０ｍＭ、ｐＨ８；トリス−ＨＣｌ２５ｍＭ、
ｐＨ８）１００μｌで再懸濁させる。室温で５分間の培
養後に、溶液ＩＩ（ＮａＯＨ０．２Ｎ；ＳＤＳ１％）２
００μｌを添加し、清澄になるまで混合し、かつエッペ
ンドルフ容器を更に５分間氷の上に放置する。次に、溶
液ＩＩＩ（Ｎａ−アセテート０．２Ｍ、ｐＨ４．８）１
５０μｌを添加し、染色体ＤＮＡをフレーク上に沈澱す
るまで振盪し、かつ該沈殿物を再度５分間氷の上に放置
する。沈澱した染色体ＤＮＡ及び細胞残分を遠心分離器
中で５分間ペレット化し、かつプラスミド−ＤＮＡを有
する上清を、新たな容器の中に移送する。プラスミド−
ＤＮＡの精製のために、フェノール５０μｌ及びクロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２４：１）１５０μｌ
を添加し、かつ短時間の振盪後に２分間遠心分離する。
水相を新たな容器の中にピペットで入れる。プラスミド
−ＤＮＡを、２用量の氷冷却したエタノールで沈澱さ
せ、かつ１０分間遠心分離する。ペレットを、７０％の
エタノールで洗浄し、かつ高速真空（Speedvac）中で乾
燥させる。プラスミド−ＤＮＡをＨ２Ｏｂｉｎｄｅｓｔ
２０ｍｌ中で再懸濁させ、かつ−２０℃で保存する。
し、かつ３７℃で一晩振盪させる。この培養物をエッペ
ンドルフ容器中で遠心分離し、培地残分をピペットで除
去する。細胞沈殿物を、溶液Ｉ（グルコース５０ｍＭ；
ＥＤＴＡ１０ｍＭ、ｐＨ８；トリス−ＨＣｌ２５ｍＭ、
ｐＨ８）１００μｌで再懸濁させる。室温で５分間の培
養後に、溶液ＩＩ（ＮａＯＨ０．２Ｎ；ＳＤＳ１％）２
００μｌを添加し、清澄になるまで混合し、かつエッペ
ンドルフ容器を更に５分間氷の上に放置する。次に、溶
液ＩＩＩ（Ｎａ−アセテート０．２Ｍ、ｐＨ４．８）１
５０μｌを添加し、染色体ＤＮＡをフレーク上に沈澱す
るまで振盪し、かつ該沈殿物を再度５分間氷の上に放置
する。沈澱した染色体ＤＮＡ及び細胞残分を遠心分離器
中で５分間ペレット化し、かつプラスミド−ＤＮＡを有
する上清を、新たな容器の中に移送する。プラスミド−
ＤＮＡの精製のために、フェノール５０μｌ及びクロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２４：１）１５０μｌ
を添加し、かつ短時間の振盪後に２分間遠心分離する。
水相を新たな容器の中にピペットで入れる。プラスミド
−ＤＮＡを、２用量の氷冷却したエタノールで沈澱さ
せ、かつ１０分間遠心分離する。ペレットを、７０％の
エタノールで洗浄し、かつ高速真空（Speedvac）中で乾
燥させる。プラスミド−ＤＮＡをＨ２Ｏｂｉｎｄｅｓｔ
２０ｍｌ中で再懸濁させ、かつ−２０℃で保存する。
【００２０】例 ２：
ＤＮＡ−配列化
ＤＮＡ−配列化を、F. Sanger他（Sanger, F.、Nickle
n, S. 及びCoulson, A.R.（１９７７） Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA ７４．：５４６３〜５４６７のDNA seque
ncing with chain terminating inhibitors）に基づい
て行った。
n, S. 及びCoulson, A.R.（１９７７） Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA ７４．：５４６３〜５４６７のDNA seque
ncing with chain terminating inhibitors）に基づい
て行った。
【００２１】ＤＮＡ配列化を、Firma Pharmacia LKB社
のＴ７−配列化キットを用いて行った。
のＴ７−配列化キットを用いて行った。
【００２２】変性工程のために、プラスミド−ＤＮＡ８
μｌ（１．５〜２μｇ）を２ＮのＮａＯＨ２μｌと混合
し、短時間遠心分離し、１０分間室温で培養する。ＤＮ
Ａを、３ＭのＮａ−アセテート３μｌ、ｐＨ４．８並び
にＨ２Ｏｂｉｄｅｓｔ７μｌ及び氷冷却したエタノール
ａｂｓｏｌｕｔ６０μｌを用いて−７０℃で１５分間沈
澱させる。沈澱したＤＮＡを１０分間遠心分離し、７０
％のエタノールで洗浄し、かつ乾燥させる。
μｌ（１．５〜２μｇ）を２ＮのＮａＯＨ２μｌと混合
し、短時間遠心分離し、１０分間室温で培養する。ＤＮ
Ａを、３ＭのＮａ−アセテート３μｌ、ｐＨ４．８並び
にＨ２Ｏｂｉｄｅｓｔ７μｌ及び氷冷却したエタノール
ａｂｓｏｌｕｔ６０μｌを用いて−７０℃で１５分間沈
澱させる。沈澱したＤＮＡを１０分間遠心分離し、７０
％のエタノールで洗浄し、かつ乾燥させる。
【００２３】アニーリング反応のために、変性したＤＮ
ＡをＨ２Ｏｂｉｄｅｓｔ１０μｌ中で懸濁させ、かつア
ニーリング緩衝液２μｌ及びプライマー２μｌ（４０ｎ
ｇ）と混合する。沈殿物を３７℃で２０分間培養する
と、鋳型ＤＮＡへのプライマーの結合を行うことができ
る。反応バッチを室温で１０分間冷却し、次に標識化反
応のために直ちに使用するか又は−２０℃で凍結させ
る。標識化反応のために、標識混合物（Labelling-Mi
x）３μｌ、［α−Ｐ３２］ｄＡＴＰ１μｌ及びＴ７−
ポリメラーゼ（Ｔ７−ポリメラーゼを酵素希釈緩衝液で
１：５希釈）２μｌを、アニーリング反応バッチ中にピ
ペットで入れ、かつ短時間の混合後に、室温で５分間培
養する。この間に、停止反応のために既に用意した配列
剤混合物（２．５μｌを有する各容器１個を「略し
て」'Ｇ'−Ｍｉｘ、'Ａ'−Ｍｉｘ、'Ｔ'−Ｍｉｘ及び'
Ｃ'−Ｍｉｘ）を３７℃で予備昇温させる。標識化反応
の経過後に、それぞれその４μｌを４種の配列化剤混合
物に添加し、かつピペットで短時間混合する。停止反応
物を３７℃で５分間培養する。停止反応の終了のため
に、それぞれ５μｌの停止溶液を添加する。こうして各
バッチを９５℃で培養器の中に移送し、２分間変性さ
せ、次に氷の上に置いた。反応物それぞれ２．５μｌ
を、配列化ゲル［尿素２５．２ｇ、Ｈ２Ｏｂｉｄｅｓｔ
２２ｍｌ、１０×ＴＢＥ６ｍｌ、ポリアクリルアミド
（４０％）１０ｍｌ、過硫酸アンモニウム（１６ｍｇ／
ｍｌ）２ｍｌ、ＴＥＭＥＤ６０μｌ］の上に、'Ｇ'、'
Ａ'、'Ｔ'、'Ｃ'の順序で載せる。電気泳動を４０ワッ
ト及び１５００ボルトで４．５時間行う。 配列表 （１） 一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：フアルマ−ツエントラーレ ゲゼルシヤフ
ト ミツト ベシユレンクテル ハフツング （Ｂ）町：レルフエルトシユトラーセ ２０ （Ｃ）市：ヘルデツケ （Ｅ）国：ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便コード：Ｄ−５８３１３ （ｉｉ）発明の名称：細菌性プラスミド （ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）コンピューター読み取り可能形： （Ａ）媒体型：フロッピー（登録商標）ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）オペレーティング システム：ＰＣ−ＤＯＳ／Ｍ
Ｓ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：パテント イン リリース ♯
１．０，バージョン♯１．３０（ＥＰＡ） （ｖ）現在の出願のデータ： 出願番号：ＰＣＴ／ＥＰ９８／０１７２０ （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３１７７塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：エシェリキア・コリ （Ｂ）株名：ＤＳＭ６６０１ （Ｃ）個体：ｐＭＵＴ１ （ｖｉｉｉ）ゲノム中の位置： （Ｃ）単位：３１７７ｂｐ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
ＡをＨ２Ｏｂｉｄｅｓｔ１０μｌ中で懸濁させ、かつア
ニーリング緩衝液２μｌ及びプライマー２μｌ（４０ｎ
ｇ）と混合する。沈殿物を３７℃で２０分間培養する
と、鋳型ＤＮＡへのプライマーの結合を行うことができ
る。反応バッチを室温で１０分間冷却し、次に標識化反
応のために直ちに使用するか又は−２０℃で凍結させ
る。標識化反応のために、標識混合物（Labelling-Mi
x）３μｌ、［α−Ｐ３２］ｄＡＴＰ１μｌ及びＴ７−
ポリメラーゼ（Ｔ７−ポリメラーゼを酵素希釈緩衝液で
１：５希釈）２μｌを、アニーリング反応バッチ中にピ
ペットで入れ、かつ短時間の混合後に、室温で５分間培
養する。この間に、停止反応のために既に用意した配列
剤混合物（２．５μｌを有する各容器１個を「略し
て」'Ｇ'−Ｍｉｘ、'Ａ'−Ｍｉｘ、'Ｔ'−Ｍｉｘ及び'
Ｃ'−Ｍｉｘ）を３７℃で予備昇温させる。標識化反応
の経過後に、それぞれその４μｌを４種の配列化剤混合
物に添加し、かつピペットで短時間混合する。停止反応
物を３７℃で５分間培養する。停止反応の終了のため
に、それぞれ５μｌの停止溶液を添加する。こうして各
バッチを９５℃で培養器の中に移送し、２分間変性さ
せ、次に氷の上に置いた。反応物それぞれ２．５μｌ
を、配列化ゲル［尿素２５．２ｇ、Ｈ２Ｏｂｉｄｅｓｔ
２２ｍｌ、１０×ＴＢＥ６ｍｌ、ポリアクリルアミド
（４０％）１０ｍｌ、過硫酸アンモニウム（１６ｍｇ／
ｍｌ）２ｍｌ、ＴＥＭＥＤ６０μｌ］の上に、'Ｇ'、'
Ａ'、'Ｔ'、'Ｃ'の順序で載せる。電気泳動を４０ワッ
ト及び１５００ボルトで４．５時間行う。 配列表 （１） 一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：フアルマ−ツエントラーレ ゲゼルシヤフ
ト ミツト ベシユレンクテル ハフツング （Ｂ）町：レルフエルトシユトラーセ ２０ （Ｃ）市：ヘルデツケ （Ｅ）国：ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便コード：Ｄ−５８３１３ （ｉｉ）発明の名称：細菌性プラスミド （ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）コンピューター読み取り可能形： （Ａ）媒体型：フロッピー（登録商標）ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）オペレーティング システム：ＰＣ−ＤＯＳ／Ｍ
Ｓ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：パテント イン リリース ♯
１．０，バージョン♯１．３０（ＥＰＡ） （ｖ）現在の出願のデータ： 出願番号：ＰＣＴ／ＥＰ９８／０１７２０ （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３１７７塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：エシェリキア・コリ （Ｂ）株名：ＤＳＭ６６０１ （Ｃ）個体：ｐＭＵＴ１ （ｖｉｉｉ）ゲノム中の位置： （Ｃ）単位：３１７７ｂｐ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
【００２４】
【外１】
【００２５】
【外２】
【００２６】
【外３】
【００２７】
【外４】
【００２８】
【外５】
【００２９】
（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：５５５２塩基対
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：環状
（ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセテイカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：エシェリキア・コリ
（Ｂ）株名：ＤＳＭ６６０１
（Ｃ）個体：ｐＭＵＴ２
（ｖｉｉｉ）ゲノム中の位置：
（Ｃ）単位：５５５２ｂｐ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
【００３０】
【外６】
【００３１】
【外７】
【００３２】
【外８】
【００３３】
【外９】
【００３４】
【外１０】
【００３５】
【外１１】
【００３６】
【外１２】
【００３７】
【外１３】
【図１Ａ】ＤＳＭ６６０１菌株の約３ｋｂの大きさのプ
ラスミドｐＭＵＴ１のヌクレオチド配列の１部を示す
図。
ラスミドｐＭＵＴ１のヌクレオチド配列の１部を示す
図。
【図１Ｂ】図１Ａの続きの配列図。
【図１Ｃ】図１Ｂの続きの配列図。
【図２】プラスミドｐＭＵＴ１の制限地図を示す図。
【図３】２種類のプラスミドｐＭＵＴ１（ａ）及びｐＭ
ＵＴ２（ｂ）のために予め結合した開いた読みとり枠の
図。
ＵＴ２（ｂ）のために予め結合した開いた読みとり枠の
図。
【図４Ａ】ＤＳＭ６６０１菌株の約５ｋｂの大きさのプ
ラスミドｐＭＵＴ２のヌクレオチド配列の１部を示す
図。
ラスミドｐＭＵＴ２のヌクレオチド配列の１部を示す
図。
【図４Ｂ】図４Ａの続きの配列図。
【図４Ｃ】図４Ｂの続きの配列図。
【図４Ｄ】図４Ｃの続きの配列図。
【図４Ｅ】図４Ｄの続きの配列図。
【図５】プラスミドｐＭＵＴ２の制限地図を示す図。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年５月２０日（２００２．５．２
０）
０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 細菌性プラスミド
【特許請求の範囲】
【外１】
【外２】
【外３】
【外４】
【外５】
。
【外６】
【外７】
【外８】
【外９】
【外１０】
。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細菌性プラスミド
に関するものである。
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】プラスミドは、染色体外の主として環状
で自己複製する小さなＤＮＡ分子であり、ほとんど全て
の細菌あるいはまたいくつかの真核生物並びにミトコン
ドリアの中に存在している。プラスミドの大きさは、約
１．５〜３００ｋｂの間で変動する。
で自己複製する小さなＤＮＡ分子であり、ほとんど全て
の細菌あるいはまたいくつかの真核生物並びにミトコン
ドリアの中に存在している。プラスミドの大きさは、約
１．５〜３００ｋｂの間で変動する。
【０００３】細菌性プラスミドは、通常、環状で共有結
合して閉じており、かつ超らせんになっている。これら
は、多くの場合、抗生物質又は重金属に抵抗性の遺伝
子、非典型的基質の代謝のための遺伝子又は一連の種特
異的特徴、例えば代謝特性又は病原性因子のための遺伝
子を有している。多くのプラスミドは、１つの細胞から
別の細胞へ転写することもできる。細菌の病原性は、今
日の見解によればプラスミドの性質によっても部分的に
左右されるので、プラスミド−ＤＮＡの性質の解明に関
して、重要性がより一層大きなものになっている。
合して閉じており、かつ超らせんになっている。これら
は、多くの場合、抗生物質又は重金属に抵抗性の遺伝
子、非典型的基質の代謝のための遺伝子又は一連の種特
異的特徴、例えば代謝特性又は病原性因子のための遺伝
子を有している。多くのプラスミドは、１つの細胞から
別の細胞へ転写することもできる。細菌の病原性は、今
日の見解によればプラスミドの性質によっても部分的に
左右されるので、プラスミド−ＤＮＡの性質の解明に関
して、重要性がより一層大きなものになっている。
【０００４】腸内細菌科については、１４の主属と６の
別種が含まれるが、これらは、種々の性質を発達させる
ことができることは公知である。代表的な例は、大腸菌
（Escherichia）、サルモネラ菌（Salmonella）及び肺
炎桿菌（Klebsiella）である。大腸菌（E.coli）は、バ
クテリア遺伝学の古典的対象である。ようやく、大腸菌
E.coliの種々の病原性因子の発見と特性決定により、前
記の種類の菌株が、最近広がった「EHEC」として公知の
変種の場合のように無毒性から高度な毒性にまで達する
部分的に極端に異なるヒトもしくは動物病原性を示すこ
とについての一般に満足のいく説明を見出すことが可能
になった。それで、腸管外並びに腸内の大腸菌E.coli株
については、部分的に十分に特性決定されている一連の
病原性因子が既に記載されている。血清グループＯ６：
Ｋ５の病原性大腸菌E.coli株については、例えば前記の
血清グループの非病原性の代表の場合には明らかに生じ
ない溶血及びｐ−フィンブリエ癒着（P-Fimbrienadheas
ine）のような病原性が見出された。
別種が含まれるが、これらは、種々の性質を発達させる
ことができることは公知である。代表的な例は、大腸菌
（Escherichia）、サルモネラ菌（Salmonella）及び肺
炎桿菌（Klebsiella）である。大腸菌（E.coli）は、バ
クテリア遺伝学の古典的対象である。ようやく、大腸菌
E.coliの種々の病原性因子の発見と特性決定により、前
記の種類の菌株が、最近広がった「EHEC」として公知の
変種の場合のように無毒性から高度な毒性にまで達する
部分的に極端に異なるヒトもしくは動物病原性を示すこ
とについての一般に満足のいく説明を見出すことが可能
になった。それで、腸管外並びに腸内の大腸菌E.coli株
については、部分的に十分に特性決定されている一連の
病原性因子が既に記載されている。血清グループＯ６：
Ｋ５の病原性大腸菌E.coli株については、例えば前記の
血清グループの非病原性の代表の場合には明らかに生じ
ない溶血及びｐ−フィンブリエ癒着（P-Fimbrienadheas
ine）のような病原性が見出された。
【０００５】ビルレンス遺伝子は、腸内細菌の場合に
は、通常大きなプラスミド（約60ｋｂ）上に見出され
る。あるいはまた、小さな、いわゆる潜在プラスミドを
有する腸内細菌も存在しているが、その機能は、これま
でにまだ確定できてはいなかった。
は、通常大きなプラスミド（約60ｋｂ）上に見出され
る。あるいはまた、小さな、いわゆる潜在プラスミドを
有する腸内細菌も存在しているが、その機能は、これま
でにまだ確定できてはいなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】大腸菌の場合には、病
原性因子が少なくとも部分的にプラスミドの遺伝子中に
も存在していることは公知であるので、従って例えば腸
内細菌による感染後の疾患の際の診断及び治療法を改善
するために腸内細菌、殊に大腸菌E.coliの場合のプラス
ミドの発見及び特性決定のための他の試験に対する要求
がある。プラスミドもしくはその細菌担体又は相応する
合成ＤＮＡは、微生物学的分析又は診断の際、医学的に
は治療又は予防の際並びに栄養生理学的又は共生目的に
使用することができる。その上更に、プラスミド、詳細
には殊に大腸菌E.coliのプラスミドは、遺伝子工学にお
ける公知の発現ベクターであるので、前記の理由から
も、この種のプラスミドの性質の訂正された知識は重要
である。
原性因子が少なくとも部分的にプラスミドの遺伝子中に
も存在していることは公知であるので、従って例えば腸
内細菌による感染後の疾患の際の診断及び治療法を改善
するために腸内細菌、殊に大腸菌E.coliの場合のプラス
ミドの発見及び特性決定のための他の試験に対する要求
がある。プラスミドもしくはその細菌担体又は相応する
合成ＤＮＡは、微生物学的分析又は診断の際、医学的に
は治療又は予防の際並びに栄養生理学的又は共生目的に
使用することができる。その上更に、プラスミド、詳細
には殊に大腸菌E.coliのプラスミドは、遺伝子工学にお
ける公知の発現ベクターであるので、前記の理由から
も、この種のプラスミドの性質の訂正された知識は重要
である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】更に、大腸菌E.coli株DS
M ６６０１を用いる分子遺伝学的試験が実施された。こ
の菌株によって得られるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列分析
のデータバンクプログラムを用いて取出され、既に存在
する別の細菌のＤＮＡ配列と比較されている。
M ６６０１を用いる分子遺伝学的試験が実施された。こ
の菌株によって得られるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列分析
のデータバンクプログラムを用いて取出され、既に存在
する別の細菌のＤＮＡ配列と比較されている。
【０００８】前記菌株DSM ６６０１は、ｐＭＵＴ１もし
くはｐＭＵＴ２と呼称された３１７７もしくは５５５２
ｂｐの大きさの２種の小さなプラスミドを有している。
くはｐＭＵＴ２と呼称された３１７７もしくは５５５２
ｂｐの大きさの２種の小さなプラスミドを有している。
【０００９】より小さい方のプラスミドｐＭＵＴ１のＤ
ＮＡは、酵素HindIIIを用いる制限切断後に、ベクター
ｐＵＣ１８中の線状フラグメントとしてサブクローニン
グされ、引き続き、ＤＮＡ配列が決定された。これは、
添付図１から明らかである。こうして得られたＤＮＡ配
列を、GenEMBL−データバンクを用いて相同性を比較し
たが、前記の対比の結果は、図２から明らかである。
ＮＡは、酵素HindIIIを用いる制限切断後に、ベクター
ｐＵＣ１８中の線状フラグメントとしてサブクローニン
グされ、引き続き、ＤＮＡ配列が決定された。これは、
添付図１から明らかである。こうして得られたＤＮＡ配
列を、GenEMBL−データバンクを用いて相同性を比較し
たが、前記の対比の結果は、図２から明らかである。
【００１０】前記の比較のために、HindIII−切断部位
を１位と定めた。２００〜８００ｂｐ位で、プラスミド
ｐＭＵＴ１のＤＮＡは、別の腸内細菌のプラスミドの種
々の重複出発地点（重複起点）、特にプラスミドＮＴＰ
１、ＮＴＰ１６及びＣｌｏＤＦ１３に対する有意相同性
を示している９５０。ｂｐ位の領域では、もともとサル
モネラチフィムリウム（Salmonella typhimurium）から
単離しておいたプラスミドＮＴＰ１６に対する５７０ｂ
ｐの大きさの均一性が開始している。前記の相同性に
は、プラスミドＮＴＰ１６の可動性にとって必要である
mobA-Gen、伝達起点（ｏｒｉＴ）が含まれている。その
上更に、１７９０〜１９２０ｂｐ位から、遺伝子ｐａｒ
Ａ及びｃｅｒに対する有意相同性が見出されたが、これ
は、細胞分裂の際の安定性及び連続的な情報伝達及びプ
ラスミド分子の分布にとって重要である。その他のＤＮ
Ａ領域については、有意相同性を確認することはできな
かった。
を１位と定めた。２００〜８００ｂｐ位で、プラスミド
ｐＭＵＴ１のＤＮＡは、別の腸内細菌のプラスミドの種
々の重複出発地点（重複起点）、特にプラスミドＮＴＰ
１、ＮＴＰ１６及びＣｌｏＤＦ１３に対する有意相同性
を示している９５０。ｂｐ位の領域では、もともとサル
モネラチフィムリウム（Salmonella typhimurium）から
単離しておいたプラスミドＮＴＰ１６に対する５７０ｂ
ｐの大きさの均一性が開始している。前記の相同性に
は、プラスミドＮＴＰ１６の可動性にとって必要である
mobA-Gen、伝達起点（ｏｒｉＴ）が含まれている。その
上更に、１７９０〜１９２０ｂｐ位から、遺伝子ｐａｒ
Ａ及びｃｅｒに対する有意相同性が見出されたが、これ
は、細胞分裂の際の安定性及び連続的な情報伝達及びプ
ラスミド分子の分布にとって重要である。その他のＤＮ
Ａ領域については、有意相同性を確認することはできな
かった。
【００１１】その上更に、プラスミドｐＭＵＴ１のＤＮ
Ａ配列を、アミノ酸配列中に書き換え、開いた読み取り
枠の存在を分析した。６つの異なる読み取り枠の可能性
を試験した。１４３、６２、５６、４９及び４８のアミ
ノ酸の大きさを有する全部で５つの開いた読み取り枠を
見出すことができた。分析図は、図３中に図示してあ
る。
Ａ配列を、アミノ酸配列中に書き換え、開いた読み取り
枠の存在を分析した。６つの異なる読み取り枠の可能性
を試験した。１４３、６２、５６、４９及び４８のアミ
ノ酸の大きさを有する全部で５つの開いた読み取り枠を
見出すことができた。分析図は、図３中に図示してあ
る。
【００１２】より大きなプラスミドpMUT2のＤＮＡを、
制限酵素SphIを用いる線状化後に同様にベクターｐＵＣ
１８中にサブクローニングし、引き続き、完全に順序付
けした。ＤＮＡ配列は、図４から明らかである。こうし
て得られたＤＮＡ配列を、遺伝子EMBL-データバンクプ
ログラムを用いて、既に公知のＤＮＡ配列に対する相同
性について試験した。結果は、図５中に図示してある。
プラスミドｐＭＵＴ２のＤＮＡは、８９０〜１６６０ｂ
ｐ位中で大腸菌E.coliの種々のＣｏｌＥ１−プラスミド
のレプリコン領域に対する有意相同性を示している。Ｃ
ｏｌＥ１プラスミドに対するもう１つの有意相同性は、
３８００〜４９５０ｂｐ位の領域に存在している。この
場合、ＣｏｌＥ１−プラスミドの可動領域に対する相同
性が重要である。３７７０〜４９８０ｂｐ位の領域中に
は、パスツレラ−ヘモリチカ株A1のプラスミドに対する
相同性が見出された。前記のプラスミド上には、パスツ
レラ属の場合に抗菌性耐性蛋白質についてコードする遺
伝子が存在している。しかしながら、相同性は、遺伝子
間領域に亘って延在しているので、プラスミドの可動性
にとって必要である配列が重要であることもある。
制限酵素SphIを用いる線状化後に同様にベクターｐＵＣ
１８中にサブクローニングし、引き続き、完全に順序付
けした。ＤＮＡ配列は、図４から明らかである。こうし
て得られたＤＮＡ配列を、遺伝子EMBL-データバンクプ
ログラムを用いて、既に公知のＤＮＡ配列に対する相同
性について試験した。結果は、図５中に図示してある。
プラスミドｐＭＵＴ２のＤＮＡは、８９０〜１６６０ｂ
ｐ位中で大腸菌E.coliの種々のＣｏｌＥ１−プラスミド
のレプリコン領域に対する有意相同性を示している。Ｃ
ｏｌＥ１プラスミドに対するもう１つの有意相同性は、
３８００〜４９５０ｂｐ位の領域に存在している。この
場合、ＣｏｌＥ１−プラスミドの可動領域に対する相同
性が重要である。３７７０〜４９８０ｂｐ位の領域中に
は、パスツレラ−ヘモリチカ株A1のプラスミドに対する
相同性が見出された。前記のプラスミド上には、パスツ
レラ属の場合に抗菌性耐性蛋白質についてコードする遺
伝子が存在している。しかしながら、相同性は、遺伝子
間領域に亘って延在しているので、プラスミドの可動性
にとって必要である配列が重要であることもある。
【００１３】別の腸内細菌プラスミドに対する有意相同
性を有する２つの領域を確認した。この場合、プラスミ
ドの可動性にとって必要である複製領域の起点及びmob
−領域が重要である。ｐＭＵＴ２については、その他の
ＤＮＡ断片にとって、有機相同性を確認することができ
なかった。
性を有する２つの領域を確認した。この場合、プラスミ
ドの可動性にとって必要である複製領域の起点及びmob
−領域が重要である。ｐＭＵＴ２については、その他の
ＤＮＡ断片にとって、有機相同性を確認することができ
なかった。
【００１４】また、プラスミドｐＭＵＴ２のＤＮＡ配列
を、引き続きアミノ酸配列中に書き換え、開いた読み取
り枠の存在を分析した。結果は、図３中に同様に図示し
てある。３２７、３１８、２６４、７６及び６３のアミ
ノ酸の大きさでのアミノ酸配列を有する５つの開いた読
み取り枠が見出された。
を、引き続きアミノ酸配列中に書き換え、開いた読み取
り枠の存在を分析した。結果は、図３中に同様に図示し
てある。３２７、３１８、２６４、７６及び６３のアミ
ノ酸の大きさでのアミノ酸配列を有する５つの開いた読
み取り枠が見出された。
【００１５】これまでに知られていないプラスミドｐＭ
ＵＴ１及びｐＭＵＴ２以外に、これらの組合せ物も、こ
れまで、E.coli菌株又は別の腸内細菌中に見出されてい
ない。
ＵＴ１及びｐＭＵＴ２以外に、これらの組合せ物も、こ
れまで、E.coli菌株又は別の腸内細菌中に見出されてい
ない。
【００１６】プラスミドの存在は、菌株ＤＳＭ ６６０
１の代謝及び医薬及び／又は栄養生理学もしくは共生に
利用可能な性質に関連していることもある。
１の代謝及び医薬及び／又は栄養生理学もしくは共生に
利用可能な性質に関連していることもある。
【００１７】プラスミドの試験は、腸内細菌、殊に大腸
菌属のより詳細な決定及び分析を可能にする。その上更
に、前記プラスミドは、遺伝子工学にとって懸念されな
い発現ベクターとして提供されている。
菌属のより詳細な決定及び分析を可能にする。その上更
に、前記プラスミドは、遺伝子工学にとって懸念されな
い発現ベクターとして提供されている。
【００１８】
【実施例】以下に本発明を実施例に基づき詳細に説明す
る： 例 １： プラスミド単離 プラスミド−ＤＮＡの単離を、Birnboim他（Birnboim,
A. C.及びDoly, J.（１９７９） Nucl. Acid Res. ７：
１５１３〜１５２３ A rapid alkaline extraction pro
cedure for screening recombinant plasmid DNA）に基
づいて行った。
る： 例 １： プラスミド単離 プラスミド−ＤＮＡの単離を、Birnboim他（Birnboim,
A. C.及びDoly, J.（１９７９） Nucl. Acid Res. ７：
１５１３〜１５２３ A rapid alkaline extraction pro
cedure for screening recombinant plasmid DNA）に基
づいて行った。
【００１９】ＬＢ−培地３ｍｌに、細菌コロニーを接種
し、かつ３７℃で一晩振盪させる。この培養物をエッペ
ンドルフ容器中で遠心分離し、培地残分をピペットで除
去する。細胞沈殿物を、溶液Ｉ（グルコース５０ｍＭ；
ＥＤＴＡ１０ｍＭ、ｐＨ８；トリス−ＨＣｌ２５ｍＭ、
ｐＨ８）１００μｌで再懸濁させる。室温で５分間の培
養後に、溶液ＩＩ（ＮａＯＨ０．２Ｎ；ＳＤＳ１％）２
００μｌを添加し、清澄になるまで混合し、かつエッペ
ンドルフ容器を更に５分間氷の上に放置する。次に、溶
液ＩＩＩ（Ｎａ−アセテート０．２Ｍ、ｐＨ４．８）１
５０μｌを添加し、染色体ＤＮＡをフレーク上に沈澱す
るまで振盪し、かつ該沈殿物を再度５分間氷の上に放置
する。沈澱した染色体ＤＮＡ及び細胞残分を遠心分離器
中で５分間ペレット化し、かつプラスミド−ＤＮＡを有
する上清を、新たな容器の中に移送する。プラスミド−
ＤＮＡの精製のために、フェノール５０μｌ及びクロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２４：１）１５０μｌ
を添加し、かつ短時間の振盪後に２分間遠心分離する。
水相を新たな容器の中にピペットで入れる。プラスミド
−ＤＮＡを、２用量の氷冷却したエタノールで沈澱さ
せ、かつ１０分間遠心分離する。ペレットを、７０％の
エタノールで洗浄し、かつ高速真空（Speedvac）中で乾
燥させる。プラスミド−ＤＮＡをＨ２Ｏｂｉｎｄｅｓｔ
２０ｍｌ中で再懸濁させ、かつ−２０℃で保存する。
し、かつ３７℃で一晩振盪させる。この培養物をエッペ
ンドルフ容器中で遠心分離し、培地残分をピペットで除
去する。細胞沈殿物を、溶液Ｉ（グルコース５０ｍＭ；
ＥＤＴＡ１０ｍＭ、ｐＨ８；トリス−ＨＣｌ２５ｍＭ、
ｐＨ８）１００μｌで再懸濁させる。室温で５分間の培
養後に、溶液ＩＩ（ＮａＯＨ０．２Ｎ；ＳＤＳ１％）２
００μｌを添加し、清澄になるまで混合し、かつエッペ
ンドルフ容器を更に５分間氷の上に放置する。次に、溶
液ＩＩＩ（Ｎａ−アセテート０．２Ｍ、ｐＨ４．８）１
５０μｌを添加し、染色体ＤＮＡをフレーク上に沈澱す
るまで振盪し、かつ該沈殿物を再度５分間氷の上に放置
する。沈澱した染色体ＤＮＡ及び細胞残分を遠心分離器
中で５分間ペレット化し、かつプラスミド−ＤＮＡを有
する上清を、新たな容器の中に移送する。プラスミド−
ＤＮＡの精製のために、フェノール５０μｌ及びクロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２４：１）１５０μｌ
を添加し、かつ短時間の振盪後に２分間遠心分離する。
水相を新たな容器の中にピペットで入れる。プラスミド
−ＤＮＡを、２用量の氷冷却したエタノールで沈澱さ
せ、かつ１０分間遠心分離する。ペレットを、７０％の
エタノールで洗浄し、かつ高速真空（Speedvac）中で乾
燥させる。プラスミド−ＤＮＡをＨ２Ｏｂｉｎｄｅｓｔ
２０ｍｌ中で再懸濁させ、かつ−２０℃で保存する。
【００２０】例 ２：
ＤＮＡ−配列化
ＤＮＡ−配列化を、F. Sanger他（Sanger, F.、Nickle
n, S. 及びCoulson, A.R.（１９７７） Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA ７４．：５４６３〜５４６７のDNA seque
ncing with chain terminating inhibitors）に基づい
て行った。
n, S. 及びCoulson, A.R.（１９７７） Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA ７４．：５４６３〜５４６７のDNA seque
ncing with chain terminating inhibitors）に基づい
て行った。
【００２１】ＤＮＡ配列化を、Firma Pharmacia LKB社
のＴ７−配列化キットを用いて行った。
のＴ７−配列化キットを用いて行った。
【００２２】変性工程のために、プラスミド−ＤＮＡ８
μｌ（１．５〜２μｇ）を２ＮのＮａＯＨ２μｌと混合
し、短時間遠心分離し、１０分間室温で培養する。ＤＮ
Ａを、３ＭのＮａ−アセテート３μｌ、ｐＨ４．８並び
にＨ２Ｏｂｉｄｅｓｔ７μｌ及び氷冷却したエタノール
ａｂｓｏｌｕｔ６０μｌを用いて−７０℃で１５分間沈
澱させる。沈澱したＤＮＡを１０分間遠心分離し、７０
％のエタノールで洗浄し、かつ乾燥させる。
μｌ（１．５〜２μｇ）を２ＮのＮａＯＨ２μｌと混合
し、短時間遠心分離し、１０分間室温で培養する。ＤＮ
Ａを、３ＭのＮａ−アセテート３μｌ、ｐＨ４．８並び
にＨ２Ｏｂｉｄｅｓｔ７μｌ及び氷冷却したエタノール
ａｂｓｏｌｕｔ６０μｌを用いて−７０℃で１５分間沈
澱させる。沈澱したＤＮＡを１０分間遠心分離し、７０
％のエタノールで洗浄し、かつ乾燥させる。
【００２３】アニーリング反応のために、変性したＤＮ
ＡをＨ２Ｏｂｉｄｅｓｔ１０μｌ中で懸濁させ、かつア
ニーリング緩衝液２μｌ及びプライマー２μｌ（４０ｎ
ｇ）と混合する。沈殿物を３７℃で２０分間培養する
と、鋳型ＤＮＡへのプライマーの結合を行うことができ
る。反応バッチを室温で１０分間冷却し、次に標識化反
応のために直ちに使用するか又は−２０℃で凍結させ
る。標識化反応のために、標識混合物（Labelling-Mi
x）３μｌ、［α−Ｐ３２］ｄＡＴＰ１μｌ及びＴ７−
ポリメラーゼ（Ｔ７−ポリメラーゼを酵素希釈緩衝液で
１：５希釈）２μｌを、アニーリング反応バッチ中にピ
ペットで入れ、かつ短時間の混合後に、室温で５分間培
養する。この間に、停止反応のために既に用意した配列
剤混合物（２．５μｌを有する各容器１個を「略し
て」'Ｇ'−Ｍｉｘ、'Ａ'−Ｍｉｘ、'Ｔ'−Ｍｉｘ及び'
Ｃ'−Ｍｉｘ）を３７℃で予備昇温させる。標識化反応
の経過後に、それぞれその４μｌを４種の配列化剤混合
物に添加し、かつピペットで短時間混合する。停止反応
物を３７℃で５分間培養する。停止反応の終了のため
に、それぞれ５μｌの停止溶液を添加する。こうして各
バッチを９５℃で培養器の中に移送し、２分間変性さ
せ、次に氷の上に置いた。反応物それぞれ２．５μｌ
を、配列化ゲル［尿素２５．２ｇ、Ｈ２Ｏｂｉｄｅｓｔ
２２ｍｌ、１０×ＴＢＥ６ｍｌ、ポリアクリルアミド
（４０％）１０ｍｌ、過硫酸アンモニウム（１６ｍｇ／
ｍｌ）２ｍｌ、ＴＥＭＥＤ６０μｌ］の上に、'Ｇ'、'
Ａ'、'Ｔ'、'Ｃ'の順序で載せる。電気泳動を４０ワッ
ト及び１５００ボルトで４．５時間行う。
ＡをＨ２Ｏｂｉｄｅｓｔ１０μｌ中で懸濁させ、かつア
ニーリング緩衝液２μｌ及びプライマー２μｌ（４０ｎ
ｇ）と混合する。沈殿物を３７℃で２０分間培養する
と、鋳型ＤＮＡへのプライマーの結合を行うことができ
る。反応バッチを室温で１０分間冷却し、次に標識化反
応のために直ちに使用するか又は−２０℃で凍結させ
る。標識化反応のために、標識混合物（Labelling-Mi
x）３μｌ、［α−Ｐ３２］ｄＡＴＰ１μｌ及びＴ７−
ポリメラーゼ（Ｔ７−ポリメラーゼを酵素希釈緩衝液で
１：５希釈）２μｌを、アニーリング反応バッチ中にピ
ペットで入れ、かつ短時間の混合後に、室温で５分間培
養する。この間に、停止反応のために既に用意した配列
剤混合物（２．５μｌを有する各容器１個を「略し
て」'Ｇ'−Ｍｉｘ、'Ａ'−Ｍｉｘ、'Ｔ'−Ｍｉｘ及び'
Ｃ'−Ｍｉｘ）を３７℃で予備昇温させる。標識化反応
の経過後に、それぞれその４μｌを４種の配列化剤混合
物に添加し、かつピペットで短時間混合する。停止反応
物を３７℃で５分間培養する。停止反応の終了のため
に、それぞれ５μｌの停止溶液を添加する。こうして各
バッチを９５℃で培養器の中に移送し、２分間変性さ
せ、次に氷の上に置いた。反応物それぞれ２．５μｌ
を、配列化ゲル［尿素２５．２ｇ、Ｈ２Ｏｂｉｄｅｓｔ
２２ｍｌ、１０×ＴＢＥ６ｍｌ、ポリアクリルアミド
（４０％）１０ｍｌ、過硫酸アンモニウム（１６ｍｇ／
ｍｌ）２ｍｌ、ＴＥＭＥＤ６０μｌ］の上に、'Ｇ'、'
Ａ'、'Ｔ'、'Ｃ'の順序で載せる。電気泳動を４０ワッ
ト及び１５００ボルトで４．５時間行う。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＤＳＭ６６０１菌株の約３ｋｂの大きさのプ
ラスミドｐＭＵＴ１のヌクレオチド配列の１部を示す
図。
ラスミドｐＭＵＴ１のヌクレオチド配列の１部を示す
図。
【図１Ｂ】図１Ａの続きの配列図。
【図１Ｃ】図１Ｂの続きの配列図。
【図２】プラスミドｐＭＵＴ１の制限地図を示す図。
【図３】２種類のプラスミドｐＭＵＴ１（ａ）及びｐＭ
ＵＴ２（ｂ）のために予め結合した開いた読みとり枠の
図。
ＵＴ２（ｂ）のために予め結合した開いた読みとり枠の
図。
【図４Ａ】ＤＳＭ６６０１菌株の約５ｋｂの大きさのプ
ラスミドｐＭＵＴ２のヌクレオチド配列の１部を示す
図。
ラスミドｐＭＵＴ２のヌクレオチド配列の１部を示す
図。
【図４Ｂ】図４Ａの続きの配列図。
【図４Ｃ】図４Ｂの続きの配列図。
【図４Ｄ】図４Ｃの続きの配列図。
【図４Ｅ】図４Ｄの続きの配列図。
【図５】プラスミドｐＭＵＴ２の制限地図を示す図。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図５】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 イェルク ハッカー
ドイツ連邦共和国 ゲアブルン エディス
−シュタイン−シュトラーセ ６
(72)発明者 ウルリッヒ ゾンネンボルン
ドイツ連邦共和国 ボッフッム アイヒェ
ンヴェーク ６
(72)発明者 ユルゲン シュルツェ
ドイツ連邦共和国 ベルクホルツ−レーブ
リュッケ アリス−ブロッホ−シュトラー
セ ７
(72)発明者 ガブリエレ ブルム−エーラー
ドイツ連邦共和国 ヴュルツブルク ゲー
テシュトラーセ ３
(72)発明者 ユルゲン マリンカ
ドイツ連邦共和国 ゼルム パウルスヴィ
ーゼ 11
(72)発明者 ハンス プロッパート
ドイツ連邦共和国 ハーゲン ローゼンシ
ュトラーセ 102
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA01 DA05 DA06
EA04
Claims (4)
- 【請求項１】 配列番号２で表されるＤＮＡ配列を有す
るプラスミド。 - 【請求項２】 配列番号２で表されるヌクレオチド列を
有するか又はこれからなるＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 微生物学的分析及び／又は診断におけ
る、請求項１または２記載のプラスミド又はＤＮＡ配列
の使用。 - 【請求項４】 発現ベクターとしての、請求項１または
２記載のプラスミド又はＤＮＡ配列の使用。
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|---|---|---|---|
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| DK (1) | DK0975774T3 (ja) |
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| HK (2) | HK1026233A1 (ja) |
| HU (1) | HU228182B1 (ja) |
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| HUP0004409A3 (en) * | 1997-11-19 | 2001-09-28 | Pharma Zentrale Gmbh | Method for identifying escherichia coli strain dsm 6601 |
| DE19915772C2 (de) * | 1998-11-18 | 2001-08-30 | Pharma Zentrale Gmbh | Verfahren zur Identifizierung von Escherichia coli Stamm DSM 6601 |
| DE10155928A1 (de) * | 2001-11-15 | 2003-06-12 | Degussa | recA-negativer und rhaB-negativer Mikroorganismus |
| US7648886B2 (en) * | 2003-01-14 | 2010-01-19 | Globalfoundries Inc. | Shallow trench isolation process |
| DE10328669B4 (de) * | 2003-06-26 | 2005-12-01 | Pharma-Zentrale Gmbh | Plasmidfreier Klon des E. coli Stammes DSM 6601 |
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