JP7054678B2 - ゲノムdna断片の標的化された精製のための調製用電気泳動方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年11月20日に出願された“Preparative Electrophoretic Method for Targeted Purification of Genomic DNA Fragments”と題する米国仮特許出願番号第62/258,384号に基づく優先権を主張しており、この仮特許出願の開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
全ゲノムシーケンシングの費用の高額さと、全ゲノム配列解析の複雑さとに起因して、大半の次世代シーケンシング実験は、いわゆる標的化されたシーケンシングの探索において、全てのタンパク質コード領域(全エクソームシーケンシング、「WES」)、または遺伝子の特異的サブセット(またはゲノム領域の特異的サブセット)など、標的化されたゲノム領域について検討しようとしている。バーコード処理されたシーケンシングアダプターを使用して、このような標的化されたシーケンシング実験を実行する場合、多くのこのような試料をプールし、単回のシーケンシングランで一緒にランし、これにより、試料シーケンシング費用を劇的に軽減することができる。この理由で、今日(および過去数年間にわたり)実施されているNGSの大部分は、WESまたは標的化されたシーケンシングである。
現行の標的化されたシーケンシング法に関する、別の困難は、ロングレンジのゲノム構造および再配列の研究、ならびにロングレンジのフェージングおよびハプロタイプ解析のために、それらを、極めて大きなDNA分子(10kb~1桁の低い(low sigle)メガ塩基対(mb))へと適用することの困難である。例えば、ロングレンジのPCRは、10kbを超える距離については信頼できず、大半の市販のDNA抽出法は、50~100kbを超えるDNAを、信頼できる形ではもたらさない。
本開示の一部の実施形態では、ゲノムDNAの特異的断片を単離するための方法が提示され、
・高分子量(HMW)DNAを含有する試料を提供するステップと;
・試料を、HMW DNAが極めて低い電気泳動移動度を有する、ゲルマトリックス内に封入するステップと;
・試料を封入したゲルマトリックスを、溶解試薬へと曝露して、HMW DNAを、他の試料夾雑物から放出するステップと;
・試料夾雑物および溶解試薬を、ゲルマトリックスから除去し、ゲル内に封入された精製HMW DNAを後に残すように、試料を封入したゲルマトリックスを、電気泳動場に供するステップと;
・精製DNAを封入したゲルマトリックスを、試料DNA内の特異的DNA配列において切断するよう構成されたDNAクリベース試薬による処理に供し、これにより、サイズを低減した断片としての試料の、規定されたセグメントを遊離させるステップであって、遊離させた規定のDNA断片が、残余の、切断されていないHMWの試料DNAより、はるかに大きな電気泳動移動度を有するステップと;
・特異的に切り出されたDNA断片を、残余の、切断されていないHMWの試料DNAから物理的に分離するように、ゲルマトリックスを、電気泳動場に供するステップと;
・特異的に切り出され、電気泳動により分離されたDNA断片を、ゲルマトリックスから単離し、依然としてゲルマトリックス内に封入されている、HMW DNA試料の切断されていない残余をあとに残すステップと
を含む。
図3A~3Eは、ゲル電気泳動カセット(例えば、図1および2に例示される)を利用する、本開示の実施形態を例示する。図1は、市販の調製用電気泳動カセットおよびこのカセットを使用するサイズ選択工程についての概略図を示す。図1の左側では、試料核酸を、試料ウェルから、アガロースを充填した分離チャネルを通して、下方へと電気泳動させ、ここで、試料核酸は、サイズにより分離される。分離の後、分離電極をオフにし、溶出電極をオンにし、これにより、分離された核酸を、分離チャネルの右側の溶出モジュールのセットへと側方に、電気溶出させる。溶出させた核酸は、電気泳動緩衝液中に存在し、手動または自動のピペッティング手段を使用して、溶出モジュールから取り出すことができる。
(項目1)
ゲノムDNAの断片を単離するための方法であって、
高分子量(HMW)DNAを有する粒子を含有する試料を提供するステップと;
前記試料をゲルマトリックス内に封入するステップと;
試料を封入した前記ゲルマトリックスを、前記HMW DNAを前記粒子から放出するように構成された溶解試薬へと曝露するステップと;
前記HMW DNAが残留するように、前記ゲルマトリックスから、前記HMW DNAを前記粒子、溶解試薬、および/または他の試料構成要素から取り出すように構成された電気泳動場に前記ゲルマトリックスを供することにより、前記試料の前記HMW DNAを精製するステップと;
サイズを低減した断片としての前記DNAの、規定されたセグメントを遊離させるように、前記ゲルマトリックスを、前記HMW DNA内の特異的DNA配列において切断するよう構成されたDNAクリベース試薬に供するステップと;
前記ゲルマトリックスを、
前記DNA断片を移動させ、これにより、実質的に不動のままである前記HMW DNAの、切断されていないDNAから分離するように構成された電気泳動場に供するステップと;
電気泳動により分離されたDNA断片を、前記ゲルマトリックスから単離するステップと
を含む方法。
(項目2)
前記HMW DNAの切断されていない残余が、前記ゲルマトリックスに封入されたままである、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記粒子が、懸濁液中に含有され、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、原生動物細胞からなる群から選択される無傷細胞、および無傷ウイルス粒子のうちの少なくとも1つを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目4)
前記ゲルマトリックスが、アガロースヒドロゲルを、約0.2%~約5%(重量/容量)の間の濃度で含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目5)
前記溶解試薬が、アニオン性界面活性剤を、0.05%~10%の間の濃度で含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目6)
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記HMW DNAのサイズが、>10メガ塩基対の長さであり、前記DNA断片のサイズが、<2メガ塩基対の長さである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目8)
前記粒子が、細菌細胞、植物細胞、または真菌細胞を含む際に、前記ゲルマトリックスを、溶解の前に細胞壁を除去するように構成された他の酵素試薬処理に供するステップをさらに含む、項目3に記載の方法。
(項目9)
前記DNA断片を、緩衝液を含有する溶出モジュールへの電気溶出により、前記ゲルマトリックスから単離する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目10)
DNAクリベース試薬が、1つまたは複数のRNAによりガイドされるエンドヌクレアーゼ組成物を含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目11)
前記RNAによりガイドされるエンドヌクレアーゼ組成物が、ガイドRNA-Cas9複合体が、前記HMW DNAの、使用者に指定された特異的部位で切断することを可能とするように構成されたガイドRNAを伴うCas9タンパク質に基づく、項目11に記載の方法。
(項目12)
ゲノムDNAの断片を単離するための方法であって、
高分子量(HMW)DNAを含有する試料を提供するステップと;
前記試料をゲルマトリックス内に封入するステップと;
サイズを低減した断片としての前記HMW DNAの、規定されたセグメントを遊離させるように、前記ゲルマトリックスを、前記HMW DNA内の特異的DNA配列において切断するよう構成されたDNAクリベース試薬に供するステップと;
前記ゲルマトリックスを、
前記DNA断片を移動させ、これにより、実質的に不動のままである前記HMW DNAの、切断されていないDNAから分離するように構成された電気泳動場に供するステップと;
電気泳動により分離されたDNA断片を、前記ゲルマトリックスから単離するステップと
を含む方法。
(項目13)
ゲノムDNAの断片を単離するための方法であって、
高分子量(HMW)DNAをゲルマトリックス内に封入するステップと;
サイズを低減した断片としての前記HMW DNAの、規定されたセグメントを遊離させるように、前記ゲルマトリックスを、前記HMW DNA内の特異的DNA配列において切断するよう構成されたDNAクリベース試薬に供するステップと;
前記ゲルマトリックスを、
前記DNA断片を移動させ、これにより、実質的に不動のままである前記HMW DNAの、切断されていないDNAから分離するように構成された電気泳動場に置くステップと;
電気泳動により分離されたDNA断片を、前記ゲルマトリックスから単離するステップと
を含む方法。
(項目14)
項目1から13のいずれかに記載の方法を実施するための装置またはシステム。
以下の実施例は、本開示の実施形態のうちの一部を例示し、裏書きする一助となるように提示されるものであり、限定的なものと考えるべきではない。
HLA遺伝子座から、長いDNA断片を単離するための、カスタムのCas9 gRNAクリベース試薬
背景:HLA分子は、クラスI(HLA-A、HLA-B、HLA-C)およびクラスII(HLA-DRB1/HLA-DRB3/HLA-DRB4/HLA-DRB5、HLA-DQB1、HLA-DPB1)遺伝子によりコードされる。これらの遺伝子は、T細胞受容体に対する多様なペプチドであって、T細胞の発生、自己寛容、および適応免疫を調節するペプチドをもたらす。HLA分子は、免疫原性であり、同種移植設定において、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の標的となり得るので、HLA型解析は、移植のドナーとレシピエントとの間の免疫学的適合性を評価するための標準ケアとなっている。サンガーシーケンシングを使用して、一塩基の分解能におけるHLA型解析が実施されているが、これは、労働集約的で、費用がかかる。別個のハプロタイプのフェージングを必要とする一塩基変異体(SNV)の数が多いため、シス/トランスの両義性が高頻度で生じるが、これは、配列特異的プライマーを伴うPCRを含む、さらなる検査によらなければ解決することができない。IlluminaおよびIon-torrentを含む、いくつかの次世代シーケンシング(NGS)技術は、HLA型解析の費用を廉価としているが、数百塩基対を超える距離にわたり、SNVを直接フェージングすることは不可能である。Pacific Biosciences(PacBio)およびOxford Nanopore製のシーケンサーなど、第三世代のシーケンサーは、廉価で、単一のDNA分子から、長いリードを得ることが可能である。これは、原理的には、HLA遺伝子座のハプロタイプ分解型シーケンシングを可能とするが、現在のところ、ゲノムから、特異的な長いDNA断片を選択するための方法は確立されていない。これは、本出願の発明の方法により遂行することができる。そうするために、以下のステップを実施する。
5'ggNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT、
[配列中、「N」は、gRNA標的化配列を表し、これらのNに対して5’側にある、2つのgは、T7による転写開始に必要とされる]を伴うgRNAを作製する。
5HLA-A-TS1
AGG PAM配列のすぐ上流の、第6染色体のchr6:29,941,185-29,941,204(全ての座標は、ヒト基準ゲノムアセンブリのバージョンGRCh38による)に存在する、5’-GAAAAGAACAGTTACGTAGC-3’。
5HLA-A-TS2
AGG PAMのすぐ上流の、chr6:29,941,096-29,941,115に存在する、5’-CCAGAAGCTTCACAAGACCG-3’。標的部位である、5HLA-A-TS1および5HLA-A-TS2は、それぞれ、約1350および1440bpだけ5’側において、コンセンサスのHLA-Aコード始点(chr6:29,942,553)に隣接するゲノム部位を切断するように構成する。
3HLA-A-TS1
GGG PAMのすぐ上流の、chr6:29949521-29949540に存在する、5’-ATTCCTTATATTCACCCCCA-3’。
3HLA-A-TS2
AGG PAMのすぐ上流の、chr6:29949520-29949539に存在する、5’-CATTCCTTATATTCACCCCC-3’。
5HLA-A-TS1F 5'-TAGG GAAAAGAACAGTTACGTAGC-3
5HLA-A-TS1R 5'-AAAC GCTACGTAACTGTTCTTTTC-3
5HLA-A-TS2F 5'-TAGG TTGAAAGCAGCAGAATTCTT-3
5HLA-A-TS2R 5'-AAAC AAGAATTCTGCTGCTTTCAA-3
3HLA-A-TS1F 5'-TAGG ATTCCTTATATTCACCCCCA-3
3HLA-A-TS1R 5'-AAAC TGGGGGTGAATATAAGGAAT-3
3HLA-A-TS2F 5'-TAGG TCTATCAACAAATTGCTAGG-3
3HLA-A-TS2R 5'-AAAC CCTAGCAATTTGTTGATAGA-3
の通りである。
本発明の電気泳動法を使用する、ヒトHLA遺伝子座からの、長いDNA断片の、標的化された切出しおよび回収。
本実施例では、’833 PCTにおいて記載されている調製用電気泳動システムであって、その例が、図2右においてもまた示される電気泳動システムを使用する。本実施例についての概略的ワークフローであって、例示を簡単にするために、分離用ゲルおよび溶出モジュールだけを示すワークフローを、図3A~3Eに示す。0.5倍濃度のKBB緩衝液(51mMのトリス(塩基)、29mMのTAPS(酸)、0.1mMのEDTA(酸)、pH8.7)中に、0.75%のアガロースを含有する、本発明のカセットを使用する。試薬および試料ウェルの総容量は、それぞれ、350および90ulであった。
ヒトタンパク質コード配列の標的化された単離(エクソン単離)のための、カスタムのgRNA-Cas9の構築
ガイドRNAの設計。本発明者らは、全てのヒトエクソン(エクソンの各側の、一部の隣接する非エクソン配列と共に)を、200~500bpの長さの断片へと切断するために、gRNAを設計/構成した。gRNAは、NGG部位のすぐ5’側の、全てが20bpのDNA配列を検討することにより選び出し、次いで、エクソンを挟む対を、このセットから選択した。500塩基対より長いエクソンについては、エクソン配列を、500塩基対未満の長さの、2つまたはこれを超える断片へと切断するように、エクソンの内部のgRNAもまた構成した。オフ標的のゲノム部位において、正確なマッチ、または1もしくは2bpのミスマッチを有するgRNAは廃棄する。
(1)切断ステップでは、より高濃度の、再構成されたgRNA-Cas9複合体:実施例2における、HLA-Aの場合に使用した8つの部位と比べて、約20,000倍というより大きな数の切断であって、全てのエクソン含有DNAを切り出すのに必要とされる切断を反映する濃度である、0.63uMの、再構成されたgRNA-Cas9複合体80ulを利用した点;
(2)調製用ゲルカセットでは、予測される200~500bpの標的に対する、より良好なサイズ分解能のために、2%のアガロースゲル(実施例2で使用した0.75%のゲルの代わりに)を利用した点
を除き、標的化された切出しもまた、実施例2で記載した通りに実行した。
標的化されたゲノムのDNAシーケンシングによる、転座切断点の特徴づけ
細胞遺伝学的研究は、特異的染色体再配列が、ヒト腫瘍と関連するという発見をもたらした。特異的ヒトがんにおける、最初の再現可能な染色体異常は、慢性骨髄性白血病と関連する、フィラデルフィア染色体であった。その後の分子的研究は、この再配列が、v-ablがん遺伝子の相同体であるc-ablと、bcr(切断点クラスター領域)と呼ばれる遺伝子とからなる、融合タンパク質をもたらすことを示した。このbcr-abl融合タンパク質は、発がん性であり、Gleevecと呼ばれる、大きな成功を収めた治療剤の標的である。
5'ggNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT、
[配列中、「N」は、gRNAの標的化配列を表し、5’側のgは、T7による転写に必要とされる]
を伴うgRNAを生成する。
NPM1-TS1
AGG PAM配列のすぐ上流で、NPM1コード配列(chr5:171,387,949)の開始から、約900bp上流にあり、多くのNPM1-ALK間の切断点が生じる、910bp長のNPM1イントロン5(chr5:171,391,799)の開始から、約4750bp上流にある、chr5:171,387,031~171,387,050に存在する、5’CAAGTCACCCGCTTTCTTTC3’。
NPM1-TS2
AGG PAMのすぐ上流で、NPM1コード配列の開始から、約750bp上流にあり、NPM1イントロン5の開始から、約4600bp上流にある、chr5:171,387,185~171,387,204に存在する、5’GACTTTGGAGATGTTTTCTC3’。
ALKの3’側のgRNAでは、
ALK-TS1
GGG PAMのすぐ上流で、ALKコード配列(chr2:29,193,225)の末端から、2930bp下流(3’側)にあり、多くのNPM1-ALK間の切断点が生じる、1940bp長のALKイントロン19の末端から、33240bp下流(3’側)にある、chr2:29,190,272~29,190,291に存在する、5’-GAAGAAAACATGGCACAAAT-3’。
ALK-TS2
GGG PAMのすぐ上流で、ALKコード配列の末端から、約2700bp下流(3’側)にある、chr2:29,190,518~29,190,537に存在する、5’-CAATGGGTCAGATAACTCAA-3’。
NPM1-TS1F 5'-TAGGCAAGTCACCCGCTTTCTTTC-3
NPM1-TS1R 5'-AAACGAAAGAAAGCGGGTGACTTG-3
NPM1-TS2F 5'-TAGGACTTTGGAGATGTTTTCTC-3
NPM1-TS2R 5'-AAACGAGAAAACATCTCCAAAGT-3
ALK-TS1F 5'-TAGGAGGGGCGCCCAATTTTGTCT-3
ALK-TS1R 5'-AAACAGACAAAATTGGGCGCCCCT-3
ALK-TS2F 5'-TAGGTCTATCAACAAATTGCTAGGAGG-3
ALK-TS2R 5'-AAAC CCTAGCAATTTGTTGATAGA-3
の通りである。
Claims (11)
- 電気泳動カセットを用いて目的のゲノムDNA領域の断片を単離するための方法であって、
電気泳動カセットのゲルマトリックスの第1のウェルに、高分子量(HMW)DNAを有する粒子を含有する試料を充填するステップと;
前記カセットの前記ゲルマトリックスの第2のウェルに、溶解試薬を充填するステップと;
前記粒子を溶解して、前記粒子から前記HMW DNAを放出するために、前記溶解試薬を前記第1のウェルに送達し、細胞成分が前記第1のウェルから電気泳動され、かつ、前記HMW DNAが前記粒子から取り出され、前記第1のウェルの壁に捕捉されるように、前記ゲルマトリックスに電気泳動場を印加するステップと;
前記第1のウェルを空にし、前記第1のウェルに、サイズを低減した断片としての前記DNAの、規定されたセグメントを遊離させるように、前記HMW DNA内の特異的DNA配列において切断するよう構成されたカスタム型CRISPR-Cas9切断試薬を再充填するステップと;
前記HMW DNAの効率的な切断を可能とするのに適する温度で、適する時間にわたり前記カセットをインキュベートするステップと;
前記DNA断片を移動させ、これにより、実質的に不動のままである前記HMW DNAの切断されていないDNAから分離するように構成された電気泳動場に前記ゲルマトリックスを供するステップと;
前記電気泳動により分離されたDNA断片を、前記ゲルマトリックスから単離するステップと
を含む方法。 - 前記空にし、再充填するステップがさらに、前記第2のウェルを空にし、前記第2のウェルにCRISPR-Cas9切断緩衝液を再充填することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記電気泳動により分離されたDNA断片の単離が電気溶出によりなされる、請求項1に記載の方法。
- 前記HMW DNAの切断されていない残余が、前記ゲルマトリックスに封入されたままである、請求項1に記載の方法。
- 前記粒子が、懸濁液中に含有され、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、原生動物細胞からなる群から選択される無傷細胞、および無傷ウイルス粒子のうちの少なくとも1つを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲルマトリックスが、アガロースヒドロゲルを、約0.2%~約5%(重量/容量)の間の濃度で含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶解試薬が、アニオン性界面活性剤を、0.05%~10%の間の濃度で含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である、請求項7に記載の方法。
- 前記HMW DNAのサイズが、>10メガ塩基対の長さであり、前記DNA断片のサイズが、<2メガ塩基対の長さである、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、懸濁液中に含有され、かつ、細菌細胞、植物細胞、または真菌細胞を含み、前記方法が、試料を封入した前記ゲルマトリックスを前記溶解試薬へと曝露する前に、前記ゲルマトリックスを、細胞壁を除去するように構成された他の酵素試薬処理に供するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA断片を、緩衝液を含有する溶出モジュールへの電気溶出により、前記ゲルマトリックスから単離する、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
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