JP3920221B2 - 電場を使用する分析物の濃縮および精製 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条第（ｅ）項の下に、２００１年５月２日出願の米国仮出願番号６０／２８８，２６８（これは、本明細書においてその全体が参考として援用される）からの利益を主張する。

（発明の分野）
本発明は、サンプル中の分析物の濃縮および精製に関する。より具体的には、本発明は、複数の電場（例えば、ＡＣおよびＤＣ）を使用して、分析物（例えば、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を濃縮および精製するためのデバイスおよび方法に関する。

（発明の背景）
分子生物学の多数の技術において、高品質のサンプルを有することは重要である。目的のポリヌクレオチド材料が潜在的干渉混入物から分離される場合、結果は、一般に、ＰＣＲ、配列決定、フラグメント分析などによって増強される。従って、分析の前にサンプル中の目的のポリヌクレオチドを精製および濃縮することが、しばしば所望される。

レーザー誘導蛍光（ＬＩＦ）検出技術を利用する分析において、代表的なＤＮＡサンプルは、色素標識ＤＮＡに加えて、以下を含み得る：塩、残留酵素、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｄＮＴＰ、色素標識ｄｄＮＴＰおよび／または界面活性剤。一般に、目的の色素標識ＤＮＡフラグメント以外の全ての種を除去することが所望される。しかし、部分的にでさえ、精製は有用であり得る。従って、最小でもより高い濃度で存在し、そして分析に対して干渉を引き起こし得る種を除去することが、しばしば所望される。最大懸念の種は、しばしば、色素標識ｄｄＮＴＰおよび塩である。

このような干渉を低減するため、およびＤＮＡを濃縮するために使用される現行の方法としては、サイズ排除クロマトグラフィーおよびアルコール沈殿が挙げられる。これらの技術は共に、時間がかかり、そして失敗しがちである。さらに、サイズ排除クロマトグラフィーは、出発サンプルと比較してＤＮＡの濃縮を生じず、そしてアルコール沈殿を使用して達成可能な濃縮の程度は、それほど大きくない。

（発明の要旨）
本発明の１局面は、複数の電場（例えば、ＡＣおよびＤＣ）を使用する、分析物（例えば、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）の濃縮および精製のためのデバイスに関する。

種々の実施形態において、このデバイスは、以下を備える：（ｉ）第一末端および第二末端を備える細長チャネル；（ｉｉ）少なくとも２つの電極であって、各電極は、上記末端のうち１つの近傍に配置される、電極；ならびに（ｉｉｉ）少なくとも１つのエネルギー源であって、このエネルギー源は、この電極と電気連絡し、そしてこのチャネルの少なくとも一部に沿ってＤＣ電位を、およびこのチャネルの少なくとも一部に沿ってＡＣ電位を同時に印加するように作動可能である、エネルギー源。１実施形態において、このチャネルは、電位の印加によって確立された電場に、ある場の強度を有するチャネル内の１以上の領域において場の勾配を形成させるように構成され、このチャネル末端の一方への分極性分析物を含むサンプルのロードの際に、この場の強度は、分極性分析物を誘引または反発する。

本発明の別の局面は、複数の電場（例えば、ＡＣおよびＤＣ）を使用する、分析物（例えば、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ））の濃縮および精製のための方法に関する。

１実施形態において、この方法は、以下を包含する：（ｉ）サンプルを、細長チャネルを備えたチャネルデバイスにロードする工程；および（ｉｉ）このチャネルの少なくとも一部に沿ってＡＣ電位およびＤＣ電位を印加する工程であって、この電位は、この印加の少なくとも一部について同時に印加され、その結果、１以上の場の勾配がチャネル内に形成され、この場の勾配が、このサンプル中の標的分析物を、チャネル内の１以上の局在化領域へと移動させ、そしてチャネル内の１以上の局在化領域において濃縮させる、工程。１実施形態において、工程（ｉｉ）は、標的分析物の濃度に対して混入物の濃度を減少させるのに有効であり、それによって精製分析物を生成する。

本発明のさらなる局面は、分析物の濃縮および精製のためのデバイスに関する。１実施形態において、このデバイスは、以下を備える：（ｉ）第一末端および第二末端を有する、一次チャネル、（ｉｉ）この第一末端との流体連絡のために配置された、ローディング領域、（ｉｉｉ）この第二末端との流体連絡のために配置された、第一収集領域、（ｉｖ）二次チャネルであって、この二次チャネルは、第二末端の近傍（例えば、第一末端よりも第二末端に近い領域）での該一次チャネルとの流体連絡のために配置された入り口末端、および二次チャネルの出口末端との流体連絡のために配置された第二収集領域を有する、二次チャネル；（ｖ）少なくとも３つの電極であって、各電極は、このローディング領域、第一収集領域および第二収集領域のそれぞれ１つの近傍に配置される、電極；ならびに（ｖｉ）少なくとも１つのエネルギー源であって、このエネルギー源は、電極に電気連絡され、そしてチャネルの両方の少なくとも一部に沿ってＤＣ電位を、および一次チャネルの少なくとも一部に沿ってＡＣ電位を同時に印加するように作動可能である、エネルギー源。１実施形態において、この一次チャネルは、電位の印加によって確立された電場に、チャネル内の複数の領域にて場の勾配を形成させるように構成され、分極性分析物を含むサンプルをローディング領域にロードする際に、ある場の強度を有する場の勾配は、この分極性分析物を誘引または反発する。

本発明の別の局面において、本発明は、チャネルデバイスを使用する方法に関し、このチャネルデバイスは、第一末端および第二末端を備える一次チャネル、第一末端との連結のために配置されたローディング領域、第二末端との連結のために配置された第一収集領域、第一末端と第二末端との間の（例えば、第一末端より第二末端に近い）領域での一次チャネルとの流体連絡のために配置された入口末端を有する二次チャネル、ならびに二次チャネルの出口末端との流体連絡のために配置された第二収集領域を有する。１実施形態において、この方法は、サンプルをローディング領域から、一次チャネル中におよび一次チャネルに向けて移動させるのに十分な駆動力を適用する工程、ならびに同時に、一次チャネルの少なくとも第一壁に沿った位置にて多様な電場を作成して、その結果、サンプルの分極性成分が一次チャネルに向けて移動する際にこの第一壁に向かって引き寄せられる工程、を包含する。

本発明のさらなる局面は、分析物の濃縮および精製のためのデバイスに関する。１実施形態において、このデバイスは、以下：（ｉ）第一末端および第二末端を備える細長チャネル；（ｉｉ）少なくとも２つの電極であって、各電極は、これらの末端の近傍に配置される、電極；（ｉｉｉ）少なくとも１つのエネルギー源であって、このエネルギー源は、これらの電極との電気連絡のために配置され、そしてチャネルの少なくとも一部に沿ってＤＣ電位を、およびチャネルの少なくとも一部に沿ってＡＣ電位を同時に印加するように作動可能である、エネルギー源；ならびに（ｉｖ）チャネルについての境界を規定する壁構造であって、この壁構造は、１以上の表面フィーチャーを備える、壁構造、を備え；ここで、この表面フィーチャーは、電位の印加によって確立された電場の印加の際に該チャネル内の規定された位置での場の勾配の形成を誘導するように構成され、その結果、分極性分析物を含むサンプルをチャネルにロードする際に、この分極性分析物は、この場によってチャネル内の１以上の規定された位置へと向けられる。

本発明のなお別の局面は、標的分極性分析物および１以上の混入物を含むサンプルを精製するためのデバイスに関する。１実施形態において、このデバイスは、以下：（ｉ）サンプルを、細長チャネルを備えるチャネルデバイス中にロードするための手段；および（ｉｉ）このチャネルの少なくとも一部に沿ってＡＣ電位およびＤＣ電位を印加するための手段であって、この電位は、印加の少なくとも一部について同時に印加され、その結果、１以上の場の勾配がこのチャネル内に形成され、この場の勾配は、サンプル中の標的分析物をチャネル内の１以上の局在化領域に移動させ、そしてチャネル内の１以上の局在化領域にて濃縮させる、手段、を備える。１実施形態において、この印加するための手段は、標的分析物の濃度に対する混入物の濃度を減少させるのに有効であり、それによって精製分析物を生じる。

本発明のさらなる局面は、分析物の濃縮および精製のためのデバイスに関する。１実施形態において、このデバイスは、以下：（ｉ）第一末端および第二末端を有する、一次チャネル、（ｉｉ）この第一末端との連絡のために配置された、ローディング領域、（ｉｉｉ）この第二末端との連絡のために配置された、第一収集領域、（ｉｖ）第一末端と第二末端との間の（例えば、この第二末端に近位の）領域での一次チャネルとの流体連絡のために配置された入口末端を有する、二次チャネル、（ｖ）この二次チャネルの出口末端との流体連絡のために配置された、第二収集領域、ならびに（ｖｉ）サンプルをローディング領域から一次チャネル中におよび一次チャネルに向けて移動させるのに十分な駆動力を適用し、そして同時に、一次チャネルの少なくとも第一壁に沿った位置にて多様な電場を作成して、その結果、サンプルの分極性成分が、一次チャネルに向けて移動する際に第一壁に向かって引き寄せられる、手段、を備える。

種々の実施形態において、ＡＣ場およびＤＣ場は、微細加工されたデバイスにおいてＤＮＡを濃縮および精製するために使用される。このような濃縮および精製は、分析システムに組み込まれ得るか、または分析器とは離れてもたらされ得る。

本発明は、例えば、他の潜在的干渉種の複合混合物から、分極性分析物を濃縮および精製することが所望である任意の状況における用途を見出し得る。このような適用の一例は、未精製ＤＮＡ配列決定反応物からの、ＤＮＡフラグメントの濃縮および精製である。

本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、以下の説明、図面および添付の特許請求の範囲を参照して、よりよく理解される。

本発明の操作の構造および様式は、そのさらなる目的および利点と一緒に、添付の図面とともに以下の記載を参照することによって最も理解され得る。これら図面において、同じ参照番号は、類似の要素を識別する。

（発明の詳細な説明）
ここで、本発明の種々の実施形態を詳細に参照する。これらの例は、添付の図面に例示されている。本発明は、種々の実施形態とともに記載されているが、これらの実施形態は、それら実施形態に対して本発明が制限されることを意図しないことが理解されるべきである。反対に、本発明は、代替物、改変物、および等価物を包含することが意図され、それらは、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の範囲内に包含され得る。

他に言及されなければ、本明細書中で使用される場合、以下の用語および句は、以下の意味を有することが意図される：
用語「チャネル」とは、本明細書中で使用される場合、分離媒体および/または緩衝溶液（例えば、電気泳動を行う際に使用されるようなもの）の容量を支持し得る、細長の、狭い通路または他の構造（例えば、管、溝など）をいう。チャネルの外形は、広範に変化し得る。例えば、チャネルは、環状、楕円形、半円形、半楕円形、三角形、長方形、球形、または他の断面、あるいはそれらの組み合わせを有し得る。チャネルは、微細加工技術を含む、広範な技術によって作製され得る。

用語「キャピラリー」とは、本明細書中で使用される場合、「チャネル」と同じ意味を有する。例示的な「キャピラリー」構造としては、例えば、細長管の管腔、またはチップ、ウエハもしくはプレートに形成される溝が挙げられる。

用語「チャネルデバイス」とは、チャネルを含む任意の構造をいい、特に、電気泳動を少なくとも部分的に実施するために適応されるものをいう。チャネルデバイスは、とりわけ、微細加工デバイス（例えば、溝付きプレート、チップ、または他の基材）またはキャピラリー管デバイスの形態をとり得る。

用語「濃縮された」または「精製された」とは、材料が本来のまたは開始時の、状態または環境から移動されることを意味する。例えば、材料が開始サンプル中に見出されるように存在するよりも高い濃度で特定の組成物中に存在する場合、この材料は、「精製された」と言われる。例えば、開始サンプルが粗製細胞溶解物中にポリヌクレオチドを含有する場合、このポリヌクレオチドは、精製されていないと言われ得るが、細胞溶解物中に共存する数種または全ての材料のから分離されている同じポリヌクレオチドは、精製されている。核酸は、例えば、それが電気泳動の際に基本的に１本のバンドを生じる場合、精製されていると言われる。

本明細書中で使用される場合、用語「サンプル領域」または「分析物領域」とは、分子の収集物をいい、これは、類似の電気泳動移動速度を有するサンプルのサブセットまたは分析物成分を含有し、その結果、サンプル領域または分析物領域の分子は、規定された領域として移動する。限界において、このような領域は、同一の電気泳動移動速度を有する分子から構成される。サンプル領域および分析物領域は、しばしば、「バンド」といわれる。

本明細書中で使用される場合、用語「分離媒体」または「分離マトリクス」とは、サンプル成分の電気泳動分離が起こり得る媒体をいう。分離媒体は、代表的には、数種の成分を含有し、これらのうちの少なくとも１種は、電荷保有成分、または電解質である。この電荷保有成分は、通常は、分離媒体を規定のｐＨに維持するための緩衝系の一部である。ポリヌクレオチド、タンパク質、または異なるサイズを有するが遊離溶液中で同一の電荷摩擦薬物速度を有する他の生体分子を分離するための媒体は、篩成分をさらに含有する。このような篩成分としては、代表的に、架橋ポリマーゲル（例えば、架橋ポリアクリルアミドまたはアガロース（Ｓａｍｂｒｏｏｋ））、またはポリマー溶液（例えば、ポリアクリルアミド、ヒドロキシエチルセルロースなどの溶液）（Ｇｒｏｓｓｍａｎ；Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ）が挙げられる。

（概要）
一般に、本発明は、チャネルデバイスおよび方法に関し、ここで、ＡＣ電場およびＤＣ電場は、分極性分析物（例えば、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ））を濃縮／精製するために使用される。

本発明のデバイスのチャネルは、上で定義されるようなデバイスのいずれかまたは等価物であり得る。１つの実施形態において、チャネルは、当該分野で公知の微細加工技術（例えば、いくつか挙げると、光リソグラフィー技術（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃａｌ）および/または湿潤化学手順、レーザー切除技術、電気鋳造技術、マイクロコンタクト（ｍｉｃｒｏｃｏｎｔａｃｔ）印刷技術、マイクロスタンピング（ｍｉｃｒｏｓｔａｍｐｉｎｇ）技術、微細成形（ｍｉｃｒｏｍｏｌｄｉｎｇ）技術、マイクロキャスティング（ｍｉｃｒｏｃａｓｔｉｎｇ）技術、微細機械加工（ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ）技術、エングレービング技術、および/またはエンボス加工技術）によって、ガラス基材またはプラスチック基材（例えば、プレート、ウェーハ、またはチップ）上に形成される。Ｗｏｏｌｌｅｙら、Ｄｏｌｎｉｋら、およびＢａｃｋｈｏｕｓｅら（全てが本明細書中で参考として援用される）は、例えば、当業者が本発明のデバイスを作製する際に使用し得る、材料および微細加工技術を開示している。別の実施形態において、分離チャネルは、電気的絶縁材料（例えば、融解シリカ、石英、ケイ酸ベースのガラス（例えば、ホウケイ酸ガラス、リン酸ガラス、アルミナ含有ガラスなど）、または他のシリカ様材料）から作製される、１つ以上の細長キャピラリーまたはマイクロキャピラリーチューブを含む。

図１は、本発明が具現化され得るデバイスの１つの型の一般的な特徴を示す。参照番号１０によって一般的に示される、図１のチャネルデバイスは、基材１２を備え、ここで、１４および１６のようなチャネルは、１８で表わされる交差点にて直角に交差するように、規定される。より詳細には、基材１２は、それぞれ底部プレート２０および上部プレート２２から構成され、向かい合わせに隣接している。底部プレート２０は、細長の溝を備え、これら溝の各々は、ほぼ半円形または半楕円形の断面であり、チャネル１４、１６についての境界を一部規定する。プレート２２の底面は、実質的に平面であり、示されるようにプレート２０に対して配置される場合、チャネル１４、１６についての境界をさらに規定する。特に、例示される培地において、プレート２０の溝は、底壁（床）および側壁または各チャネル１４、１６の境界を規定し、そしてプレート２２の底面は、上壁またはチャネル１４、１６についての天井（境界）を与える。

２４、２６、２８および３０として概略的に示されるようないくつかの電極が備えられ；各々が、それぞれ、３４、３６、３８および４０のようなレザバと電気的に連絡するように配置されている。これらのレザバは、穿孔されるか、エッチングされるか、パンチングされるか、さもなければ上部プレート２２を通して形成される、小さい貫通穴によって規定される。レザバ３４、３６、３８および４０の各々は、示されるように、チャネル１６、１８の一方の各端部と流体連絡するように配置される。

明確にするために、チャネル１４、１６が、図全体を通して１、２、３および４として示される４つのセグメントまたはアームを備えるとみなすことが便利である。より詳細には、セグメント１、２および３は、本明細書中で、「サイドアーム」または「ショートアーム」といい、そしてセグメント４は、本明細書中で、「分離アーム」または「メインアーム」という。

チャネルは、任意の適切な長さでかつ任意の適切なプロフィールであり得る。１つの例示的な配置において、メインアーム４は、５０マイクロメートル幅（一方の側壁から反対側の側壁まで、その上部にて測定される）、および２０マイクロメートル深さ（その上天井または上壁からその底壁または床の最も低い領域まで、測定される）であり、８．５センチメートルの長さである。サイドアームはまた、任意の適切な外形（非直線外形を含む）、および任意の適切な長さである。この実施形態において、サイドアーム１、２、３の各々が、長いチャネルと同じ断面プロフィール（幅および深さ）、および１センチメートル長を有する。このような寸法を有する、本発明の使用に適切な１つのチャネルデバイスは、Ｍｉｃｒａｌｙｎｅ Ｉｎｃ．（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）製のＳｔａｎｄａｒｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｈｉｐ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｃｒｏｓｓ，ＭＣ−ＢＦ４−ＳＣ）である。複数交差チャネル配置または他のチャネル配置が、所望な場合、単一チップまたはプレート上に提供され得る。

図１に記載されるような交差チャネル構成は、しばしば、当該分野において「Ｔ」形態（「Ｔ」は、チャネルの交差点を表す）と呼ばれる。

本発明は、図１に記載される構造に限定されず、むしろ多くのデバイス構成が可能であり、かつ本発明の文脈において使用され得ることが理解されるべきである。例えば、１つのＴ形態交差チャネル配置のみが図１に示されているが、このような配置の任意の妥当な数が、基材上に提供され得る。１つの実施形態において、上部プレートと底部プレートとの両方が、相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）溝配置を与えられ、この配置は、互いに整列され、その結果、対応する上溝および下溝が、１つ以上のチャネルを規定するように協同する。別の実施形態において、複数のスペーサーストリップが、直面プレートの、平面で平行な対向する表面の間に配置される。この実施形態において、スペーサーストリップは、その対向するプレート面を分離する距離を規定し、スペーサーの隣接した対の間の領域は、少なくとも部分的に、１つ以上のチャネルの各々を規定する。特に、各スペーサーの側面の一方または両方が、チャネルの側面境界を規定し、そして平面の直面プレート表面が、上部と底部の境界を規定する。

上部プレートによって覆われる底部プレートに溝を提供する代わりに、図１に示されるように、チャネルデバイスは、その底面に沿って形成される溝を有する上部プレートを備え得、この上部プレートは、底部プレートの平面の上部表面を覆って配置され得る。さらに、図１に示されるチャネルデバイスは、実質的に水平な様式で配置される主要な平面を有して配置されるが、このデバイスは、その代わりに、実質的に垂直に配置されるかまたは所望の角度に傾けられた、主要な平面を有して配置される。これらおよび他の改変および適応が、当業者によって容易に選択され、企図され得る。

本明細書中で使用するためのチャネルデバイスに含まれ得る他の特徴は、例えば、以下の参考文献において見出され得、それらの各々が、その全体が本明細書中で参考として援用される：

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実際には、分離媒体は、注入され得るか（例えば、圧力装填または真空吸引）、さもなければデバイスのチャネルに提供され得る。例示的な分離媒体としては、アガロースおよび架橋ポリアクリルアミドが挙げられるがこれらに限定されない。種々の実施形態において、各チャネルは、その全体を分離媒体（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）製の、ＧｅｎｅＳｃａｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｐ／Ｎ ４０１８８５）またはＰＯＰ−６（Ｐ／Ｎ ４０２８４４））で充填される。本発明の種々の実施形態が、分離媒体の使用のために必要とされたが、他の実施形態は、分離媒体の使用を企図も必要もしないことに留意のこと。種々の実施形態において、例えば、デバイスのチャネルは、分離媒体なしに、緩衝溶液（カチオンとしてナトリウムを含むＴＡＰＳ）のみで充填される。

分離媒体が使用される種々の実施形態において、分極性分析物および１種以上の汚染物質を含有するサンプルが、レザバ３４、３６、３８、４０のうちの１つに配置され；そして、緩衝溶液が、その他のレザバの１つ以上に配置される。充填は、任意の適切な様式で（例えば、手動または自動化したピペットアセンブリによって）、もたらされ得る。

サンプルは、任意の種々の様式で操作され得る。例えば、図２Ａ〜２Ｃは、交差チャネル１４、１６を満たした分離媒体を有するチャネルデバイス１０を示す。影を付けて示したサンプル溶液は、レザバ３６に配置され得（図２Ａ参照）、そして緩衝溶液は、他のレザバ３４、３８、４０に配置され得る。次いで、ローディング電圧（例えば、１００Ｖ ＤＣ）が、例えば、レザバ３６、４０の間に付与されて、影をつけて示したように、サンプルをアーム１、３へ押し出し得る（図２Ｂ参照）。次いで、ローディング電圧が停止され、分離電力（例えば、１０００Ｖ ＤＣ）が、レザバ３８、３４の間に付与され；それによって、プラグとして影を付けて示すサンプル容量は、分離のためにメインアーム４に吸入される（図２Ｃ参照）。メインチャネルに吸入されたサンプル容量は、一般に、交差チャネルの横断容量によって規定されることに留意のこと。次いで、１つ以上の分析物領域が、メインチャネルの下流領域にて検出および／または回復され得る。ここで記載される方法は、多くの目的のために有用であるが、分離前のサンプル中の任意の分析物の濃縮／精製を提供しない。特に、ここに記載される方法は、ＤＣ場とともにＡＣ磁の使用を包含せず、磁場勾配は、ＤＣ場の上へのＡＣ場の重ね合わせによってほとんど形成されない。

本発明の種々の実施形態は、サンプル中の分析物を濃縮および精製するために磁場勾配（チャネルデバイスの１つ以上のチャネルに沿って、ＤＣ場とＡＣ場の両方を同時に付与することによって形成される勾配を含む）を使用する。基法的には、電場において分極され得る任意の分析物（例えば、分子または懸濁粒子）は、生じた磁場勾配を使用して、操作され得る。本発明者らは、分極性分析物（例えば、電極縁部付近および／またはマイクロ流体チャネルのコーナーにて発生したもの）が高い磁場勾配領域に引き付けられ得ることを見出した。さらに、いくつかの場合において、分極性分析物は、高い磁場勾配領域からはじかれ得る。高い磁場勾配領域への誘引および／またはこの領域からの反発は、バルク溶液から分極性粒子を濃縮する手段として利用可能である。

分極性分析物を引き付けるかまたは反発させるのに有用な、付与される磁場は、一定電位（直流またはＤＣ）または振動電位（交流またはＡＣ）のいずれかとして生じ得る。唯一の制限は、磁場が分析物を引き付けるかまたは反発させるための磁場勾配を形成するために、１つ以上の地点または領域にて分岐されることである。誘引および反発は、中性分析物または荷電分析物のいずれかで生じ得る。特定の理論に全く付することなく、荷電した種の場合において、ＤＣ場はまた、分極誘導力からの力を圧倒し得る強力な電気泳動の誘引または反発を引き起こすと考えられる。ＡＣ場を使用して高い磁場勾配を起こすことによって、電気泳動力が等しくなり、逆向きになり、それによって相殺される。従って、荷電した分析物の濃度は、ＡＣ場またはＤＣ場のいずれかを用いて達成され得るが、ＡＣ場を使用することによって、分極誘導力が優勢となり、分極化に基づいた濃度の選択性が増強され得る。

誘引および／または反発による濃縮を使用して、分極性分析物がバルク溶液に対して濃縮され得る。さらに、適切な電場パラメータを選択することによって、分極性分析物は、印加される電場下においてほとんど分極不可能なバルク溶液中で、他の種に対して精製され得る。ほとんど分極しないこれらの分析物は、印加される磁場に起因して、顕著に類似した誘引または反発を与え、より分極性分析物とともには濃縮されない。高い磁場勾配に対する誘引または反発に基づく種の選択性における差異は、複合混合物からの１種以上の種の濃縮および精製についての基礎を形成する。

（高度な電場勾配の発生）
適切な電場勾配の発生は、種々の方法において達成され得る。例えば、種々の形状の金属電極が、それらの縁部近くで高度な場の勾配を発生し得る。あるいは、またはさらに、高度な場の勾配は、電場の進路に、場を集めるために役立つ不規則さまたは一様でない壁プロフィール（例えば、コーナー、湾曲部、縁部、隆起、突出、島、波のようにうねっている面、くびれなど）を取り入れることによって作製され得る。例えば、微小製造チャネルにおいて、高度な場の勾配は、場がコーナーに遭遇する（例えば、強制的に曲げられる）縁で発生され得る。より完全に以下に記載される以下の実施例において、微小製造されたデバイス中で２つのチャネルが交差する交差領域の構成は、電場勾配を発生するために活用される。例えば、図３は、微小製造されたチャネルデバイス１０のチャネル交差点１８の４つのコーナー（１８ａ、１８ｂ、１８ｃ、１８ｄ）に近接する場の集中を示す。チャネル交差点のこの鋭い縁（コーナー）は、これらの領域で場の線（Ｆとして示す）を分岐させる。これは、４つのコーナー（１８ａ、１８ｂ、１８ｃ、１８ｄ）それぞれで、高度な場の勾配を生じる。この実施形態において場の勾配を発生するために使用される電極（図３に示さず）は、アーム１およびアーム３の上流で対称的に配置される。各電極は、電極のバルク溶液との相互作用を回避するために、アーム１、３の１つと連絡しているそれぞれのレザバ（図３に示さず）に配置される。交流の場の勾配幾何学は、以下に示すようなデバイスの他のアーム中に、場を発生している電極を配置することによって達成され得る。

明らかになるように、種々の幾何学が、場の勾配の集中を発生し、調整し、そしてなお増加させる（例えば、強化する）ために使用され得る。４つの例示的な配置は、図４ａ〜４ｄに示される。図４ａおよび図４ｂは、チャネルデバイスのチャネルの１つ以上のくびれ（すなわち、狭められた幅領域）を示す。図４ｃおよび図４ｄはさらに、電場が印加される場合に発生される場の勾配を増大させるために鋭いコーナーの利用を示す。鋭いコーナーは、例えば、任意の折り返しに沿って電場線が（電子流の方向に沿って）通過するような、少なくとも４０°；例えば、４５°、７０°、９０°、１２０°、１４５°またはそれ以上であるその折り返しを含み得る。本明細書中の教示に従って、当業者は、チャネル内の所望の地点で場の勾配を増大させるに効果的な種々の幾何学を発明し得る。例えば、微小製造されたチャネルデバイスの交差点「Ｔ」に達するにつれて側部アームの幅を狭め得る。

ＡＣ場は、種々の方法において発生されて印加され得る。１つの実施形態において、ＡＣ場は、増幅器に接続されている機能ジェネレータによって発生され、そして電気的に、変圧器によって、ＤＣ回路から単離される。ＡＣ回路を通過する残存する漏れ電流はさらに、回路内のコンデンサーによって減少させられ得る。適切なＡＣ回路図を図５に示す。

（ポリヌクレオチドの精製）
本発明の実施形態は、交差チャネルまたはＴ字型幾何学を使用して、バルク溶液中の潜在的に干渉している種から離してＤＮＡを濃縮し、そして精製し得る電場勾配を発生させる。交差チャネルの交差点（「Ｔ」）での鋭い縁（コーナー）は、交差チャネル領域において場の線を高度に分岐させる。ＤＣ場（電気泳動場）と組み合わせて印加されるＡＣ場は、微小製造されたデバイス内に非常に小容量のＤＮＡ濃縮物を生じる。一旦、小容量に濃縮され、そしてバルク溶液中の潜在的な干渉物から離して精製されると、ＤＮＡは、分析および／または回収のために、必要に応じて、分離チャネル内または回収レザバ内に移動され得る。

本発明の１つの利点は、目的のＤＮＡフラグメントを濃縮して干渉している種から離して精製し、そして使用者のいずれの操作も必要とすることなく分析器に注入し得ることである。本明細書中の特定の実施形態において、ＤＮＡの濃縮および精製は、分離デバイスと一体化されており、従って、精製デバイスから分析器へのサンプルの移動を必要としない。このような実施形態のいくつかは、現在、以下の実施例の文脈に記載されている。これらの実施例は、微小製造されたチャネルデバイスの状況において記載される一方、本発明が他の形式においても実施され得ることを理解されるべきである。

（実施例１：）
本発明の第１の実施例は、図６，図７，および図８において概略的に描かれている。チャネルの幾何学および寸法は、図１に関して、上記の通りである。アーム１、２、３、および４全体を、分離媒体（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からのＧｅｎｅＳｃａｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ）で充填した。ＤＮＡ含有サンプルをレザバ３８にロードし、そして緩衝液（ＴＡＰＳ）をレザバ３４、３６、および４０に入れた。ＤＣ電位の影響下で、このＤＮＡ含有サンプルを電気泳動して、デバイス内に導入した。特に、１００ＶのＤＣ電位を、レザバ３８とレザバ３４との間に印加し、それによって電気泳動的に、ＤＮＡ含有サンプルを（陰影によって示されるように）アーム２および４に引き入れた。この時点まで、アーム１および３がＤＮＡ含有サンプルを実質的に含まないままであったことに注意されるべきである。

次いで、ＡＣ場を、アーム１および３にわたって印加した。このＡＣ場は、波形、場の強度、および周波数の任意の適切な組み合わせであり得るが、この実施例において、ＡＣ場は、１０ｋＨｚでピークトゥピーク２０００Ｖの電位を有する方形波であった。ＤＣ場を、アーム２および４に沿って同時に印加した。任意の適切なＤＣ電位が使用され得ると理解され；この実施例において、印加されたＤＣ電位は１０００Ｖであった。

これらの条件下で、ＤＮＡを、アーム１および３における局所領域の小さなバンド内に濃縮した（図６を参照のこと；黒く塗られた領域は濃縮されたＤＮＡを示す）。一旦濃縮されると、このＤＮＡを、ＡＣを遮断し、そしてアーム１および３にわたって小さなＤＣ電位（１００Ｖ ＤＣ）を印加することによって、チャネルの中心（すなわち、交差チャネルの接合部）に移動させた（図７を参照のこと）。最後に、アーム２および主要アーム４の長さに沿ってＤＣ電位（１０００Ｖ ＤＣ）を印加することによって、このＤＮＡを主要なアーム４に導入した（図８を参照のこと）。一旦、チャンネル中に入ると、ＤＮＡを分離した。次いで、この分離したＤＮＡを検出し（例えば、分離アームに沿って下流領域を観察するように配置されたＬＩＦ検出装置を用いて）そして／または回収し得る。

（実施例２：）
本発明の第２の実施例は、図９および図１０において、概略的に描かれている。チャネルの幾何学および寸法は、上記の通りである。アーム１、２、３、および４全体を、分離媒体で充填した。ＤＮＡ含有サンプルをレザバ３６にロードし、そして緩衝液をレザバ３４、３８、および４０に入れた。ＤＣ電位の影響下で、このＤＮＡ含有サンプルを電気泳動して、デバイス内に導入した。特に、１００ＶのＤＣ電位を、レザバ３４とレザバ３６との間で印加し、それによって電気泳動的に、ＤＮＡ含有サンプルをアーム３に引き入れ、そして長いアーム４に追い込んだ（陰影によって示されるように）。この時点まで、アーム１および２がＤＮＡ含有サンプルを実質的に含まないままであったことに注意されるべきである。

次いで、ＡＣ場を、サイドアーム１および２にわたって印加した。このＡＣ場は、１０ｋＨｚでピークトゥピーク２０００Ｖの電位を有する方形波であった。ＤＣ場を、アーム３および４にわたって同時に印加した。印加されたＤＣ電位は１０００Ｖであった。

これらの条件下で、ＤＮＡを、Ｔ字型交差点近くのアーム２の小さなバンド内に濃縮した（図９を参照のこと）。一旦濃縮されると、次いでこのＤＮＡを、アーム２および４の長さに沿ってＤＣ電位を使用することによって、分離アーム４内に導入した（図１０を参照のこと）。小さなＤＣピンチング（ｐｉｎｃｈｉｎｇ）電位は、サンプルプラグを分離アーム内に導入する際に有用であり得る。この実施例において、このような電位は、アーム１および３の末端の電極を、１００ ＭΩ抵抗器を介してアーム２の末端の電極につなぐことによって形成された。このピンチは、ＡＣ濃縮が完了し、そしてＡＣ電位が解除された後、適用された。しかし、このようなピンチングの非存在下においてさえ、これらの技術が効果的であることが注意される。一旦チャンネル中に入ると、ＤＮＡは分離され、検出され、そして／または回収され得る。
（実施例３：）
本発明の第３の実施例は、図１１および図１２において、概略的に描かれている。チャネルの幾何学および寸法は、上記の通りである。アーム１、２、３、および４全体を、分離媒体で充填した。ＤＮＡ含有サンプルをレザバ３６にロードし、そして緩衝液をレザバ３４、３８、および４０に入れた。ＤＣ電位の影響下で、このＤＮＡ含有サンプルを電気泳動して、デバイス内に導入した。特に、１００ＶのＤＣ電位を、レザバ３６とレザバ４０との間で印加し、それによって電気泳動的に、ＤＮＡ含有サンプルをアーム１および３に引き入れた（陰影によって示されるように）。この時点まで、アーム２および４がＤＮＡ含有サンプルを実質的に含まないままであったことに注意される。

次いで、ＡＣ場を、アーム２および長いアーム４にわたって印加した。このＡＣ場は、１０ｋＨｚでピークトゥピーク２０００Ｖの電位を有する方形波であった。ＤＣ場を、アーム３および１にわたって同時に印加した。印加されたＤＣ電位は１００Ｖであった。

これらの条件下で、ＤＮＡ含有サンプルは、Ｔ字型交差点近くのアーム２の小さなバンド内に濃縮された（図１１を参照のこと）。一旦濃縮されると、このＤＮＡを、ＡＣ供給源を取り外し、そしてアーム２および４の長さに沿ってＤＣ電位（１０００Ｖ ＤＣ）を印加することによって、分離アーム内に導入した（図１２を参照のこと）。小さなＤＣピンチング電位は、サンプルプラグを長いアーム内に導入する際に有用であり得る。この実施例において、このような電位は、アーム１および３の末端の電極を、１００ ＭΩ抵抗器を介してアーム２の末端の電極につなぐことによって形成した。このピンチを、ＡＣ濃縮が完了し、そしてＡＣ電位が解除された後、適用した。しかし、このようなピンチング電位の非存在下においてさえ、これらの技術が効果的であることが注意される。一旦、チャネル中に入ると、ＤＮＡは分離され、検出され、そして／または回収され得る。この実施形態は、有利であり得る。なぜなら、色素で標識したＤＮＡを含まない、精製されたＤＮＡをチャネル内に注入するからである。従って、検出ポイントでより低いノイズが得られ得る。

（実施例４：）
本発明の第４の実施例において、分極性分析物を、先の実施例において記載されるような方法で濃縮する；しかし、デバイスと一体的なチャネル（例えば、長いアーム４）内では分離されない。それどころか、標的分析物が予想可能に濃縮される既知の領域に隣接するデバイス上部の小さなアクセス開口部が、濃縮プロセス中にシールされるように構築され、次いで、濃縮された分析物へのアクセスを可能にするように開放される；例えば、外部分析器と干渉するために。例えば、キャピラリーを使用して、濃縮された分析物をチャネルデバイスから直接除去し得る。キャピラリーの一端は、分析物の濃縮スラグに隣接するように位置付けるために、開口部を通過し得る。次いで、この分析物は、キャピラリー内に注入され得る。例えば、電気泳動力は、濃縮された分析物をキャピラリー中に誘引し得る。種々の実施形態において、分離キャピラリーに注入するために、カソード電極を使用し、この電極は、濃縮デバイスに一体であるか、またはキャピラリーサンプラーの一部であるかのいずれかである。

この実施形態は、使用（例えば、キャピラリー電気泳動分析前のＤＮＡ含有サンプルの精製および濃縮における使用）を見出し得る。このようなデバイスを使用して、バルク溶液中に塩および色素ターミネーターを含まないキャピラリー内に、ＤＮＡの濃縮プラグを注入し得る。

先に示されるように、本発明の種々の実施形態が、分離デバイスまたは他の分析デバイスから離れた位置での分析物（例えば、ＤＮＡ）の濃縮／精製を意図する。

本明細書中で企図されるチャネルデバイスの種々の実施形態が、図１３において示される。このデバイスは、先に記載される材料および製造技術のいずれかを使用して形成され得る。１実施形態において、チャネルデバイスは、エッチング処理されるか、あるいは他の様式で、絶縁物質（例えば、プラスチック、ガラス、酸化シリコンなど）において形成される１つ以上の溝を有するチップ様デバイスまたはプレート様デバイスを備える。

１１０として示されるデバイスは、一端にローディングレザバ１３８を有し、そして他端にＹ型交差点１４１の開口部領域を有する細長いチャネル１１６を備える。Ｙ型交差点１４１は、それぞれが、別個のレザバとの連絡のために配置される末端（１５５および１５７）を有する、２つのセグメントまたはアーム（１４５および１４７と示される）に分岐する。アーム１４５へと導く入口領域が、アーム１４７へと導く入口領域の流れ断面積より小さな流れ断面積（すなわち、サンプル移動方向に対して垂直に向く断面積）を有するように設計される。例えば、アーム１４５の入口領域の流れ断面積は、アーム１４７の入口領域の流れ断面積の２０〜５０％であり得る。

種々の実施形態において、レザバ１３８は、流体サンプルを受容するためのローディングウェルとして働き、レザバ１５５は、濃縮サンプル回収ウェルとして働き、ここに、精製されたサンプルは集積し得、そしてレザバ１５７は廃液回収ウェルとして働き、ここに、潜在的な干渉物が蓄積され得る。１実施形態において、チャネル１１６は５ｃｍ長であり、そして各々のセグメント１４５、１４７は、２ｃｍ長である。各々のレザバ１３８、１５５、１５７は、順番に、１つ以上の電位ジェネレーター（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｒａｔｏｒｓ）（例えば、ＡＣエネルギー源およびＤＣエネルギー源）との電気連絡のために配置される別個の電極（図示せず）と連絡するために適合される。

チャネル１１６の一面（１１９として示される）は、ＡＣ場が印加される場合、壁に沿って場の勾配形成に寄与するように構成された表面フィーチャーを備える壁構造を有する側壁または境界を規定する壁構造を備える。図１３の実施形態において、側壁１１９は、ノコギリ状または鋸歯状のプロフィール（ｐｒｏｆｉｌｅ）を与えられる。以下に考察されるような他の一様でないプロフィールが使用され得る。ＡＣ場をチャネルに沿って印加する際、高度な場の勾配は、図１４Ａに示されるように、各歯に隣接して形成する。このような場の勾配は、分極性分析物（例えば、ＤＮＡ）を効果的に引き付ける場の強度を有する。

以下のことが理解されるべきである：表面フィーチャーは、１つの側壁に沿った配置に限定されない；むしろ、上面、底面、または側壁、あるいはそれらの組み合わせに沿って配置され得る。

デバイス１１０の例示的使用において、ＤＮＡ含有サンプルは、レザバ１３８内にロードされ、そしてチャネル１１６に挿入され、電気泳動的な（ＤＣ）場の印加を介して、Ｙ交差点１４１へと向かってチャネル１１６に沿って移動される。ＤＣ場を印加すると同時に、またはその後すぐに（サンプルが実質的にチャネルに沿って移動してしまう前に）、ＡＣ場をＤＣの表面上で印加する。側壁１１９の表面フィーチャーは、サンプルの分極性成分（例えば、ＤＮＡ）が、側壁１１９と並んで辺縁領域に引き付けられるように、正味の電場を、そこに近接する位置で分岐させる。従って、サンプルがチャネル内に誘引され、そして電気泳動的な力（ＤＣ場）によってチャネルに沿って移動されるにつれて、サンプルのＤＮＡ成分は、チャネルに沿った移動に加えて、側壁１１９に沿って濃縮される。Ｙ型交差点１４１に到達する際、濃縮されたＤＮＡは、主に、アーム１４５に入る。なぜなら、サンプルのＤＮＡ成分は、チャネル１１６の、アームと同じ側に沿って配置される一方、側壁１１９に引き付けられないサンプルの他の成分は、レザバ１５７に向かうアーム１４７に入るような軌道に引き継がれるからである。異なるアームに入った結果、サンプルのＤＮＡ成分の大部分が、最終的にレザバ１５５に到達し、そしてアーム１４７に入った成分は、レザバ１５７に到達する。従って、主に、この分極性ＤＮＡは、１つのレザバに分岐して入り、一方、残りのほとんど（非分極性成分）は、他のレザバへと進む。

側壁のプロフィールは、サンプルを分離するように作用する任意の形状を有し得る。いくつかの実施例が、図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃに示される。図１４Ａは、「ノコギリ状」または鋸歯状のフィーチャーを図示する。ＡＣ場およびＤＣ場を印加する際、高度な場の勾配が、各歯の先端（ｐｏｉｎｔ ｏｒ ｔｉｐ）領域（黒い矢印によって示される）付近に形成される。ＤＣ場から生じる引き筋は、側壁１１９に沿って辺縁領域において、下流に広がるように見られ得る（破線の矢印）。図１４Ｂは、「波」プロフィールを図示する。高度な場の勾配は、各波の頂点（先端）で構築される。隣接する波の間の領域（すなわち、谷領域）は、低い場の収集帯を提供する。図１４Ｃは、「ピンチング島（ｐｉｎｃｈｉｎｇ ｉｓｌａｎｄｓ）」を図示し、ここで、ほぼ涙形の島１２１は、側壁１１９に隣接するチャネル１１６に沿って間隙を介する位置で形成される。島１２１に並ぶ側壁１１９のプロフィールは、リップルを生じ、各リップルの先端は、それぞれ隣接する島１２１の尖った領域に隣接して配置される。

別の実施形態は、チャネル長に沿った位置で形成される高い場の強度勾配を有するチャネルに沿って移動する、サンプルの種々の成分間の異なる遅延速度を利用する。例えば、図１５は、１つの側壁２１９に沿ってノコギリ状プロフィールを有するチャネル２１６を備えるチャネルデバイス２１０を示す。ローディング／回収ウェルとして作用し得る第１のレザバ２３８は、チャネル２１６の一端と連絡し、そして廃液ウェルとして作用し得る第２のレザバ２５７は、他端と連絡する。

図１５Ａ〜１５Ｄのデバイスの１つの使用において、ＤＮＡ含有サンプルは、レザバ２３８内にロードされ、そしてチャネル２１６に沿って電気泳動される。最初に、ＡＣ電位およびＤＣ電位の両方が、適応される（図１５Ａを参照のこと）。側壁２１９の表面フィーチャーとの正味の場の相互作用（すなわち、このようなフィーチャー付近における場の勾配の形成）は、分極性分析物（例えば、ＤＮＡ）を側壁２１９に並んで辺縁領域に引き付ける一方、サンプルの非分極性成分は、実質的に、場の勾配によって妨げられることなく、レザバ２５７へと移動する（図１５Ｂを参照のこと）。従って、このＤＮＡは、廃液成分から分離される。なぜなら、チャネルに沿ったＤＮＡの移動は、側壁２１９に引き付けられない、サンプルの非分極性成分と比較して、遅延性であるからである。このＤＮＡがレザバ２５７に到達し得る前（または、少なくとも、サンプルのＤＮＡ内容物の任意の実質的部分が、このようなレザバに到達し得る前）に、ＡＣ場を中断し、その結果、ＤＮＡは、もはや、側壁２１９に引き付けられない。次いで、ＤＮＡは、側壁２１９から離れてチャネル２１６へと拡散し得る（図１５Ｃを参照のこと）。この時点で、ＤＣ場を逆転させ、その結果、サンプル成分が、レザバ２３８へと引き戻される。レザバ２３８への移動においても、チャネル中のなお大部分のＤＮＡは、この時点で、主にレザバ２５７中に位置するサンプル廃液に対して、空間的リードを有する。一旦ＤＮＡがレザバ２３８に戻り、そして廃液のかなりの量が到達する前に、この現在濃縮されたＤＮＡは、回収され得る（図１５Ｄを参照のこと）。収集したＤＮＡを収容しているレザバ内に廃液成分が誘引されるのを避けるために、ＤＣ場は、遮断され得る。この分離は、所望レベルの精製を達成するために、必要な場合、１回以上繰り返され得る。

分離が調子を合わせて行われるため、チャネルの片側または両側のいずれかは、一様でないプロフィールを有し得る。従って、別の実施形態は、図１５の２１０の様なデバイスを企図するが、そのデバイスは、両方の外側面に沿って一様でない縁プロフィールを有する。

種々の関連した実施形態は、単一の廃液ウェル（２５７の様な）で終了される一様でない縁プロフィール（２１９の様な）を有するチャネル（２１６の様な）内に合併される、多数のローディング／回収レザバ（２３８の様な）を提供する。

高濃度のＤＮＡをローディング／回収レザバ内に回収するために、プロセスの最後に容量（すなわち、ローディング／回収ウェルでの標的分析物収集）をより小さくすることは有用であり得る。このことは、多くの方法によって達成され得る。例えば、標的ＤＮＡを含むサンプルがチャネル内に存在する間に、液体は、ローディングレザバから除去され得る。あるいは、ローディングレザバ内の液体は、エバポレート（例えば、加熱によって）され得るか、または、廃液ウェルへと流され得る。

本発明の種々の実施形態は、ＤＮＡ適用に限定されない。例えば、それらは、細胞または他の複雑なサンプルを集めるために適用され得る。

上記の説明は、サンプルの分極性成分だけが所望の標的であると想定している。しかし本発明は、そのように制限されない。特定の適用において、サンプルの非分極性成分が標的分析物を含み得、従って、本発明は、これらの回収／精製も提供すると企図される。

電気泳動的な力以外の駆動力が、種々のサンプル成分を、チャネルを通して移動させるために使用され得ることが理解される。例えば、圧力勾配（ＤＣ場と対照的に）は、サンプル成分をチャネルに沿って移動させるために使用され得る。

本発明の種々の実施形態において、電極は、チャネルデバイスのチャネルと境界を接する壁構造に組み込まれ、この電極は、交流を提供するように作動する電極との電気連絡のために、配置される。図１６に示すように、例えば、微小製造されたチャネルデバイス３１０は、チャネル３１６に沿って間隙を介する位置に配置された電極３７１を備え、隣接する対の電極は、チャネル内に別個のＡＣ場の勾配を形成するように適合されている。この特定の実施形態において、この電極は、チャネルの一方の側（のみ）に沿って壁構造に埋め込まれる。さらに、ＤＣ場は、チャネル３１６の一端との連絡のために配置される第１のレザバ３３８と、チャネルの他端に位置付けられる第２および第３のレザバ（３５５、３５７）との間で適用され得る。

以上の実施形態は、チャネルの側壁に配置される、場の勾配を誘導する表面フィーチャーについて記載するが、本発明は、表面フィーチャー（例えば、他の境界または壁表面（例えば、底部（床面）壁または上面（天井）壁）に沿った、場の勾配を生成するように構成されたフィーチャーのような、以上の実施形態に記載される表面フィーチャー）を企図する。

種々の実施形態において、例えば、図１７に示されるように、分離チャネル（１つの側に沿って鋸歯状のプロフィールを有する）の幅は、チャネルの長さに沿って変化（増加または減少）する。サンプルの流れは、図１７の左から右である。図示される配置において、距離「ｘ」は、距離「ｙ」より小さい。空隙を増加させることによって、物理的分離を増加させ得るか、または場の勾配を減少させ得る。いくつかの適用において、「ｘ」が「ｙ」以上となるように、図１７に示されるものは、有用な改変であり得る。

本明細書中で記載され、そして特許請求されるデバイスは、単回使用（使い捨て）であり得るか、または使用間に適切な洗浄を伴って複数回使用されるように設計され得る。

上記実施形態は、濃密な適用または平行な適用（例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートの形式を使用する）に適合され得る。例えば、キャピラリー電気泳動装置の複数の毛細管が、それらの入口端部が共通平面を規定するように配置され得、そして中心間が０．９ｃｍ離れた、８×１２の長方形アレイとして配置され得る。９６チャネルのデバイスは、毛細管の入口端部に対応して（すなわち、中心間が０．９ｃｍ離れた８×１２の長方形アレイとして）配置された収集領域（例えば、ウェル）を、プレート形式で備え得、これによって、入口端部のアレイ全体が、濃縮／精製されたサンプルを装填するために、同時にそれぞれの収集ウェルにアドレスすることを可能にする。もちろん、収集領域および入口端部の任意の適合する空間的な位置が、使用され得る（例えば、平坦なアレイなど）。

本発明の種々の実施形態によれば、デバイスは、ＤＮＡを濃縮するために設計されたチャネル構造を有するチャネルを備え得る（例えば、チャネル内に制限部を有するデバイス）。これらのデバイスは、ピンチチャネルデバイスと称され、そして以下に詳細に記載される。以下にはまた、ピンチデバイスブレッドボード上にＡＣ場を発生させるために使用され得る、例示的な電気システムの特徴付けにおける新たなデータが示され、そしてまた、このピンチデバイスおよび関連する電気システムを使用して濃縮されたＤＮＡの、終点データを示す。

本発明の種々の実施形態によるピンチされたチャネルデバイスは、チャネル内に不連続面を有するマスクを調製することによって、作製され得る。この不連続面は、作製のエッチング段階の間に、不連続面の２つの側が貫通され、そしてチャネルにピンチを形成するような寸法にされ得る。図１８は、本発明の種々の実施形態によるピンチチャネルデバイス４１１のための、マスク４０５の上面図である。デバイス４１１は、３つのサイドアーム４０１、４０２、および４０３、および分離アームまたはメインアーム４０４、ならびにピンチチャネルデバイスのサイドアーム４０１に示されるピンチ４１４を備える。このデバイスはまた、レザバまたは入口４０６、４０８、４１０、および４１２を備える。得られる制限部の形状は、図１９に斜視図で示される。図１９に示されるように、ピンチ点４１４は、マスキングおよびエッチングの操作から生じた環状リッジ４１５によって少なくとも部分的に規定される。このデバイスは、エッチングの深さに依存して、メインチャネルにおいて、例えば、約１２０μｍ幅×約５０μｍ深さのチャネル構造、または約７２μｍ幅×約３０μｍ深さのチャネル構造を有し得る。ピンチの開口部の断面積は、この開口部の約１０分の１〜約２分の１、例えば、メインチャネルの約５分の１であり得る。

以下に記載されるさらなる実施例の大部分は、分離チャネルのサイドアームにピンチチャネルを有するデバイスを使用して、実施された。図２０ａ〜２０ｄは、デバイスがチャネルのサイドアームにピンチを有する本発明の種々の実施形態に従う方法およびこの方法を使用して処理されたサンプルを図示する。

濃縮方法のための一般的な手順は、以下の通りであった。図２０ａに示されるように、電気泳動を使用して、チャネルの短いアームにサンプルを充填した。次いで、バイアス電圧設定（以下にさらに詳細に記載される）よりずっと低い電圧に、ＤＣ場を低下させ、そしてＡＣ場をオンにした。図２０ｂに示されるように、ＤＮＡが、チャネル中のピンチに蓄積し、ピンチ４１４において濃縮バンド４２０を形成した。約２〜約１０分間の濃縮後、ＡＣ場を除き、そして図２０ｃのバンド４２２に示されるように、ＤＣ電気泳動を使用して、ＤＮＡの濃縮バンド４２０を、デバイスの分離アーム４０４に移動させた。一旦、濃縮バンド４２２が分離アーム４０４に入ったら、図２０ｄに示されるように、ＤＣ電極を点４１２および４０８に移動させ、そして電気泳動を開始した。放出されたＤＮＡ４２２を、終点隣接チャネル終点４１２において、検出器４３０によって検出した。

図２０ａ〜２０ｄに示されるように、ＤＮＡは、チャネルのピンチの片側にトラップされ、そしていくつかの場合において、このピンチを通してほとんど漏出せずに保持されるようである。本発明の種々の実施形態によれば、非常に効果的なＤＮＡトラップが、このピンチ構造を用いて達成され得る。

小さなＤＣバイアス電圧が、ＡＣトラップ場に加えて、このデバイスに印加され得る。これら２つの場は、トラップ電圧（ＡＣ）およびバイアス電圧（ＤＣ）と称される。トラップ電圧のみが、ポリマーおよび染料標識されたＤＮＡを充填されたチャネルに印加される場合、濃縮の小さなバンドが、トラップの片側に形成されるが、トラップ点から離れてゆっくりと移動する。効果的な濃縮は、これらの条件下では起こらないかもしれない。理論によって束縛されることを望まないが、何が起こっているかついて、３つの可能な説明が存在すると考えられる。第一に、トラップ場は、完全には対称的ではないかもしれず、従って、ＡＣに対して生じる小さなＤＣオフセットが存在し得る。このオフセット電圧は、トラップ力を圧倒し、従って、発生するバンドをトラップから引き離すために十分に強くあり得る。第二の可能性は、ＡＣの波形は非対称であるが、ＤＣオフセットが存在しないことである。非線形の電気泳動効果は、正味の場がゼロである場合でさえも、非対称な振動場においてＤＮＡの正味の移動を引き起こし得るものであることが、公知である。この効果は、ポリマーにおける非線形の電圧依存性の電気泳動移動度に起因して、生じる。しかし、これは、電気泳動効果にすぎず、そして分子の誘導された極性によって引き起こされる誘電泳動（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）とは異なる。実験的に、非線形電気泳動移動度からの効果は、ＤＣオフセットと区別することが困難である；両方が、小さなＤＣ場がチャネルに印加されたかのように現れる。新生のバンドがピンチから離れて移動する理由の第三の可能性は、このバンドが反発されることである。誘電泳動は、誘因的または反発的であり得ることが公知であり、そして観察される効果は、反発誘電泳動または誘引誘電泳動のいずれかによって引き起こされ得ると考えられる。

本発明の上記実施形態は、正弦波および方形波を使用し、同じように成功した。しかし、ピンチチャネルデバイスは、特定の波形および周波数が使用される場合に、なおより効果的である。図２１は、ピンチチャネルを有する本発明の種々の実施形態において良好に作動するＡＣ波形を示す。図２１の鋸歯状の波形は、５ｋＨｚの周波数および１６５０Ｖのピーク間電圧を有する。

図２１に示される鋸歯状の波形は、非対称であるが、ゼロ点の上および下の波形の面積が等しいことが可能である。この場合には、正味のＤＣ成分もまた、ゼロに等しくあり得る。このシステムブレッドボード電気システムに対する向上は、以下に議論されており、そして本発明の種々の実施形態のピンチチャネルデバイスの波形効果を理解する助けになり得る。

濃縮の機構にかかわらず、バイアス電圧が、ピンチにおけるＤＮＡ濃縮を引き起こすために使用され得る。このバイアスは、ＤＣ電源に取り付けられた、第二のセットの電極を使用することによって印加され得る。これらの電極は、ＡＣ電極と共に、ピンチチャネルデバイスの緩衝液レザバ内に位置し得る。システムブレッドボードのＤＣ電源は、キロボルトの範囲で作動するように設計され得、従って、１．０ギガオームの抵抗器が、このＤＣ電源と直列に配置されて、小さなＤＣバイアスが印加されることを可能にし得る。図２２は、本発明の種々の実施形態による、サイドアームピンチチャネルデバイスの電気系統の詳細な概略図を示す。図２２に示されるように、このシステムは、ＡＣ電源４２１（これは、１６５０ＶのＡＣのピーク間電圧および５ｋＨｚにおける鋸歯状波形を有する）、変圧器４２３、１ＧΩの抵抗器４２２、−０．１ｋＶのＤＣ電源４２４（これは、図２２に示される点４２６において、−１０５ＶのＤＣ電圧を供給する）、および０．０ＶのＤＣ電源４３２を備える。ＡＣ電源４２１と変圧器４２３との間は、１０倍増幅器である。

ＤＣバイアス電圧を操作することによって、ＤＮＡの濃縮されたバンドは、トラップ中に移動して蓄積されるように誘導され得る。最適なバイアス電圧は、試行錯誤によって見出され得る。例えば、バイアス電圧は、トラップが漏出し始めるまで増加され得、次いで濃縮バンドが安定化するまで低下され得る。濃縮が起こる程度は、ＣＣＤにおける画像化領域の強度を測定することによって、大まかに推定され得る。より多くの場合において、バンドの輝度は、約５〜７分後に頭打ちし始める。

図２３ａ〜２３ｄは、本発明の種々の実施形態によるトラップおよび放出のＣＣＤ画像である。図２３ａ〜２３ｄは、ＤＮＡが比較的小さなバンド（この場合には、約３０ミクロンの厚さ）において濃縮されること、および濃縮がトラップの上流側で起こることを示す。図２３ａ〜２３ｃは、それぞれ１分、３分、および６分におけるトラップの上流側でのサンプル濃縮を示す。１分、３分、および６分における相対信号強度は、それぞれ８５０、１１，５００、および４４，０００である。この場合、上流とは、サンプルの電気泳動の始点となるトラップの側として定義される。ＤＮＡは、ピンチの片側で濃縮され得、そして中央で濃縮されることが回避され得る。濃縮が決定されるピンチの側は、ＡＣ電極の配向によって決定され得る。ＤＮＡがＡＣ電極の特定の片側で常に濃縮される場合、理論に束縛されることを望まないが、濃縮の機構は、非対称な波形に関連すると考えられる。図２３ｄは、ＡＣ電圧が除かれた後に、トラップを通過したサンプルを示す。

図２４は、Ｒ６Ｇで標識された４４３ｎｔのｄｓＤＮＡフラグメントの一連の希釈物に関する、濃縮バンドのシグナルの輝度対時間のグラフである。これらのデータは、濃縮が起こっている間にピンチを画像化することによって、収集された。濃縮が進行するにつれて、頭打ち効果が存在し、そして異なる濃度の傾きは、全く異なる。このことは、本発明の種々の実施形態によるピンチチャネルデバイスにおいて繰返し観察される；ＤＮＡは、開始信号に比例する特定の点まで濃縮されるようである。このことは、希薄なサンプルからの信号が、より濃縮されたサンプルからの信号と同レベルには増加し得ないことを意味する。濃縮の程度（開始信号で除算された、所定の時点でのＣＣＤ信号として定義される）は、およそ一定であること（この場合、約５０倍から約７０倍への濃度の増加）に注目することもまた興味深い。この５０倍から７０倍への濃度の増加は、本発明の種々の実施形態による方法およびデバイスによって、開始濃度にかかわらず達成され得る。従って、本発明は、なお半定量的な、時間に非依存性の濃縮を提供し得る。開始濃度依存性の現象は、漏出速度が濃縮に比例する、漏出しやすいトラップと一致し、これは、何が起こっているかのモデルであり得る。

本発明の種々の実施形態従って、サンプルにＮａＣｌを添加することによって、イオン濃度の効果を試験した。条件は、上記実験のための、図２４のグラフに報告されている条件と類似である。サンプルは、０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、および１００ｍＭのＮａＣｌ中に調製された、Ｒ６Ｇで標識された４４３ｎｔのｄｓＤＮＡであった。図２４に報告される先の実験と同様に、濃縮バンドの輝度を画像化ＣＣＤで測定し、そして時間の関数としてプロットした。ＮａＣｌ濃度に対してプロットされたＣＣＤ信号のグラフとして表される結果を、図２５に示す。

上の３つの曲線は、０ｍＭ、５ｍＭ、および１０ｍＭのＮａＣｌを表す。１０ｍＭまでの塩の添加は、ＤＮＡが濃縮される程度に対して影響を有さなかった。下の２つの曲線は、５０ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｍＭのＮａＣｌの存在を表し、顕著な効果を示した。５０ｍＭおよび１００ｍＭの塩の添加は、この系の濃縮能力を有意に低下させた。緩衝液濃度は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｔａｐｓであった。本発明の種々の実施形態に従って、サンプルのイオン強度対緩衝液のイオン強度の比の制御を使用して、このシステムがいかに良好に濃縮するかを決定する。

本発明の種々の実施形態によれば、濃縮バンドを所定の位置に保持するために必要とされるＤＣバイアス電圧は、サンプルイオン強度の関数として増加することが観察された。この観察は、図２６に示されるような、ＮａＣｌ濃度に対する印加されたＤＣバイアス電圧のグラフを見ることから生じ得る。図２６に示されるように、サンプル中の塩濃度が増加するにつれて、印加バイアス電圧もまた増加した。理論によって束縛されることを望まないが、このことは、塩の多いサンプルのより高い電流によって引き起こされる、アームにおける電圧低下の上昇に起因し得ること、およびこのことは、不適切なＡＣ電源の指標であることが考えられる。

サンプルの塩濃度が増加するにつれて、濃縮バンドがより不安定に見えることもまた、観察された。濃厚化するＤＮＡがピンチポイントの近くで循環するように見える位置で、「溶岩傾斜（ｌａｖａ ｌａｍｐ）」効果が観察された。理論に束縛されることを望まないが、この効果は、チャネルにおいて加熱によって引き起こされ得ると考えられる。加熱効果がチャネル内で起こる場合、本発明によれば、ピンチポイントにおいて起こると予測される。なぜなら、この位置は、電流密度が最も高い位置であるからである。

次いで、いくつかの実験を実施して、変性環境下で、本発明の種々の実施形態によるピンチチャネルデバイスを使用する濃縮方法を試験した。４％ ｐＤＭＡおよび１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｔａｐｓ緩衝液からなり、変性剤を含まない、注文したポリマー系を使用した。チャネル内の加熱に起因する濃縮バンドの不安定性を示唆した、先の実験における観察に起因して、この緩衝系を使用した。より小さな（７２×３０μｍの）チャネルと組み合わせて、より低いイオン強度の緩衝系を使用して、不安定性に伴うほとんどの問題を軽減した。

終点検出を使用する結果のほとんどを、変性ポリマー系を使用して得た。使用され得る例示的なポリマー系は、ＰＯＰ６に類似であるが、１／３の緩衝液濃度（６．５％ ｐＤＭＡ、８Ｍ尿素、５％ ２−ピロリジノン、３３ｍＭ Ｎａ−Ｔａｐｓ（ＥＤＴＡを含む））を例外とする。この系は、微生物増殖に対する耐性と伝導性との間の良好なバランスを達成する。これはまた、変性系であり、そしてＴｒｉｓ−Ｔａｐｓに基づく系より良好な終点結果を与える。

前述の実施例のほとんどは、４００〜７００ｎｔの範囲のＤＮＡフラグメントを用いる試験に対する結果を報告する。いくつかの実験を実施して、本発明の種々の実施形態のピンチチャネルデバイスがもはや効果的に濃縮しない、ＤＮＡフラグメント長の観点でカットオフが存在するか否かを決定した。より大きなフラグメントはより効率的に濃縮されたが、２５ｎｔ程度の小さなフラグメントが、ピンチチャネルデバイスを用いて濃縮され得ることが、決定された。実験結果は、一般に、１００ｎｔより大きなフラグメントが濃縮され得、そして１３６ｎｔのフラグメントと２０４ｎｔのフラグメントとの間には、濃度効果にほとんど差異がないことを示した。４４３ｎｔおよび７３１ｎｔのフラグメントは、１３６ｎｔおよび２０４ｎｔのフラグメントより効率的に濃縮されたように見えた。最後に、１００ｎｔ未満のフラグメントに対する制御された実験は、フラグメントの大きさの減少と共に、濃度の有意な低下を示した。７５ｎｔ、５０ｎｔ、および２５ｎｔのフラグメントを使用する実験について、濃縮の程度は、それぞれ１７倍、８倍、および３倍であった。

終点検出器は、ストック３１０オプティクスおよびレーザアセンブリであり得、９０°回転され、そしてブレッドボードに取り付けられる。３１０に対してなされ得る改変は、キャピラリーホルダの除去である。終点検出のためのデータ収集は、３１０データ収集ソフトウェアを使用して実施され得る。

ＡＣトラップ電圧が印加される前にピンチフィーチャーを含むチャネルがサンプルで充填される場合に、デバイスにおいて、サンプルバックグラウンドの問題が生じ得る。このことは、終点検出を複雑にする。なぜなら、濃縮されたサンプルが、所望でない材料のバックグラウンド（そのいくつかは、蛍光であり得る）に埋没するからである。例えば、ピンチチャネルデバイスの最も単純なバージョンは、一端の近くにピンチフィーチャーを有する、単一の長いチャネルである。サンプルは、このピンチにおいて濃縮され、一方で他の蛍光の無意味なデータは、単に、トラップを通過する。次いで、トラップ場が除去され、そして濃縮バンドが解放される。しかし、濃縮サンプルバンドを検出する試みは、高度に蛍光性の、変動するバックグラウンドにおいて、問題であり得る。しかし、図２０ａ〜２０ｄに示されるように、サイドアームにピンチを有するチャネルの使用は、この効果を少なくした。なぜなら、サンプルは清浄なチャネルに「注入」されるが、トラップの直前および直後の材料は、メインチャネルに進むからである。

サンプルがコーナーを曲がってメインチャネルに入ることに伴う問題もまた、存在し得る。図２０ｃに示されるように、９０°の屈曲を曲がることは、バンドの有意なひずみを引き起こす。このひずみの大まかな推定は、ピンチから解放された５０μｍ幅のバンドが、コーナーを曲がって分離アームに入る際に、ほぼ２００μｍに伸びることである。この効果は、図２８ａ〜２８ｄのＣＣＤ画像に見られ得る。記載したばかりのこれらの問題は、曲がるべきコーナーを必要としないが清浄なチャネルに解放するための手段を依然として有する、異なるデバイス構造を使用することによって軽減され得る。図２７ａ〜２７ｃは、サンプルがピンチを通って清浄なチャネルに入り得る構造を有する、本発明の実施形態を使用して処理されたサンプルを示す。図２７ａ〜２７ｃのピンチチャネルデバイス５１１は、ショートアーム５０１、５０２、および５０３、分離アーム５０４、ならびにレザバまたは投入ポート５０６、５０８、５１０、および５１２を備える。デバイス５１１は、サンプル５１６を充填されている。図２７ａ〜２７ｃは、それぞれ、（図２７ａ）サンプルが注入側に装填され、（図２７ｂ）サンプルがピンチにおいてされて濃縮ＤＮＡバンド５２０を形成し、そして（図２７ｃ）サンプルが分離アームに解放されて移動する濃縮バンド５２２を提供する、本発明の実施形態を示す。このデバイスは、「二重Ｔ字型（ｄｏｕｂｌｅ−ｔｅｅ）ピンチ」と称される。

この報告に提示される終点データの全ては、図２０ａ〜２０ｄおよび図２２に示されるようなサイドアームピンチ構造を使用して、作製された。この構造は、高度な濃縮を与えた。図２８ａ〜２８ｄに見られるようなデータは、（図２８ａに示されるような）ピンチトラップから解放された後の４４３ｎｔのＲ６Ｇの濃縮バンド、（図２８ｂおよび２８ｃに示されるような）コーナーを曲がっているバンド、および（図２８ｄに示されるような）メイン分離チャネルに移動するバンドの、ＣＣＤ画像を示す。開始サンプルは、５０ｎＭのｄＣＴＰ−Ｒ６Ｇを含む１ｎＭ ４４３−Ｒ６Ｇであった。Ｒ６Ｇで標識されたｄＣＴＰを、内部標準として使用した。なぜなら、これはピンチにおいて濃縮されないからである。図２９に示されるような、スクリーンショット（ｓｃｒｅｅｎ ｓｈｏｔ）に示されるような、終点において得られた電気泳動図。図２９の電気泳動図は、濃縮されていないｄＣＴＰに対する４４３ｎｔのフラグメントの濃縮を示す。図２９において、コントロール泳動の電気泳動図（図の上半分に見られる）および本発明の実施形態を使用するサンプル泳動（図の下半分）が示される。濃縮の程度は中程度（この場合には、７倍）であるが、混合物中に存在する他の種と比較しての、ＤＮＡの濃縮が実証される。

トラップを囲むチャネルにおけるサンプルバックグラウンドのいくらかのレベルが常に存在し、そしてこの物質は、しばしば、濃縮バンドと共にメインチャネルに注入される。本発明は、この問題を最小にする手法を提供する。バックグラウンドの問題を最小にする第一の方法は、トラップの近くに最少のバックグラウンドが存在するように、サンプルの構造を変化させることによる。このことは、図２７ａ〜２７ｃの概略図に示されるように、二重Ｔ字型ピンチ構造の基礎である。二重Ｔ字型ピンチ構造において、バックグラウンドを含む二重Ｔ字型中に、非常に小さな容量が存在する。第二の方法は、新鮮な緩衝液を用いて、トラップを洗浄することを包含する。この方法は、トラップを開始すること、次いで、サンプルレザバ中のサンプルを緩衝液と置き換えることを包含する。小さなＤＣバイアス電圧は、最終的に、アーム中のサンプルの全てを移動させ、トラップを通し、そしてこのサンプルを、レザバからの新鮮な緩衝液と置き換える。残りの全てのものは、トラップ自体における材料である。この第二の方法に付随する問題は、例えば、ＡＣトラップ電圧を増加させることによって、トラップの保持力を増加させることによって、軽減され得る。

本明細書中で言及された全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が具体的かつ別個に、参考として援用されると示されたかのような程度まで、本明細書中に参考として援用される。

電気泳動分野の当業者は、多くの改変が、本発明の教示から逸脱することなく、本発明の上記種々の実施形態において可能であることを、明らかに理解する。全てのこのような改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

図１は、本発明を実施するのに有用な微細加工チャネルデバイスの一方面からの部分的な概略図である。 図２Ａは、微細加工チャネルデバイスのＴ型注入配置の外観を概略的に示す。 図２Ｂは、微細加工チャネルデバイスのＴ型注入配置の外観を概略的に示す。 図２Ｃは、微細加工チャネルデバイスのＴ型注入配置の外観を概略的に示す。 図３は、微細加工チャネルデバイスのコーナー縁部近位の電場集中を概略的に示す。 図４は、磁場勾配の集中に効果的な、本発明によって企図されるような、例示的なチャネル外形を示す。図４Ａおよび４Ｂは、チャネル幅のくびれを示す。さらに、図４Ｃおよび４Ｄは、電場が印加された場合に生じる磁場勾配を増強するのに有効な鋭いコーナーを含むものを示す。 図５は、本発明の使用に適したＡＣ回路の概略図である。 図６は、本発明の第一の例を概略的に示す。最初に、ＤＮＡは、チャネルデバイスのサイドアームの小さいバンド内に濃縮される（図６）。 図７は、本発明の第一の例を概略的に示す。最初に、ＤＮＡは、チャネルデバイスのサイドアームの小さいバンド内に濃縮される（図６）。次に、この濃縮されたＤＮＡの一部は、このデバイスの交差チャネルの交差領域に移動する。 図８は、本発明の第一の例を概略的に示す。最初に、ＤＮＡは、チャネルデバイスのサイドアームの小さいバンド内に濃縮される（図６）。次に、この濃縮されたＤＮＡの一部は、このデバイスの交差チャネルの交差領域に移動する（図７）。次いで、この濃縮されたＤＮＡ部分は、このデバイスの分離アームに導入される（図８）。 図９は、本発明の第二の例を概略的に示す。ＤＮＡは、チャネルデバイスの交差チャネルの交差領域に近いアームの小さいバンド内に濃縮される（図９）。 図１０は、本発明の第二の例を概略的に示す。ＤＮＡは、チャネルデバイスの交差チャネルの交差領域に近いアームの小さいバンド内に濃縮される（図９）。一旦濃縮されると、このＤＮＡは、このデバイスの分離アームに導入される（図１０）。 図１１は、本発明の第三の例を概略的に示す。ＤＮＡは、チャネルデバイスの交差チャネルの交差領域に近いアームの小さいバンド内に濃縮される（図１１）。 図１２は、本発明の第三の例を概略的に示す。ＤＮＡは、チャネルデバイスの交差チャネルの交差領域に近いアームの小さいバンド内に濃縮される（図１１）。一旦濃縮されると、このＤＮＡは、このデバイスの分離アームに導入される（図１２）。 図１３は、本発明の実施形態によって企図されるような、一方の側壁に沿った鋸歯状（ｓａｗ−ｔｏｏｔｈｅｄ）プロフィールまたは鋸歯状（ｓｅｒｒａｔｅｄ）プロフィールを有するチャネルを有するチャネルデバイスを概略的に示す。 図１４Ａ、ＢおよびＣは、図１３と同じチャネルデバイスに組み込まれ得る側壁面外形の種々の実施形態の部分的な拡大図である。 図１５は、一方の壁に沿った鋸歯状（ｓａｗ−ｔｏｏｔｈｅｄ）プロフィールまたは鋸歯状（ｓｅｒｒａｔｅｄ）プロフィールを有するチャネルを有するチャネルデバイスの別の実施形態を示す。 図１６は、チャネルに結合した壁構造に埋め込まれた電極を有するチャネルデバイスを概略的に示す。この電極は、ＡＣ電源と電気的に連絡するように配置されている。 図１７は、チャネルの長さに沿って変化する幅または断面積を有するチャネルを概略的に示す。 図１８は、本発明の種々の実施形態に従うピンチチャネルを形成するのに有用なマスクを概略的に示す。 図１９は、本発明の種々の実施形態に従うピンチポイントを備えるチャネルの断面部分の概略図である。 図２０ａ〜ｄは、ピンチポイントチャネルを有する本発明の種々のの実施形態に従うデバイスにおける、ＤＮＡバンドの濃縮および移動を概略的に示す。 図２１は、ピンチポイントチャネルデバイスとともに使用され得、１，６５０ボルトのピーク間電圧にて５ｋＨｚで泳動する鋸歯状波形を示すグラフである。 本発明の種々の実施形態に従うピンチポイントチャネルデバイスとともに使用され得る電気回路の概略図である。 図２３ａ〜ｄは、ピンチポイントチャネルデバイスのピンチポイントを通るＤＮＡバンドの濃縮および移動のＣＣＤ画像であり、本明細書中で「捕捉および放出」とも呼ばれる。 図２４は、ＣＣＤ信号によって決定される標識されたＤＮＡフラグメントの連続希釈のための、ＤＮＡの濃縮バンドの光度 対 時間を示すグラフである。 図２５は、塩化ナトリウム濃度によって影響を受けた、ＣＣＤ信号によって決定されるＤＮＡの濃縮バンドの光度 対 時間を示す。 図２６は濃縮されたバンドを適所に保持するために必要なＤＣバイアス電圧 対 サンプルイオン強度を示すグラフである。 図２７ａは、本発明の種々の実施形態に従う二重Ｔピンチポイントデバイスを通るＤＮＡバンドの濃縮および移動を概略的に示す。 図２７ｂは、本発明の種々の実施形態に従う二重Ｔピンチポイントデバイスを通るＤＮＡバンドの濃縮および移動を概略的に示す。 図２７ｃは、本発明の種々の実施形態に従う二重Ｔピンチポイントデバイスを通るＤＮＡバンドの濃縮および移動を概略的に示す。 図２８ａ〜ｄは、ピンチトラップからのＤＮＡの濃縮バンドの放出（図２８ａ）、主分離チャネル内にピンチトラップを有するサイドアームからのＤＮＡの濃縮バンドの旋回（図２８ｂおよび２８ｃ）、分離チャンバ内の完全に注入されたＤＮＡバンド（図２８ｄ）のＣＣＤ画像である。 図２９は、本発明の種々の実施形態に従うピンチポイントデバイスの分離後の、濃縮されていないｄＣＴＰに対する４４３ｎｔ ＤＮＡフラグメントの実施形態を示す電気泳動図を含むスクリーンショットである。

Claims (78)

1. チャネルデバイスであって、以下：
   第一末端および第二末端を備える、細長チャネル；
   少なくとも１つの第一の電極と少なくとも１つの第二の電極とを備える複数の電極であって、該第一の電極は、該第一末端に配置され、および該第二の電極は該第二末端に配置される、電極；ならびに
   少なくとも１つのエネルギー源であって、該エネルギー源は、該複数の電極と電気連絡し、そして該細長チャネルの少なくとも一部に沿ってＤＣ電位を、および該細長チャネルの少なくとも第二の一部に沿ってＡＣ電位を同時に印加し、続いて該細長チャネルの少なくとも一部に沿ってＤＣ電位のみを印加するように構成される、エネルギー源、
   を備え、
   ここで、該細長チャネルは、該電位の印加によって確立された電場に、ある場の強度を有する該細長チャネル内の１以上の領域において捕捉する場の勾配を形成させるように構成され、該場の強度は、該第二の一部への分極性分析物の移動の際に、該第二の一部において該分極性分析物を捕捉する、
   デバイス。
2. 少なくとも１つの場の勾配が、前記分極性分析物を誘引する、請求項１に記載のデバイス。
3. 請求項１に記載のデバイスであって、前記細長チャネルは、該細長チャネルの長手軸に対して垂直な平面に沿って取られた可変的断面積を有し；該細長チャネルは、該細長チャネルの最も狭い領域において直径１マイクロメートル未満である、デバイス。
4. 請求項１に記載のデバイスであって、前記細長チャネルは、該細長チャネルの長手軸に対して垂直な平面に沿って取られた一定の断面積を有し；該細長チャネルは、直径１マイクロメートル未満である、デバイス。
5. 前記細長チャネルが、プレートまたはチップにおいて形成された溝を含む、請求項１に記載のデバイス。
6. 請求項１に記載のデバイスであって、前記のように形成される少なくとも１つの場の勾配が、その最も長い寸法が、直径１マイクロメートル未満の分極性分析物を誘引または反発するのに有効である、デバイス。
7. 請求項６に記載のデバイスであって、前記のように形成される少なくとも１つの場の勾配が、細胞下の生体分子を含む分極性分析物を誘引または反発するのに有効である、デバイス。
8. 請求項６に記載のデバイスであって、少なくとも１つの場の勾配が、ポリヌクレオチドを含む分極性分析物を誘引または反発するのに有効である、デバイス。
9. 請求項１に記載のデバイスであって、前記少なくとも１つのエネルギー源が、以下：（ｉ）ＤＣ場が第一の方向で印加される、第一状態；および（ｉｉ）ＤＣ場が、該第一の方向とは逆の第二の方向で印加される、第二状態、を含む少なくとも２つの状態の間で選択可能である、デバイス。
10. 前記少なくとも１つのエネルギー源が、ＤＣジェネレータおよびＡＣジェネレータを備える、請求項１に記載のデバイス。
11. 請求項１に記載のデバイスであって、前記少なくとも１つのエネルギー源が、以下：（ｉ）前記ＤＣ電位およびＡＣ電位が、ある時点において１つで個々に印加される、第一状態；および（ｉｉ）該ＤＣ電位およびＡＣ電位が、両方同時に合わせて印加される、第二状態、を含む少なくとも２つの状態の間で選択可能である、デバイス。
12. 請求項１に記載のデバイスであって、前記少なくとも１つのエネルギー源および前記少なくとも２つの電極が、前記ＤＣ電位の少なくとも一部に重なった前記ＡＣ電位を印加するために適合される、デバイス。
13. 請求項１に記載のデバイスであって、前記細長チャネルに沿って間隔をあけて配置され、そして前記少なくとも１つのエネルギー源と連絡する複数の電極をさらに備え、その結果、該複数の電極の隣接対は、該細長チャネル内のそれぞれの位置において局所的ＡＣ場を確立し得る、デバイス。
14. 請求項１に記載のデバイスであって、前記細長チャネルが、該細長チャネルへと伸びる１つ以上の島を備え、該島は、前記場の勾配の形成に寄与するように構成される、デバイス。
15. 前記１以上の島の少なくとも１つが、一般に涙型である、請求項１４に記載のデバイス。
16. 請求項１に記載のデバイスであって、前記細長チャネルについての境界を規定する壁構造をさらに備え、該壁構造は、前記場の勾配の形成に寄与するように構成された１以上の表面フィーチャーを備える、デバイス。
17. 前記表面フィーチャーが、該表面フィーチャーに隣接する位置での場の勾配の形成を誘導するように構成される、請求項１６に記載のデバイス。
18. 前記壁構造が、絶縁物質から構成される、請求項１６に記載のデバイス。
19. 前記物質が、プラスチック、ガラス、酸化シリコンおよびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１８に記載のデバイス。
20. 請求項１８に記載のデバイスであって、前記表面フィーチャーが、縁、コーナー、角、突出、くぼみ、凸部、歯状、波状、鋸歯状、ノッチ、隆起、ぎざぎざ、波、リップル、フィン、棒、錐体、ペグおよびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１以上の形状を規定する、デバイス。
21. 前記表面フィーチャーが、前記壁構造に沿ってほぼ波状のトポグラフィーを規定する、請求項１６に記載のデバイス。
22. 前記表面フィーチャーが、前記壁構造に沿って、ほぼのこぎり歯状または鋸歯状のトポグラフィーを規定する、請求項１６に記載のデバイス。
23. 前記表面フィーチャーが、前記壁構造に沿って、ほぼ波様のトポグラフィーを規定する、請求項１６に記載のデバイス。
24. 前記表面フィーチャーが、前記壁構造に沿って、ほぼリップルのトポグラフィーを規定する、請求項１６に記載のデバイス。
25. 請求項１に記載のデバイスであって、第一末端および第二末端を備える第二の細長チャネルをさらに備え、該第二の細長チャネルは、最初に言及した前記細長チャネルと交差する、デバイス。
26. 前記細長チャネルおよび前記第二の細長チャネルが、Ｔ字型の交差を規定する、請求項２５に記載のデバイス。
27. 前記細長チャネルおよび前記第二の細長チャネルが、前記場の勾配の形成に寄与するように配置された１以上のコーナーを規定する、請求項２５に記載のデバイス。
28. 少なくとも１つのコーナーが、直角を規定する、請求項２７に記載のデバイス。
29. 少なくとも１つのコーナーが、斜角を規定する、請求項２７に記載のデバイス。
30. 前記交差チャネルが、ほぼＹ字型の交差を規定する、請求項２５に記載のデバイス。
31. 請求項２５に記載のデバイスであって、前記細長チャネルおよび前記第二の細長チャネルの１つまたは両方が、該チャネルのそれぞれの長手軸に対して垂直な平面に沿って取られた断面積が異なる１以上の領域を備え、該断面積は、場の勾配の形成に寄与するように構成される、デバイス。
32. 少なくとも１つの異なる断面積の領域が、くびれを備える、請求項３１に記載のデバイス。
33. 前記表面フィーチャーが、前記細長チャネルの１つの壁に沿って位置し、そして該細長チャネルの反対の壁は、このような表面フィーチャーを有さない、請求項１６に記載のデバイス。
34. 前記反対の壁に沿って長手軸方向に走る線が、ほぼまっすぐであるかまたはゆるくカーブしている、請求項３３に記載のデバイス。
35. 前記１以上の前記第一末端および第二末端との連絡のために、隣接して位置づけられて配置されたレザバをさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
36. 標的分極性分析物および１以上の混入物を含むサンプルを精製するための方法であって、該方法は、以下：
    該サンプルを、細長チャネルを備えたチャネルデバイスにロードする工程；
    該チャネルの少なくとも一部に沿ってＡＣ電位およびＤＣ電位を印加する工程であって、該電位は、該印加の少なくとも一部について同時に印加され、その結果、１以上の場の勾配が該チャネル内に形成され、該場の勾配は、該サンプル中の該標的分析物を、該チャネル内の１以上の局在化領域へと移動させ、そして該チャネル内の１以上の局在化領域において濃縮させる、工程、
    を包含し、ここで、該印加する工程が、標的分析物の濃度に対して混入物の濃度を減少させるのに有効であり、それによって精製分析物を生成する、
    方法。
37. １以上の前記場の勾配が、前記標的分析物が移動する前記１以上の局在化領域を規定する、請求項３６に記載の方法。
38. 請求項３６に記載の方法であって、前記チャネルは、該チャネルの長手軸に対して垂直な平面に沿って取られた可変的断面積を有し；該チャネルは、該チャネルの最も狭い領域において直径１マイクロメートル未満である、方法。
39. 請求項３６に記載の方法であって、前記チャネルは、該チャネルの長手軸に対して垂直な平面に沿って取られた一定の断面積を有し；該チャネルは、直径１マイクロメートル未満である、方法。
40. 前記分析物が、１以上の細胞下生体分子を含む、請求項３６に記載の方法。
41. 前記分析物が、１以上のポリヌクレオチドを含む、請求項３６に記載の方法。
42. 前記ポリヌクレオチドが、１以上のＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡフラグメントを含む、請求項４１に記載の方法。
43. 前記ＤＣ電位が、ＤＣジェネレータを使用して形成され、そして前記ＡＣ電位が、ＡＣジェネレータを使用して形成される、請求項３６に記載の方法。
44. 前記ＡＣ電位が、前記ＤＣ電位の少なくとも一部上に重なる、請求項３６に記載の方法。
45. 複数のＡＣ電位が、前記チャネルの壁に沿って間隔をあけたそれぞれの位置において、該チャネル内に形成される、請求項３６に記載の方法。
46. １以上の島が、前記チャネル内の位置において配置され、そして前記１以上の場の勾配が、該島の近傍に形成される、請求項３６に記載の方法。
47. 前記チャネルが、該チャネルの境界を規定する壁構造を備え、そして前記１以上の場の勾配が、該壁構造の近傍の位置において形成される、請求項３６に記載の方法。
48. 前記壁構造が、絶縁物質から構成される、請求項４７に記載の方法。
49. 前記壁構造が、１以上の表面フィーチャーを備え、そして前記１以上の場の勾配が、該表面フィーチャーの近傍の位置において形成される、請求項４７に記載の方法。
50. 前記表面フィーチャーが、前記チャネルの壁上に位置し、そして該チャネルの反対の壁は、該表面フィーチャーを有さない、請求項４９に記載の方法。
51. 前記チャネルデバイスが、少なくとも２つの細長チャネルを備え、該チャネルのうち１つが、該チャネルの他方と交差する、請求項３６に記載の方法。
52. 前記１以上の場の勾配が、前記交差チャネルによって規定される１以上のコーナーの近傍に形成される、請求項５１に記載の方法。
53. 請求項３６に記載の方法であって、前記チャネルが、該チャネルの長手軸に対して垂直な平面に沿って取られた断面積が異なる１以上の領域を備え；そして前記場の勾配が、該断面積が異なる１以上の領域の近傍に形成される、方法。
54. 請求項３６に記載の方法であって、前記チャネルデバイスが、１以上のレザバをさらに備え、該レザバの各々が、該チャネルの末端への流体連絡のために配置され；そして前記ロードする工程が、該サンプルを該１以上のレザバのうちの少なくとも１つに配置することを包含する、方法。
55. 別の１以上の前記レザバ中に緩衝溶液を配置する工程をさらに包含する、請求項５４に記載の方法。
56. 前記精製分析物を電気泳動し、それによって該分析物を１以上の分析物ゾーンへと分離する工程をさらに包含する、請求項３６に記載の方法。
57. 前記精製分析物を回収する工程をさらに包含する、請求項３６に記載の方法。
58. 請求項３６に記載の方法であって、前記場の勾配が、前記チャネルの一方の側に沿って形成され、そして該チャネルの反対側にはこのような勾配が存在せず、その結果、前記標的分析物が、該一方の側に沿った該チャネルの辺縁領域に誘引され、そして該一方の側に沿った該チャネルの辺縁領域に濃縮する、方法。
59. 前記濃縮標的分析物を、前記一方の側から第一収集領域へと方向付ける工程をさらに包含する、請求項５８に記載の方法。
60. 前記辺縁領域に誘引されないサンプル成分を、前記第一収集領域とは別個の第二収集領域へと方向付ける工程をさらに包含する、請求項５９に記載の方法。
61. 請求項３６に記載の方法であって、該方法は、前記ＡＣ電位を中断する工程、および該中断されたＡＣ電位を用いて、前記ＤＣ電位を逆転し、それによって前記濃縮分析物を逆方向に移動させる工程、をさらに包含する、方法。
62. 請求項６１に記載の方法であって、該方法は、前記ＤＣ電位を逆転し、そして前記標的分析物を逆方向に移動させた後に、該標的分析物を収集する工程をさらに包含する、方法。
63. チャネルデバイスであって、以下：
    第一末端および第二末端を有する、一次チャネル；
    該第一末端との流体連絡のために配置された、ローディング領域；
    該第二末端との流体連絡のために配置された、第一収集領域；
    二次チャネルであって、該二次チャネルは、該第一末端よりも該第二末端に近い領域での該一次チャネルとの流体連絡のために配置された入り口末端、および該二次チャネルの出口末端との流体連絡のために配置された第二収集領域を有する、二次チャネル；ならびに
    少なくとも３つの電極であって、各電極は、該ローディング領域、第一収集領域および第二収集領域のそれぞれ１つの近傍に配置される、電極；ならびに
    少なくとも１つのエネルギー源であって、該エネルギー源は、該電極との電気連絡のために配置され、そして該チャネルの両方の少なくとも一部に沿ってＤＣ電位を、および該一次チャネルの少なくとも一部に沿ってＡＣ電位を同時に印加するように作動可能である、エネルギー源、を備え、
    ここで、該一次チャネルは、該電位の印加によって確立された電場に、該チャネル内の複数の領域にて場の勾配を形成させるように構成され、分極性分析物を含むサンプルを該ローディング領域にロードする際に、ある場の強度を有する該場の勾配は、該分極性分析物を誘引または反発する、
    チャネルデバイス。
64. 請求項６３に記載のデバイスであって、前記一次チャネルは、該一次チャネルの長さに沿って間隔をあけた位置に配置された複数の電極対を備え、各対は、該一次チャネルの隣接領域内に、それぞれのＡＣ場を生じるように適合される、方法。
65. 請求項６３に記載のデバイスであって、前記一次チャネルは、該一次チャネルについての境界を規定する壁構造を備え、該壁構造は、縁、コーナー、角、突出、くぼみ、凸部、歯状、波状、鋸歯状、ノッチ、隆起、ぎざぎざ、波、リップル、フィン、棒、錐体、ペグおよびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１以上の形状を規定する表面フィーチャーを備える、デバイス。
66. 前記壁構造が、前記チャネルの１つの壁上に形成され、そして該チャネルの反対の壁は、該壁構造を有さない、請求項６５に記載のデバイス。
67. 前記壁構造が、前記チャネルの１つより多い壁上に形成される、請求項６５に記載のデバイス。
68. 前記チャネルが、プレートまたはチップにおいて形成された溝を含む、請求項６３に記載のデバイス。
69. 請求項６３に記載のデバイスであって、前記ローディグ領域がローディングレザバを備え、前記第一収集領域が廃液レザバを備え、そして前記第二収集領域が精製分析物レザバを備える、デバイス。
70. チャネルデバイスであって、以下：
    第一末端および第二末端を備える細長チャネル；
    少なくとも２つの電極であって、各電極は、該末端の近傍に配置される、電極；
    少なくとも１つのエネルギー源であって、該エネルギー源は、該電極との電気連絡のために配置され、そして該チャネルの少なくとも一部に沿ってＤＣ電位を、および該チャネルの少なくとも一部に沿ってＡＣ電位を同時に印加するように作動可能である、エネルギー源；
    該チャネルについての境界を規定する壁構造であって、該壁構造は、１以上の表面フィーチャーを備える、壁構造、
    を備え、ここで、該表面フィーチャーは、該電位の印加によって確立された電場の印加の際に該チャネル内の規定された位置での場の勾配の形成を誘導するように構成され、その結果、分極性分析物を含むサンプルを該チャネルにロードする際に、該分極性分析物は、該場によって該チャネル内の１以上の規定された位置へと向けられる、チャネルデバイス。
71. 前記分極分析物が、前記チャネル内の３つ以下の規定された位置へと向けられる、請求項７０に記載のデバイス。
72. 前記規定された位置の少なくとも１つとの連絡を可能にするアクセス開口部をさらに備える、請求項７０に記載のデバイス。
73. 請求項７２に記載のデバイスであって、前記アクセス開口部は、以下：（ｉ）開放状態、および（ｉｉ）閉鎖状態、を含む少なくとも２つの状態の間で作動可能な閉鎖部を備える、デバイス。
74. 標的分極性分析物および１以上の混入物を含むサンプルを精製するためのデバイスであって、該デバイスは、以下：
    該サンプルを、細長チャネルを備えるチャネルデバイス中にロードするための手段；
    該チャネルの少なくとも一部に沿ってＡＣ電位およびＤＣ電位を印加するための手段であって、該電位は、該印加の少なくとも一部について同時に印加され、その結果、１以上の場の勾配が該チャネル内に形成され、該場の勾配は、該サンプル中の該標的分析物を、該チャネル内の１以上の局在化領域に移動させ、そして該チャネル内の１以上の局在化領域にて濃縮させる、手段、
    を備え、該印加するための手段は、標的分析物の濃度に対して混入物の濃度を減少させるのに有効であり、それによって精製分析物を生じる、
    デバイス。
75. チャネルデバイスであって、以下：
    第一末端および第二末端を備え、そしてある平均断面積を有する、少なくとも１つの細長チャネル、ならびに該平均断面積よりも小さい断面積を有するピンチ領域；
    少なくとも２つの電極であって、各電極は、該末端の一つの近傍に配置される、電極；および
    少なくとも１つのエネルギー源であって、該エネルギー源は、該電極との電気連絡のために配置され、そして該少なくとも１つのチャネルの少なくとも一部に沿ってＤＣ電位を、および該少なくとも１つのチャネルの少なくとも一部に沿ってＡＣ電位を同時に印加するように作動可能である、エネルギー源、
    を備え、ここで、該チャネルは、該電位の印加によって確立された電場に、ある場の強度を有するチャネル内の該ピンチ領域において場の勾配を形成させるように構成され、該チャネル末端の一方への分極性分析物を含むサンプルのロードの際に、該場の強度は、該分極性分析物を誘引または反発する、チャネルデバイス。
76. 前記少なくとも１つの細長チャネルが、互いに交差する少なくとも２つのチャネルを備える、請求項７５に記載のチャネルデバイス。
77. 請求項７５に記載のチャネルデバイスであって、前記少なくとも１つの細長チャネルが、分離チャネルおよび該分離チャネルと交差する側方チャネルを備え、ここで、前記ピンチ領域が、該側方チャネル中に位置する、チャネルデバイス。
78. 前記側方チャネルが、第一長さを有し、そして前記分離チャネルが、該第一長さよりも長い第二長さを有する、請求項７７に記載のチャネルデバイス。

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