CN107937242B - 一种基于纸基的dna电固相萃取方法与装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纸基的DNA电固相萃取方法与装置，所述装置包括纸基核酸电固相萃取芯片、升压控制模块；纸基核酸电固相萃取芯片的上层基片设有两个储液池，一个流体通道，两储液池通过流体通道相连接；萃取芯片下层基片上表面设有至少包含三个电极的多电极结构，所述多电极结构包含的至少三个电极为位于低电势储液池下方的第一电极、位于高电势储液池下方的第二电极，和位于流体通道的下方的第三电极，本发明利用纸基芯片的优良特性，结合可变电场的多模式调控方法，研制成本低廉、体积微小、萃取效率高的纸基核酸电固相萃取装置与方法。本发明对实现基于纸基的核酸微全分析系统，实现核酸分析装置的小型化具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物分析领域，特别是涉及一种基于纸基的核酸固相萃取方法与装置。
背景技术
基因检测与疾病密切相关。除外伤、过度饥饿外，几乎所有的疾病都可以通过基因检测测出风险，并可进行疾病的风险预警，针对性进行干预，从而有针对性地主动改善自己的生活环境和生活习惯，预防和避免重大疾病的发生。因此基因检测已经成为影响人类健康的全球性重点研究领域，而在基因检测实际分析中作为第一步的核酸萃取则至关重要，该过程的完成质量直接决定了后续过程分析中扩增与分离检测的成功与否。传统的核酸固相萃取方法主要采用与管柱内的固定相进行吸附解吸来完成，该方法制作工艺难度大，成本高，反应时间长，很难与微流控分析技术相结合。
而自2007年，Whitesides首次提出“纸基微流控分析装置”(microfluidic paper-basedanalyticaldevices,PADs)的概念之后，纸基以其疏松多空、稳定性好、制作方便、成本低廉、体积小、生物兼容性好、功能性强、后处理简单等优点越来越引起微流控研究领域的重视。而纸基同样也是核酸微流控分析中的良好载体。
CN201210193723.9公开了一种基于滤纸的生物大分子提取装置，整个装置需要附加体积较大的驱动设备，并且可控性低，便携性和现场实用性上较差，其富集原理的驱动方式采用的是载样液体流动，遇纸基进行过滤浓缩，因此需要外加流体注射泵，并且由于微流控芯片内流体流型的原因，驱动微泵装置控制能力的滞后性，导致流体内样本可控性不高。
本发明利用纸基芯片的优良特性，结合可变电场的多模式调控方法，研制成本低廉、体积微小、萃取效率高的纸基核酸电固相萃取装置与方法。本发明对实现基于纸基的核酸微全分析系统，实现核酸分析装置的小型化具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种基于纸基的DNA电固相萃取方法与装置。
一种基于纸基的DNA电固相萃取装置包括纸基核酸电固相萃取芯片、升压控制模块，所述的纸基核酸电固相萃取芯片主要由上层基片、下层基片以及夹持在所述上层基片流体通道内的纸基组成，所述上层基片、下层基片采用上下层键合式结构；上层基片设有两个储液池，一个流体通道，两储液池通过流体通道相连接；萃取芯片下层基片上表面设有至少包含三个电极的多电极结构，所述多电极结构包含的至少三个电极为位于低电势储液池下方的第一电极、位于高电势储液池下方的第二电极，和位于纸基下方的第三电极；所述的升压控制模块与萃取芯片下层基片上表面的电极相连。
所述的储液池与流体通道为微流体管道尺寸为毫米级别，流体通道内的纸基为多孔纤维材料，其形状与大小应与流体通道相适配，流体通道内纸基需要通过化学修饰形成功能化区域。
所述功能化区域的化学修饰方法为：在流体通道内选择一处靠近低电势储液池的区域作为特定区域，在特定区域滴加离子选择性试剂，烘干，形成功能化区域；所述的功能化区域的长度为流体通道长度的1/10；所述的功能化区域位于纸基上、第三电极的上方。
所述的上层基片和下层基片选材为涤纶树脂、丙烯酸类树酯或有机硅胶。
所述的多电极结构为采用丝网印刷、溅射剥离、喷墨打印纳米导电材料在下层基片上加工形成。
所述的纸基核酸电固相萃取装置还包括移动终端，所述的移动终端与升压控制模块均设有无线通信模块，并通过所述的无线通信模块进行通信。
所述的升压控制模块包括电源、升压模块和单片机，提供电压输出。
本发明还公开了一种所述装置的纸基核酸电固相萃取方法，所述的方法是指利用本发明装置进行多电极结构的电压的调控，通过变化的电压产生变化的电场，从而驱动核酸的富集与脱附，完成复杂体系下核酸萃取过程，包括如下步骤：
1)选择所述功能化区域和高电势储液池之间的流体通道作为进样区域；在所述进样区域滴加进样样品；
2)设置升压控制模块，在第一电极与第二电极之间施加10-50V电压，第二电极电势高于第一电极，使得装置进入预导通模式，持续1-2min；
3)设置升压控制模块，将第一电极与第二电极之间电压提高至150-300V，第二电极电势高于第一电极，3-5min后进行程序式变压，降低第一电极与第二电极之间电压至100-120V，5min后完成核酸富集过程；
4)设置升压控制模块,在第三电极与第二电极之间施加50-60V电压，第二电极电势高于第三电极，驱动核酸富集后的核酸导入其中一个储液池或下一级反应芯片，最终完成电固相萃取过程。
所述的流体通道下方还设置有用于形成电场梯度的若干电极，所述的电极与升压控制模块相连。
与现有技术相比，本发明所具有的有益效果是：
(1)整体装置小，使用简单，成本低，原因：采用电驱动无需外加微型泵，而电压装置硬件相比注射泵体积小很多，可以做到随时随地现场分析，并且分析芯片采用纸基微流控芯片，纸基成本低廉，芯片可以量产。
(2)萃取速度快，原因：因为本发明的方法采用电驱动，并且修饰了离子选择性试剂，会引起电场叠加，从而提高萃取速度。
(3)对于智能终端有良好的适配性，原因：通过蓝牙与智能终端进行通讯，接受分析萃取指令，升压模块进行相关电压的程序化调控。从而可控性高，模式灵活，可变化多种萃取驱动方式。
附图说明
图1为本发明实施例中基于纸基的DNA电固相萃取装置中纸基核酸电固相萃取芯片的结构示意图；
图2为图1中的A-A’截面剖视图；
图3为实施例中基于纸基的DNA电固相萃取装置中纸基核酸电固相萃取芯片的分解示意图；
图4为基于纸基的DNA电固相萃取方法示意图；
图5为升压装置硬件结构示意图；
图6为本发明实施例的PCR结果图。其中A为实施例1，B为实施例2。
具体实施方式
以下实施例便于跟好的理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
以下两个实施例以三电极体系为例：
如图1-3所示一种基于纸基的DNA电固相萃取装置包括纸基核酸电固相萃取芯片、升压控制模块，所述的纸基核酸电固相萃取芯片主要由上层基片1、下层基片2以及夹持在所述上层基片流体通道5内的纸基3组成，所述上层基片1、下层基片2采用上下层键合式结构；上层基片设有两个储液池，一个流体通道，两储液池通过流体通道相连接；萃取芯片下层基片上表面设有至少包含三个电极的多电极结构，所述多电极结构包含的至少三个电极为位于低电势储液池4下方的第一电极10、位于高电势储液池6下方的第二电极8，和位于纸基3的下方的第三电极9；所述的升压控制模块与萃取芯片下层基片上表面的电极相连。
所述的储液池与流体通道为微流体管道尺寸为毫米级别，流体通道内的纸基为多孔纤维材料，其形状与大小应与流体通道相适配，流体通道内纸基需要通过化学修饰形成功能化区域7。
所述功能化区域7的化学修饰方法为：在流体通道内选择一处靠近低电势储液池4的区域作为特定区域，在特定区域滴加离子选择性试剂，烘干，形成功能化区域7；所述的功能化区域的长度为流体通道长度的1/10；所述的功能化区域7修饰于纸基3上、第三电极9的上方。
储液池为圆形直径为7毫米；所述流体通道为微流体管道宽度均为2毫米，深度均为1毫米。上层基片可以选用PET材料，下层基片可以选PMMA材料，并在上面制备三电极体系，基片采用微流控芯片加工技术加工。上下层基片的键合方式通过粘合剂粘合。三电极体系采用丝网印刷在下层基片上进行加工。
升压装置由arduino单片机、HC-05蓝牙模块、三个MM微型升压模块(该模块可提供高达300V的电压输出)、微型12V开关电源电源、智能移动智能移动手机组成，智能移动智能移动手机作为控制上位机；
实施例(1)
如图4和5所示，首先使用浓度为10-7mol/L的未染色DNA进行试验，每次试验取10μL的DNA样品母液，加入1mL的TBE试剂，配置成待萃取样品液(稀释100倍)，待用。
用10μL规格移液枪取5μL全氟化介质分离试剂滴在纸基特定区域，等待20秒后全氟化介质分离完全被纸基吸收，并利用烘箱进行加热，加热温度100℃，使纸基纤维内部多孔通道形成具有离子选择性透过能力的表面。在储液池中滴加适量TBE溶液，浸润纸基，静止装置1-2min。
将DNA样本溶液滴在条带特定区域右侧位置，设置升压控制模块，在第一电极与第二电极之间施加10-50V电压，第二电极电势高于第一电极，使得装置进入预导通模式，持续1-2min；设置升压控制模块，将第一电极与第二电极之间电压提高至150-300V，第二电极电势高于第一电极，3-5min后进行程序式变压，适当降低第一电极与第二电极之间电压至100-120V，5min后完成核酸富集过程；设置升压控制模块,在第三电极与第二电极之间电压至50-60V电压，第二电极电势高于第三电极，驱动核酸富集后的核酸导入其中一个储液池或下一级反应芯片，最终完成电固相萃取过程。
为了表征固相萃取结果，采用等温扩增实验进行验证：
在高电势储液池中用移液枪取萃取后的溶液0.5μL，加超纯水配置成50μL溶液。
配置等温扩增反应样本：每个反应混合液样本的总体积为25μL，包括0.125μL的SYBR(荧光染料)溶液、4μL的MgCl2、1μLdNTPs溶液、2.5μL的NEBuffer溶液、0.6μLNt.BstNBL、0.1μLBst2.0WS以及四种引物(FP、RP-00、DA-F、DA-R)各0.25μL，最后加入2.5μL带扩增，其余组分为水。配置好后放入PCR扩增仪。
等待扩增结束，获得扩增数据，将数据制作成图表，进行分析对比。
根据得到的数据，绘制曲线得到说明书附图6(A)的曲线，从曲线中可以看出试验中TBE样品萃取后的扩增曲线在20分钟左右出现拐点，将此曲线所对应的拐点时间与标准浓度溶液扩增曲线的拐点时间相对比，该曲线拐点时间与标准扩增曲线中的10-10mol/L拐点时间接近，由于用PCR扩增的溶液是将萃取后的溶液，加超纯水配置成50μL溶液的样品，所以说明萃取后高电势储液池的DNA浓度在10-8mol/L左右。所配置的待萃取样品中DNA浓度为10-9mol/L，萃取后约为10-8mol/L左右，达到了萃取提纯的预期目标。
实施例(2)
人体体液环境下的萃取实验
首先将稀释了DNA样本溶液稀释，稀释后得到浓度为10-11mol/L的母液；
取少量人体体液；
实验时用于萃取的溶液是超纯水与10μL10-11mol/LDNA母液配置成的1mL溶液(样品A)和稀释后的人体体液与10μL10-11mol/L母液配置成的1mL溶液(样品B)，
用10μL规格移液枪取5μL全氟化介质分离试剂滴在纸基特定区域，等待20秒后全氟化介质分离完全被纸基吸收，并利用烘箱进行加热，加热温度100℃，使纸基纤维内部多孔通道形成具有离子选择性透过能力的表面。在储液池中滴加适量TBE溶液，浸润纸基，静止装置1-2min。
将样品A溶液滴在条带特定区域右侧位置，设置升压控制模块，在第一电极与第二电极之间施加10-50V电压，第二电极电势高于第一电极，使得装置进入预导通模式，持续1-2min；设置升压控制模块，将第一电极与第二电极之间电压提高至150-300V，第二电极电势高于第一电极，3-5min后进行程序式变压，适当降低第一电极与第二电极之间电压至100-120V，5min后完成核酸富集过程；设置升压控制模块,在第三电极与第二电极之间电压至50-60V电压，第二电极电势高于第三电极，驱动核酸富集后的核酸导入其中一个储液池或下一级反应芯片，最终完成电固相萃取过程。
为了表征固相萃取结果，采用等温扩增实验进行验证：
在高电势储液池中用移液枪取萃取后的溶液50μL溶液。
配置等温扩增反应样本：每个反应混合液样本的总体积为25μL，包括0.125μL的SYBR(荧光染料)溶液、4μL的MgCl2、1μLdNTPs溶液、2.5μL的NEBuffer溶液、0.6μLNt.BstNBL、0.1μLBst2.0WS以及四种引物(FP、RP-00、DA-F、DA-R)各0.25μL，最后加入2.5μL带扩增，其余组分为水。配置好后放入PCR扩增仪。
然后对样品B进行同样的操作，并进行等温扩增表征。
得到如说明书附图6(B)的曲线，将此曲线所对应的拐点时间与标准浓度溶液扩增曲线的拐点时间相对比，可以得出体液环境下的萃取后的DNA浓度与在超纯水中的DNA浓度均在10-12mol/L左右。将1mL浓度为10-13mol/L的DNA复杂体系溶液电固相萃取成了50μL浓度10-12mol/L浓缩液，达到了萃取的效果。
实施例(3)
实施例目的：针对食源性致病菌单增李斯特菌的毒理性片段进行萃取并扩增检测。
首先配制样本溶液：针对被单增李斯特菌污染的样品。配置样本溶液。用10μL规格移液枪取5μL全氟化介质分离试剂滴在纸基特定区域7，等待20秒后全氟化介质分离完全被纸基吸收，并利用烘箱进行加热，加热温度100℃，使纸基纤维内部多孔通道形成具有离子选择性透过能力的表面。在储液池中滴加适量TBE溶液，浸润纸基，静止装置1-2min。
将DNA样本溶液滴在条带特定区域右侧位置，设置升压控制模块，在第一电极与第二电极之间施加10-50V电压，第二电极电势高于第一电极，使得装置进入预导通模式，持续1-2min；设置升压控制模块，将第一电极与第二电极之间电压提高至150-300V，第二电极电势高于第一电极，3-5min后进行程序式变压，适当降低第一电极与第二电极之间电压至100-120V，5min后完成核酸富集过程；设置升压控制模块,在第三电极与第二电极之间电压至50-60V电压，第二电极电势高于第三电极，驱动核酸富集后的核酸导入其中一个储液池或下一级反应芯片，最终完成电固相萃取过程。
在下一级反应区域中，采用等温扩增的方法，针对单增李斯特菌的毒理性片段，选择适当引物，配置扩增溶液，可以针对单增李斯特菌的毒理性片段进行特异性扩增。
最终的扩增产物经过荧光定量检测，与标准浓度溶液进行比对，发现被测食源性致病菌毒理性片段浓度可以提升到食源性致病菌毒理性片段定性检测方法的检测限。证明利用本发明的装置与方法，可大大提升被测食源性致病菌毒理性片段的浓度，萃取后的单增李斯特菌的毒理性片段可以采用现场筛查级定性检测方法进行定性检测，说明本发明可较好的应用在食品安全检测行业。
Claims (8)
1.一种基于纸基的DNA电固相萃取装置，其特征在于:包括纸基核酸电固相萃取芯片、升压控制模块，所述的纸基核酸电固相萃取芯片主要由上层基片、下层基片以及夹持在所述上层基片流体通道内的纸基组成，所述上层基片、下层基片采用上下层键合式结构；上层基片设有两个储液池，一个流体通道，两储液池通过流体通道相连接；萃取芯片下层基片上表面设有至少包含三个电极的多电极结构，所述多电极结构包含的至少三个电极为位于低电势储液池下方的第一电极、位于高电势储液池下方的第二电极，和位于纸基下方的第三电极；所述的升压控制模块与萃取芯片下层基片上表面的电极相连；所述的储液池与流体通道为微流体管道尺寸为毫米级别，流体通道内的纸基为多孔纤维材料，其形状与大小应与流体通道相适配，流体通道内纸基需要通过化学修饰形成功能化区域；所述功能化区域的化学修饰方法为：在流体通道内选择一处靠近低电势储液池的区域作为特定区域，在特定区域滴加离子选择性试剂，烘干，形成具有离子选择性透过能力的表面作为功能化区域；所述的功能化区域的长度为流体通道长度的1/10；所述的功能化区域位于纸基上、第三电极的上方。
2.如权利要求1所述的基于纸基的DNA电固相萃取装置，其特征在于：所述的离子选择性试剂为全氟化介质分离试剂。
3.如权利要求1所述的基于纸基的DNA电固相萃取装置，其特征在于:所述的上层基片和下层基片选材为涤纶树脂、丙烯酸类树酯或有机硅胶。
4.如权利要求1所述的基于纸基的DNA电固相萃取装置，其特征在于所述的多电极结构为采用丝网印刷、溅射剥离、喷墨打印纳米导电材料在下层基片上加工形成。
5.如权利要求1所述的基于纸基的DNA电固相萃取装置，其特征在于还包括移动终端，所述的移动终端与升压控制模块均设有无线通信模块，并通过所述的无线通信模块进行通信。
6.如权利要求1所述的基于纸基的DNA电固相萃取装置，其特征在于:所述的升压控制模块包括电源、升压模块和单片机，提供电压输出。
7.一种如权利要求1所述装置的基于纸基的DNA电固相萃取方法，其特征在于包括如下步骤：
1）选择所述功能化区域和高电势储液池之间的流体通道作为进样区域；在所述进样区域滴加进样样品；
2）设置升压控制模块，在第一电极与第二电极之间施加10-50V电压，第二电极电势高于第一电极，使得装置进入预导通模式，持续1-2min；
3）设置升压控制模块，将第一电极与第二电极之间电压提高至150-300V，第二电极电势高于第一电极，3-5min后进行程序式变压，降低第一电极与第二电极之间电压至100-120V，5min后完成核酸富集过程；
4）设置升压控制模块,在第三电极与第二电极之间施加50-60V电压，第二电极电势高于第三电极，驱动核酸富集后的核酸导入其中一个储液池或下一级反应芯片，最终完成电固相萃取过程。
8.如权利要求7所述方法，其特征在于所述的流体通道下方还设置有用于形成电场梯度的若干电极，所述的电极与升压控制模块相连。
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