CN101024851A - 基于梯状回收的基因拷贝数鉴定和各拷贝序列获得的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于梯状回收的基因拷贝数鉴定和各拷贝序列获得的方法，克服了目前判断基因拷贝数所采用的Southern杂交、竞争性PCR、实时定量PCR均不能确定每个拷贝的核苷酸序列的缺陷。其技术方案是：基因组DNA充分酶切→酶切产物电泳→梯状回收→PCR扩增→判断基因拷贝数→PCR产物克隆测序→获得每个拷贝的核苷酸序列。本发明可成功的判断脱水素基因在无核白葡萄中的拷贝数，结果与Southern杂交结果相同，并且获得了不同拷贝脱水素基因的部分核苷酸序列。可用于判断内源和外源基因的拷贝数，是以较低的成本判断基因拷贝数以及获得每个拷贝的核苷酸序列。其原理及操作简单，成本低廉，具有广阔的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于梯状回收的基因拷贝数鉴定和各拷贝序列获得的方法，属于生物工程领域。
背景技术
目前判断基因拷贝数的方法有Southern杂交、竞争性PCR、实时定量PCR，尤以Southern杂交和实时定量PCR使用广泛。对于Southern杂交，该方法通过基因组酶切、电泳、转膜、杂交等步骤，可判断拷贝数；对于竞争性PCR，该方法通过同时扩增目标基因和参考基因、在琼脂糖上比较两者相对亮度，可判断基因拷贝数；对于实时定量PCR，该方法通过监测PCR过程中产物的实时变化，可判断基因拷贝数。这三种方法仅能判断基因拷贝数，但不能确定每个拷贝的核苷酸序列。同时，对于Southern杂交和实时定量PCR，实施起来复杂且成本较高。
发明内容
本发明的目的是公开一种基于梯状回收的基因拷贝数鉴定和各拷贝序列获得的方法，是以较低的成本判断基因拷贝数以及获得每个拷贝的核苷酸序列。
本发明的技术方案是：
基因组DNA充分酶切→酶切产物电泳→梯状回收→PCR扩增→判断基因拷贝数→PCR产物克隆测序→获得每个拷贝的核苷酸序列。
本发明可成功的判断脱水素基因在无核白葡萄中的拷贝数，结果与Southern杂交结果相同，并且获得了不同拷贝脱水素基因的部分核苷酸序列。
具体实施方式
本发明的具体操作步骤如下：
a.基因组DNA充分酶切
a.1将10-20μg基因组DNA用限制性内切酶充分酶切；
b.酶切产物电泳
b.1将酶切产物在琼脂糖凝胶上电泳
b.1.1使用标准的TAE电泳缓冲液
b.1.2琼脂糖浓度为0.8％-1.0％
b.1.3电泳电压为1.0V/cm-1.5V/cm
b.1.4电泳时间为10h-14h
b.2不同拷贝将在泳道上被分开；
c.梯状回收
c.1将胶条切下，其宽度比点样孔左右各宽1mm-2mm
c.2将胶条沿泳道垂直方向切成宽度为2.0mm-2.5mm的胶块
c.3分别回收每个胶块里的酶切DNA
c.4这样不同的拷贝就被回收进不同的样品中
c.5胶条切割后呈梯状；
d.PCR扩增
d.1用基因特异性引物对所回收样品PCR扩增；
e.判断基因拷贝数
e.1将PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳
e.1.1使用标准的TAE电泳缓冲液
e.1.2琼脂糖浓度为1.0％-1.5％
e.1.3电泳电压为4V/cm-6V/cm
e.2待电泳合适时用凝胶成像仪照相
e.3含有目标基因的样品PCR将呈阳性
e.4基此便可判断拷贝数量；
f.PCR产物克隆测序；
g.获得每个拷贝的核苷酸序列。
有时不同拷贝因为电泳后彼此距离较近以至于不能通过梯状回收将不同拷贝回收到不同的胶块中，可通过以下措施尝试解决：在琼脂糖凝胶上电泳分离更长的时间；更换限制性内切酶；减少PCR循环数。
使用本发明需注意两点：一是在连续切胶时务必防止胶块之间的交叉污染，在切胶宽度为2.5mm时，每个拷贝可能被回收进连续的2-3块胶里，故PCR时若连续的2-3个样品均为阳性时，应视为一个拷贝；二是用于PCR的引物应该位于所检测基因的保守区域，特别是引物3’端所对应的区域应是100％保守。
本发明可用于判断内源和外源基因的拷贝数，其原理及操作简单，成本低廉，具有广阔的开发应用前景。
Claims (2)
1.基于梯状回收的基因拷贝数鉴定和各拷贝序列获得的方法，其特征是采取如下技术方案：基因组DNA充分酶切→酶切产物电泳→梯状回收→PCR扩增→判断基因拷贝数→PCR产物克隆测序→获得每个拷贝的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的基于梯状回收的基因拷贝数鉴定和各拷贝序列获得的方法，其特征是具体操作步骤如下：
2.a基因组DNA充分酶切
2.a.1将10-20μg基因组DNA用限制性内切酶充分酶切；
2.b酶切产物电泳
2.b.1将酶切产物在琼脂糖凝胶上电泳
2.b.1.1使用标准的TAE电泳缓冲液
2.b.1.2琼脂糖浓度为0.8％-1.0％
2.b.1.3电泳电压为1.0V/cm-1.5V/cm
2.b.1.4电泳时间为10h-14h
2.b.2不同拷贝将在泳道上被分开；
2.c梯状回收
2.c.1将胶条切下，其宽度比点样孔左右各宽1mm-2mm
2.c.2将胶条沿泳道垂直方向切成宽度为2.0mm-2.5mm的胶块
2.c.3分别回收每个胶块里的酶切DNA
2.c.4这样不同的拷贝就被回收进不同的样品中
2.c.5胶条切割后呈梯状；
2.d PCR扩增
2.d.1用基因特异性引物对所回收样品PCR扩增；
2.e判断基因拷贝数
2.e.1将PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳
2.e.1.1使用标准的TAE电泳缓冲液
2.e.1.2琼脂糖浓度为1.0％-1.5％
2.e.1.3电泳电压为4V/cm-6V/cm
2.e.2待电泳合适时用凝胶成像仪照相
2.e.3含有目标基因的样品PCR将呈阳性
2.e.4基此便可判断拷贝数量；
2.f PCR产物克隆测序；
2.g获得每个拷贝的核苷酸序列。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105917036A (zh) * | 2013-08-19 | 2016-08-31 | 雅培分子公司 | 下一代测序文库 |
| CN110506203A (zh) * | 2017-04-07 | 2019-11-26 | 塞奇科学股份有限公司 | 用于通过使用集成电泳dna纯化来检测遗传结构变异的系统和方法 |
| US11542495B2 (en) | 2015-11-20 | 2023-01-03 | Sage Science, Inc. | Preparative electrophoretic method for targeted purification of genomic DNA fragments |
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2007
- 2007-03-29 CN CN 200710017579 patent/CN101024851A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105917036A (zh) * | 2013-08-19 | 2016-08-31 | 雅培分子公司 | 下一代测序文库 |
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| US11867661B2 (en) | 2017-04-07 | 2024-01-09 | Sage Science, Inc. | Systems and methods for detection of genetic structural variation using integrated electrophoretic DNA purification |
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