CN104005090B - 低质量样本dna高通量测序文库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低质量样本DNA的高通量测序文库的构建方法,该构建方法包括:对低质量样本DNA进行电泳分离,无需经过纯化处理的步骤直接获得样本DNA;对无需经过纯化处理的步骤直接获得的上述样本DNA直接进行片段化文库构建,获得上述高通量测序文库。本发明的上述构建方法通过电泳分离后对样本DNA直接进行片段化文库构建的步骤,不仅实现了纯化样本DNA的目的,还减少了样本DNA的损失,提高了样本DNA的得率,使低质量的样本DNA的量能够满足构建高通量测序文库的需求,而且使构建的高通量测序文库有效地避免了蛋白、细菌基因组DNA或其他杂质DNA的污染,进而避免了对后续序列组装的影响。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体而言,涉及一种低质量样本DNA高通量测序文库的构建方法。
背景技术
随着高通量测序技术的发展,越来越多的生命科学领域的研究都涉及到测序文库构建以及高通量测序。测序文库是含有某种生物体全部基因组DNA的随机片段的重组DNA克隆群体,是进行全基因组测序、构建物理图谱、染色体步移、基因筛选及基因图位克隆的基础,为基因组学的研究提供了强有力的技术平台。
测序文库质量的高低决定了测序文库作用的大小,而测序文库质量的高低直接取决于样本DNA的质量,即高通量测序文库对样本DNA的纯度和量都有一定的要求。对于有杂质的样本DNA,通常采用电泳凝胶分离,对带有目标片段的DNA凝胶进行割取,然后再把目标DNA凝胶块进行溶化后,经电透析或其他手段进行纯化,从而得到较纯的样本DNA。通过这些常规方法提纯得到的DNA的量至少要达到1ug时,才能满足高通量测序文库构建的要求。
然而,对于一些混有其他DNA杂质的样本DNA、含有蛋白杂质的样本DNA或者容易受宿主基因组DNA污染的样本DNA如细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)DNA而言,往往由于难以提纯或提纯步骤过于复杂致使提纯后的样本DNA量低于1ug而无法完成高通量测序文库的构建,尤其是量少而又比较珍贵的样本DNA。
因此,对于这类含有杂质而经纯化分离后又因总量低于1ug而难以进行测序文库构建的低质量样本DNA,仍需要开发一种新的方法来进行高通量测序文库的构建。
发明内容
本发明旨在提供一种低质量样本DNA的高通量测序文库的构建方法,以弥补难以通过现有的构建方法完成一些低质量样本DNA高通量测序文库构建的不足。
为了实现上述目的,根据本发明的一个方面,提供了一种低质量样本DNA的高通量测序文库的构建方法,上述构建方法包括:对上述低质量样本DNA进行电泳分离,无需经过纯化处理的步骤直接获得样本DNA;对无需经过纯化处理的步骤直接获得的上述样本DNA直接进行片段化文库构建,获得上述高通量测序文库。
进一步地,上述低质量样本DNA为细菌人工染色体样本DNA、含蛋白杂质的样本DNA或含其它DNA杂质的样本DNA。
进一步地,上述低质量样本DNA中目标DNA片段长度为15Kb~200Kb的大片段DNA。
进一步地,上述的构建方法中的电泳分离的步骤包括:对上述低质量样本DNA进行电泳分离,得到凝胶块式的样本DNA;对凝胶块式的上述样本DNA进行溶胶处理,得到凝胶液式的样本DNA。
进一步地,上述片段化文库构建的步骤包括:对上述凝胶液式的样本DNA进行片段化处理,得到片段化DNA;对片段化DNA进行末端修复,得到修复DNA;对修复DNA进行接头连接,得到带接头DNA;对上述带接头DNA进行扩增,得到上述高通量测序文库。
进一步地,上述片段化处理的步骤中采用超声破碎的方法对上述样本DNA进行片段化,得到上述片段化DNA。
进一步地,上述片段化处理的步骤中采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对上述样本DNA进行破碎。
进一步地,上述构建方法在获得上述高通量测序文库之后,还包括对高通量测序文库进行上机前质检的步骤,包括:检测高通量测序文库中所携带的样本DNA片段的浓度;当上述样本DNA片段的浓度不小于2nmol/L时,则进行后续步骤。
进一步地,上述上机前质检的步骤还包括:在检测上述高通量测序文库中所携带的样本DNA片段的浓度的步骤后,进一步检测上述高通量测序文库中所携带的样本DNA片段的长度;当上述样本DNA片段的长度在400~600bp时,则进行后续步骤。
进一步地,上述上机前质检的步骤采用安捷伦2100DNA检测仪进行检测和采用实时荧光定量PCR方法进行检测。
应用本发明的技术方案,通过采用电泳分离得到相对干净的样本DNA,然后对所得的具有大片段的样本DNA无需经过纯化步骤直接进行片段化文库构建,从而完成高通量测序文库的构建。本发明的上述构建方法通过对电泳分离后对样本DNA直接进行片段化文库构建的步骤,不仅实现了纯化样本DNA的目的,还减少了样本DNA的损失,提高了样本DNA的得率,使低质量的样本DNA的量能够满足构建高通量测序文库的需求,而且使构建的高通量测序文库有效地避免了蛋白、细菌基因组DNA或其他杂质DNA的污染,进而避免了对后续序列组装的影响。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1示出了本发明实施例的高通量测序文库的构建流程;
图2示出了本发明实施例中含有蛋白、细菌基因组污染的细菌人工染色体样本的电泳图;
图3示出了本发明实施例中使用Covaris S220进行破碎结果的电泳图;
图4示出了本发明实施例中使用安捷伦2100检测所构建文库包含接头的插入片段的大小;
图5示出了本发明实施例中所构建文库GC或AT分离度与GC含量;以及
图6示出了本发明实施例中所构建文库上机检验最终插入片段大小(insert-size)分布图。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
正如背景技术中所提到的,在现有技术中,对那些含有杂质而提纯后DNA量又低于1ug的低质量样本DNA,无法通过现有的方法进行高通量测序文库的构建。为了解决这一技术问题,本发明提供了一种低质量样本DNA高通量测序文库的构建方法,该构建方法包括:步骤S1,对所述低质量样本DNA进行电泳分离,获得样本DNA;步骤S2,对所述样本DNA进行片段化文库构建,获得所述高通量测序文库。
本发明的上述构建方法,通过采用电泳分离得到相对干净的样本DNA,然后对所得的具有大片段的样本DNA无需经过纯化步骤直接进行片段化文库构建,从而完成高通量测序文库的构建。本发明的上述构建方法通过对电泳分离后对样本DNA直接进行片段化文库构建的步骤,不仅实现了纯化样本DNA的目的,还减少了样本DNA的损失,提高了样本DNA的得率,使低质量的样本DNA的量能够满足构建高通量测序文库的需求,而且使构建的高通量测序文库有效地避免了蛋白、细菌基因组DNA或其他杂质DNA的污染,进而避免了对后续序列组装的影响。
低质量样本DNA包括细菌人工染色体样本DNA、含蛋白杂质的样本DNA、含其它DNA杂质的样本DNA。以细菌人工染色体样本DNA为例,目前,对于细菌人工染色体样本DNA样本进行提取的常用的方法有碱裂解法和样本提取试剂盒,比如Qiagen公司的大构建载体试剂盒(large-construct kit)。但是这些方法都存在一个共同的缺点:很难避免宿主中细菌基因组、蛋白等杂质的污染。蛋白等杂质污染对后续文库构建以及数据产出有很大的影响,而细菌基因组的污染会严重影响后续细菌人工染色体序列的组装效果。
想要得到相对纯净的细菌人工染色体样本DNA,主要有两种思路:一、细菌基因组的清除;二、细菌人工染色体样本区域的回收。目前对细菌基因组污染的处理比较好的方法就是使用线性DNA消化酶,但是这样处理一方面会导致细菌人工染色体样本的损失,另一方面就是消化效果并不好,导致大量的细菌基因组的残留。对于细菌人工染色体样本区域的回收,目前最好的办法就是利用电泳切胶加电透析的方式,但是这种方法操作繁琐,回收效率低,成本高等缺点,而对于高通量文库构建需要大量的DNA样本,采用这种方法进行回收根本不适合高通量文库的大规模构建。因此,本发明所提供的高通量测序文库的构建方法,尤其适合上述的低质量样本DNA的高通量测序文库的构建。
上述低质量样本DNA,无论DNA长度大小均可采用本发明的上述构建方法。当DNA长度较小,比如低于500bp时,无需破碎处理即可直接进入建库流程。而当上述低质量样本DNA的长度为15kb~200Kb的大片段DNA时,更适合采用本发明的上述构建方法进行高通量测序文库构建,这样把极难回收的大片段转化成了很容易回收的短片段进行回收,回收效率高且简化了文库构建步骤。
在本发明一种优选的实施例中,上述电泳分离的步骤包括:对低质量样本DNA进行电泳分离,得到凝胶块式的样本DNA;对凝胶块式的样本DNA进行溶胶处理,得到凝胶液式的样本DNA。先通过凝胶电泳的方法对目标DNA片段进行分离,对分离在凝胶上的目标DNA片段进行割胶,然后利用自制的或市售的DNA回收试剂盒中的溶胶液进行溶胶,使得含有目标片段的样本DNA从固体凝胶中释放出来,以利于后续对该样本DNA的片段化。
在上述实施例中,在得到含有目标片段的凝胶液样本DNA后,直接取凝胶液中的DNA进行后续片段化文库构建的步骤。片段化文库构建的步骤按照本领域常用的文库构建方法即可。在本发明一种优选的实施例中,上述片段化文库构建的步骤包括:对凝胶液式的样本DNA进行片段化处理,得到片段化DNA;对片段化DNA进行末端修复,得到修复DNA;对修复DNA进行接头连接,得到带接头DNA;对带接头DNA进行扩增,即可得到高通量测序文库。上述末端修复和接头连接步骤中利用市售的相关文库构建试剂盒,如Illumina公司的TrueseqDNA文库构建试剂盒中的试剂或接头即可。
上述片段化文库构建的步骤中通过对凝胶液式的样本DNA进行破碎,不仅完成了建库流程中对大片段DNA的片段化,而且在对这些片段化的小片段进行回收纯化的过程中,同时实现了对样本DNA的回收纯化。这种处理方式大大减低了样本DNA的损失,提高了样本DNA高通量测序文库的质量。同时也简化了建库流程,缩短了建库时间。
破碎通常采用物理破碎的方式将大片段DNA破碎成200~600bp大小,最常用的物理破碎方式是超声破碎。在本发明中,优选采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220进行破碎。自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220具有对DNA浓度测量更精确且操作简单方便的优点。
在高通量测序领域,通常在测序文库构建好之后,还需要对高通量测序文库进行质检的步骤。质检的内容包括带有样本DNA小片段的浓度大小以及插入片段的大小。首先对文库中带有样本DNA小片段的浓度大小进行检测,当文库中样本DNA小片段的浓度过低时,比如,对于Hiseq2000的测序平台而言,文库中样本DNA小片段的浓度通常需要达到2nmol/L,低于2nmol/L时,则无法进行后续的高通量测序。在浓度达到至少2nmol/L时,进一步检测文库中样本DNA小片段的大小,当文库中样本DNA的插入片段大小过大或过小,都无法达到高通量测序的目的。对于Hiseq2000的测序平台而言,文库中样本DNA的插入片段大小通常小于600bp。大于600bp时,因Hiseq的读长较短,无法读取文库中的样本DNA小片段的全长,进而导致后续拼接过程难度加大或无法完成拼接。而小于200bp时又使得重复测序的片段增多,造成数据的浪费。
在对带有样本DNA小片段的文库进行检测时,最常用的是安捷伦2100。安捷伦2100不仅能够很好地显示待检测样品的浓度的高低,而且还可以直观地显示样品插入片段大小的分布范围,是目前高通量测序领域常用的检测仪器。同时对待检测文库进行实时荧光定量PCR进行检测,能够更准确地体现各文库的浓度值,对构建好的高通量测序文库能够进行多少次测序实验具有更准确的指导意义。
能够通过上述质检的高通量测序文库,通常质量都比较高,对得到的后续的测序数据的质量也有较高的保证。若再取少量高通量测序文库进行上机质检,得到的测序数据更能直接反映出所构建的文库的质量。
下面将结合具体的实施例来说明本发明的有益效果。
需要说明的是,下列实施例是按照图1所示高通量测序文库的构建流程进行构建的。下列实施例所提供的高通量测序文库的构建方法中如无特别说明均为常规方法,所用接头序列来自于Illumina公司的IlluminaTruseq文库构建试剂盒,所用试剂如无特别说明均为NEB公司的产品,所用水为超纯水。
下列实施例的样品为携带酵母基因组片段的细菌人工染色体样本DNA,总体积15ul,经检测OD260/OD280值为1.23,说明样本DNA中有蛋白质污染;OD260值为60ug/ml,可算出样本DNA的总量为0.9ug,若再经常规的方法纯化后,得到的样本DNA的总量会远低于1ug,无法按照常规的纯化后再片段化的高通量测序文库构建方法进行文库构建。
实验一、细菌人工染色体(BAC)DNA样本的破碎和回收
1)样品检测
在0.8%琼脂糖凝胶中,120v的电压下,电泳1小时,检测样品质量,确定目的条带位置以及污染的细菌基因组位置,如图2所示,其中,最左侧泳道为trans 2k plus(全式金)Marker,从上到下片段大小依次为5kbp、3kbp、2kbp、1kbp、750bp、500bp、250bp、100bp;最右侧泳道为Lambda细菌DNA被HindIII酶切后的片段,从上到下片段大小依次为:23k、9.5k、6.5k、2.3k、2k,中间泳道为酵母细菌人工染色体样本DNA。从图2上可以看出,与右侧对照大小接近的23kb的条带为细菌基因组污染,中间最亮的条带为细菌人工染色体样本,点样孔处为蛋白污染。
2)细菌人工染色体DNA条带凝胶溶解、打断、回收
对步骤1)检测的有基因组污染的样本采用美国的Qubit仪器进行定量,取1μg进行电泳并切取BAC样本对应条带,使用天平进行称重,按1ug对应100ul溶胶液计算,添加3倍胶重量所对应的体积。溶胶液采用Qiagen试剂盒中的QG溶液室温直至胶完全溶解,将溶解的产物加入300μl体系的Covaris管中,补水至300μl。使用Covaris S220设备进行物理破碎至片段大小500bp,片度化结果如图3所示,图3中的100bp DNA Marker(全式金)表示的条带大小分别是1.5kbp、1.2kbp、1kbp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。上述片段化的参数如下:
对片段化产物使用Qiagen试剂盒进行胶回收,最后溶解在30μl的水中。
实验二、破碎产物的末端修复以及添加dATP
1)将实验一中得到的破碎产物进行末端补平。
末端修复反应体系如下:
反应条件:在30℃条件下孵育30min。
2)对步骤1)的补平产物进行纯化。
将上述产物进行磁珠纯化回收。整个回收过程按照AMPure XP Beads纯化回收操作说明书进行。
3)对步骤2)中的纯化产物进行加dATP。
反应体系如下:
反应条件:充分混匀后37℃孵育30min,然后在75℃热击20min使Klenow exo酶热失活。
实验三、接头的连接
1)向实验二的产物中加入接头(来自于Illumina Truseq),反应体系具体如下:
反应条件是在室温(或16℃)下连接2小时,连接产物在65℃热击20min,使连接酶活性丧失。
2)向步骤1)中的连接产物中加入等体积AMPure XP Beads纯化1次。纯化过程严格按照使用说明书进行。
3)将步骤2)中的纯化回收产物进行Qubit定量,用于下一步PCR反应。
实验四、PCR扩增目的片段
1)将实验三中回收的产物,用Qubit精准定量10ng用于PCR反应,得到的PCR产物,即为所构建的文库。
反应体系如下:
应条件为:先98℃预变性1min;然后98℃10s,60℃30s,72℃30s,共10个循环;最后72℃延伸5min。
2)向步骤1)所得的PCR产物中加入等体积AMPure XP Beads纯化两次。纯化过程严格按照使用说明书进行。
3)将步骤2)中的纯化产物进行Qubit精准定量。
实验五、文库库检
1)将实验四中所得的纯化产物稀释到1ng/ul,取出1ul用于Agilent2100(美国Agilent公司)检测,检测结果如图4所示,构建的文库的总长度在500bp~1000bp之间。另外,再取1ul用于实时荧光定量PCR(QPCR)(Biorad公司)检测,根据检测结果来决定上机浓度。
2)根据步骤1)所得的浓度,将文库稀释到上机要求后(2nmol/L),在Illumina公司的Hiseq2000测序平台进行测序。
实验六、上机结果质控
1)对所建文库的进行GC分离度和GC含量进行评估,如图5所示,所构建的文库中没有无GC或AT分离,GC含量也无过高或过低偏离(可参考彩图5’)。
2)对所建文库的插入片段大小进行评估,如图6所示,结果表明在所构建的文库中,实际插入的片段大小在400bp~600bp之间有明显的主峰,且无杂峰,说明文库中实际插入片段大小与预期的400bp~600bp文库插入片段大小一致。
从以上的描述中,可以看出,上述实施例通过利用本发明提供的高通量测序文库的构建方法,能够有效的避免蛋白、细菌基因组对细菌人工染色体样本文库构建的影响。运用本发明的方法,不仅去除基因组污染,而且成功的构建了细菌人工染色体DNA的测序文库,并成功的运用在Illumina公司的Hiseq2000的测序平台进行测序,在高通量测序建库领域有着广泛的应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种低质量样本DNA的高通量测序文库的构建方法,其特征在于,所述构建方法包括:
对所述低质量样本DNA进行电泳分离,无需经过纯化处理的步骤直接获得样本DNA;所述低质量样本DNA是指含有杂质而提纯后DNA量又低于1μg的样本DNA;
对无需经过纯化处理的步骤直接获得的所述样本DNA直接进行片段化文库构建,获得所述高通量测序文库,
所述电泳分离的步骤包括:
对所述低质量样本DNA进行电泳分离,得到凝胶块式的所述样本DNA;
对所述凝胶块式的所述样本DNA进行溶胶处理,得到凝胶液式的所述样本DNA。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述低质量样本DNA为细菌人工染色体样本DNA、含蛋白杂质的样本DNA或含其它DNA杂质的样本DNA。
3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述低质量样本DNA中目标DNA片段长度为15Kb~200Kb的大片段DNA。
4.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述片段化文库构建的步骤包括:
对所述凝胶液式的所述样本DNA进行片段化处理,得到片段化DNA;
对所述片段化DNA进行末端修复,得到修复DNA;
对所述修复DNA进行接头连接,得到带接头DNA;
对所述带接头DNA进行扩增,得到所述高通量测序文库。
5.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,所述片段化处理的步骤中采用超声破碎的方法对所述样本DNA进行片段化,得到所述片段化DNA。
6.根据权利要求5所述的构建方法,其特征在于,所述片段化处理的步骤中采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对所述样本DNA进行破碎。
7.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述构建方法在获得所述高通量测序文库之后,还包括对所述高通量测序文库进行上机前质检的步骤,所述上机前质检的步骤包括:
检测所述高通量测序文库中所携带的样本DNA片段的浓度;
当所述样本DNA片段的浓度不小于2nmol/L时,则进行后续步骤。
8.根据权利要求7所述的构建方法,其特征在于,所述上机前质检的步骤还包括:
在检测所述高通量测序文库中所携带的样本DNA片段的浓度的步骤后,进一步检测所述高通量测序文库中所携带的样本DNA片段的长度;
当所述样本DNA片段的长度在400~600bp时,则进行后续步骤。
9.根据权利要求7或8所述的构建方法,其特征在于,所述上机前质检的步骤采用安捷伦2100 DNA检测仪进行检测和采用实时荧光定量PCR方法进行检测。
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