JPS62239047A - 核酸塩基配列決定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は核酸の塩基配列決定装置にかがわり、特に、高
分解能で核酸断片を検出するのに好適な核酸塩基配列決
定装置に関する。

〔従来の技術〕

従来、核酸の塩基配列の決定は、「細胞二■二学」誌、
Ｖｏｌ、　ｌ　（１９８２）第７９頁カラ第８７頁、オ
ヨヒ第１９２頁から第２０２頁に記載されているように
、マキサム−ギルバート法、あるいはダイデオキシ法で
ラジオアイソトープラベルされた種々の長さの核酸断片
を調製し、それをゲル電気泳動法で分子量分離した後、
その泳動パターンをオートラジオ′グラフィで可視化し
て読みとることにより行われてきた。ゲル電気泳動の担
体としては、第５図（ａ）。

（ｂ）に示すような、厚さか均一な平板状のポリアクリ
ルアミドゲルが専ら用いられてきた。

シカシ、最近では、ジャーナルオブバイオケミカル　ア
ンドバイオフィジヵルメソッズ、第１０巻、（１９８４
年）、第８３頁から第９０頁（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　、　Ｖｏｌ、　
１０．　（１９８４）、　Ｉ）Ｉ’）　８３−９０　）
に記載されているように、厚さが均一なゲルの代りに、
ゲルの厚さに泳動路の終端、すなわち正極側はど厚くな
るような勾配を付けたゲルを用い、泳動路終端付近で泳
動パターンを圧縮して、同一ゲル内により広い分子量範
囲の核酸断片を展開した例も見られる。第５図（Ｃ）、
（ｄ）にその模様を示す。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記２種類の電気泳動ゲルは、電気泳動終了後にオート
ラジオグラフィでゲル全面の泳動パターンを読み取る方
式（オートラジオグラフィ法）に専ら用いられてきたが
、電気泳動部の泳動路」二に検出部を設け、泳動により
順次検出部に到達した核酸断片を検出して、実時間で泳
動パターンを読み取る方式（実時間直接検出法。第１図
参照）のことは全く考慮されておらず、以下述べるよう
な問題があった。

一般に、ゲル電気泳動では、核酸断片の長さが長くなる
と、−塩基分だけ長さの異なった核酸断片の泳動帯の間
隔が狭くなる。一方、核酸断片を検出するにはβ線のカ
ウント数をある程度以上集める必要があるため、無闇に
スリット幅を狭め、β線を有効に検出できる立体角を小
さくして検出感度を低下させることはできない。従って
、第５図（ａ）　、　（１））に示したような従来の厚
さが均一なゲルを用いた場合は、核酸断片の長さが長く
なると、スリット中に同時に２つ以−にの泳動帯が入る
ようになり、各泳動帯を分離して検出できないという問
題があった（第２図（ａｊ　、　（１１＋参照）。また
、第５図（Ｃ１，（（＋１に示したような、ゲルの厚さ
を泳動路の終端すなわち正極側はど厚くしたゲルでは、
オートラジオグラフィ法を用いる場合には、１枚のゲル
でより多くの塩基配列が決定できるというメリットがあ
るが、実時間直接検出法を用いた場合には、相隣り合っ
た泳動帯の間隔がかえって狭くなり、長い核酸断片を分
離して検出するのがより困難になってしまうという問題
があった。

・　３　・ 本発明の目的は、実時間直接検出法を用いた核酸塩基配
列決定装置であって、検出感度を損うことなく核酸断片
の検出を高分解能化し、より長い核酸断片を分離検出で
きるようにして、一度の電気泳動で決定できる塩基配列
数を増すことのできる装置を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

」二記目的は、検出部において電気泳動パターンを引き
伸ばし、相隣り合った２つの泳動帯の間隔を広げること
によって、達成される。

このため、本発明では、電気泳動担体の電界強度が、検
出部より負極側の部分よりも、検出部で高くなるように
することによって、電気泳動パターンを引き伸ばしてい
る。

また、上記の高い電界強度は、電気泳動担体の泳動路に
直角な断面積を、検出部で小さくすることによって、実
現できる。

〔作用〕

電気泳動ゲルの電気抵抗はゲルの断面積に逆比例する。

また、同一ゲル中では各部で同一の電流・　４　・ が流れるから、ゲル中の電界強度は電気抵抗に比例し、
さらに、泳動速度は電界強度に比例する。

従って、ゲルの断面積が小さいほど電気抵抗、電界強度
が太き（なり、泳動速度か早くなる。そこで、同一ゲル
中の各部でゲルの断面積を変化させてやれば、泳動速度
を制御できるため、各部の泳動パターンを伸縮すること
ができる。

本発明では、泳動路に直角なゲルの断面積を、検出部よ
り負極側の部分に比べて検出部で小さくなるようにして
あり、この部分で電界強度が大きくなり泳動速度が速く
なるので、泳動パターンを引き伸ばすことができ、相隣
り合った２つの泳動帯の間隔を広げることができる。

以上の構成の結果、実際にスリット幅を狭めなくても、
スリット幅は泳動パターンに対して相対的に狭くなり、
検出感度を低下させることな（分解能を高めることがで
きる。

〔実施例〕

以下、本発明の一実施例を図面を用いて説明する。第１
図（ａ）、（ｂ＋に該実施例の装置のそれぞれ縦断面図
および正面図を示す。図において、２枚の電気泳動ｖｉ
ｌａ　＋　１１）の片方あるいは両方には（図は片方の
場合を示す）、核酸断片検出用の窓２と隔壁３およびス
リット４が設けられ、さらにその上に、４種類の核酸塩
基ごとの放射線検出器５ａ〜５ｄが設置されている。２
枚の電気泳動板１ａ、１ｂの間には、電気泳動担体であ
るポリアクリルアミドゲルからなる電気泳動ゲル６が充
填されているか、その厚さを、検出部より負極側の部分
に比べて検出部で薄くして、ゲルの泳動路に直角な断面
積を小さくしである。なお、このような電気泳動ゲルは
、２枚の電気泳動板と、その間隔を決めるスペーサとを
目的の形状に加工し、その間にアクリルアミドモノマー
を注入し、これを重合させることにより作ることができ
る。電気泳動板１ａ　＋　ｌｂの上・下端には、それぞ
れバッファ槽？ａ＋７ｂと、負極８ａおよび正極８ｂが
設置され、また２つの電極の間には直流高圧電源９が接
続されて、垂直型電気泳動装置を構成している。放射線
検出器５ａ〜５ｄの各出力は信号処理装置１ｏに入力し
て処理され。

さらに出力装置１１によって出力されるようになってい
る。

次に、本実施例の動作を説明する。まず、マキサム−ギ
ルバー１・法あるいはグイデオキシ法で調製した３２ｐ
によってラジオアイソトープラベルされた種々の長さの
核酸断片混合物を、ゲル」一端に設けたウェル１２ａ〜
１２ｄに、４種類の核酸塩基ごとに注入する。続いて、
直流高圧電源９により直流電圧（約５０Ｖ／ｃｍ）を負
極８ａと正極８ｂとの間に印加すると、核酸断片は電気
泳動され、分子量分離され、同じ長さの核酸断片は泳動
帯Ｊ３を形成する。そして、短かい核酸断片はど泳動速
度が速いので、短かい核酸断片の泳動帯から順に放射線
検出器５ａ〜５ｄの前に到達し、３２ｐから発せられた
β線が検出器により検出される。相隣り合った泳動帯は
、スリット４により分離して検出される。

検出器から出力される信号は信号処理装置１０に送られ
、４種類の塩基のうち、どの塩基に対応する検出器から
の信号であるかを加味して処理され、電気泳動パターン
が読み取られる。このように、・　７　・ 本実施例の装置では、電気泳動中に実時間で、写真フィ
ルムなどを使うことなく、直接に電気泳動パターンを読
み取ることができ、塩基配列を決定することができる。

ところで、前述のように、検出される核酸断片の長さが
長くなると、相隣り合った泳動帯、すなわちｌ塩基分だ
け長さが異なった核酸断片のっくる泳動帯同志の間隔は
狭くなるという性質がある。

一方、核酸断片を検出するにはβ線のカウント数をある
程度以上集める必要があるため、無闇にスリット幅を狭
めて、β線を有効に検出できる立体角を小さくすること
はできない。従って、従来の厚さが均一なゲルを用いた
場合、検出される核酸断片の長さが１００〜１５０塩基
長程度になると、スリットの前のゲル中に同時に２つ以
」二の泳動帯が入るようになり、各泳動帯を分離して検
出できな（なってしまうという問題があった。（第２図
（ａ）。

（ｂ）参照）そこで、本実施例では、ゲルの厚さを検出
部より負極側の部分に比べて検出部で薄くし、具体的に
はウェル部力月、０叫であるのに対し検出・　８　・ 部を０．５　ｒｒａｎとして、泳動路１４に直角なゲル
の断面積を小さくしである。その結果、検出部でゲルの
電気抵抗が大きくなるため、一定の電流が流れている状
態では電界強度が増し、泳動速度が速くなって、泳動パ
ターンが引き伸ばされる。従って、実際にスリット幅を
狭めることなく、スリット幅を泳動パターンに対して相
対的に狭くできるため、検出感度を損なわずに分解能を
」二げることかできる（第２図（Ｃ）、（ｄｌ参照）。

なお、ゲルの形状としては、第１図に示したもの以外に
、例えば第３図（ａ）〜（Ｃ）に示したものでも、同様
の効果が得られる。特に検出部よりも泳動路の正極側の
ゲルの形状は、」１記の効果に直接影響を及ぼさない。

次に、本発明のもう−っの実施例を説明する。

第４図（ａ）、（ｂｌに該実施例の装置のそれぞれ縦断
面図および正面図を示す。図において、ガラス管１５に
は、その一部に管径が細い部分が設けられている。また
、この部分のガラスの肉厚は３２ｐからのβ線が十分透
過できるように薄くして、ここを検出窓として用いる。

このガラス管１５は４種類の核酸塩基ごとに設けられ、
」二記検出窓となる部分の周囲には、それぞれリング状
のスリット４と放射線検出器５ａ〜５ｄが配されている
。それぞれのガラス管１５の内部には、電気泳動ゲル６
となるポリアクリルアミドゲルが充填されているが、ガ
ラス管１５の管径が、検出部より負極側の部分（内径３
ｍｍ）に比べて検出部で細い（内径２咽）ため、検出部
では泳動路１４に直角なゲルの断面積が小さくなってい
る。ガラス管１５の上端および下端には、それぞれバッ
ファ槽７ａ＋　７ｂと、負極８ａおよび正極８ｂが設置
され、２つの電極の間には直流高圧電源９が接続されて
いる。放射線検出器５ａ〜５ｄの出力は信号処理装置１
０に入力して処理され、さらに出力装置１１によって出
力されるようになっている。

本実施例の動作は前記実施例とほぼ同じである。

ただし、本実施例では、種々の長さの核酸断片の混合物
は、ウェルではなく各ガラス管中のゲルの上端に重層す
る。また、本実施例の場合は、β線の検出は円柱状のゲ
ルの全周から行われるので、平板状のゲルの片面あるい
は両面から検出を行う前記実施例に比べてβ線検出の立
体角が大きくなり、それぞれ２倍強、１倍強のβ線カウ
ント数が得られる。従って、本実施例によれば、前記実
施例と同様に検出感度を損なうことなく分解能を上げら
れることに加えて、検出感度を高くすることができる。

また、カラス管を引き伸ばすことにより容易にβ線検出
窓を作れるという長所がある。

〔発明の効果〕

本発明によれば、検出部における泳動パターンを引き伸
ばすことができるので、実際にスリット幅を狭めなくて
も、スリット幅は泳動パターンに対して相対的に狭くな
るので、検出感度を低下させることなく分解能をにげる
ことかできる。

従って、検出すべき核酸断片が長くなって、相隣り合っ
た２つの泳動帯の間隔が小さくなっても、２つの泳動帯
を分離して検出できるので、一度の電気泳動で決定でき
る塩基配列数を増すことができる。

・１１　・

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）、（ｂ）は本発明の一実施例の装置を示す
それぞれ縦断面図および正面図、第２図（ａｌ、ｆｂｌ
は従来の厚さが均一なゲルを用いた場合のそれぞれ電気
泳動担体を示す縦断面図および検出器の出力例を示す図
、第２図（Ｃ）、ｆｄｌは前記実施例の場合のそれぞれ
電気泳動担体を示す縦断面図および検出器の出力例を示
す図、第３図（ａ）　、　（１））　、　（Ｃ１はいず
れも前記実施例の変形例を示す縦断面図、第４図（ａ）
。 （ｂ）は本発明の他の実施例の装置を示すそれぞれ縦断
面図および正面図、第５図（ａｌとｆｂｌ、およびｆｃ
）と（ｄｌはそれぞれ従来の電気泳動ゲルを示す縦断面
図および泳動パターンを示す図である。 符号の説明 ｌａ＋１ｂ・・・電気泳動板 ４・・・スリット ５ａ〜５ｄ・・・放射線検出器 ６・・・電気泳動ゲル ７ａ＋　７ｂ・・・バッファ槽 ８ａ・・・負極 ・１２　・ ８ｂ・・・正極　　　　　　９・・・直流高圧電源１０
・・・信号処理装置１１・・・出力装置１２ａ〜１２ｃ
ｌ・・・ウェル　　１３・・・泳動帯１４・・・泳動路
　　　　　１５・・・ガラス管代理人弁理士　中　村　
純忠　助 ヘ −（ｆ：　マいｑ）０マ ｃｎ　　０　−　　ｃつ　＼ｊ　ば） −〇 （Ｃ） ５　図 （ｂ） （ｄ） １ａ、ｌｂ　　電彫永動才 ６電Ｊい永啼ηＴ“ル １３　ラネ【Ｐ７７予

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、電気泳動装置の泳動路上に検出部を設け、泳動によ
   り順次検出部に到達した核酸断片を実時間で検出して核
   酸の塩基配列を決定する核酸塩基配列決定装置であって
   、電気泳動担体の電界強度が、検出部より電気泳動装置
   の負極側の少なくとも１ケ所で、該検出部より低くなる
   ようにしたことを特徴とする核酸塩基配列決定装置。 ２、特許請求の範囲第１項に記載の核酸塩基配列決定装
   置において、電気泳動担体の泳動路に直角な断面積を、
   検出部より電気泳動装置の負極側の少なくとも１ケ所で
   、該検出部より大きくすることにより、該検出部より電
   気泳動担体の電界強度を低くなるようにしたことを特徴
   とする核酸塩基配列決定装置。 ３、特許請求の範囲第２項に記載の核酸塩基配列決定装
   置において、一部に管径が細い部分を有するガラス管の
   内部に電気泳動担体を充填して電気泳動路を形成し、該
   管径が細い部分に検出部を設けたことを特徴とする核酸
   塩基配列決定装置。