CN102268426B - 一种从环境样品中提取高分子量基因组dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种环境样品中提取基因组DNA的方法。本发明方法包含包埋、破壁、消化、洗涤、电泳、胶回收、溶解步骤，用悬浮液悬浮环境样品，加入低熔点琼脂糖，室温冷却使凝固；将胶块放入破壁缓冲液中，温育，期间保持水平震荡；倒掉破壁缓冲液，加入消化缓冲液，温育，期间保持水平震荡；倒掉消化缓冲液，加入洗涤液洗涤，再用电泳缓冲液洗涤；将经破壁消化后的胶块切成小块，插入到低熔点琼脂糖凝胶的点样孔中，用低熔点琼脂糖凝胶封好点样孔的空隙后，在电泳缓冲液中电泳；染色后将含DNA的凝胶切下，用电洗脱法回收DNA；将电洗脱后得到的DNA晾干，溶于无菌去离子水或TE溶液，溶解液即为所提的DNA。本发明方法重复性好，操作较为简单，完全能满足建库等分子操作的要求。

Description

一种从环境样品中提取高分子量基因组DNA的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种环境样品中提取基因组DNA的方法。
背景技术
在地球各种环境的物质元素循环和生命过程中，各种微生物起到了极其重要的作用，但是由于环境中存在大量的未培养微生物，所以针对环境中所有微生物的研究显得更具意义。目前，对于环境中所有微生物的研究已经深入到了分子水平，主要是通过各种宏基因组技术开展。如分子克隆，RFLP分析，DGGE分析，文库构建等，这些方法和技术的发展，都对DNA片段大小提出了更高的要求。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在40kb以上，否则酶切后核酸片段两端都带合适末端的有效片段很少；如果是构建细菌人工染色体文库，则要求初始DNA长度在50kb以上。
目前，实验室提取环境样品基因组DNA的方法主要有溶菌酶-SDS法、CTAB法、试剂盒法。但由于环境样品的复杂性和操作时水力剪切作用等原因会造成DNA分子的损伤，所以这些方法提取的环境样品基因组DNA片段较短，其长度达不到50kb以上的水平，且通用性较差。
发明内容
为了解决现有环境样品基因组提取方法中存在的不足，本发明提供一种从环境样品中提取高分子量基因组DNA的方法。
一种从环境样品中提取高分子量基因组DNA的方法，包括包埋、破壁、消化、电泳、胶回收、溶解，具体工艺过程如下：
包埋：用1mL悬浮液悬浮1g环境样品，加入1mL于50℃保温的1％低熔点琼脂糖后混匀，室温冷却使凝固；
破壁：将胶块放入10mL破壁缓冲液中，37℃温育24h，期间保持水平50rpm震荡；
消化：倒掉破壁缓冲液，加入10mL消化缓冲液，37℃温育24h，期间保持水平50rpm震荡；
洗涤：倒掉消化缓冲液，加入100mL洗涤液洗涤三次，再用4℃的电泳缓冲液洗涤一次；
电泳：将经破壁消化后的胶块切成长8mm、宽6mm、高2mm大小，插入到0.7％低熔点琼脂糖凝胶的点样孔中，用0.7％低熔点琼脂糖凝胶封好点样孔的空隙后，在电泳缓冲液中以5v/cm的电压低温电泳4小时；将0.7％低熔点琼脂糖凝胶旋转90度后，继续电泳2小时；
切胶回收：染色后将含DNA的凝胶切下，用电洗脱法回收DNA；
溶解：将透析袋电洗脱后得到的DNA晾干，溶于50μl的无菌去离子水或TE溶液，溶解液即为所提的DNA；
所述的悬浮液组成为：10mmol/L HEPE-NaOH，1mol/L NaCl，50mmol/L EDTA，pH8.0；
所述的破壁缓冲液组成为：15mmol/L HEPES-NaOH，100mmol/L NaCl，100mmol/L EDTA，0.5g/L SDS，5mg/mL溶菌酶，pH 7.8；
所述的消化缓冲液组成为：30mmol/L HEPES-NaOH，500mmol/L NaCl，100mmol/L Na3PO4，100mmol/L EDTA，10mmol/L CaCl2，0.5g/L SDS，1.5mg/mL蛋白酶K，pH 7.8；
所述的洗涤液组成为：5mmol/L HEPES-NaOH，100mmol/L EDTA，pH 7.8；
所述的电泳缓冲液组成为：16mmol/L HEPES-NaOH，16mmol/L NaAc，0.8mmol/LEDTA，100μmol/L硫脲，pH 7.5；
所述的1％低熔点琼脂糖为：1％(W/V)低熔点琼脂糖，100℃保温使其溶解。
所述的0.7％低熔点琼脂糖凝胶为：0.7％(W/V)低熔点琼脂糖，溶于电泳缓冲液中，100℃保温使其溶解。
所述的TE溶液组成为：1mol/L Tris-HCl，500mmol/L EDTA，500mmol/L柠檬酸，pH8.0。
本发明从影响提取DNA片段大小的因素入手，从环境样品中提取了较其他方法所提片段大的高分子量DNA片段，提取的基因组DNA达到50kb以上，经吸光度检测，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间。本发明方法重复性好，操作较为简单，完全能满足建库等分子操作的要求。
本发明在破壁和消化时使用琼脂糖包埋样品，减少了溶液对DNA的机械剪切破坏，对DNA起到保护作用；本发明使用含有HEPES的电泳缓冲液代替一般的含有Tris的电泳缓冲液，减少了电泳过程了由于Tris对DNA的破坏作用；本发明在电泳过程中使用了双向电泳，减少了腐殖酸、多糖等杂质对最终产物的污染；本发明使用电洗脱回收DNA，避免了其他方法苯酚抽提步骤对于DNA的机械剪切破坏。
附图说明
附图为不同提取方法所提取活性污泥基因组DNA电泳比较：A.为试剂盒法提取的活性污泥基因组DNA；B.为溶菌酶+SDS法提取的活性污泥基因组DNA；C.为本发明方法所提取的活性污泥基因组DNA，Marker为DL15000。
具体实施方式
取湿重约1g的活性污泥，加入1mL于50℃保温的1％低熔点琼脂糖后混匀，冷却使凝固；
将胶块放入10mL破壁缓冲液中，37℃温育24h，期间保持水平50rpm震荡；
倒掉破壁缓冲液，加入10mL消化缓冲液，37℃温育24h，期间保持水平50rpm震荡；
倒掉消化缓冲液，加入100mL洗涤液洗涤三次，再用4℃电泳缓冲液洗涤一次；
将经破壁消化后的胶块切成长8mm、宽6mm、高2mm大小，插入到0.7％低熔点琼脂糖凝胶的点样孔中，用0.7％低熔点琼脂糖凝胶封好点样孔的空隙后，在电泳缓冲液中以5v/cm的电压低温电泳4小时；将0.7％低熔点琼脂糖凝胶旋转90度后，继续电泳2小时；
染色后将含DNA的凝胶切下，用电洗脱法回收DNA，将电洗脱后得到的DNA凉干，溶于50μl的无菌去离子水或TE溶液，溶解液即为所提的DNA。
使用0.4％浓度琼脂糖凝胶电泳检测本方法所提取基因组DNA分子量大小。使用1×TAE作为电泳缓冲液，电场强度为4V/cm，4℃电泳3h。
凝胶染色后，使用美国基因公司G Box凝胶成像系统成像，并使用美国Bio-rad公司Quantity one V4.6.2软件分析所提取的DNA分子量大小为50kb以上。

Claims (1)

1.一种从环境样品中提取高分子量基因组DNA的方法，其特征在于：由包埋、破壁、消化、洗涤、电泳、胶回收、溶解步骤组成：
包埋：用悬浮液悬浮环境样品，加入50℃的1%低熔点琼脂糖，室温冷却使凝固；悬浮液的组成为：10mmol/L HEPE-NaOH，1mol/L NaCl，50mmol/L EDTA,pH8.0；悬浮液、环境样品、琼脂糖三者的用量比为1mL悬浮液：1g环境样品：1mL琼脂糖；
破壁：将胶块放入破壁缓冲液中，37℃温育24h，期间保持水平50rpm震荡；破壁缓冲液组成为：15mmol/L HEPES-NaOH，100mmol/L NaCl，100mmol/L EDTA，0.5g/L SDS，5mg/mL溶菌酶，pH7.8；破壁缓冲液的用量为：2mL样品：10mL破壁缓冲液；
消化：倒掉破壁缓冲液，加入消化缓冲液，37℃温育24h，期间保持水平50rpm震荡；消化缓冲液组成为：30mmol/L HEPES-NaOH，500mmol/L NaCl，100mmol/L Na3PO4，100mmol/LEDTA，10mmol/L CaCl2，0.5g/L SDS，1.5mg/mL蛋白酶K,pH7.8；消化缓冲液的用量与破壁缓冲液的用量相等；
洗涤：倒掉消化缓冲液，加入洗涤液洗涤，再用4℃的电泳缓冲液洗涤；洗涤液组成为：5mmol/L HEPES-NaOH，100mmol/L EDTA,pH7.8；电泳缓冲液组成为：16mmol/L HEPES-NaOH，16mmol/L NaAc，0.8mmol/L EDTA,100μmol/L硫脲，pH7.5；
电泳：将经破壁消化后的胶块切成长8mm、宽6mm、高2mm的小块，插入到到0.7%低熔点琼脂糖凝胶的点样孔中，用到0.7%低熔点琼脂糖凝胶封好点样孔的空隙后，在电泳缓冲液中以5v/cm的电压低温电泳4小时；将0.7%低熔点琼脂糖凝胶旋转90度后，继续电泳2小时；
胶回收：染色后将含DNA的凝胶切下，用电洗脱法回收DNA；
溶解：将电洗脱后得到的DNA晾干，溶于无菌去离子水或TE溶液，溶解液即为所提的DNA；TE溶液组成为：1mol/L Tris-HCl，500mmol/L EDTA，500mmol/L柠檬酸，pH8.0；
所述环境样品为土壤或活性污泥。
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