CN104531677A - 一种动物组织长片段dna的提取方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动物组织长片段DNA的提取方法，包括以下步骤：1)通过酶消化法对动物组织进行消化，制得细胞悬液；2)通过琼脂糖包埋所述细胞悬液中的细胞，制成胶块，然后在胶块中进行蛋白酶K及RNase酶消化；3)将消化后清洗好的胶块进行溶胶、透析，制得长片段DNA。本发明还公开了一种动物组织长片段DNA的提取试剂盒及其使用方法。本发明的提取方法及试剂盒可克服物种及组织样品的局限性，提取的DNA长度可达2MB以上，能够很好地满足Irys系统或其他酶切图谱对基因组DNA长度的要求。

Description

一种动物组织长片段DNA的提取方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及DNA的提取领域，尤其涉及一种克服了物种和组织样品局限性的动物长片段DNA的提取方法，还涉及一种动物组织长片段DNA的提取试剂盒及其使用方法。

背景技术

BioNano公司推出了Irys系统用于长链DNA的单分子成像。该系统利用单酶酶切和荧光标记对长达几百kb的单链DNA分子进行成像，利用高质量图像使基因组结构通过酶切图谱的方式展现无遗。Irys特有的超长序列读长能够轻松跨越重复片段和一些包含复杂元件的区域，在大大简化基因组组装的同时也让困扰NGS技术的拼接缺口无处遁形。

目前,国内外已有多种提取DNA的方法，如水煮法、酚抽提法、甲酰胺解聚法、盐酸胍裂解法、盐洗法等，但片段长度都不能Irys系统的要求，最近BioNano公司推出了一种试剂盒，采用将动物组织进行研磨、处理后，作为样品进行DNA提取，此种方法可以使DNA长度达到100kb以上，但是由于研磨过程，容易破坏DNA，且此方法在物种方面及组织样品的局限性比较大，如对于一些组织，如神经组织，则不易获取DNA，限制了Irys系统的应用。

发明内容

本发明的目的是解决现有的DNA提取方法受物种及组织样品的局限性较大，从而无法有效实现动物组织长片段DNA的提取的问题。

因此，本发明提供了一种动物长片段DNA的提取方法，包括以下步骤：

1)通过酶消化法对动物组织进行消化，制得细胞悬液；

2)通过琼脂糖包埋所述细胞悬液中的细胞，制成胶块，然后在胶块中进行蛋白酶K消化及RNase酶消化；

3)将消化后清洗好的胶块进行溶胶、透析，制得长片段DNA。

在上述技术方案中，酶消化法，是通过酶消化液把已剪成小块的组织进一步松散，直接获得细胞的方法，此方法的细胞产量高，便于后续的DNA提取，同时可以避免研磨造成细胞破碎，DNA提前释放。通过将动物组织利用酶处理技术消化成细胞，可克服物种及组织样品的局限性，对于一些组织，如神经组织，通过研磨不易获取DNA，将组织消化成细胞可更好的获取DNA；后续对细胞利用低熔点琼脂糖进行包埋处理，减少了DNA提取过程中的机械损伤，更好的保证了DNA的完整。利用本发明的动物组织长片段DNA的提取方法提取的DNA长度可达2MB以上，能够很好地满足Irys系统的要求。本发明中提到的“动物”是一个广泛的概念，既包括人，还包括其他动物。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤1)中：若所述动物组织为肝组织，则通过胰酶对肝组织进行消化；若所述动物组织为非肝组织，则通过胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ对非肝组织进行消化。所述非肝组织即除肝组织以外的其他动物组织，包括脑、肌肉等。

在上述技术方案中，胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。胶原酶分为多种类型，其中，胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不，它能消化多种组织。试验表明，胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ结合使用，能够消化动物的多种组织，消化效果颇佳，解决了组织和酶的类别对细胞消化的限制，使得动物组织消化更为简单、便捷。肝组织消化可采用多种酶，如胰酶、胶原酶Ⅳ等，由于胰酶对肝组织消化效果较好，在此对动物肝脏组织进行消化时，优选胰酶。

作为对上述技术方案的更进一步改进，所述胰酶的消化体积百分比浓度为0.125～0.25％，所述胶原酶Ⅰ的消化浓度为0.7～1.3mg/mL，所述胶原酶Ⅳ的消化浓度为0.3～0.7mg/mL。此处的消化体积百分比浓度为酶的最终反应体积百分比浓度，消化浓度是指酶的最终反应浓度。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤1)为：制备动物组织匀浆；向所述组织匀浆中加入酶对组织进行消化，直至组织块变为柔软的絮状，镜检可观察到较多的分散细胞；过滤消化好的组织匀浆，离心过滤液，弃上清液，洗涤沉淀，加入缓冲液制备细胞悬液。所述缓冲液优选为PBS缓冲液。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤1)的具体步骤如下：

a1.将0.8～1.5g动物组织在已消毒的培养皿中用剪刀充分剪碎，加入0.5～1.5mL的细胞培养液，进一步剪碎；

a2.将剪碎的组织转移到15mL的离心管中，再向培养皿中加入0.5～1.5mL的细胞培养液清洗剪刀及培养皿，并收入离心管中，用细胞培养液补充体积至原体积的4～5倍，上下颠倒混匀，制得组织匀浆；

a3.向制得的的组织匀浆中加入的胶原酶I至终浓度为0.7～1.3mg/mL及胶原酶IV至其终浓度为0.3～0.7mg/mL，若为肝组织，则仅需加入胰酶至其最终体积百分比浓度为0.125～0.25％，置于37℃温度下，水平放置1.5～3h，直至组织块变为柔软的絮状；

a4.取少量的组织消化液进行镜检，可以看到较多的分散细胞；

a5.将消化好的组织匀浆过70μm的过滤器，同时用注射器的活塞进行轻微的研磨，过滤至培养皿中；

a6.将过滤液分装到离心管中，500g离心5～10min，弃上清液，将沉淀用1xPBS悬浮，洗涤，500g离心5～10min，重复2～3次，加入适量PBS，制得细胞悬液，待包埋。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤2)为：将低熔点琼脂糖凝胶溶液与细胞悬液混合，并将制得的混合液加入成胶模具中进行凝固，制得胶块；将胶块转移至蛋白酶K消化液中，确保胶块完全浸没，45～55℃加热1.5～3h，每隔一段时间混匀一次，然后清洗胶块；将胶块转移至RNase酶消化液中，35～40℃消化1～2h，每隔一段时间混匀一次，然后清洗胶块。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤2)中：所述蛋白酶K消化是在蛋白酶K消化液中进行的，所述RNase酶消化是在RNase酶消化液中进行的，所述蛋白酶K消化液由蛋白酶K与裂解缓冲液混合而成，其中，蛋白酶K的浓度为1.0～1.5mg/mL；RNase酶消化液由RNase酶和TE缓冲液混合而成，其中，RNase酶的浓度为0.15～0.25mg/mL。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤2)中：所述蛋白酶K消化的温度为50℃，消化时间为1.5～3h；所述RNase酶消化的温度为37℃，消化时间为1～2h。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤2)的具体步骤如下：

b1.将450～550μL质量百分比浓度为1.5～3％的低熔点琼脂糖置于65～75℃的温度下加热，直到低熔点琼脂糖完全融化，将溶解后的低熔点琼脂糖转移至40～45℃的温度下平衡至少10min，将细胞悬液放置在40～45℃的温度下加热至多10min；

b2.将40～50μL低熔点琼脂糖快速加入到70～80μL的细胞悬浮液中，用枪头快速吸取90％的体积进行上下吹打，避免气泡产生，吸取细胞与胶的混合物90～100μL，快速添满成胶模具，接着将成胶模具置于冰上凝固，制得胶块；

b3.转移胶块到含有蛋白酶K消化液的离心管中，确保胶块完全浸没，其中，蛋白酶K消化液由150～170μL的浓度为20mg/mL的蛋白酶K和2.0～3.0mL裂解缓冲液混合而成，50℃加热1.5～2.5h；

b4.弃掉蛋白酶K消化液，重复步骤b3；

b5.弃掉蛋白酶K消化液，用1×Washing buffer冲洗3～5次；

b6.用10mL的TE buffer快速冲洗胶块两次，放在摇床上180rpm摇晃10～20min，重复三次；

b7.弃掉步骤b6中的TE Buffer，将管塞上的胶块用下铲子移置离心管底部，每个离心管中加入RNase酶消化液，在37℃水浴锅中消化1～2h，其中，RNase消化液由40～60μL的浓度为10mg/mL的RNase酶和1.5～2.5mL的TE buffer混合而成；

b8.弃掉RNase酶消化液，用1×washing buffer快速冲洗胶块三次，然后加入10ml 1×washing buffer，放在摇床上180rpm摇晃15min，慢洗四次；

b9.弃掉1×washing buffer，用TE buffer慢洗五次，每次10～20mL TE buffer，放在摇床上180rpm摇晃10～20min，最后弃掉TE buffer。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤3)中：所述溶胶的过程为：先70℃下融化胶块，于40～45℃平衡后向胶块中加入琼脂糖酶，混匀，于40～45℃水浴35～50min；所述透析的过程为：将透析膜放置在TE缓冲液表面，静止湿润，混匀DNA，将DNA全部点在透析膜上。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤3)的具体步骤如下：

c1.取一个胶块，吸去胶块底部和边缘的水，将吸好的胶块放置在1.5mL离心管中；

c2.将胶块用离心机5000rpm点甩1s；

c3.在65～75℃水浴锅溶胶2min，快速将离心管转移到40～45℃水浴锅中5min，加入2μL浓度为0.2U/μL的琼脂糖酶，用移液器轻柔搅拌混匀，在40～45℃水浴锅中40～60min；

c4.将10～20mL TE Buffer加入到6cm的培养皿中，用镊子将0.1μm透析膜放置在TE Buffer表面，盖盖静止润湿10min，用宽口枪头混匀DNA，将DNA全部点在透析膜上，将培养皿盖上盖子，在室温静止2～3h；

c5.用宽口枪头转移DNA到1.5mL离心管中，用枪头轻轻的吹打最多9次至DNA混匀，4℃保存备用。

本发明还提供了一种动物组织长片段DNA的提取试剂盒，所述试剂盒包括动物组织消化酶、蛋白酶K消化液、RNase酶消化液、琼脂糖酶、TE缓冲液、冲洗缓冲液、低熔点琼脂糖和透析膜。其中，动物组织消化酶是指能够消化动物组织的酶。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述动物组织消化酶包括胰酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ；所述蛋白酶K消化液由蛋白酶K和裂解缓冲液混合而成，其中，蛋白酶K的浓度为1.0～1.5mg/mL；所述RNase酶消化液由RNase酶和TE缓冲液混合而成，其中，RNase酶的浓度为0.15～0.25mg/mL。

本发明还进一步提供了动物组织长片段DNA的提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)制备动物组织匀浆，取出动物组织消化酶，向组织匀浆中加入动物组织消化酶对组织进行消化，直至组织块变为柔软的絮状，镜检可观察到较多的分散细胞；其中，若所述动物组织为肝组织，则加入胰酶至其最终体积百分比浓度为0.125～0.25％，若所述动物组织为非肝组织，则加入胶原酶Ⅰ至其终浓度为0.7～1.3mg/mL及胶原酶IV至其终浓度为0.3～0.7mg/mL；过滤消化好的组织匀浆，离心过滤液，弃上清液，洗涤沉淀，加入缓冲液制备细胞悬液待包埋；

(2)取出低熔点琼脂糖凝胶，制备质量百分比浓度为1.5～3％低熔点琼脂糖凝胶溶液，将40～45℃的低熔点琼脂糖凝胶溶液与细胞悬液混合，并将制得的混合液加入成胶模具中进行凝固，制得胶块；取出蛋白酶K消化液，将胶块转移至蛋白酶K消化液中，确保胶块完全浸没，45～55℃加热1.5～3h，每隔一段时间混匀一次，然后用冲洗缓冲液和TE缓冲液清洗胶块；将胶块转移至RNase酶消化液中，35～40℃消化1～2h，每隔一段时间混匀一次，然后用冲洗缓冲液和TE缓冲液清洗胶块；

(3)融化胶块，加入琼脂糖酶，搅拌混匀琼脂糖酶与低熔点琼脂糖，于40～45℃水浴35～50min。将透析膜放置在TE缓冲液表面，静止湿润，混匀DNA，将DNA全部点在透析膜上；转移DNA至离心管中，混匀，保存备用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明的动物组织长片段DNA的提取方法，通过将动物组织利用酶处理技术消化成细胞，可克服物种及组织样品的局限性，因为酶解是非常温和的，细胞是完整无破碎的，这样DNA就是完整的，如果是研磨，极有可能把细胞破碎，DNA被提前释放出来造成降解。对于一些组织，如神经组织，通过研磨不易获取DNA，将组织消化成细胞可更好的获取DNA；后续对细胞利用低熔点琼脂糖进行包埋处理，减少了DNA提取过程中的机械损伤，更好的保证了DNA的完整。利用本发明的动物组织长片段DNA的提取方法提取的DNA长度可达2MB以上，能够很好地满足Irys系统或其他酶切图谱的要求。

本发明的动物组织长片段DNA的提取试剂盒，配方简单、使用方便，可实现动物组织长片段DNA的快速提取。

附图说明

图1为实施例1中采用本发明的用于动物长片段DNA的提取方法提取的金龙鱼脑组织DNA的脉冲场凝胶电泳图；其中M为Marker，5、6为金龙鱼DNA；

图2为比较例1中采用研磨方法提取DNA的方法提取的金龙鱼脑组织DNA的脉冲场凝胶电泳图；其中M为Marker，1、2、3为金龙鱼DNA。

具体实施方式

本发明公开了一种克服物种及组织样品的局限性、可保证提取的DNA的质量、提取的DNA长度可达100kb以上的适合用于动物长片段DNA的提取方法和试剂盒。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

本发明的用于动物长片段DNA的提取方法可以通过以下步骤来实现：

1)通过酶消化法对动物组织进行消化，制得细胞悬液；

在本发明中，动物组织可为脑、肌肉、神经、肝脏等，通过酶消化法处理动物组织块，将其细胞之间的连接蛋白(细胞外基质)消化掉，使组织块分散为细胞。选择合适的酶将动物组织消化成细胞，对于本领域技术人员来说是可以实现的。例如，使用的酶可为胶原酶(能特异性地降解胞外胶原蛋白，使胶原蛋白和纤维粘连蛋白的网状结构解离，而不损坏细胞表面结构的完整性)，也可为胶原酶、胰蛋白酶等蛋白水解酶的混合物(能降解胶原蛋白和其他蛋白，及多糖等胞外大分子物质，适用于多种组织的消化应用)。作为本发明的优选实施方式，当动物组织为肝组织时，选择通过胰酶将肝组织消化成细胞；当动物组织为非肝组织时，选择通过胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ将非肝组织消化成细胞，此优选实施方式是发明人通过大量实验总结得出的，此种方式可高效消化多种动物组织。

在通过酶消化法进行动物组织的消化过程中，酶的加入量要适中，若酶的浓度过大，则会过度消化，对细胞的细胞膜造成破坏；若酶的浓度过小，则不能有效消化细胞间的胞外间质使细胞分散开来。作为本发明的优选实施方式，在动物组织消化过程中，若所述动物组织为肝组织，加入胰酶至其最终体积百分比浓度为0.125～0.25％；若所述动物组织为非肝组织，加入胶原酶I至终浓度为0.7～1.3mg/mL及胶原酶IV至终浓度为0.3～0.7mg/mL，然后将组织匀浆置于37℃温度下，水平放置直至组织块变为柔软的絮状，取少量的组织消化液进行镜检，可以看到较多的分散细胞，即可认为完成了组织消化过程。

步骤1)的具体过程可为：制备动物组织的组织匀浆，向组织匀浆中加入酶对组织进行消化，消化完全后，分离细胞，制备细胞悬液。

其中，组织匀浆可利用机械破碎法制得，为了更好地保持细胞的完整性，可将动物组织充分剪碎制得组织匀浆，具体可为向充分剪碎的动物组织中加入细胞培养液，混匀，即制得组织匀浆。制备组织匀浆的优选步骤为：将一定量的动物组织在已消毒的培养皿中用剪刀充分剪碎，加入细胞培养液，进一步剪碎；然后将剪碎的组织转移到离心管中，再向培养皿中加入细胞培养液清洗剪刀及培养皿，并收入离心管中，上下颠倒混匀，制得组织匀浆。

消化完全后，可通过过滤消化好的组织匀浆、离心过滤液、弃上清，得到分离的细胞，将其洗涤沉淀后，制备细胞悬液。分离细胞的优选步骤为：将消化好的组织匀浆过70μm的过滤器，同时用注射器的活塞进行轻微的研磨，过滤至培养皿中；然后将过滤液分装到离心管中，500g离心5～10min，弃上清液，将沉淀用1xPBS悬浮，500g离心5～10min，再用1xPBS洗2～5次，加入适量的PBS，制得细胞悬液待包埋。

2)通过琼脂糖包埋所述细胞悬液，制成胶块，然后在胶块中进行蛋白酶K消化及RNase酶消化；

在DNA的提取过程中，为了避免机械震荡、吹打对DNA产生的物理损伤，避免DNA断裂，在提取动物组织的DNA时，可以将细胞包埋在琼脂糖胶块中，然后再消化细胞。琼脂糖在此优选为低熔点琼脂糖。

其中，通过低熔点琼脂糖包埋所述细胞悬液中的细胞、制得胶块的步骤为：通过将低熔点琼脂糖凝胶溶液与细胞悬液混合，并将制得的混合液加入成胶模具中进行凝固，制得胶块。优选地，使用的低熔点琼脂糖凝胶溶液的质量百分比浓度为1.5～3％，将40～45℃的质量百分比浓度为1.5～3％的低熔点琼脂糖凝胶溶液快速加入到细胞悬浮液(可预先将细胞悬浮液放置在40～45℃的温度下加热至多10min)中，用枪头上下吹打混匀，避免气泡产生，以保证混合的均匀性和细胞的活性，吸取细胞与胶的混合物，快速添满成胶模具，冷却后制得胶块。40～45℃的低熔点琼脂糖凝胶溶液的制备过程为：将质量百分比浓度为1.5～3％的低熔点琼脂糖置于65～75℃的温度下加热，直到低熔点琼脂糖完全融化，将溶解后的低熔点琼脂糖转移至40～45℃的温度下平衡至少10min即制得。胶块凝固的方法有多种，比如低温冷凝，温度越低凝固的时间越短，但温度也不宜过低。优选地，将添满细胞与胶的混合物的成胶模具置于冰上凝固，制得胶块。

蛋白酶K的消化步骤是：将胶块转移至蛋白酶K消化液中，确保胶块完全浸没，45～55℃加热1.5～3h，每隔一段时间混匀一次，其中蛋白酶K消化液由蛋白酶K与裂解buffer混合而成。蛋白酶K消化液能够裂解细胞、消化细胞蛋白质，使得核蛋白解聚，从而将DNA释放出来，释放的DNA被低熔点琼脂糖捕获。优选地，蛋白酶K消化液中，蛋白酶K的浓度为1.0～1.5mg/mL。蛋白酶K的浓度影响蛋白质的水解效果，在此优选浓度下，能够保证蛋白质更好地消化，与DNA更好地进行分离。更优选地，蛋白酶K消化液中，蛋白酶K的浓度为1.2mg/mL。在此浓度下，蛋白质的消化效果最佳。

蛋白酶K消化后，需要清洗胶块，其目的是除去蛋白酶K及进行蛋白酶K消化后的产物，以避免对下面的步骤产生影响(如蛋白酶K的存在会影响RNase酶的消化)。清洗胶块的步骤优选为：弃掉蛋白酶K消化液，用1×Washing buffer冲洗3～5次；然后用10mL的TE buffer快速冲洗胶块两次，在摇床上180rpm摇10～20min，重复三次。

RNase酶的消化步骤是：将胶块转移至RNase酶消化液中，35～40℃消化1～2h，每隔一段时间混匀一次，其中RNase酶消化液由RNase酶和TE buffer混合而成。在此消化过程中，RNase酶能够催化RNA降解，消除RNA对DNA提取的影响。优选地，RNase酶消化液中，RNase酶的浓度为0.15～0.25mg/mL。更优选地，RNase酶消化液中，RNase酶的浓度为0.2mg/mL。

RNase酶消化后，需要清洗胶块，其目的是除去RNase酶及进行RNase酶消化后的产物，以避免对下面的步骤产生影响。清洗胶块的步骤优选为：弃掉RNase酶消化液，用1×washing buffer快速冲洗胶块三次，然后加入10mL1×washing buffer，在摇床上180rpm摇晃15min，慢洗四次；然后弃掉1×washingbuffer，用10～20ml TE buffer慢洗五次，在摇床于180rpm下摇晃10～20min，弃掉TE buffer。

3)将消化后清洗好的胶块进行溶胶、透析，制得长片段DNA。

在步骤3)中，可使用琼脂糖酶溶胶，琼脂糖酶能够消化低熔点琼脂糖，形成不能再成胶的碳水化合物分子，同时释放所俘获的DNA。溶胶步骤优选为：在70℃下融化胶块，在40-45℃平衡一下后加入琼脂糖酶，搅拌混匀琼脂糖酶与低熔点琼脂糖，于40～45℃水浴35～50min。在一个具体的实施例中，溶胶的步骤为：取一个胶块，吸去胶块底部和边缘的水，将吸好的胶块放置在1.5mL离心管中；将胶块用离心机5000rpm点甩1s，以利于更好的溶胶；在70℃水浴锅溶胶2min，快速将离心管转移到43℃水浴锅中5min，加入琼脂糖酶，用移液器轻柔搅拌10s，混匀琼脂糖酶与低熔点琼脂糖，在43℃水浴锅中45min。

分离DNA时，采用透析法分离，如透析膜透析分离。分离步骤优选为：将透析膜放置在TE buffer表面，静止湿润，混匀DNA，将DNA全部点在透析膜上；转移DNA至离心管中，混匀，保存备用。在一个具体的实施例中，分离步骤为：将15mL TE Buffer加入到6cm的培养皿中，用镊子将0.1μm透析膜放置在TE Buffer表面，盖盖静止润湿10min，用粗枪头混匀DNA，将DNA全部点在透析膜上，将培养皿盖上盖子，在室温静止2.5h；用宽口枪头转移DNA到1.5mL离心管中，用枪头轻轻的吹打最多9次至DNA混匀，4℃保存备用。

本发明的动物组织长片段DNA的提取试剂盒，包括动物组织消化酶、蛋白酶K消化液、RNase酶消化液、TE缓冲液、冲洗缓冲液、琼脂糖酶、低熔点琼脂糖和透析膜。其中，动物组织消化酶是指能够消化动物组织的酶。

其中，动物组织消化酶，即将动物组织消化成细胞时使用的酶，在此不作限制，能够实现多种组织消化的酶均可作为本试剂盒的动物组织消化酶，优选地，动物组织消化酶包括胰酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ。

蛋白酶K消化液裂解细胞、消化细胞蛋白质，使得核蛋白解聚，从而将DNA释放出来。所述蛋白酶K消化液由蛋白酶K和裂解缓冲液配制而成，其中，蛋白酶K的浓度为1.0～1.5mg/mL；蛋白酶K的浓度影响蛋白质的水解效果，在此优选浓度下，能够保证蛋白质更好地消化，与DNA更好地进行分离。更优选地，蛋白酶K消化液中，蛋白酶K的浓度为1.2mg/mL。在此浓度下，蛋白质的消化效果最佳。

RNase酶消化液用于催化RNA降解，消除RNA对DNA提取的影响。优选地，RNase酶消化液中，所述RNase酶消化液由RNase酶和TE缓冲液配制而成，其中，RNase酶的浓度为0.15～0.25mg/mL。更优选地，RNase酶消化液中，RNase酶的浓度为0.2mg/mL。

低熔点琼脂糖用于制备包埋细胞所需的低熔点琼脂糖凝胶溶液，此处的低熔点琼脂糖可为凝固的低熔点琼脂糖凝胶(优选其质量百分比浓度为1.5～3％，更优选为2％)，也可为低熔点琼脂糖固体。当低熔点琼脂糖为凝固的低熔点琼脂糖凝胶时，只需将其置于65～70℃的水浴锅中5～10min即可得到低熔点琼脂糖凝胶溶液；当低熔点琼脂糖为低熔点琼脂糖固体时，需先称取适量的低熔点琼脂糖固体，加入缓冲溶液中，加热至低熔点琼脂糖溶解，即可得低熔点琼脂糖溶液。使用时需将溶解后的低熔点琼脂糖溶液转移至40～45℃的温度下平衡至少10min。

本发明的动物组织长片段DNA的提取试剂盒还可进一步包括细胞培养液，以便于制备组织匀浆，细胞培养液可为DMEM培养基和FBS的混合液。

本发明的动物组织长片段DNA的提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)制备动物组织匀浆，取出动物组织消化酶，向组织匀浆中加入动物组织消化酶对组织进行消化，直至组织块变为柔软的絮状，镜检可观察到较多的分散细胞；其中，若所述动物组织为肝组织，则加入胰酶至其最终体积百分比浓度为0.125～0.25％，若所述动物组织为非肝组织，则加入胶原酶Ⅰ至其终浓度为0.7～1.3mg/mL及胶原酶IV至终浓度为0.3～0.7mg/mL；过滤消化好的组织匀浆，离心过滤液，弃上清液，洗涤沉淀，加入缓冲液制备细胞悬液待包埋。

(2)取出低熔点琼脂糖凝胶，制备质量百分比浓度为1.5～3％低熔点琼脂糖凝胶溶液，将40～45℃的低熔点琼脂糖凝胶溶液与细胞悬液混合，并将制得的混合液加入成胶模具中进行凝固，制得胶块；取出蛋白酶K消化液，将胶块转移至蛋白酶K消化液中，确保胶块完全浸没，45～55℃加热1.5～3h，每隔一段时间混匀一次，然后用冲洗缓冲液和TE缓冲液清洗胶块；将胶块转移至RNase酶消化液中，35～40℃消化1～2h，每隔一段时间混匀一次，然后用冲洗缓冲液和TE缓冲液清洗胶块；

(3)融化胶块，加入琼脂糖酶，搅拌混匀琼脂糖酶与低熔点琼脂糖，于40～45℃水浴35～50min。将透析膜放置在TE缓冲液表面，静止湿润，混匀DNA，将DNA全部点在透析膜上；转移DNA至离心管中，混匀，保存备用。

本发明的提取方法和试剂盒特别适合用于动物组织长片段DNA的提取，本发明的有益效果在于：

(1)本发明的动物长片段DNA的提取方法，通过将动物组织利用酶处理技术消化成细胞，可克服物种及组织样品的局限性，对于一些组织，如神经组织，通过研磨不易获取DNA，将组织消化成细胞可更好的获取DNA；

(2)后续对细胞利用低熔点琼脂糖进行包埋处理，减少了DNA提取过程中的机械损伤，更好的保证了DNA的完整。

(3)利用本发明的动物组织长片段DNA的提取方法提取的DNA长度可达2MB以上，能够很好地满足Irys系统或其他酶切图谱的要求。

(4)本发明的动物组织长片段DNA的提取试剂盒，配方简单、使用方便，可实现动物组织长片段DNA的快速提取。

下面通过具体实施例方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1

利用本发明的动物组织长片段DNA的提取方法从金龙鱼的脑组织提取DNA，具体步骤如下：

(1)将1g的脑组织在已消毒的培养皿中用剪刀充分剪碎，加入1mL的细胞培养液(90％DMEM培养+10％FBS)，进一步剪碎；

(2)将剪碎的组织转移到15mL的离心管中，再向培养皿中加入1mL的细胞培养液清洗剪刀及培养皿，并收入离心管中，用细胞培养液补充离心管内液体体积至原体积的5倍，上下颠倒混匀，制得组织匀浆；

(3)向步骤(2)中得到的组织匀浆中加入160μL的浓度为50mg/mL胶原酶I至终浓度为1mg/mL及80μL的浓度为50mg/mL胶原酶IV至终浓度为0.5mg/mL，若组织是肝脏组织，则仅需要加入1-2mL的0.05％的胰酶，然后将加入酶的组织匀浆置于37℃水浴或培养箱中，水平放置2h，每隔15min混匀一次，直至组织块变为柔软的絮状；

(4)取少量的组织消化液利用普通相差显微镜进行镜检，可以看到较多的分散细胞；

(5)将消化好的组织匀浆液过70μm的过滤器(Filter,Falcon)，同时用5mL注射器的活塞进行轻微的研磨，过滤至培养皿中；

(6)将过滤液分装到2mL的离心管中，500g，离心5min，弃上清液；将沉淀用1xPBS悬浮，500g，离心5min；再用1xPBS洗2次，加入适量的1x PBS，制得细胞悬液(cell suspension buffer)待包埋；

(7)将凝固的低熔点琼脂糖放置70℃待熔化，将500μL质量百分比浓度为2％的低熔点琼脂糖置于70℃的水浴锅中10min直到琼脂糖完全融化，将溶解后的琼脂糖转移至43℃的水浴锅或恒温仪中至少10min，将细胞悬液放置于43℃的水浴锅或恒温仪中至多10min；

(8)将45μL的低熔点琼脂糖快速加入75μL的细胞悬浮液，用P1000枪头快速吸取90％的体积进行上下吹打，避免气泡产生，用P200的枪头吸取细胞与胶的混合物95μL，快速添满成胶模具(plug cast)，确保细胞与胶在水浴锅或恒温仪中保持43℃；

(9)将成胶模具(plug cast)放置在冰上45min，或放在冰盒中放置4℃冰箱45min，要避免胶与碎冰的接触，制得胶块；

(10)转移胶块(plugs)到含有2.6mL蛋白酶K消化液的离心管中，确保胶块(plugs)完全浸没，50℃水浴2h，每隔一段时间混匀一次，其中，蛋白酶K消化液由167μL的浓度为20mg/mL蛋白酶K(Qiagen Proteinase K enzyme)与2.5mL裂解buffer混合而成；

(11)弃掉蛋白酶K消化液，重复步骤(10)；

(12)弃掉蛋白酶K消化液，用1×Washing buffer冲洗3次；

(13)用10mL的TE buffer快速冲洗胶块(plugs)两次，在室温用摇床180rpm摇晃浸入10mL的TE buffer中的胶块15min，重复三次；

(14)弃掉步骤(13)中的TE Buffer将管塞上的胶块(plug)用下铲子移置离心管底部，每个离心管中加2.5mL的RNase酶消化液，在37℃水浴锅中消化1h，每隔一段时间混匀一次，其中，RNase消化液由50μL的浓度为10mg/mL的RNase酶(Qiagen RNase enzyme)和2.5mL的TE buffer混合而成；

(15)弃掉RNase酶消化液，用1×washing buffer冲洗胶块三次，每次手动摇晃10s，然后加入10mL 1×washing buffer慢洗四次，放在摇床上180rpm摇晃15min；

(16)弃掉1×washing buffer，改用10mL TE buffer慢洗五次，在摇床上于180rpm下摇晃15min，弃掉TE buffer；

(17)用金属小铲子取一个胶块，在干净的吸水纸(Kimwipes)上通过触碰小铲子底部除去胶块多余的液体，不要让吸水纸碰触到胶面，轻轻接触胶块的边缘；将吸好的胶块放置在1.5mL离心管中；

(18)将胶块用离心机5000rpm点甩1s，有利于更好的溶胶；

(19)在70℃水浴锅溶胶2min，快速将离心管转移到43℃水浴锅中5min，加入2μL的浓度为0.2U/μL的琼脂糖酶(Epicentre)，用移液器快速搅拌10s保证酶混匀于琼脂糖中，在43℃水浴锅中45min，保证温差小于3℃；

(20)将15mL TE Buffer加入到6cm的培养皿中，用镊子将0.1μm透析膜放置在TE Buffer表面，盖盖静止润湿10min，用宽口枪头混匀DNA，将DNA全部点在膜上，不要点在膜边缘，每张膜可点2～3个DNA，将培养皿盖上盖子，在室温静止2.5h；

(21)用宽口枪头转移DNA到1.5mL离心管中，用枪头(USAScientific,#1111-1810)轻轻的吹打最多9次至DNA混匀，4℃保存备用。

接着，利用提取的金龙鱼DNA进行脉冲场凝胶电泳试验，步骤如下：

(1)用150mL 0.5×TBE缓冲液制备一个1％琼脂糖凝胶。

(2)胶凝后，小心移去样品梳，将样品跟loading buffer混合，慢慢注入加样孔中。

(3)把胶放入电泳槽中，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先14℃冷却。

(4)将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。打开电源，调节蠕动泵到适当流速(5～10mL/rain)或打开变速泵至70。

(5)调整电泳参数。大于50kb限制性片段在35s Initial switch time和90sFinal switch time的电脉冲下得以分离，时间20h。

(6)在0.5μg/mL的溴化乙锭中进行染色并拍照。

通过得到的脉冲场凝胶电泳图(如图1所示)，上述步骤得到的DNA长度可达2MB，效果良好。

比较例1

利用研磨方法从金龙鱼的脑组织提取DNA，具体步骤如下：

(1)称取40mg组织迅速转移到遇冷的研钵中。

(2)快速加入遇冷的2mL MB buffer，研杵上下研20次，不能旋转，避免气泡产生。

(3)冰浴5min，使未匀碎的组织下沉，将每500μL上清转移至1.5mL离心管中。

(4)加入等体积无水乙醇，颠倒混匀5次，冰浴60min，中间摇匀一次。

(5)1500g，4℃离心7min，弃上清。

(6)加入1mL的MB buffer重悬细胞，1500g，4℃离心7min，弃上清。

(7)重复(6)一次。

(8)每5mg组织用125μL MB buffer重悬，室温放置15min。

(9)将凝固的低熔点琼脂糖放置70℃待熔化，将500μL 2％的低熔点琼脂糖置于70℃的水浴锅中10min直到琼脂糖完全融化，将溶解后的琼脂糖转移至43℃的水浴锅或恒温仪中至少10min，将细胞悬浮液放置43℃的水浴锅或恒温仪中至多10min。

(10)将45μL的2％琼脂糖快速加入75μL的细胞悬浮液，用P1000枪头快速吸取90％的体积进行上下吹打，避免气泡产生，用P200的枪头吸取细胞与胶的混合物95μL，快速添满成胶模具(plug cast)，确保细胞与胶在水浴锅或恒温仪中保持43℃。

(11)将成胶模具(plug cast)放置在冰上45min，或放在冰盒中放置4℃冰箱45min，要避免胶与碎冰的接触，制得胶块。

(12)转移胶块(plugs)到含有2.6mL蛋白酶K消化液的离心管中，确保胶块(plugs)完全浸没。50℃水浴2h，每隔一段时间混匀一次，其中，蛋白酶K消化液由167μL的浓度为20mg/mL蛋白酶K(Qiagen Proteinase K enzyme)与2.5mL裂解buffer混合而成；

(13)弃掉蛋白酶K消化液，重复步骤(12)。

(14)弃掉蛋白酶K消化液，用1×Washing buffer冲洗3次。

(15)用10mL的TE buffer快速冲洗胶块(plugs)两次，在室温用摇床180rpm摇晃浸入10mL的TE buffer中的胶块15min，重复三次。

(16)弃掉步骤(15)中的TE Buffer将管塞上的胶块(plug)用下铲子移置离心管底部，每个离心管中加2.6mL的RNase消化液，在37℃水浴锅中消化1h，每隔一段时间混匀一次，其中，RNase酶消化液由50μL的浓度为10mg/mL的RNase酶(Qiagen RNase enzyme)和2.5mL的TE buffer混合而成。

(17)通过管塞弃掉RNase酶消化液，用1×washing buffer冲洗胶块(plugs)三次，每次手动摇晃10s，然后加入10mL 1×washing buffer慢洗四次，放在摇床上180rpm摇晃15min。

(18)弃掉1×washing buffer，改用10mL TE buffer慢洗五次，在摇床上于180rpm下摇晃15min，弃掉TE buffer。

(19)用金属小铲子取一个胶块，在干净的吸水纸(clean KimWipes)上通过触碰小铲子底部除去胶块多余的液体，不要让吸水纸碰触到胶面，轻轻接触胶块的边缘；将吸好的胶块放置在1.5mL离心管中。

(20)将胶块用离心机5000rpm点甩1s，有利于更好的溶胶。

(21)在70℃水浴锅溶胶2min，快速将离心管转移到43℃水浴锅中5min，加入2μL的浓度为0.2U/μL的琼脂糖酶(0.2U/μL-Epicentre)，用移液器快速搅拌10s保证溶胶酶混匀与琼脂糖中，在43℃水浴锅中45min，保证温差小于3℃。

(22)将15mL TE Buffer加入到6cm的培养皿中，用镊子将0.1μm透析膜放置在TE Buffer表面，盖盖静止润湿10min，用宽口枪头混匀DNA，将DNA全部点在膜上，不要点在膜边缘，每个膜可点2～3个DNA，将培养皿盖上盖子，在室温静止2.5h。

(23)用宽口枪头转移DNA到1.5mL离心管中，用枪头(USA Scientific,#1111-1810)轻轻的吹打最多9次至DNA混匀，4℃保存备用。

接着，利用提取的金龙鱼DNA进行脉冲场凝胶电泳试验，步骤同实施例1。

通过得到的脉冲场凝胶电泳图(如图2所示)，上述步骤得到的DNA长度仅达到23kB，其长度远远短于采用本发明的动物组织长片段DNA的提取方法得到的DNA长度。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为术语本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种动物组织长片段DNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)通过酶消化法对动物组织进行消化，制得细胞悬液；

2)通过琼脂糖包埋所述细胞悬液中的细胞，制成胶块，然后在胶块中进行蛋白酶K消化及RNase酶消化；

3)将消化后清洗好的胶块进行溶胶、透析，制得长片段DNA。

2.如权利要求1所述的动物长片段DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤1)中：若所述动物组织为肝组织，则通过胰酶对肝组织进行消化；若所述动物组织为非肝组织，则通过胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ对非肝组织进行消化。

3.如权利要求2所述的动物长片段DNA的提取方法，其特征在于：所述胰酶的消化体积百分比浓度为0.125～0.25％，所述胶原酶Ⅰ的消化浓度为0.7～1.3mg/mL，所述胶原酶Ⅳ的消化浓度为0.3～0.7mg/mL。

4.如权利要求1所述的动物长片段DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤1)为：制备动物组织匀浆；向所述组织匀浆中加入酶对组织进行消化，直至组织块变为柔软的絮状，镜检可观察到较多的分散细胞；过滤消化好的组织匀浆，离心过滤液，弃上清液，洗涤沉淀，加入缓冲液制备细胞悬液。

5.如权利要求1所述的动物长片段DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤2)中：所述蛋白酶K消化是在蛋白酶K消化液中进行的，所述RNase酶消化是在RNase酶消化液中进行的，所述蛋白酶K消化液由蛋白酶K与裂解缓冲液混合而成，其中，蛋白酶K的浓度为1.0～1.5mg/mL；RNase酶消化液由RNase酶和TE缓冲液混合而成，其中，RNase酶的浓度为0.15～0.25mg/mL。

6.如权利要求1所述的动物组织长片段DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤2)中：所述蛋白酶K消化的温度为50℃，消化时间为1.5～3h；所述RNase酶消化的温度为37℃，消化时间为1～2h。

7.如权利要求1所述的动物组织长片段DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤3)中：所述溶胶的过程为：先70℃下融化胶块，于40～45℃平衡后向胶块中加入琼脂糖酶，混匀，于40～45℃水浴35～50min；所述透析的过程为：将透析膜放置在TE缓冲液表面，静止湿润，混匀DNA，将DNA全部点在透析膜上。

8.一种动物组织长片段DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括动物组织消化酶、蛋白酶K消化液、RNase酶消化液、琼脂糖酶、TE缓冲液、冲洗缓冲液、低熔点琼脂糖和透析膜。

9.如权利要求8所述的动物组织长片段DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述动物组织消化酶包括胰酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ；所述蛋白酶K消化液由蛋白酶K和裂解缓冲液混合而成，其中，蛋白酶K的浓度为1.0～1.5mg/mL；所述RNase酶消化液由RNase酶和TE缓冲液混合而成，其中，RNase酶的浓度为0.15～0.25mg/mL。

10.如权利要求9所述的动物组织长片段DNA的提取试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)制备动物组织匀浆，取出动物组织消化酶，向组织匀浆中加入动物组织消化酶对组织进行消化，直至组织块变为柔软的絮状，镜检可观察到较多的分散细胞；其中，若所述动物组织为肝组织，则加入胰酶至其最终体积百分比浓度为0.125～0.25％，若所述动物组织为非肝组织，则加入胶原酶Ⅰ至其终浓度为0.7～1.3mg/mL及胶原酶IV至其终浓度为0.3～0.7mg/mL；过滤消化好的组织匀浆，离心过滤液，弃上清液，洗涤沉淀，加入缓冲液制得细胞悬液待包埋；

(2)取出低熔点琼脂糖凝胶，制备质量百分比浓度为1.5～3％低熔点琼脂糖凝胶溶液，将40～45℃的低熔点琼脂糖凝胶溶液与细胞悬液混合，并将制得的混合液加入成胶模具中进行凝固，制得胶块；取出蛋白酶K消化液，将胶块转移至蛋白酶K消化液中，确保胶块完全浸没，45～55℃加热1.5～3h，每隔一段时间混匀一次，然后用冲洗缓冲液和TE缓冲液清洗胶块；将胶块转移至RNase酶消化液中，35～40℃消化1～2h，每隔一段时间混匀一次，然后用冲洗缓冲液和TE缓冲液清洗胶块；

(3)融化胶块，加入琼脂糖酶，搅拌混匀琼脂糖酶与低熔点琼脂糖，于40～45℃水浴35～50min。将透析膜放置在TE缓冲液表面，静止湿润，混匀DNA，将DNA全部点在透析膜上；转移DNA至离心管中，混匀，保存备用。