CN110156903A - 一种莼菜多糖的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及莼菜多糖制备技术领域，为制备高纯度的莼菜多糖，公开了一种莼菜多糖的提取方法，将莼菜清洗后经低浓度氢氧化钠溶液浸泡脱胶，然后脱脂，再纤维素酶酶解，然后热水水提得到粗多糖溶液，加乙醇含量85～90wt%醇沉得粗多糖，然后将粗多糖分离并冷水冲洗后分散溶于10～15倍的热水中，超声处理，加氯仿和正丁醇脱蛋白，再超声处理后超滤膜过滤，然后加乙醇至含量为70～80wt%醇沉、洗涤、减压干燥得到灰白色胶状的莼菜多糖。本发明的莼菜多糖提取方法得到的莼菜多糖的纯度高，提取效率高，且以水溶性多糖为主，具有较高的生物活性。

Description

一种莼菜多糖的提取方法

技术领域

本发明涉及莼菜多糖制备技术领域，具体涉及一种莼菜多糖的提取方法。

背景技术

莼菜别名马蹄草、屏风、莼菜、胡菜等，是亚纲睡莲科莼菜属多年生淡水水生草本植物，生长于池塘、湖泊和沼泽中，主要分布于浙江、江苏、湖南和四川等地，是可供食用的稀有名贵蔬菜，其中以杭州西湖莼菜最为著名，且具《本草纲目》记载，莼菜具有清热、利水、消肿、治热痢、黄疸等功效，明朝时期便是宫廷贡品。

新鲜的莼菜中含水量达97％，余下含1％的多糖、0.76％的蛋白质以及丰富的氨基酸、微量元素和脂质物。莼菜所含多糖经研究主要有三种，分别是碱溶性多糖、水溶性多糖酸和酸溶性多糖，碱溶性多糖主要是体外多糖，即包裹在嫩芽外的透明胶质，含量最多，可经碱液如氢氧化钠、碳酸氢钠提取得到，酸溶性多糖和水溶性多糖大多分布在莼菜细胞内或细胞间质间，酸溶性多糖可通过酸溶液如低浓度盐酸、有机弱酸等提取得到，水溶性多糖通过热水提取得到，莼菜多糖中碱溶性多糖的含量是水溶性多糖含量的3～4倍。

高纯度的莼菜多糖在降血糖、血脂、抗肿瘤抗氧化，增强机体免疫力等方面具有重要意义，但是多糖溶于水是其发挥生物活性的关键所在。现有研究也表明水溶性多糖的抗氧化能力和清除自由基能力大大高于碱溶性多糖，若达到相同效果，需要碱溶性多糖浓度为水溶性多糖的2.5倍，因此从莼菜中提取莼菜的水溶性多糖具有积极的意义。但现有对莼菜多糖的提取研究主要集中在碱溶性多糖的提取制备上，涉及水溶性多糖的还比较少。中国专利申请CN201410603567.8，专利名称一种莼菜多糖的提取方法，公开了如下的提取步骤：将莼菜粉先脱脂，然后加入氢氧化钠溶液混合振荡提取，再离心分离得到含莼菜多糖的上清液，如此重复四次，然后将得到的上清液合并得到含莼菜多糖的上清液。该方法主要是提取碱溶性多糖，可能夹带水溶性多糖，同时所得多糖未纯化分离，多糖的纯度低，影响多糖活性的发挥。因此，有必要研究如何进一步制备纯度较高，且以水溶性多糖为主的莼菜多糖，增强莼菜多糖的生物活性。

发明内容

为制备高纯度的莼菜多糖，本发明的目的在于提供一种莼菜多糖的提取方法，所得莼菜多糖的纯度高，而且以水溶性多糖为主。

本发明提供如下的技术方案：

一种莼菜多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)清洗莼菜，在0.1～0.2mol/L氢氧化钠溶液中5～10℃浸泡、过滤、水洗、干燥，然后粉碎得莼菜粉；

(2)将莼菜粉浸渍于无水乙醇中，50～60℃旋转回流脱脂得脱脂莼菜粉；

(3)向脱脂莼菜粉中加纤维素酶溶液或果胶酶溶液或木瓜蛋白酶溶液50～60℃酶解处理，灭酶活性，离心得到酶解清液；

(4)浓缩酶解清液，与10～15倍体积热水混合提取得粗多糖溶液，加乙醇至乙醇含量85～90wt％醇沉得粗多糖；

(5)将粗多糖分离并冷水冲洗后，分散溶于10～15倍的热水中，超声处理，加入氯仿和正丁醇混合试剂搅拌混合，氯仿和正丁醇混合试剂与热水的体积比为1:1，然后离心去除不容杂质，得到离心液；

(6)将离心液加热至40～50℃，然后继续超声处理，再用超滤膜超滤，保留截留液；

(7)向截留液中加入无水乙醇至乙醇含量为70～80wt％，然后2～5℃静置过夜后离心，然后用乙醇洗涤多次，减压干燥得到莼菜多糖。

本发明的莼菜多糖提取方法中，首先将莼菜洗净后在低浓度氢氧化钠溶液中浸泡，通过氢氧化钠溶液脱除莼菜表面的大部分的酸性胶质多糖，然后脱脂制成莼菜粉，再经纤维素酶酶解，破坏莼菜细胞壁，使细胞内多糖充分释放，然后加热水提取，使提取的细胞内多糖以水溶性多糖为主，然后将得到的粗多糖溶液经85～90wt％的乙醇初步醇沉分离，去除乙醇溶杂质分子再分散于热水中经超声处理，超声一方面使水溶性多糖均匀分散在热水中，另一方面降低得到的多糖溶液的黏度，这样再加入氯仿和正丁醇混合试剂脱除蛋白质时，减少因多糖黏度高导致的蛋白质不能充分生成沉淀或者沉降，并方便离心分离，使蛋白质能够充分脱除。然后将离心液加热后继续超声处理，这样再次使离心后的多糖溶液的黏度趋于蛋白质脱除前，然后超滤处理去除色素等小分子杂质，然后再次乙醇醇沉得到莼菜多糖，由于经过预先脱除碱溶性多糖、脱脂、并以热水水提、乙醇醇沉初步除杂、脱蛋白质、超滤膜超滤、乙醇再次醇沉等过程处理，得到的莼菜多糖的纯度高，并且以水溶性多糖为主，且步骤(1)所得碱液可用于提取碱溶性多糖的原料液。

作为本发明方法的优选，步骤(2)中莼菜粉与无水乙醇的料液比为1g:10～20mL，回流脱脂1～2h。

作为本发明方法的优选，还包括向步骤(3)所得酶解清液中加入岩藻糖苷酶二次酶解，灭活性得到酶解清液，然后操作步骤(4)，岩藻糖苷酶的加入量为步骤(3)酶解清液质量的0.6～1wt％，酶解温度50～60℃，时间60～120min。新鲜莼菜中不仅含有1％的多糖物质，还含有0.076％的蛋白质，存在蛋白质与多糖形成的糖蛋白物质，这样通过岩藻糖苷酶二次酶解，使糖蛋白分解得到多糖链和蛋白质，使莼菜中的多糖得到有效提取，提高提取率。

作为本发明方法的优选，步骤(3)中脱脂莼菜粉的浓度为10～15wt％、纤维素酶或果胶酶或木瓜蛋白酶的浓度为0.6～1wt％，酶解时间60～120min。

作为本发明方法的优选，步骤(6)中还包括超声处理后向离心液中通入高含氧空气并施加光照，高含氧空气的氧气体积浓度为40～50v/v％，1L离心液中的高含氧空气通入量为10～20ml/min，光照强度为5000～6000Lux。通过光照和高含氧空气共同作用氧化分解粗多糖溶液中夹带的色素等物质，例如未溶解但也未能充分去除的叶绿素等，提高纯度。

作为本发明方法的优选，热水温度为40～50℃，超声处理的功率为200～300W，处理时间10～20min。通过控制合适的水提温度和超声功率，降低多糖的粘度。超声功率过高可能导致糖链断开，超声功率低则无法有效降低粘度。

作为本发明方法的优选，步骤(7)中减压干燥的温度≤70℃、干燥时间5～6h。

本发明的有益效果如下：

本发明的莼菜多糖提取方法通过热水水提，并经脱碱溶性多糖、脱脂、多蛋白、乙醇两步醇沉和超滤膜超滤等方法处理，得到的莼菜多糖的纯度高，提取效率高，且以水溶性多糖为主。

具体实施方式

下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。

如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。

实施例1

一种莼菜多糖的提取方法，包括以下步骤：

(1)清洗莼菜，在0.2mol/L氢氧化钠溶液中5℃浸泡、过滤、水洗、干燥，粉碎得莼菜粉；

(2)将莼菜粉浸渍于无水乙醇中，莼菜粉与乙醇的料液比为1g:20mL，60℃旋转回流脱脂1h得脱脂莼菜粉；

(3)向脱脂莼菜粉中加纤维素酶溶液60℃酶解处理，脱脂莼菜粉的浓度为15wt％、纤维素酶的浓度为1wt％，酶解时间90min，灭酶活性，离心得到酶解清液；

(4)浓缩酶解清液，与15倍体积热水混合提取得粗多糖溶液，热水温度为50℃，加乙醇至乙醇含量90wt％醇沉得粗多糖；

(5)将粗多糖分离并冷水冲洗后，分散溶于15倍的热水中，热水温度为50℃，300W超声处理10min，加入氯仿和正丁醇混合试剂搅拌混合，氯仿和正丁醇混合试剂与热水的体积比为1:1，氯仿与正丁醇的体积比为3:1，然后离心去除不容杂质，得到离心液；

(6)将离心液加热至50℃，继续300W超声处理10min，用10000NMWC超滤膜超滤，保留截留液；

(7)向截留液中加入无水乙醇至乙醇含量为80wt％，然后2℃静置过夜后离心，然后用乙醇洗涤多次，减压干燥得到灰白色胶状的莼菜多糖，减压干燥的温度≤70℃，为50℃、干燥时间5h。

实施例2

一种莼菜多糖的提取方法，包括以下步骤：

(1)清洗莼菜，在0.1mol/L氢氧化钠溶液中8℃浸泡、过滤、水洗、干燥，粉碎得莼菜粉；

(2)将莼菜粉浸渍于无水乙醇中，莼菜粉与乙醇的料液比为1g:15mL，55℃旋转回流脱脂2h得脱脂莼菜粉；

(3)向脱脂莼菜粉中加木瓜蛋白酶溶液55℃酶解处理，脱脂莼菜粉的浓度为13wt％、木瓜蛋白酶的浓度为0.8wt％，酶解时间60min，灭酶活性，离心得到酶解清液；

(4)浓缩酶解清液，与13倍体积热水混合提取得粗多糖溶液，热水温度为45℃，加乙醇至乙醇含量85wt％醇沉得粗多糖；

(5)将粗多糖分离并冷水冲洗后，分散溶于13倍的热水中，热水温度为45℃，250W超声处理15min，加入氯仿和正丁醇混合试剂搅拌混合，氯仿和正丁醇混合试剂与热水的体积比为1:1，氯仿与正丁醇的体积比为3:1，然后离心去除不容杂质，得到离心液；

(6)将离心液加热至45℃，继续250W超声处理15min，用10000NMWC超滤膜超滤，保留截留液；

(7)向截留液中加入无水乙醇至乙醇含量为75wt％，然后3℃静置过夜后离心，然后用乙醇洗涤多次，减压干燥得到灰白色胶状的莼菜多糖，减压干燥的温度≤70℃，为40℃、干燥时间6h。

实施例3

一种莼菜多糖的提取方法，包括以下步骤：

(1)清洗莼菜，在0.1mol/L氢氧化钠溶液中10℃浸泡、过滤、水洗、干燥，粉碎得莼菜粉；

(2)将莼菜粉浸渍于无水乙醇中，莼菜粉与乙醇的料液比为1g:10mL，50℃旋转回流脱脂2h得脱脂莼菜粉；

(3)向脱脂莼菜粉中加果胶酶溶液50℃酶解处理，脱脂莼菜粉的浓度为10wt％、果胶酶的浓度为0.6wt％，酶解时间120min，灭酶活性，离心得到酶解清液；

(4)浓缩酶解清液，与10倍体积热水混合提取得粗多糖溶液，热水温度为40℃，加乙醇至乙醇含量85wt％醇沉得粗多糖；

(5)将粗多糖分离并冷水冲洗后，分散溶于10倍的热水中，热水温度为40℃，200W超声处理20min，加入氯仿和正丁醇混合试剂搅拌混合，氯仿和正丁醇混合试剂与热水的体积比为1:1，氯仿与正丁醇的体积比为3:1，然后离心去除不容杂质，得到离心液；

(6)将离心液加热至40℃，继续200W超声处理20min，用10000NMWC超滤膜超滤，保留截留液；

(7)向截留液中加入无水乙醇至乙醇含量为70wt％，然后5℃静置过夜后离心，然后用乙醇洗涤多次，减压干燥得到灰白色胶状的莼菜多糖，减压干燥的温度≤70℃，为35℃，干燥时间6h。

实施例4

一种莼菜多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于：向步骤(3)所得酶解清液中加入岩藻糖苷酶二次酶解，灭活性得到酶解清液，然后再操作步骤(4)，其中，岩藻糖苷酶的加入量为步骤(3)酶解清液质量的1wt％，酶解温度60℃，时间60min。

实施例5

一种莼菜多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于：向步骤(3)所得酶解清液中加入岩藻糖苷酶二次酶解，灭活性得到酶解清液，然后再操作步骤(4)，其中，岩藻糖苷酶的加入量为步骤(3)酶解清液质量的0.6wt％，酶解温度50℃，时间120min。

实施例6

一种莼菜多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于：向步骤(3)所得酶解清液中加入岩藻糖苷酶二次酶解，灭活性得到酶解清液，然后再操作步骤(4)，其中，岩藻糖苷酶的加入量为步骤(3)酶解清液质量的0.8wt％，酶解温度55℃，时间90min。

实施例7

一种莼菜多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于：步骤(6)中还包括超声处理后向离心液中通入高含氧空气并施加光照，然后再超滤处理，其中高含氧空气的氧气体积浓度为40v/v％，1L离心液中的高含氧空气通入量为20ml/min，光照强度为6000Lux。

实施例8

一种莼菜多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于：步骤(6)中还包括超声处理后向离心液中通入高含氧空气并施加光照，然后再超滤处理，其中高含氧空气的氧气体积浓度为45v/v％，1L离心液中的高含氧空气通入量为15ml/min，光照强度为5500Lux。

实施例9

一种莼菜多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于：步骤(6)中还包括超声处理后向离心液中通入高含氧空气并施加光照，然后再超滤处理，其中高含氧空气的氧气体积浓度为50v/v％，1L离心液中的高含氧空气通入量为10ml/min，光照强度为5000Lux。

实施例10

一种莼菜多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于：

向步骤(3)所得酶解清液中加入岩藻糖苷酶二次酶解，灭活性得到酶解清液，然后再操作步骤(4)，其中，岩藻糖苷酶的加入量为步骤(3)酶解清液质量的0.8wt％，酶解温度55℃，时间90min；

步骤(6)中还包括超声处理后向离心液中通入高含氧空气并施加光照，然后再超滤处理，其中高含氧空气的氧气体积浓度为40v/v％，1L离心液中的高含氧空气通入量为20ml/min，光照强度为6000Lux。

对比例1：按照实施例1的方法提取莼菜多糖，但是在步骤(5)和步骤(6)中不施加超声处理。

1、莼菜多糖的提取率和纯度

采用蒽酮-硫酸法测定各实施例和对比例1所得莼菜多糖的质量，并分别计算莼菜多糖的提取率，结果如表1所示，其中提取率为所得莼菜多糖相对莼菜粉质量的百分比。

表1莼菜多糖的提取率和纯度

项目	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	对比例1
												提取率/％	9.82	9.60	9.24	11.46	10.32	10.88	9.74	9.68	9.84	11.62	9.56
纯度/％	86.6	85.2	84.8	85.4	86.0	84.6	90.2	89.4	88.6	91.4	79.6

2、莼菜多糖对体外羟基自由基的清除性能测试

测试方法参照程超的对体外羟基自由基的清除试验方法(平菇水溶性多糖结构表征与体外抗氧化作用，食品科学，2005，26(8)：55～58)，莼菜多糖浓度为1mg/mL。

测试结果如表2所示，其中：

对比例2为中国专利申请CN201410603567.8所得莼菜多糖，且按1wt％分散在热水中，然后加氯仿和正丁醇脱除蛋白质，再经10000NMWC超滤膜超滤，然后65％乙醇醇沉得到的以碱溶性多糖为主的莼菜多糖，纯度为80.2％。

表2莼菜多糖多体外羟基自由基(·OH)的清除率

项目	实施例1	实施例4	实施例7	实施例10	对比例1	对比例2
							清除率/％	18.24	17.92	18.66	18.94	16.74	11.22

Claims (7)

1.一种莼菜多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）清洗莼菜，在0.1～0.2mol/L氢氧化钠溶液中5～10℃浸泡、过滤、水洗、干燥，然后粉碎得莼菜粉；

（2）将莼菜粉浸渍于无水乙醇中，50～60℃旋转回流脱脂得脱脂莼菜粉；

（3）向脱脂莼菜粉中加纤维素酶溶液或果胶酶溶液或木瓜蛋白酶溶液50～60℃酶解处理，灭酶活性，离心得到酶解清液；

（4）浓缩酶解清液，与10～15倍体积热水混合提取得粗多糖溶液，加乙醇至乙醇含量85～90wt%醇沉得粗多糖；

（5）将粗多糖分离并冷水冲洗后，分散溶于10～15倍的热水中，超声处理，加入氯仿和正丁醇混合试剂搅拌混合，氯仿和正丁醇混合试剂与热水的体积比为1:1，然后离心去除不容杂质，得到离心液；

（6）将离心液加热至40～50℃，然后继续超声处理，再用超滤膜超滤，保留截留液；

（7）向截留液中加入无水乙醇至乙醇含量为70～80wt%，然后2～5℃静置过夜后离心，然后用乙醇洗涤多次，减压干燥得到莼菜多糖。

2.根据权利要求1所述的莼菜多糖的提取方法，其特征在于，步骤（2）中莼菜粉与无水乙醇的料液比为1g:10～20mL，回流脱脂1～2h。

3.根据权利要求1所述的莼菜多糖的提取方法，其特征在于，还包括向步骤（3）所得酶解清液中加入岩藻糖苷酶二次酶解，灭活性得到酶解清液，然后操作步骤（4），岩藻糖苷酶的加入量为步骤（3）酶解清液质量的0.6～1wt%，酶解温度50～60℃，时间60～120min。

4.根据权利要求1或3所述的莼菜多糖的提取方法，其特征在于，步骤（3）中脱脂莼菜粉的浓度为10～15wt%、纤维素酶或果胶酶或木瓜蛋白酶的浓度为0.6～1wt%，酶解时间60～120min。

5.根据权利要求1所述的莼菜多糖的提取方法，其特征在于，步骤（6）中还包括超声处理后向离心液中通入高含氧空气并施加光照，高含氧空气的氧气体积浓度为40～50v/v%，1L离心液中的高含氧空气通入量为10～20ml/min，光照强度为5000～6000Lux。

6.根据权利要求1或5所述的莼菜多糖的提取方法，其特征在于，热水温度为40～50℃，超声处理的功率为200～300W，处理时间10～20min。

7.根据权利要求1所述的莼菜多糖的提取方法，其特征在于，步骤（7）中减压干燥的温度≤70℃、干燥时间5～6h。