CN104341533A

CN104341533A - 一种莼菜多糖提取方法

Info

Publication number: CN104341533A
Application number: CN201410603567.8A
Authority: CN
Inventors: 张宇昊; 马良; 刘馨
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2015-02-11

Abstract

本发明公开了一种莼菜多糖提取方法，将冻干莼菜粉碎，采用石油醚于50℃下抽提脱脂，室温下挥干溶剂后，置于烘箱中40℃烘干，得到烘干后的莼菜粉，加入NaOH溶液，于水浴振荡器上震荡提取，然后进行离心处理，得到含有莼菜多糖的上清液，提取出上清液，剩下莼菜粉沉淀物加入NaOH溶液继续提取，提取次数总共四次，将每次得到的上清液合并，得到最终含有多糖的上清液，测定多糖得率。本发明的有益效果是莼菜原材料利用率高，效果好，用本发明的方法提取莼菜多糖产量高。

Description

一种莼菜多糖提取方法

技术领域

本发明属于植物提取多糖的方法技术领域，涉及一种莼菜多糖提取方法。

背景技术

莼菜为我国传统珍稀水生蔬菜，具有丰富的营养价值和药用价值，据《本草纲目》记载，莼菜具有消渴热痹、治热疸、厚肠胃、安下焦、逐水、解百毒等功效。重庆石柱莼菜生长于重庆市东南部三峡库区腹地的土家族自治县，平均海拔1500米以上，水质良好，土壤肥沃，莼菜年产量达1000吨，是我国乃至亚洲、全世界最大的莼菜基地。研究表明，莼菜多糖具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂、降血糖、消炎抑菌、改善便秘和增进食欲的作用，具有较高的保健价值。国外莼菜多糖价格昂贵，国际市场售价已达到3000美元/千克。目前关于莼菜多糖提取方面的研究极少，采用传统方法提取产量低，利用率低。极大制约了莼菜产业的发展。研究发现，构成莼菜多糖的主要是碱溶性的酸性多糖和少量的中性多糖，故考虑采用碱液浸提法进行提取。本实验以石柱莼菜为研究对象，研究了影响莼菜多糖提取的主要因素，并采用正交试验进行优化，研究实验条件下最佳提取工艺。

莼菜多糖是莼菜的主要特征成分之一，主要存在于莼菜表面的胶质中，研究发现胶质中主要由酸性多糖和中性多糖组成。莼菜多糖提取研究较少，采用的方法也比较单一。周毅峰等对莼菜胶质的分离条件作了研究。王婧以解冻莼菜芽为原料，选择了莼菜多糖的提取溶剂，研究了莼菜多糖的提取工艺，但尚未进行工艺优化。溶剂提取法是多糖提取方法中较为传统的方法，也是多糖提取使用较多的一种方法，较为经济，但是花费时间较长，同时所需的温度也较高，并且提取多糖的同时，蛋白质、色素等也会随之渗出。酶辅助提取法也是多糖提取较为常用的方法,利用的酶专一性的性质，如采用纤维素酶，破坏植物细胞壁，使有效成分得以溶出的方法，酶法辅助提取具有提取率高、花费时间短、环境污染小的特点,但是需要研究酶的种类且存在成本大幅升高的问题，不好实现产业化。总体上讲传统提取方式实现成本低的同时多糖提取率较低。

发明内容

本发明的目的在提供一种莼菜多糖提取方法，解决了现有的莼菜多糖传统提取方法提取出来的多糖产量低，莼菜产出多糖率低的问题。

本发明的技术方案为按照以下步骤进行：

步骤1，将冻干莼菜粉碎，过40目筛，采用石油醚于50℃下抽提脱脂，抽提脱脂的时间为1.9-2.1小时，室温下挥干溶剂后，置于烘箱中40℃烘干，得到烘干后的莼菜粉进行下一步骤；

步骤2，在莼菜粉中加入NaOH溶液，于水浴振荡器上震荡提取，振荡频率为175-185r/min；提取1-5小时，提取温度30℃-90℃，然后进行离心处理，离心转速7300-7700r/min，离心时间4-6min；得到含有莼菜多糖的上清液，提取出上清液，剩下莼菜粉沉淀物进行下一步；

步骤3，将莼菜粉沉淀物加入NaOH溶液继续提取，选取莼菜粉沉淀物加入NaOH溶液，重复上一步骤进行震荡提取和离心的过程，再次提取出得到的上清液；

步骤4，重复步骤3共4次，将每次得到的上清液合并，得到最终含有多糖的上清液，测定多糖得率。

进一步，所述步骤1中，石油醚沸程为30～60℃。

进一步，所述步骤2中，在莼菜粉中加入NaOH溶液，料液比为1:24-1:36(g/mL)；NaOH溶液浓度为0.09-0.11mol/L。

进一步，所述步骤3中，莼菜粉沉淀物与NaOH溶液料液比为1:24-1:36(g/mL)。

本发明的有益效果是莼菜原材料利用率高，效果好，用本发明的方法提取莼菜多糖产量高。

附图说明

图1是本发明吸光值与葡萄糖标准曲线图；

图2是本发明氢氧化钠浓度对提取率的影响曲线图；

图3是本发明料液比对提取率的影响曲线图；

图4是本发明提取次数对提取率的影响曲线图；

图5是本发明浸提温度对提取率的影响曲线图；

图6是本发明提取时间对多糖提取率的影响曲线图；

图7是本发明震荡频率对多塘提取率的影响曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明中莼菜多糖提取工艺流程为：

步骤1，将冻干莼菜粉碎，过40目筛，采用石油醚沸程为30～60℃，于50℃下抽提脱脂，抽提脱脂的时间为1.9-2.1小时，室温下挥干溶剂后，置于烘箱中40℃烘干，得到烘干后的莼菜粉进行下一步骤；

步骤2，在莼菜粉中加入NaOH溶液，料液比为1:24-1:36(g/mL)；NaOH溶液浓度为0.09-0.11mol/L，于水浴振荡器上震荡提取，振荡频率为175-185r/min；提取1-5小时，提取温度30℃-90℃，然后进行离心处理，离心转速7300-7700r/min，离心时间4-6min；得到含有莼菜多糖的上清液，提取出上清液，剩下莼菜粉沉淀物进行下一步；

步骤3，将莼菜粉沉淀物加入NaOH溶液继续提取，选取莼菜粉沉淀物加入NaOH溶液，莼菜粉沉淀物与NaOH溶液料液比为1:24-1:36(g/mL)，重复上一步骤进行震荡提取和离心的过程，再次提取出得到的上清液；

对此种方法进行分析，主要试剂有葡糖糖、硫酸、苯酚、石油醚、氢氧化钠。以上试剂均为分析用。仪器与设备的准备，JA300B电子天平、FA2004B电子天平上海精天仪器厂；JB-260恒温水浴锅、RES2CS-1旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司；5804R台式高速离心机德国Eppendorf公司；CJ-78-1磁力加热搅拌上海将任实验设备有限公司；ALPAAI-4LSC真空冷冻干燥机德国Chist公司；UV-2450紫外分光光度计日本岛津公司；QL-901旋涡混合器海门市其林贝尔仪器制造有限公司。下面是对发明方法的实验；

多糖提取单因素试验：

以总糖浸出率为指标评价莼菜多糖的提取效果。单因素试验基本条件设定为：NaOH溶液浓度0.1mol/L，提取温度60℃，料液比1:30(g/mL)，提取时间2h，提取次数2次，振荡频率为175r/min。在改变一个条件，固定其他条件的情况下，分析NaOH溶液浓度、提取时间、提取次数、提取温度、振荡频率、料液比对提取率的影响。各因素梯度分别为：NaOH溶液浓度：0.01、0.05、0.1、0.15、0.2mol/L；水提时间：1、2、3、4、5h；料液比：1:10、1:30、1:50、1:70；提取次数：1、2、3、4次；提取温度：30、50、70、90℃；振荡频率：60、100、140、180、220r/min。每个单因素重复试验3次，结果取平均值。

多糖提取的正交试验设计：

根据单因素实验结果，选取四个主要影响因子：选取料液比、NaOH溶液浓度、提取次数、振荡频率，采用正交表L₉(3⁴)进行正交试验。实验因素及水平如下表1所示：

表1

总糖含量的测定：

总糖含量采用硫酸-苯酚法进行检测。多糖在浓硫酸的作用下，脱水生成糖醛及其衍生物，与苯酚结合后产生黄色物质，该物质在490nm有最大吸光值，吸光值的大小与多糖含量呈正比。

(1)葡萄糖标准曲线的制作：

称取一定量的葡萄糖于105℃烘干至恒重后，准确称取0.100g，纯水定容至100mL，即得葡萄糖标准储备液。分别准确吸取0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL储备液，分别置于100mL容量瓶以纯水定容，配制成0，20，40，60，80，100μg/mL待测液。准确吸取1.0mL待测液于试管中，依次加入1mL 6％苯酚，5mL浓硫酸，混匀，室温静置30min。另取一只试管，准确吸取1.0mL纯水，依次加入1mL6％苯酚，5mL浓硫酸，混匀，室温静置30min，作为空白对照。490nm处测吸光值，以吸光度对葡萄糖浓度进行回归，得到回归方程y＝0.0101x-0.0697，R²＝0.9937。式中：y为在波长490nm处的吸光值，x为葡萄糖的浓度(μg/mL)，图1为吸光值与葡萄糖标准曲线图。

以总糖浸出率来评价多糖得率，总糖含量按下式计算：

总糖含量％＝(m’×V×N)/(Vs×m×10⁶)×100％，式中：

m’：标准曲线上查得的葡萄糖含量，μg；

V：样液体积，mL；

N：稀释倍数；

Vs：测定时吸取样液的体积，mL；

m：样品的质量，g。

将莼菜多糖提取液定容至250mL容量瓶，准确吸取1.0mL于10mL容量瓶中，以纯水定容。混匀后准确吸取1.0mL待测液于试管中，依次加入1mL新鲜配制的6％苯酚，5mL浓硫酸混匀，室温静置30min。另取一只试管，准确吸取1.0mL纯水，依次加入1mL6％苯酚，5ml浓硫酸，混匀，室温静置30min，作为空白对照，于490nm处测定吸光值。

单因素试验结果：

NaOH溶液浓度对多糖提取率的影响，提取温度为60℃，料液比为1:30，提取次数2次，提取时间2h，考察不同NaOH溶液浓度对总糖浸出率的影响，由图2可知，NaOH溶液浓度在0.01mol/L到0.1mol/L的范围内，多糖提取率随着NaOH溶液浓度的显著上升(p＜0.05)，0.1mol/L时达到最大值14.65％，这可能是由于在相对较低的碱浓度的情况下，酸性多糖会随着提取液碱性的增强而更易被溶出，另外，多糖与蛋白质等物质之间可能会以非共价键形态结合在一起，碱性条件下，蛋白质等易被溶解，从而将多糖释放出来，之后随碱浓度增加，总糖浸出率增加显著下降(p＜0.05)，这有可能是加热情况下，碱浓度过高会导致多糖降解。故选取碱浓度为0.1mol/L。

液料比对多糖提取率的影响：

固定提取温度为60℃，NaOH溶液浓度为0.1mol/L，提取次数2次，时间2h，考察不同料液比对总糖浸出率的影响，结果如图3所示，料液比对多糖的提取率有显著影响，料液比过低，多糖提取不完全，料液比过高导致能源的浪费。料液比从1:10上升至1:30时，总糖浸出率显著增加(p＜0.05)，当料液比为1:30时，提取率达到14.46％，这是由于水的比例增加，多糖在溶剂和物料之间的浓度差增大，提高传质速率加快，多糖提取率增加；之后总糖渗出率随料液比增大不再增加，甚至略有下降的趋势，可能是多糖已完全溶出，和外界溶剂的浓度达到平衡状态，同时由于增大了料液比有可能使其他非糖类物质渗出，导致糖相对含量下降。考虑到提取率和能源消耗两方面的因素，选取料液比为1:30。

提取次数对多糖提取率的影响：

固定提取温度为60℃，料液比为1:30，NaOH溶液浓度为0.1mol/L，提取时间2h，考察不同提取次数对总糖浸出率的影响，结果如图4所示，提取1次，2次，3次，总糖浸出率率无显著性增加(p＞0.05)，当提取次数为4次时，浸出率有显著增加(p＜0.05)，提取率达到16.95％，故选择提取次数为4次。

提取温度对多糖提取率的影响：

料液比为1:30，NaOH溶液浓度为0.1mol/L，提取时间2h，提取次数2次，考察不同提取温度分别对总糖浸出率的影响，结果图5所示，随着温度升高，总糖浸出率无显著增加(p＞0.05)，温度过高时略有下降，温度过高容易导致多糖的降解、色素溶出增加、多糖活性降低，且提取温度越高，成本费用越高，故选择提取温度为30℃。

提取时间对多糖提取率的影响：

提取温度60℃，料液比为1:30，碱浓度为0.1mol/L，提取次数2次，考察不同提取时间对总糖浸出率的影响，结果如图6所示，当浸提时间在3h内时，总糖浸出率随浸提时间的延长显著提高(p＜0.05)，这可能是由于随着提取的时间增加，多糖在水溶中溶解地更为充分，当浸提时间超过3h后，总糖浸出率随提取时间增加而无显著增长(p＞0.05)，此时提取率为17.88％，这可能是由于多糖溶解度已基本达到饱和，故总糖浸出率无显著增加；此外过长时间的提取也容易导致多糖的降解，因此浸提时间选定3h。

振荡频率对多糖提取率的影响实验：

固定提取温度60℃，料液比为1:30，碱浓度为0.1mol/L，提取时间2小时，提取次数2次，考察不同振荡频率对总糖浸出率的影响，结果如图7所示，总糖浸出率随震荡频率增加而增加，当转速上升到180r/min后，总糖浸出率显著增加(p＜0.05)，此时提取率为16.13％，之后随着转速的增加，总糖浸出率无显著增加(p＞0.05)，故选择转速为180r/min。莼菜多糖提取正交实验结果如下表2所示：

表2

极差分析可知，在考察的4个因素中，极差大小依次为：振荡频率＞碱浓度＞提取时间＞料液比，由此可见影响莼菜多糖提取的主次顺序依次为振荡频率、碱浓度、提取时间、料液比。根据正交试验结果，莼菜多糖提取的最优组合为A₂B₂C₁D₁，即料液比1:30(g/mL)，NaOH溶液浓度0.1mol/L，震荡频率180r/min，提取时间2小时，提取温度30℃，提取4次。在此条件下进行多糖提取，提取率为17.65％。

以总糖浸出率为考察指标，研究不同碱液浓度、料液比、浸提温度、浸提时间、转速、提取次数等单因素对莼菜多糖提取率的影响，在单因素试验的基础上，选取了料液比、碱浓度、提取次数、转速为考察因素，采用正交表L₉(3⁴)进行正交试验，从而得出莼菜多糖提取的最优工艺。

下面列举具体实施例对本发明进行说明：

实施例1，料液比1:30(g/mL)，碱浓度0.1mol/L，震荡频率180r/min，提取时间2小时，提取温度30℃，提取4次；

实施例2，考虑到能源、效率及成本等其他因素，选取莼菜多糖提取工艺为料液比1:24(g/mL)，碱浓度0.1mol/L，震荡频率180r/min，提取时间2小时，提取温度30℃，提取4次。

实施例3，料液比1:25(g/mL)，碱浓度0.09mol/L，震荡频率175r/min，提取时间2小时，提取温度30℃，提取4次。

实施例4，料液比1:25(g/mL)，碱浓度0.11mol/L，震荡频率185r/min，提取时间2小时，提取温度30℃，提取4次。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种莼菜多糖提取方法，其特征在于：按照以下步骤进行：

2.按照权利要求1所述一种莼菜多糖提取方法，其特征在于：所述步骤1中，石油醚沸程为30～60℃。

3.按照权利要求1所述一种莼菜多糖提取方法，其特征在于：所述步骤2中，在莼菜粉中加入NaOH溶液，料液比为1:24-1:36(g/mL)；NaOH溶液浓度为0.09-0.11mol/L。

4.按照权利要求1所述一种莼菜多糖提取方法，其特征在于：所述步骤3中，莼菜粉沉淀物与NaOH溶液料液比为1:24-1:36(g/mL)。