CN104211829A - 一种银耳功能性多糖的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银耳功能性多糖的制备方法及其应用。本发明以市售银耳为原料，所述制备方法包括步骤：混合、水提、碱提、透析、浓缩、沉淀、润洗和干燥。本方法最大程度地提高了银耳多糖的得率，而根据本方法制备而得的银耳多糖能够保持较高的抗氧化活性，可以应用于抗氧化食品和药物中。

Description

一种银耳功能性多糖的制备及应用

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，涉及一种功能性多糖的制备及应用，尤其涉及一种以银耳为原料的功能性多糖的制备及应用。

背景技术

银耳是一种经济价值高，营养丰富的药食两用菌，具有滋补生津、润肺养胃的功效。研究表明，银耳中的多糖具有广泛的生理活性，能提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖和降血脂等。另外，作为一种天然药食两用菌，它对人体基本上没有负作用。所以，开发银耳的生物活性，并应用于保健和药品行业，有着广阔的需求市场。

近年来有很多对银耳多糖的提取方法的研究报道。利用热水浸提法提取银耳多糖，通过单因素和正交试验考察了不同提取条件对银耳多糖提取率的影响，得出银耳多糖的最佳提取工艺条件(周帅飞等，银耳多糖的提取工艺研究，安徽农业科学，2013,41(27):11148-11149)。利用微波辅助萃取法，分析了微波功率、加热温度、保持时间对银耳多糖提取率的影响，得到微波辅助提取银耳多糖的最佳工艺条件(吴琼等，微波辅助萃取银耳多糖的研究，食品科技，2006,9:109-111)。通过比较水浸提法、碱浸提法和酶法对银耳多糖的提取率，研究得出利用果胶酶浸提能够得到得率较高的银耳多糖(崔蕊静等，银耳多糖的提取及其在饮料中的应用，中国食用菌，2003,23(2):39-41)。采用热水浸提、乙醇沉淀和Sevag法得到银耳多糖，并对银耳多糖的抗氧化活性进行了评价(颜军等，银耳多糖的提取及其清除自由基作用，成都大学学报，2006,25(1):35-38)。多糖的提取或制备方法影响其抗氧化活性(王艳丽等，超声参数对白术多糖抗氧化活性的影响，生物加工过程[J]，2012,10(1):7-12；张丽霞等，不同提取方法对桦褐孔菌多糖抗氧化活性的影响，安徽农业科学[J]，2012,40(10):5870-5872)。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种能提高产率和抗氧化活性的银耳多糖制备方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何在制备银耳多糖的过程中，既提高多糖的得率和又保持多糖的抗氧化活性。

为实现上述目的，本发明提供了一种银耳功能性多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)混合：将银耳除杂洗净，加入蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；

2)水提：在加热条件下，对步骤1)中的混合液进行磁力搅拌，一段时间后将混合液用滤布过滤，得到的滤液即为水提液，将滤渣取出进行碱提；

3)碱提：在步骤2)的滤渣中加入NaOH溶液，在加热条件下进行磁力搅拌，一段时间后用滤布过滤，得到的滤液即为碱提液；

4)透析：向步骤3)的碱提液中加入盐酸，调溶液pH值至7，然后用透析袋透析；

5)浓缩：合并步骤2)中的水提液和步骤4)中透析后的碱提液，加热浓缩，得到浓缩液；

6)沉淀：在步骤5)的浓缩液中加入乙醇，静置过夜，以除去蛋白质；

7)润洗：将步骤6)中静置过夜后得到的浓缩液离心，去除上层清液，用低沸点有机溶剂润洗沉淀；

8)干燥：将步骤7)润洗后的沉淀吹干，得到银耳功能性多糖。

优选地，步骤1)中的银耳为市售银耳，按重量计其含水量为5％；加入蒸馏水的重量为银耳重量的20-40倍；所用打磨机为家用型或实验室用型。

优选地，步骤2)和步骤3)中的加热温度为80-100℃，搅拌时间为2-3小时；所用的滤布为200目或以上。

优选地，步骤3)中加入NaOH溶液的浓度为0.5-1mol/L，加入的量为滤渣重量的20-40倍。

优选地，步骤4)中加入的盐酸是浓盐酸稀释后的稀盐酸溶液，其较佳的浓度为6mol/L；透析过程中所使用的透析袋规格为3500Da的截留分子量，透析时间为24小时。

优选地，步骤5)的浓缩过程在可调温度的恒温加热装置上进行，加热温度为80-100℃；最终得到的浓缩液体积为浓缩前体积的1/20。

优选地，步骤6)中加入乙醇的量为使最终混合后的溶液中乙醇的体积百分比浓度大于80％。

优选地，步骤7)中离心的转速为4000rpm；润洗所用的低沸点有机溶剂为丙酮、乙醇和乙醚中的一种或多种。

此外，本发明还提供了用上述方法制备而得的银耳功能性多糖。本发明的银耳功能性多糖可应用于抗氧化食品和药品中。

本发明采用了以上技术方案，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明提供了一种银耳功能性多糖的制备方法，相较于现有的常规制备方法，所得的多糖具有更高的得率；

2、本发明所得的银耳多糖，相较于现有的常规制备方法，具有更高的抗氧化活性。

以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的两个较佳实施例与对比例获得的多糖的得率对比图；

图2是本发明的两个较佳实施例与对比例获得的多糖的ORAC抗氧化活性对比图，其中TE为trolox当量；

图3是本发明的两个较佳实施例与对比例获得的多糖的CAA抗氧化活性对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1)混合：将市售银耳除杂洗净，加入20倍重量蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；

2)水提：在加热温度为100℃条件下，对步骤1)中混合液进行磁力搅拌，水提2小时，再将混合液用滤布过滤，得到滤液即为水提液，将滤渣取出进行碱提；

3)碱提：在步骤2)的滤渣中加入20倍重量的NaOH溶液(0.5mol/L)，在加热温度为100℃条件下进行磁力搅拌，碱提2小时后用滤布过滤，得到滤液即为碱提液；

4)透析：向步骤3)的碱提液中加入盐酸(6mol/L)，调节溶液pH值至7，然后透析24小时；

5)浓缩：合并步骤2)中的水提液和步骤4)中透析后的碱提液，在加热温度为80℃条件下浓缩至原来体积的1/20，得到浓缩液；

6)沉淀：在步骤5)的浓缩液中加入乙醇，使得混合均匀后乙醇最终的体积百分比浓度大于80％，静置过夜；

7)润洗：将步骤6)中静置过夜的浓缩液在4000rpm下离心后去除上层清液，相继用丙酮和乙醚润洗沉淀；

8)干燥：将步骤7)润洗后的沉淀吹干、称重，并进行抗氧化活性评价。

实施例2

1)混合：将市售银耳除杂洗净，加入40倍重量的蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；

2)水提：在加热温度为80℃条件下，对步骤1)中混合液进行磁力搅拌，水提3小时，再将混合液用滤布过滤，得到滤液即为水提液，将滤渣取出进行碱提；

3)碱提：在步骤2)的滤渣中加入40倍重量的NaOH溶液(1mol/L)，在加热温度为80℃的条件下进行磁力搅拌，碱提3小时后用滤布过滤，得到滤液即为碱提液；

4)透析：向步骤3)的碱提液中加入盐酸(6mol/L)，调节溶液pH值至7，然后透析24小时；

5)浓缩：合并步骤2)中的水提液和步骤4)中透析后的碱提液，在加热温度为100℃条件下浓缩至原来体积的1/20，得到浓缩液；

6)沉淀：在步骤5)的浓缩液中加入乙醇，使得混合均匀后乙醇最终的体积百分比浓度大于80％，静置过夜；

7)润洗：将步骤6)中静置过夜的浓缩液在4000rpm下离心后去除上层清液，用无水乙醇润洗沉淀两次；

8)干燥：将步骤7)润洗后的沉淀吹干、称重，并进行抗氧化活性评价。

对比例

1)混合：将市售银耳除杂洗净，加入20倍重量蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；

2)第一次水提：在加热温度为100℃的条件下，对步骤1)中的混合液进行磁力搅拌，水提3小时，再将混合液用滤布过滤，将得到的水提液保留，将滤渣进一步水提；

3)第二次水提：在步骤2)的滤渣中加入20倍重量的蒸馏水，在加热温度为100℃的条件下进行磁力搅拌，水提3小时，然后用滤布过滤，将得到的水提液保留；

4)浓缩：合并步骤2)和步骤3)中的水提液，在加热温度为80℃条件下浓缩至原来体积的1/20，得到浓缩液；

5)沉淀：在步骤4)的浓缩液中加入乙醇，并使乙醇的最终体积百分比浓度大于80％，静置过夜；

6)润洗：将步骤5)中的静置过夜后的浓缩液在4000rpm下离心后去除上层清液，相继用丙酮和乙醚润洗沉淀；

7)干燥：将步骤6)润洗后的沉淀吹干、称重，并进行抗氧化活性评价。

评价实验

将实施例1、实施例2和对比例所得银耳多糖分别进行抗氧化ORAC评价。

具体评价方法如下：在96孔酶标板(黑色)最外周加入300μL水，测量孔中依次加入25μL样品，150μL的4x10^-6mmol/L荧光素钠溶液。将酶标板放入酶标仪中，37℃下预热30min后，加入25μL2,2'-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride(AAPH)开始荧光淬灭反应。其中空白组以25μL缓冲液代替样品，对照组以25μL不同浓度的Trolox溶液代替样品。样品平行测定三次。结果以Trolox含量作为当量来表示ORAC值。酶标仪测量条件设置如下：激发波长485nm，发射波长538nm；加入AAPH后，振幅1mm，震荡8S。反应开始后，测量循环次数为120，循环周期为1min。

将实施例1、实施例2和对比例所得银耳多糖分别进行细胞抗氧化(celluarantioxidant activity，CAA)评价。

具体评价方法如下：在黑色96孔酶标板上将肝脏细胞LO2按照每孔6×10⁴的浓度铺板，培养基为100μL，培育24h；移除培养基，用100μL PBS洗一次；加入多糖样品和2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate)为荧光探针，在37℃孵育1小时，然后移去孵育液，100μL PBS洗一次，加100μL的600μml/L AAPH，立刻放入已在37℃预热的酶标仪中测量。酶标仪测量条件设置如下：485nm激发光，538nm发射光，反应温度37℃，1min读一次，读90min。其中，空白组是用超纯水代替多糖样品的处理组。

结果与比较

如图1所示，实施例1和实施例2的多糖得率分别为1.00％和2.93％(w/w)，而对比例为0.77％(w/w)。由此可见，本发明所提供的银耳功能性多糖的制备方法可以提高银耳多糖的得率。

如图2所示，实施例2制得的多糖ORAC值最高，为11.9μmol TE/mg，即抗氧化活性最好，其次为实施例1，为1.65μmol TE/mg，对比例制得的多糖抗氧化值最小，仅为0.12μmol TE/mg。

如图3所示，在正常肝细胞模型上，实施例1和实施例2制得多糖的荧光值降低百分率提高到43.5和53.7％，而对比例仅为31.4％，显示了实施例1和实施例2制得多糖的清除自由基的活力明显增强。由此可见，本发明所提供的银耳功能性多糖的制备方法可以明显提高银耳多糖的抗氧化活性。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种银耳功能性多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)混合：将银耳除杂洗净，加入蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；

2)水提：在加热条件下，对步骤1)中的混合液进行磁力搅拌，一段时间后将混合液用滤布过滤，得到的滤液即为水提液，将滤渣取出进行碱提；

3)碱提：在步骤2)的滤渣中加入NaOH溶液，在加热条件下进行磁力搅拌，一段时间后用滤布过滤，得到的滤液即为碱提液；

4)透析：向步骤3)的碱提液中加入盐酸，调溶液pH值至7，然后用透析袋透析；

5)浓缩：合并步骤2)中的水提液和步骤4)中透析后的碱提液，加热浓缩，得到浓缩液；

6)沉淀：在步骤5)的浓缩液中加入乙醇，静置过夜，以除去蛋白质；

7)润洗：将步骤6)中静置过夜后得到的浓缩液离心，去除上层清液，用低沸点有机溶剂润洗沉淀；

8)干燥：将步骤7)润洗后的沉淀吹干，得到银耳功能性多糖。

2.根据权利要求1所述的银耳功能性多糖的制备方法，其特征在于，步骤1)中的银耳按重量计，其含水量为5％，加入蒸馏水的重量为银耳重量的20-40倍。

3.根据权利要求1所述的银耳功能性多糖的制备方法，其特征在于，步骤2)和步骤3)中所述滤布为200目或以上。

4.根据权利要求1所述的银耳功能性多糖的制备方法，其特征在于，步骤2)和步骤3)中的加热温度为80-100℃，搅拌时间为2-3小时；步骤5)中加热温度为80-100℃。

5.根据权利要求1所述的银耳功能性多糖的制备方法，其特征在于，步骤3)中加入的所述NaOH溶液的浓度为0.5-1mol/L，加入的重量为滤渣重量的20-40倍。

6.根据权利要求1所述的银耳功能性多糖的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述透析使用的透析袋规格为3500Da的截留分子量，透析时间为24小时。

7.根据权利要求1所述的银耳功能性多糖的制备方法，其特征在于，步骤6)中所述加入乙醇的量为使混合后的溶液中乙醇的最终体积百分比浓度大于80％。

8.根据权利要求1所述的银耳功能性多糖的制备方法，其特征在于，步骤7)中所述离心的转速为4000rpm。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的制备方法制得的银耳功能性多糖。

10.根据权利要求9所述的银耳功能性多糖在抗氧化食品及药品中的应用。