CN104193846B - 提取枸杞中多糖的方法及其多糖的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取枸杞中多糖的方法。以市售枸杞为原料，采用水提和碱提相结合的方式进行提取，即先采用水提，得到部分多糖提取液，再对滤渣进行碱提，得到另一部分多糖提取液，将上述两部分提取液合并浓缩得到最终产物。本发明的提取方法最大程度地提高了枸杞多糖的得率。同时，本发明所提供的枸杞多糖具有较高的抗氧化活性，可应用于抗氧化、抗疲劳的食品和药品中。

Description

提取枸杞中多糖的方法及其多糖的应用

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，涉及一种多糖的提取方法，尤其涉及一种以枸杞为原料的多糖的提取方法。

背景技术

枸杞属于茄科类，是一种名贵的中药，具有补肾养肝、益精明目、清热凉血等功效。其中多糖是枸杞最有效的药用活性成分之一。研究发现枸杞多糖具有调节免疫、抑制肿瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖和抗疲劳等多种生物活性。另外，枸杞作为一种名贵的药食两用的材料，对人体基本上没有负作用。所以，枸杞的生物活性的开发，并应用于保健食品，有着广阔的应用前景。

近年来关于枸杞多糖的提取方法的研究报道有很多。利用水浸提法提取枸杞多糖。通过考察提取温度、料液比、时间因素对多糖提取率的影响，优化出枸杞多糖的最佳提取条件(孙平等，枸杞多糖的提取及其残渣处理的研究，食品工业，2013,34(1):48-50)。采用超声波萃取法从枸杞中提取多糖，通过单因素和正交试验，确定超声波提取的最佳工艺条件(孟良玉，枸杞多糖的超声提取工艺优化及其抗氧化能力研究，安徽农业科学，2009,37(25):12168-12170)。利用纤维素酶从枸杞中提取枸杞多糖,通过考察加水量、酶解pH、酶解温度、酶解时间、加酶量对多糖提取率的影响，得出酶法提取枸杞多糖的最佳条件(吴素萍等，酶法提取枸杞多糖的研究，食品科技，2007,8:114-117)。利用纤维素酶，辅助微波法提取枸杞多糖(王启为等，微波-纤维素酶法提取枸杞多糖的工艺研究，生物学杂志，2013,30(6):95-98)。枸杞多糖具有清除自由基的能力，在体外有很强的抗氧化活性(刘长建等，枸杞子多糖提取工艺优化及体外抗氧化活性研究，时珍国医国药，2009,20(3):661-663)。多糖的提取或制备方法影响其抗氧化活性(张民等，超细粉碎对枸杞多糖得率、结构及抗氧化活性的影响，中国食品添加剂，2012,135(6):134-141；王艳丽等，超声参数对白术多糖抗氧化活性的影响，生物加工过程，2012,10(1):7-12；张丽霞等，不同提取方法对桦褐孔菌多糖抗氧化活性的影响，安徽农业科学，2012,40(10):5870-5872)。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种提取枸杞中多糖的方法，该方法既能提高产率，又能提供多糖抗氧化活性。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何在提取枸杞多糖的过程中，既提高多糖的得率和保持多糖的抗氧化活性。

为实现上述目的，本发明提供了一种提取枸杞中多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.将枸杞除杂洗净，加入蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；

b.在加热条件下，对步骤a中的混合液进行磁力搅拌，一段时间后将混合液用滤布过滤，得到的滤液即为水提液，将滤渣取出进行碱提；

c.在步骤b的滤渣中加入NaOH溶液，在加热条件下进行磁力搅拌，一段时间后用滤布过滤，得到的滤液即为碱提液；

d.向步骤c的碱提液中加入盐酸，调溶液pH值至7，然后用透析袋透析；

e.合并步骤b中的水提液和步骤d中透析后的碱提液，加热浓缩，得到浓缩液；

f.在步骤e的浓缩液中加入乙醇，静置过夜，以除去蛋白质；

g.将步骤f中静置过夜后得到的浓缩液离心，去除上层清液，用低沸点有机溶剂润洗沉淀；

h.将步骤g润洗后的沉淀吹干，得到枸杞多糖。

优选地，步骤a中的枸杞为市售枸杞，按重量计其含水量为10％；加入蒸馏水的重量为枸杞重量的20-50倍；所用打磨机为家用型或实验室用型。

优选地，步骤b和步骤c中的加热温度为80-100℃，搅拌时间为2-3小时；所用的滤布为200目或以上。

优选地，步骤c中加入NaOH溶液的浓度为0.5-1mol/L，加入的重量为滤渣重量的20-40倍。

优选地，步骤d中加入的盐酸是浓盐酸稀释后的稀盐酸溶液，其较佳的浓度为6mol/L；透析过程中所使用的透析袋规格为3500Da的截留分子量，透析时间为24小时。

优选地，步骤e的浓缩过程在可调温度的恒温加热装置上进行，加热温度为80-100℃；最终得到的浓缩液体积为浓缩前体积的1/20。

优选地，步骤f中加入乙醇的量为使最终混合后的溶液中乙醇的体积百分比浓度大于80％。

优选地，步骤g中离心速率为4000rpm；润洗所用的低沸点有机溶剂为丙酮、乙醇和乙醚中的一种或多种。

此外，本发明还提供了用上述方法提取而得的枸杞多糖。

本发明采用了以上技术方案，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明提供了一种提取枸杞中多糖的方法，相较于现有的常规制备方法，所得的多糖具有更高的得率；

2、本发明所得的枸杞多糖，相较于现有的常规制备方法，具有更高的抗氧化活性。

以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的两个较佳实施例与对比例获得的多糖的得率对比图；

图2是本发明的两个较佳实施例与对比例获得的多糖的ORAC抗氧化活性比较图，其中TE为trolox当量。

具体实施方式

实施例1

a.将市售枸杞除杂洗净，加入20倍重量蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；

b.在加热温度为100℃条件下，对步骤a中混合液进行磁力搅拌，水提2小时，再将混合液用滤布过滤，得到滤液即为水提液，将滤渣取出进行碱提；

c.在步骤b的滤渣中加入20倍重量的NaOH溶液(0.5mol/L)，在加热温度为100℃条件下进行磁力搅拌，碱提2小时后用滤布过滤，得到滤液即为碱提液；

d.向步骤c的碱提液中加入盐酸(6mol/L)，调节溶液pH值至7，然后透析24小时；

e.合并步骤b中的水提液和步骤d中透析后的碱提液，在加热温度为80℃条件下浓缩至原来体积的1/20，得到浓缩液；

f.在步骤e的浓缩液中加入乙醇，使得混合均匀后乙醇最终的体积百分比浓度大于80％，静置过夜；

g.将步骤f中静置过夜的浓缩液4000rpm离心后去除上层清液，相继用丙酮和乙醚润洗沉淀；

h.将步骤g润洗后的沉淀吹干、称重，并进行抗氧化活性和细胞毒性评价。

实施例2

a.将市售枸杞除杂洗净，加入40倍重量的蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；

b.在加热温度为80℃条件下，对步骤a中混合液进行磁力搅拌，水提3小时，再将混合液用滤布过滤，得到滤液即为水提液，将滤渣取出进行碱提；

c.在步骤b的滤渣中加入50倍重量的NaOH溶液(1mol/L)，在加热温度为80℃的条件下进行磁力搅拌，碱提3小时后用滤布过滤，得到滤液即为碱提液；

d.向步骤c的碱提液中加入盐酸(6mol/L)，调节溶液pH值至7，然后透析24小时；

e.合并步骤b中的水提液和步骤d中透析后的碱提液，在加热温度为100℃条件下浓缩至原来体积的1/20，得到浓缩液；

f.在步骤e的浓缩液中加入乙醇，使得混合均匀后乙醇最终的体积百分比浓度大于80％，静置过夜；

g.将步骤f中静置过夜的浓缩液4000rpm离心后去除上层清液，用无水乙醇润洗沉淀两次；

h.将步骤g润洗后的沉淀吹干、称重，并进行抗氧化活性和细胞毒性评价。

对比例

a.将市售杭白菊除杂洗净，加入20倍重量蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；

b.第一次水提：在加热温度为100℃的条件下，对步骤a中的混合液进行磁力搅拌，水提3小时，再将混合液用滤布过滤，将得到的水提液保留，将滤渣进一步水提；

c.第二次水提：在步骤b的滤渣中加入20倍重量的蒸馏水，在加热温度为100℃的条件下进行磁力搅拌，水提3小时，然后用滤布过滤，将得到的水提液保留；

d.合并步骤b和步骤c中的水提液，在加热温度为80℃条件下浓缩至原来体积的1/20，得到浓缩液；

e.在步骤d的浓缩液中加入乙醇，并使乙醇的最终体积百分比浓度大于80％，静置过夜；

f.将步骤e中的静置过夜后的浓缩液4000rpm离心去除上层清液，相继用丙酮和乙醚润洗沉淀；

g.将步骤f润洗后的沉淀吹干、称重，并进行抗氧化活性和细胞毒性评价。

评价实验

将实施例1、实施例2和对比例所得枸杞多糖分别进行抗氧化ORAC评价。

具体评价方法如下：在96孔酶标板(黑色)最外周加入300μL水。测量孔中依次加入25μL样品，150μL 4x10^-6mM荧光素钠溶液。将酶标板放入酶标仪中，37℃下预热30min后，加入25μL AAPH开始荧光淬灭反应。其中空白组以25μL缓冲液代替样品，对照组以25μL不同浓度的Trolox溶液代替样品。样品平行测定三次。结果以Trolox含量作为当量来表示ORAC值。酶标仪测量条件设置如下：激发波长485nm，发射波长528nm；加入AAPH后，振幅1mm，震荡8S。反应开始后，测量循环次数为120，循环周期为1min。

将实施例1、实施例2和对比例所得枸杞多糖分别进行细胞毒性评价。

具体评价方法如下：将100μL肝细胞LO2接种(1x10⁴/孔)到96孔板，培养24h后，加入待测多糖样品，并作空白对照(空白对照为只加入100μL细胞培养液但是没加细胞的板孔)；向每孔小心加入10ul的CCK-8溶液，在加入过程中注意不要在孔中生成气泡，以免影响O.D值的读数；将培养板放入培养箱内孵育1-4小时；用酶标仪测定在450nm处的吸光值。

结果与比较

如图1所示，实施例1和实施例2的多糖得率分别为1.99％和2.68％(w/w)，而对比实施例为1.22％(w/w)。由此可见，本发明所提供的枸杞多糖的制备方法可以提高枸杞多糖的产率。

如图2所示，实施例2制得的多糖ORAC值最高，为19.1μmol TE/mg，即抗氧化活性最好，其次为实施例1，为14.1μmol TE/mg，对比实施例制得的多糖抗氧化值最小，仅为2.9μmol TE/mg。由此可见，本发明所提供的枸杞多糖的制备方法可以明显提高枸杞多糖的抗氧化活性。

通过细胞毒性评价方法，确定在测试范围内肝细胞存活率>98％，均无明显细胞毒性。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种提取枸杞中多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.将枸杞除杂洗净，加入蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；

b.在加热条件下，对步骤a中的混合液进行磁力搅拌，一段时间后将混合液用滤布过滤，得到的滤液即为水提液，将滤渣取出进行碱提；

c.在步骤b的滤渣中加入NaOH溶液，在加热条件下进行磁力搅拌，一段时间后用滤布过滤，得到的滤液即为碱提液；其中，加入的所述NaOH溶液的浓度为0.5-1mol/L，加入的重量为滤渣重量的20-50倍，加热温度为80-100℃，搅拌时间为2-3小时；

d.向步骤c的碱提液中加入盐酸，调溶液pH值至7，然后用透析袋透析；

e.合并步骤b中的水提液和步骤d中透析后的碱提液，加热浓缩，得到浓缩液；

f.在步骤e的浓缩液中加入乙醇，静置过夜，以除去蛋白质；

g.将步骤f中静置过夜后得到的浓缩液离心，去除上层清液，用低沸点有机溶剂润洗沉淀；

h.将步骤g润洗后的沉淀吹干，得到枸杞多糖。

2.根据权利要求1所述的提取枸杞中多糖的方法，其特征在于，步骤a中的枸杞按重量计，其含水量为5％，加入蒸馏水的重量为枸杞重量的20-50倍。

3.根据权利要求1所述的提取枸杞中多糖的方法，其特征在于，步骤b中的加热温度为80-100℃，搅拌时间为2-3小时；步骤e中的加热温度为80-100℃。

4.根据权利要求1所述的提取枸杞中多糖的方法，其特征在于，步骤b和步骤c中所述滤布为200目或以上。

5.根据权利要求1所述的提取枸杞中多糖的方法，其特征在于，步骤d中所述透析使用的透析袋规格为3500Da的截留分子量，透析时间为24小时。

6.根据权利要求1所述的提取枸杞中多糖的方法，其特征在于，步骤f中所述加入乙醇的量为使混合后的溶液中乙醇的最终体积百分比浓度大于80％。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的提取枸杞中多糖的方法制得的枸杞多糖。

8.权利要求7所述枸杞多糖在抗氧化食品和药品中的应用。

9.权利要求7所述枸杞多糖在抗疲劳食品和药品中的应用。