CN102718882B - 一种提高当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种提高当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法，属于中药多糖的结构改造技术领域。提取、纯化当归多糖，用硝酸-亚硒酸钠法进行硒化修饰，以产物的增强免疫活性为指标，用L₉(3⁴)正交实验对亚硒酸钠用量、反应温度和反应时间3因素进行优选，确定最佳修饰条件为亚硒酸钠用量200mg(500mg当归多糖)，反应温度70℃，反应时间6h。本发明能显著提高当归多糖的增强免疫活性。

Description

一种提高当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法

一、技术领域

本发明一种当归多糖的硒化修饰方法，属于中药多糖的结构改造技术领域。

二、背景技术

多糖广泛存在于植物、微生物、藻类和动物体内，是构成生命的四大基本物质之一。随着化学和生物学的快速发展和分离技术的提高，多糖的生物学功能，特别是作为生命物质参与生命的全部时间和空间功能，突破了多糖作为支持组织和能量来源的传统观念，发现其具有更广泛的生物学功效，如增强免疫、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗突变、抗衰老、降血糖、降血脂等，而且具有毒性小、安全性高等优点。特别是多糖具有免疫增强、抗病毒等功能使得多糖物质成为人类及动植物医疗、保健、病虫害防治领域的重要成员，也是食品功能化学关注的焦点。近年来，多糖研究一直是国际前沿课题。

研究证实，多糖的活性直接或间接地受到其结构的制约。影响多糖生物学活性的结构因素包括多糖的主链性质、支链性质和分子的高级结构，主链的糖单元组成和糖苷键类型直接决定多糖的活性，支链的类型、聚合度和在糖链上的分布及其取代度决定了多糖活性的大小，多糖分子的高级结构如链的柔韧性和空间构像与多糖的活性紧密相关。因此，可根据需要选择合适的分子修饰方法对多糖进行结构改造。利用糖残基上的羟基、羧基、氨基等基团进行化学修饰以引入新的基团，增强多糖的活性或使多糖产生新的活性。

硒是生命必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的主要活性成分，可以直接或间接地清除体内氧自由基，抑制脂氧化或过氧化，阻断活性氧和自由基的致病作用，保护细胞免遭过氧化物的损伤，维护细胞膜的稳定性，对动物的生长、繁殖、免疫、抗感染、抗应激等方面起着重要的作用，但是我国约72％的地区属于低硒或缺硒地区，饲料和牧草硒含量小于0.05mg/kg，不能满足动物的正常生理需要，补硒成为一种必要措施。硒的存在形式有无机硒和有机硒两种，常见的无机硒如亚硒酸钠和硒酸钠，有机硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒多糖是一种多糖有机硒化合物，具备了硒和多糖两者的活性，而且其生物活性普遍高于多糖和硒。补无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制；而有机硒的毒性低、副作用小，不但能够更好地发挥硒的作用，而且在促进生长和激发免疫反应上比无机硒显著，更易于为机体吸收和利用。然而天然硒多糖一般存在于植物或微生物中，含量较低，即使在高硒地区的植物或微生物中，硒多糖中的硒含量也相对较低。除了通过一些富硒手段(如人工协迫富硒栽培、富硒酵母培养等)使生物体中硒多糖的硒含量增加外，通过硒化修饰的方法获取硒多糖是重要手段。

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，其性温味甘、辛，归肝、心、脾经，具有补血养血、活血止痛、润燥通便等功效，主治血虚劳伤、血瘀疼痛、跌打损伤、痈肿疮疡、肠燥便秘、胎产诸病。现代药理学研究证实，当归多糖是当归的主要活性成分，具有增强免疫、抗病毒、降血糖、抗肿瘤、抗氧化等作用。本发明首次对当归多糖进行硒化修饰，建立了当归多糖的硒化修饰方法，基于产物的增强免疫活性优化了修饰条件，发现硒化修饰能显著提高当归多糖的增强免疫活性。

三、发明内容

技术问题本发明针对中药多糖生物活性低的问题，提供一种通过当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法，达到显著提高当归多糖的增强免疫活性的目的。

技术方案

一种提高当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法，包括：提取、纯化当归多糖，用硝酸-亚硒酸钠法对当归多糖进行硒化修饰，其特征在于，基于产物的增强免疫活性比较，确定最佳修饰条件为亚硒酸钠用量200mg(500mg当归多糖)，反应温度70℃，反应时间6h；并筛选出一种活性最好的硒化当归多糖产品。

有益效果

1.建立了当归多糖的硒化修饰方法，通过正交实验优化了当归多糖的硒化修饰条件。

2.证明硒化修饰能够显著提高当归多糖的增强免疫活性，并筛选出一种增强免疫活性最好的硒化当归多糖。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1.当归多糖的硒化修饰国内外未见报道，本发明提供了一种提高当归多糖免疫增强活性的硒化修饰方法及其优化的修饰条件，填补了国内外研究的空白。

2.通过本发明的实施，证明硒化修饰能够显著提高当归多糖的增强免疫活性，并筛选出一种活性最好的硒化当归多糖，为研制新型免疫增强剂提供了材料和示范。

四、具体实施方式

1.当归多糖的提取

用水煎-醇沉法。取当归饮片1000g，粉碎成0.3～1cm³的小块，加95％乙醇2000mL浸泡12h，80℃水浴回流2次，每次1h，药物晾12h，加20倍量水煎煮2次，每次30min，合并滤液，浓缩至1000mL，2500rpm离心20min，弃去沉淀，加95％乙醇使醇含量达90％，4℃静置12h，回收乙醇，离心，沉淀60℃真空干燥，得到粗的当归多糖。

2.当归多糖的纯化

将粗当归多糖用Sevage法去蛋白，真空干燥，加蒸馏水溶解成50mg·mL^-1的溶液，上Sephadex G-200(2cm×100cm)柱，用蒸馏水洗脱，流速12mL·h^-1，自动收集器收集洗脱液，每管4mL，苯酚-硫酸法检测各管是否含糖，绘制洗脱曲线(得到1个峰)。合并含糖管洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化的当归多糖(CAP)，用苯酚-硫酸法测定糖含量为92.7％。

3.当归多糖的硒化修饰

用硝酸-亚硒酸钠法。

(1)修饰条件设计由于亚硒酸钠用量、反应温度、反应时间是影响多糖硒化修饰的主要因素，在预实验的基础上，以亚硒酸钠用量(每500mg多糖)(A)、反应温度(B)和反应时间(C)为因素，按3因素3水平的L₉(3⁴)正交试验设计9种修饰条件(表1)。

表1L₉(3⁴)正交试验设计因素水平表

(2)修饰操作取当归多糖500mg9份，分别缓慢加入到装有50mL0.5％HNO₃的三颈瓶中，边加边搅拌至完全溶解。按表1设计的亚硒酸钠用量、反应温度和反应时间滴加亚硒酸钠溶液搅拌反应，反应结束后冷却至室温，用无水碳酸钠调节pH至5～6，离心，上清溶液装入透析袋，流水透析，每隔6小时抽样检测是否含亚硒酸钠，至无亚硒酸钠残留时停止透析。透析液减压浓缩，冷冻干燥，分别得到9个硒化当归多糖(selenizing CA P，sCAP)，依次标记为sCAP₁～sCAP₉。分别计算各硒化当归多糖的得率、用原子荧光光谱法测定硒含量、用苯酚-硫酸法测定糖含量，用溴化钾压片法测定红外光谱。

正交试验结果表明，sCAP₉的得率最高，为42.76％，其次是sCAP₆、sCAP₈和sCAP₂；sCAP₂硒含量最高，为12.98％，其次是sCAP₃、sCAP₄和sCAP₆；sCAP₈的糖含量最高，为63.2％，其次是sCAP₆、sCAP₂和sCAP₇(表2)。

表2L₉(3⁴)正交试验结果

红外光谱测定结果显示，在CAP的红外光谱中，出现一些糖的特征性振动峰：在3385cm^-1有1强而宽的吸收峰，为O-H键的伸缩振动；在1620cm^-1处有1吸收峰，为乙酰氨基C＝O的伸缩振动；在1400～1000cm^-1处有1吸收峰，为C-H、C-O和C-C振动吸收。sCAP的红外光谱图中，除了糖的特征吸收峰外，在668.54cm-¹处有1吸收峰，这与硒酸酯的振动模式(Se-O-C，600～700cm^-1)吻合，提示sCAP存在硒酸酯键，硒化修饰成功。

4.硒化当归多糖的增强免疫活性的比较

用MTT法。首先测定9个sCAP和未修饰的CAP对鸡外周血淋巴细胞的安全浓度，然后比较它们对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响。

(1)硒化当归多糖对淋巴细胞的安全浓度

将9个sCAPs分别用RPMI-1640培养液自100μg·mL^-1稀释至0.097μg·mL^-1、CAP自500μg·mL^-1稀释至0.463μg·mL^-1共11个浓度。取成年鸡心脏无菌采血，肝素抗凝，用Hank’s液稀释1倍，小心加在淋巴细胞分离液上层，2000rpm离心20min，吸取中间云雾状白细胞层，用Hank′s液洗2遍，1500rpm离心15min，活细胞计数大于90％后，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2.5×10⁶个·mL^-1，接种到96孔细胞培养板，每孔100μL，再加入各浓度的多糖，每孔100μl，每个浓度重复4孔，39.5℃、5％CO₂培养44h，每孔加入MTT30μL，继续培养4h，每孔加裂解液DMSO100μL，将细胞板置于微量震荡器上震荡5min使沉淀完全溶解，在酶联免疫仪上检测570nm处的吸光度(A₅₇₀值)。选择A₅₇₀值不显著低于细胞对照组的多糖最大浓度作为该多糖的最大安全浓度。测得各多糖的最大安全浓度在1.563～125μg·mL^-1，为了便于同水平比较，将10个多糖的最大安全浓度统一设为1.563μg·mL^-1。

(2)硒化当归多糖对淋巴细胞增殖的影响

将9个sCAPs和未修饰的CAP分别用RPMI-1640自1.563μg·mL^-1倍比稀释至0.098μg·mL^-1共5个浓度。同上法制备淋巴细胞，调整细胞浓度为2.5×10⁶个·mL^-1，分成2份，1份加入PHA溶液(终浓度为10μg·mL^-1)，分别接种到96孔细胞培养板，每孔100μL，然后每孔加入各浓度多糖100μL，每个样品重复4孔，另设细胞对照组(CC，仅加细胞培养液)和PHA对照组(加细胞培养液和PHA)，同法测定细胞A₅₇₀值，作为淋巴细胞增殖的指标；同时按下式计算淋巴细胞增殖率，

(

为多糖5个浓度的平均值或对照组4个孔的平均值)，比较各多糖的作用强度。结果如下：

(3)多糖单独刺激时淋巴细胞增殖的变化

sCAP₁～sCAP₄、sCAP₆和sCAP₈组在1.563～0.098μg·mL^-1、sCAP₅组在0.781～0.098μg·mL^-1、sCAP₇组在0.391μg·mL^-1和0.098μg·mL^-1、sCAP₉组在1.563～0.391μg·mL^-1和0.098μg·mL^-1、CAP组在0.781～0.391μg·mL^-1的A₅₇₀值均显著大于细胞对照组(P＜0.05)(表3)。说明它们在这些浓度单独能显著促进淋巴细胞增殖。

表3多糖单独刺激时各组淋巴细胞增殖的变化(A₅₇₀值)

淋巴细胞增值率值：sCAP₂组的淋巴细胞增殖率最高(29.90％)，其次为sCAP₆(24.61％)、sCAP₈(22.88％)组，这3组均极显著大于未修饰的CAP组(P＜0.01)；sCAP₄(17.88％)组大于未修饰的CAP组(P＞0.05)，说明它们促进淋巴细胞增殖的作用强于未修饰的CAP，sCAP₂的作用最强。

(4)多糖协同PHA刺激时淋巴细胞增殖的变化

sCAP₂、sCAP₆～sCAP₉和CAP组在1.563～0.098μg·mL^-1、sCAP₁组在0.195～0.098μg·mL^-1、sCAP₃组在1.563～0.195μg·mL^-1、sCAP₄组在0.781～0.098μg·mL^-1、sCAP₅组在0.195～0.098μg·mL^-1和1.563μg·mL^-1的A₅₇₀值显著大于PHA对照组(P＜0.05)(表4)，说明它们在这些浓度能协同PHA显著促进淋巴细胞增殖。

表3多糖协同PHA刺激时各组淋巴细胞增殖的变化(A₅₇₀值)

淋巴细胞增值率值：sCAP₂组的增殖率最高(16.84％)，显著大于未修饰的CAP组(P＜0.05)；其次为sCAP₈(15.39％)、sCAP₆(14.22％)、sCAP₇(13.66％)和sCAP₃(11.61％)组，均大于未修饰的CAP组(P＞0.05)。说明它们在这些浓度协同PHA促进淋巴细胞增殖的作用强于未修饰的当归多糖，sCAP₂的作用最强。

以上结果表明，硒化修饰能显著提高当归多糖的增强免疫活性，sCAP₂的作用最强，可以作为新型免疫增强剂的组分药，其修饰条件可以作为当归多糖硒化修饰的最佳条件，即亚硒酸钠用量200mg(500mg当归多糖)，反应温度70℃，反应时间6h。

Claims (2)

1.一种提高当归多糖的淋巴细胞增殖活性的硒化修饰方法，包括：

(1)当归多糖的提取

取当归饮片1000g，粉碎成0.3～1cm³的小块，加95％乙醇2000mL浸泡12h，80℃水浴回流2次，每次1h，药物晾12h，加20倍量水煎煮2次，每次30min，合并滤液，浓缩至1000mL，2500rpm离心20min，弃去沉淀，加95％乙醇使醇含量达90％，4℃静置12h，回收乙醇，离心，沉淀60℃真空干燥，得到粗的当归多糖；

(2)当归多糖的纯化

将粗当归多糖用Sevage法去蛋白，真空干燥，加蒸馏水溶解成50mg·mL^-1的溶液，上2cm×100cm的Sephadex G-200柱，用蒸馏水洗脱，流速12mL·h^-1，自动收集器收集洗脱液，每管4mL，苯酚-硫酸法检测各管是否含糖，绘制洗脱曲线，得到1个峰，合并含糖管洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化的当归多糖，用苯酚-硫酸法测定糖含量为92.7％；

(3)当归多糖的硒化修饰

用硝酸-亚硒酸钠法进行硒化修饰，取当归多糖500mg，缓慢加入到装有50mL0.5％HNO₃的三颈瓶中，边加边搅拌至完全溶解；然后按照亚硒酸钠200mg、反应温度70℃、反应时间8h，滴加亚硒酸钠溶液搅拌反应，反应结束后冷却至室温，用无水碳酸钠调节pH至5～6，离心，上清溶液装入透析袋，流水透析，每隔6h抽样检测是否含亚硒酸钠，至无亚硒酸钠残留时停止透析，透析液减压浓缩，冷冻干燥，得到硒化当归多糖，所得产物的含硒量为12.98mg·g^-1，含糖量为50.9％。

2.如权利要求1所述的方法，特征在于获得的硒化当归多糖的增强免疫活性高于未修饰的当归多糖。