CN106084080A - 一种甘草硒多糖及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甘草硒多糖及其制备方法，属于食品加工领域。该制备方法包括粗多糖提取、浓缩、纯化多糖、硒化修饰及除去亚硒酸钠。采用本发明的制备方法得到的甘草硒多糖毒性小，副作用低。本发明的制备方法反应时间较短，无反应副产物，反应过程操作简单，使用化学试剂较少，后处理容易，反应条件可控，重复性好，容易实现工业化生产。

Description

一种甘草硒多糖及其制备方法
技术领域
本发明属于食品加工领域，特别涉及一种甘草硒多糖及其制备方法。
背景技术
甘草属植物药用历史悠久，是最常用的中草药材之一，有“十方九草”之称，《神农本草经》中将甘草列为上品。国内外对甘草的药理作用研究表明,甘草具有补脾益气、清热解毒、止咳祛痰、调和诸药的功效。主要用于脾胃虚弱、倦怠无力、心悸气短、咳嗽痰多、脘腹挛急疼痛、痈疽疮毒，并能够缓解药物毒性。由于对甘草化学成分研究的日益深入，发现了许多具有药用价值的生物活性化合物，随着先进的分离分析技术进一步应用，还会有更新颖、药用价值更高的先导化合物被陆续分离鉴定出来。新疆甘草产量占全国的1/2以上，新疆甘草的出口量约占全国的80％。新疆药用甘草品种中，对环境的适应幅度甘草(乌拉尔甘草)最大，分布地区最广；最耐盐碱，最抵抗干旱的是胀果甘草，但对气温、热量要求较高。
硒元素作为人体必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的主要活性成分，可以直接或间接地清除体内氧自由基，抑制脂氧化或过氧化，阻断活性氧和自由基的致病作用，保护细胞免遭过氧化物的损伤，维护细胞膜的稳定性，对动物的生长、繁殖、免疫、抗感染、抗应激等方面起着重要的作用。硒元素不仅是一些酶的重要组成部分，而且硒元素本身在预防肿瘤发生、治疗心脑血管疾病以及延缓衰老等方面扮演着重要角色。硒在自然界广泛存在，主要有两种形式:(1)无机硒，包括单质硒、硒的金属化合物、亚硒酸盐(亚硒酸钠、亚硒酸钙、亚硒酸锌等、硒酸盐(硒酸钠等)、硒化物(硒化氢、硒化锌、硒化钠等)、硫化硒、二氧化硒、二硫化硒等；(2)有机硒，主要以含硒蛋白质和硒多糖形式存在。近年来硒化药物的研究受到了广泛关注。现代药理学和毒理学研究表明，硒化物在人体中的药理学作用和毒理学作用与硒元素的化学形式有关。硒多糖是一种多糖有机硒化合物，具备了硒和多糖两者的活性，而且其生物活性普遍高于多糖和硒。补无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制；而有机硒的毒性低、副作用小，不但能够更好地发挥硒的作用，而且在促进生长和激发免疫反应上比无机硒显著,更易于为机体吸收和利用。因此，寻找一种安全有效的有机硒化合物显得至关重要,其中硒多糖就是一种理想选择。硒化多糖因具有特殊的化学键-硒氧键，而使之较普通多糖具有了更多的生理活性。人工合成硒多糖主要有以下三种方式:(1)在温和条件下使用单体硒、亚硒酸或亚硒酸钠等对多糖进行化学修饰；(2)利用化学性质活泼，具有酞氯结构的SeOC12作为硒化试剂；(3)将含硒的功能基团接枝到多糖分子上。
现有技术中硒多糖的制备方法主要有生物富集法和化学合成法两种，生物富集法的存在问题是制备周期长，条件不易控制，规模化生产可行性困难。化学合成法存在硒化剂使用量过大、污染较大、硒化合成时间较长、产物含硒量过低、生物学效价不高及产生有毒物质等相关问题，如中国专利CN1284509A公开了壳聚糖亚硒酸盐及其制备方法，将壳聚糖与二氧化硒的水溶液混合,间隔搅拌反应1-3h后,加乙醇沉淀,过滤,用乙醇洗涤除去未反应的亚硒酸,干燥后即得到壳聚糖亚硒酸盐产物，此合成方法使用丙酮和亚硒酸等有机试剂,污染较大；中国专利CN1011046C4643A公开了硒化多糖硫酸酯化合物及其制法和应用,将多糖硫酸酯通过加热10-100℃,恒温反应1-100h生成硒化多糖硫酸酯,使用硫酸溶液除去Ba2+,过滤后加入氯化铁溶液调整pH值后，搅拌反应过夜,除去未反应的亚硒酸或盐,然后用乙醇沉淀,滤出物干燥，此方法制备过程繁琐,合成时间较长,并使用硫酸等腐蚀性液体,污染较大。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种甘草硒多糖的制备方法，该方法反应时间较短，无反应副产物，反应过程操作简单。
为实现本发明的目的，本发明提供一种甘草硒多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取粗多糖：将甘草干燥、粉碎后，过筛，将过筛后的细粉用酒精浸泡,再过滤除去液体，将过滤后的不溶物用蒸馏水煎煮，过滤，将滤液离心，除去沉淀，收集上清液，得到甘草粗多糖溶液；
(2)浓缩：将甘草粗多糖溶液浓缩后加入无水乙醇，室温静置，再抽滤，沉淀后干燥，得到甘草粗多糖；
(3)纯化多糖：将甘草粗多糖用蒸馏水溶解后，加入三氯乙酸,3-5℃静置，离心，除去沉淀，重复此过程2-3次，至上清液中无蛋白质检出；浓缩上清液后加入无水乙醇室温静置，离心，沉淀，冷冻干燥后用蒸馏水溶解成48-52mg/mL的溶液，上层析柱，用蒸馏水洗脱，流速10-14mL/h，收集洗脱液，检测洗脱液中不含粗多糖时洗脱完成，将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，得到甘草精多糖；
(4)硒化修饰：将甘草精多糖用硝酸溶液溶解，搅拌，加热后加入Na2SeO3，搅拌反应后，将反应液自然冷却至室温，离心，除去沉淀，取上清液备用；
(5)除去亚硒酸钠：在上清液中加入饱和碳酸钠溶液调节pH值至5-6，再用蒸馏水透析，然后减压浓缩，再用无水乙醇进行醇沉，0-4℃放置8-12h，离心弃去上清液，沉淀物经干燥得到甘草硒多糖。
优选的，所述步骤(1)中：过筛为过18-24目筛，所述酒精质量浓度为85-95％，所述酒精浸泡的时间为46-50h，所述细粉与酒精质量比为1:5-7；所述蒸馏水煎煮的次数为2-3次，每次待沸腾后，煎煮时间为30-40min。
优选的，所述步骤(2)中：所述室温静置的时间为8-12h，干燥的温度为65-75℃，干燥的时间30-60min,所述甘草粗多糖溶液浓缩至原体积的1/5-2/5后得到浓缩液，所述无水乙醇用量为浓缩液体积的8-10倍。
优选的，所述步骤(3)中：溶解甘草粗多糖的蒸馏水与甘草粗多糖的质量比为18-22:1，无水乙醇与浓缩后的上清液的体积比为2.5-3.5：1；所述三氯乙酸与甘草粗多糖的质量比为5.8-6.2:1；静置时间在3-5℃条件下为2.5-3.5h，室温条件下为8-12h。
优选的，所述步骤(4)中：所述硝酸溶液的质量浓度为0.4-0.6％，硝酸溶液与甘草精多糖的质量比为95-105:1，Na2SeO3和甘草精多糖的质量比为1:2-3；所述加热温度为65-75℃，加热时间为12-18min；所述搅拌反应是在65-75℃条件下搅拌反应6-9h。
优选的，所述步骤(5)中：所述浓缩为浓缩至原体积的1/5-2/5，无水乙醇与蒸馏水的体积比为3-5:1；所述干燥为真空冷冻干燥。
优选的，所述离心为2800-3200rpm，离心时间为8-12min。
另一方面，本发明采用上述方法制备得到一种甘草硒多糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明的甘草硒多糖制备方法简单快速，简化了中间的多个步骤，使用了较少的化学试剂，避免了因使用多种化学试剂而产生新的化学污染物质等一系列潜在的风险，不产生硒化氢等有毒气体，不使用吡啶、苯等有毒有机溶剂，无污染，大大降低了合成过程中产生多种化学废物的概率，减少了化学废物的生成量。
2.本发明优化了制备工艺方法，多糖直接与硒化合物溶液混合反应，控制原料配比、反应温度、反应时间等工艺条件，原料来源丰富，工艺流程简单，后处理容易，反应条件可控，重复性好，容易实现工业化生产。
3.本发明制备的硒多糖毒性小，副作用低，生物利用度高，硒在多糖中以硒酸酯的形式存在，仍然保留了多糖的结构，具备硒和多糖两者的活性，可更好地发挥硒的作用，更易于为机体吸收和利用。
附图说明
图1为甘草硒多糖和甘草多糖UV图谱；
图2为甘草多糖红外光谱；
图3为甘草硒多糖红外光谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种甘草硒多糖的制备方法：
(1)选取乌拉尔甘草，将甘草干燥、粉碎后过20目筛，取80g甘草粉末，用480g质量浓度为90％的工业酒精浸泡48h,过滤除去液体，向过滤后的甘草中加入蒸馏水，蒸馏水的加入量以将甘草粉末全部浸泡为宜，反复煎煮2次，过滤后合并滤液，离心，弃去沉淀物，收集上清液，得到甘草粗多糖溶液；
(2)浓缩：用旋转蒸发仪将甘草粗多糖溶液浓缩至原体积的1/5，加入9倍于浓缩液的无水乙醇，室温静置12h，抽滤，沉淀放入70℃干燥箱，得甘草粗多糖；
(3)纯化多糖：称取20g甘草粗多糖用400ml蒸馏水溶解，充分溶解后，加入30％体积分数的三氯乙酸,4℃静置3h，3000rpm离心10min，除去沉淀，重复此过程3次，至上清液中无蛋白质检出。浓缩上清液，加入3倍体积的无水乙醇室温静置10h，3000rpm离心10min，沉淀，冷冻干燥后用蒸馏水溶解成50mg/mL的溶液,上SephadeX G-100层析柱，用蒸馏水洗脱，流速12mL/h，自动收集器收集洗脱液，每管4mL，蒽酮-硫酸法检测各管是否含糖，绘制洗脱曲线，合并含糖管洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到甘草精多糖。
(4)硒化修饰：准确称取0.5g甘草精多糖加入锥形瓶中，加入质量分数为0.5％浓硝酸溶液50mL溶解，匀速搅拌，放入70℃水浴锅15mins后加入0.2g Na2SeO3，于70℃水浴匀速搅拌反应8h，反应结束后将反应液冷却至室温，3000rpm离心10mins，除去沉淀，取上清液备用。
(5)除去亚硒酸钠：在上清液中加入饱和碳酸钠溶液调节pH至6，用蒸馏水且采用1KD超滤膜透析，透析的蒸馏水用量为上清液体积的4倍，透析液中加入抗坏血酸直至透析液无红色时停止透析，即透析液中无亚硒酸钠残留，用4倍体积于透析液的无水乙醇醇沉；4℃低温放置10h，离心弃去上清液，用无水乙醇洗涤沉淀物，将沉淀物在真空冷冻干燥机内冷冻干燥2h后得甘草硒多糖，为白色固体粉末。配制10％的甘草多糖溶液和甘草硒多糖溶液，以超纯水为空白对照，在300nm-400nm范围内进行紫外扫描分析。谱如图1所示的UV图，两者的紫外光谱有所不同：甘草多糖在300nm-400nm范围内无吸收峰，而甘草硒多糖在338nm处有一个强的吸收峰，与前人研究的结果基本相吻合，即硒在335nm处有强的吸收峰,紫外结果表明合成物中含有硒。
采用溴化钾压片法，称取5mg甘草多糖和5mg甘草硒多糖，分别与400mg溴化钾粉末混合、研磨、压片，在4000-400cm-1范围内进行红外扫描分析。红外扫描图如图2和图3所示，图2为甘草多糖，显示其在800-900cm-1之间没有吸收峰，而图3为甘草硒多糖，显示其在860cm-1处有吸收峰，归属为Se＝O的伸缩振动峰，说明硒在多糖中以硒酸酯的形式存在，且硒多糖仍然保留了多糖的结构。
实施例2
本实施例与实施例1的制备方法基本相同，所不同的是：
步骤(1)中：过筛为过18目筛，酒精质量浓度为85％，酒精浸泡的时间为46h，细粉与酒精质量比为1:5；蒸馏水煎煮的次数为2次，每次待沸腾后，煎煮时间为30min。
步骤(2)中：室温静置的时间为8h，干燥的温度为65℃，干燥的时间30min,甘草粗多糖溶液浓缩至原体积的1/5后得到浓缩液，无水乙醇用量为浓缩液体积的8倍。
步骤(3)中：溶解甘草粗多糖的蒸馏水与甘草粗多糖的质量比为18:1，无水乙醇与浓缩上清液的体积比为2.5：1；三氯乙酸与甘草粗多糖的质量比为5.8:1；静置时间在3℃条件下为2.5h，室温条件下为8h。
步骤(4)中：硝酸溶液的质量浓度为0.4％，硝酸溶液与甘草精多糖的质量比为95:1，Na2SeO3和甘草精多糖的质量比为1:2；加热温度为65℃，加热时间为12-18min；搅拌反应是在65℃条件下搅拌反应8h。
步骤(5)中：减压浓缩为浓缩至原体积的1/5，无水乙醇与蒸馏水的体积比为3:1；干燥为真空冷冻干燥1.5h。
离心为2800rpm，离心时间为8min。
实施例3
本实施例与实施例1的制备方法基本相同，所不同的是：
步骤(1)中：过筛为过24目筛，酒精质量浓度为95％，所述酒精浸泡的时间为50h，细粉与酒精质量比为1:7；蒸馏水煎煮的次数为3次，每次待沸腾后，煎煮时间为40min。
步骤(2)中：室温静置的时间为12h，干燥的温度为75℃，干燥的时间60min,甘草粗多糖溶液浓缩至原体积的2/5后得到浓缩液，述水乙醇用量为浓缩液体积的10倍。
步骤(3)中：溶解甘草粗多糖的蒸馏水与甘草粗多糖的质量比为22:1，无水乙醇与浓缩上清液的体积比为3.5：1；三氯乙酸与甘草粗多糖的质量比为6.2:1；静置时间在5℃条件下为3.5h，室温条件下为12h。
步骤(4)中：硝酸溶液的质量浓度为0.6％，硝酸溶液与甘草精多糖的质量比为105:1，Na2SeO3和甘草精多糖的质量比为1:3；加热温度为75℃，加热时间为18min；搅拌反应是在75℃条件下搅拌反应9h。
步骤(5)中：减压浓缩为浓缩至原体积的2/5，无水乙醇与蒸馏水的体积比为5:1；干燥为真空冷冻干燥2.5h。
离心为3200rpm，离心时间为12min。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种甘草硒多糖的制备方法,其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取粗多糖：将甘草干燥、粉碎后，过筛，将过筛后的细粉用酒精浸泡,再过滤除去液体，将过滤后的不溶物用蒸馏水煎煮，过滤，将滤液离心，除去沉淀，收集上清液，得到甘草粗多糖溶液；
(2)浓缩：将甘草粗多糖溶液浓缩后加入无水乙醇，室温静置，再抽滤，沉淀后干燥，得到甘草粗多糖；
(3)纯化多糖：将甘草粗多糖用蒸馏水溶解后，加入三氯乙酸,3-5℃静置，离心，除去沉淀，重复此过程2-3次，至上清液中无蛋白质检出；浓缩上清液后加入无水乙醇室温静置，离心，沉淀，冷冻干燥后用蒸馏水溶解成48-52mg/mL的溶液，上层析柱，用蒸馏水洗脱，流速10-14mL/h，收集洗脱液，检测洗脱液中不含粗多糖时洗脱完成，将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，得到甘草精多糖；
(4)硒化修饰：将甘草精多糖用硝酸溶液溶解，搅拌，加热后加入Na2SeO3，搅拌反应后，将反应液自然冷却至室温，离心，除去沉淀，取上清液备用；
(5)除去亚硒酸钠：在上清液中加入饱和碳酸钠溶液调节pH值至5-6，再用蒸馏水透析，然后减压浓缩，再用无水乙醇进行醇沉，0-4℃放置8-12h，离心弃去上清液，沉淀物经干燥得到甘草硒多糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中：过筛为过18-24目筛，所述酒精质量浓度为85-95％，所述酒精浸泡的时间为46-50h，所述细粉与酒精质量比为1:5-7；所述蒸馏水煎煮的次数为2-3次，每次待沸腾后，煎煮时间为30-40min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中：所述室温静置的时间为8-12h，干燥的温度为65-75℃，干燥的时间30-60min,所述甘草粗多糖溶液浓缩至原体积的1/5-2/5后得到浓缩液，所述无水乙醇用量为浓缩液体积的8-10倍。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中：溶解甘草粗多糖的蒸馏水与甘草粗多糖的质量比为18-22:1，无水乙醇与浓缩后的上清液的体积比为2.5-3.5：1；所述三氯乙酸与甘草粗多糖的质量比为5.8-6.2:1；静置时间在3-5℃条件下为2.5-3.5h，室温条件下为8-12h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中：所述硝酸溶液的质量浓度为0.4-0.6％，硝酸溶液与甘草精多糖的质量比为95-105:1，Na2SeO3和甘草精多糖的质量比为1:2-3；所述加热温度为65-75℃，加热时间为12-18min；所述搅拌反应是在65-75℃条件下搅拌反应6-9h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中：所述浓缩为浓缩至原体积的1/5-2/5，无水乙醇与蒸馏水的体积比为3-5:1；所述干燥为真空冷冻干燥。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述离心为2800-3200rpm，离心时间为8-12min。
8.一种甘草硒多糖，其特征在于，按照权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到。
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