CN103193839B - 一种紫甘薯中花色苷的提取纯化方法 - Google Patents

一种紫甘薯中花色苷的提取纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种紫甘薯花色苷的提取纯化方法，采用α-淀粉酶法对紫甘薯全粉进行酶解处理以达到最大限度提取紫甘薯花色苷的目的，同时以AB-8吸附树脂纯化，极大的提高了紫甘薯花色苷的得率及品质，提取率高达72.223mg/g，色价E1%？1cm(530nm)=92。该方法为每mL紫甘薯乳中添加酶活力为200U的α-淀粉酶进行酶解处理，离心后通过AB-8大孔吸附树脂进行吸附纯化，浓缩后通过冷冻干燥得到紫甘薯花色苷样品。本发明应用于色素提取领域，特别是紫甘薯花色苷的提取，提高了色素提取的得率及品质，为紫甘薯花色苷的工业生产提供了新的思路，可广泛应用于紫甘薯深加工及其它色素提取领域。

Description

一种紫甘薯中花色苷的提取纯化方法
技术领域
本发明涉及天然色素生产工艺领域，具体涉及一种紫甘薯中花色苷的提取纯化方法。
背景技术
紫色甘薯(Ipomoea.batatasLam.)是一种块根内部含有高花色苷的新品种甘薯，在山东、广东、广西、云南等省均有大面积种植，资源广泛。紫甘薯中所含的花色苷与葡萄皮等原料相当，其稳定性又优于葡萄皮和黑莓色素等，是一种重要的天然色素源；最近研究表明，紫色甘薯中提取出的花色苷具有抗突变性、抗氧化性、活性氧消除能力、调节血压及缓解肝功能等作用，是一种资源广泛，生物功能突出，稳定性良好的天然色素，在食品和化妆品行业中应有广泛的应用前景。
目前，紫甘薯花色苷的提取方法大多采用酸性乙醇或者柠檬酸溶液浸提，该浸提所需温度较高、提取时间较长，不利于花色甙的稳定，而且耗费溶剂多，一次提取率不高，因此常采用一些辅助方法来提高其得率，除了传统的冷冻、加热和破碎处理外，还包括了超声波处理、微波辅助处理、高压处理等方法。虽然在很大程度上提高改善了浸提的很多缺点，提高了得率及品质，同时也提高了提取的成本，依然不足以为紫甘薯花色苷的应用发展提供足够的技术支持，所以寻找一种更加稳定高产，品质优良的紫甘薯花色苷提取方法成为了该领域发展的关键问题，亟需解决。
植物细胞壁大多是由纤维素、半纤维素、果胶等碳水化合物构成，此外还含有少量的单宁、果胶质、树脂、脂肪、腊及不可皂化物等，支撑着整个细胞的构架，保证细胞内的各组分正常有序的运转。纤维素酶是一种复合酶，在分解纤维素时起到催化作用，可以将纤维素分解成多糖或单糖，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，果胶酶是能够分解果胶物质的多种酶的总称，这两种酶被广泛应用于食品及饲料行业。所以，理论上可以将纤维素酶、果胶酶综合应用于紫甘薯细胞壁的破碎，更加全面的对细胞壁进行降解。但是实验数据表明：纤维素酶与果胶酶混合使用时会对紫甘薯花色苷具有一定的破坏作用，具体机理还在探索研究过程中。
发明内容
针对现有技术中提取紫甘薯中花色苷存在的上述缺陷和不足，本发明提供了一种紫色甘薯中花色苷的提取纯化方法，本发明所述技术方案开拓了全新紫甘薯花色苷的提取纯化技术领域，为紫甘薯花色苷领域的发展提供了强大的技术支持。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种紫甘薯中花色苷的提取纯化方法，所述提取步骤如下：
（1）挑选紫甘薯，进行干燥、粉碎得紫甘薯全粉；
（2）用pH为4-6.5、质量比为3%-5%的柠檬酸水溶液进行提取，以紫甘薯全粉与柠檬酸水溶液的m：v=1：9-1：11进行混匀处理，形成紫甘薯乳；
（3）向紫甘薯乳中添加α-淀粉酶，搅拌均匀，在52℃-58℃水浴下酶解处理；
（4）将上述酶解处理的紫甘薯乳离心，取上清液；
（5）将酶解离心后的上清液与树脂按照v：v=2.5：1-3.5：1的比例，取经预处理的大孔吸附树脂装入柱子中，对色素进行洗脱；
（6）对洗脱下来的色素溶液稀释，测其吸光度；
（7）将解析后的色素溶液进行真空旋转蒸发浓缩至体积小于原有体积的10%时，采用冷冻干燥得到样品。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（1）中紫甘薯的干燥粉碎是指把紫甘薯块茎切成厚0.2-0.5cm薄片后避光干燥至恒重，后用粉碎机粉碎成100目颗粒。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3）中α-淀粉酶最适添加量为500U/mL。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3）中α-淀粉酶最适酶解时间为80min。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3）中α-淀粉酶作用的最适温度是60℃。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3）中α-淀粉酶的最适pH为5。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3）中α-淀粉酶酶解的最优条件为酶用量203.35U/mL、温度57.9℃、时间58.4min、pH6.3。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（5）中纯化采用的树脂为AB-8，色素洗脱液为70%乙醇溶液，洗脱液流速为3mL/min。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（6）中洗脱下来的色素溶液稀释后，在紫甘薯花色苷最大吸收波长λmax530nm波长下测其吸光度值。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（7）中产品在真空冷冻干燥时，升华解析温度为40℃，冷冻干燥温度为-35℃。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
1、紫甘薯中淀粉含量很高，紫甘薯花色苷提取纯化过程中，其中的可溶性淀粉能较明显降低花色苷的稳定性，故本发明使用α-淀粉酶在提取时直接酶解可溶性淀粉，离心取上清液进行AB-8大孔树脂吸附，70%乙醇进行洗脱，以达到最大限度提取紫甘薯花色苷的目的，使用α-淀粉酶进行酶解提高了花色苷的稳定性。从而提高了紫甘薯花色苷的提取率，同时缩短了提取的时间，保证了紫甘薯花色苷的品质及稳定性。本发明同传统方法相比具有明显的优势，采用酶法进行紫甘薯花色苷提取处理，更适合于工业生产，降低了生产成本。开拓了一个全新的紫甘薯花色苷提取方法和领域。
2、通过对比使用纤维素酶与果胶酶，试验数据表明α-淀粉酶的使用可以提高花色苷的提取率，进一步通过对α-淀粉酶单位酶活力、酶解条件，大孔树脂纯化条件的控制，达到提取纯化的目的。本发明效果明显，花色苷提取率达到了72.223mg/g，色价品质更高，性质更加稳定。
3、本发明采用AB-8大孔吸附树脂进行纯化，效果明显，纯度更高。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其它特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1表明本发明中α-淀粉酶、果胶酶和纤维素酶三种酶作用时间对紫甘薯花色苷提取的影响。
图2表明本发明中а-淀粉酶添加量对紫甘薯花色苷提取的影响。
图3表明本发明中酶解温度对紫甘薯花色苷提取的影响。
图4表明本发明中pH值对紫甘薯花色苷提取的影响。
图5表明本发明中四个单因素交互项对紫甘薯花色苷提取量影响对比。
图6表明本发明中紫甘薯花色苷紫外可见吸收光谱。
图7表明本发明中苋菜红吸光度与浓度的关系曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
取50g紫甘薯全粉，与500mL3%柠檬酸水溶液混匀形成紫甘薯乳，均匀取浆液50mL，分别加入100U/mL的果胶酶、纤维素酶、α-淀粉酶，在50℃下酶解2h后测定紫甘薯浆花色苷色素含量变化，确定最适加酶量。
实验结果如图1所示，图1中α-淀粉酶提取的色素吸光度随着酶解时间变长而变大，色素溶液中部分色素被大分子淀粉颗粒附着，酶解到80min时，色素解附达到最大，80min以后有下降趋势，吸光度变化不大，由此确定α-淀粉酶最适酶解时间为80min。20min到120min时果胶酶还没充分发挥作用，120min时色素得到充分提取，吸光度最大。随着时间的延长，吸光度曲线趋于平缓。纤维素酶提取的色素，通过酶解破坏了细胞壁的结构，使得色素更好的溶出，随着时间的增加，吸光度有缓慢提高，140min时处于较高水平，但纤维素酶成本高。综合考虑生产效率以及酶用量成本，故选择α-淀粉酶作为酶提取剂。
实施例2
取实施例1中所述50mL均匀紫甘薯浆液，分别加入200、300、400、500、600、700U/mL的α-淀粉酶，调节pH值为5，在50℃下酶解2h后测定紫甘薯花色苷色素含量，确定最适酶添加量。
实验结果如图2所示，由图2可以看出α-淀粉酶添加量为500U/mL时色素提取效果最好，500U/mL之前酶用量不足，紫甘薯花色苷有部分未被提取出来，500U/mL时色素提取充分，再继续添加酶，吸光度曲线趋于平缓，吸光度无大变化，故选择500U/mL为最适α-淀粉酶添加量。
实施例3
取上述50mL均匀浆液，分别加入150U/mL的α-淀粉酶，调节pH值为5，分别在温度50、60、70、80、90℃下酶解2h后测定紫甘薯花色苷色素含量，确定最适酶作用温度。
实验结果如图3所示，由图3可以看出随着温度的变化，酶解液的吸光度先增大，后逐步减小，在60℃时吸光度达到最大值。60℃之前酶活力没有达到最大，但是还没有变性，所以吸光度不断增大，60℃之后随着温度升高，所有酶分子的空间结构遭到了不同程度的破坏。使得酶迅速丧失大部分的生物学活性，酶变性，活力降低，酶作用效果下降，故吸光度逐步降低。由此可以确定α-淀粉酶作用的最适温度是60℃。
实施例4
取50mL均匀浆液，分别加入150U/mL的α-淀粉酶，调节pH值分别为4、5、6、7、8，分别在温度50℃下酶解2h后测定紫甘薯花色苷色素含量，确定最适酶解pH。
实验结果如图4所示，图4显示pH为5之前没有达到α-淀粉酶的最适pH，酶活力没有达到最大，故吸光度增大，pH为5时酶活力最大，色素提取效果最好，5之后随着pH值不断上升，酶活力降低，故提取效果下降。由此可以确定α-淀粉酶的最适pH为5。
选择α-淀粉酶为最适用酶，经过酶添加量、酶作用温度、酶反应时间、酶解pH四种单因素对花色苷提取率的影响试验后，针对四个因素与花色苷含量进行四因素三水平响应面试验设计，优化紫甘薯花色苷色素酶法提取工艺。通过Design-ExpertSoftware7.0软件对试验数据进行回归分析，预测紫甘薯花色苷酶法提取最优工艺参数。实验设计见表1。
表1响应面分析因素与水平
根据软件Design-expert7.0所做的分析，得出了二次拟合回归方程：Y=54.30+0.92X1+0.66X2+0.74X3+1.01X4+0.24X1X2+0.84X1X3+0.095X1X4-0.10X2X3-0.27X2X4-0.035X3X4-1.09X1 2-1.85X2 2-1.38X3 2-2.28X4 2
由回归方程的方差分析可知，回归模型方差分析结果显著（P=0.0004<0.1），回归模型的决定系数为R2=0.9904，决定系数越接近1，说明回归方程的拟合度越好。
通过响应面回归方程，经Design-expert软件分析，可以得出模型中最佳条件参数：酶用量203.35U/mL，温度57.9℃，时间58.4min，pH6.3。在此参数下，提取的色素含量为72.23mg/g，比不添加酶时的提取率提高了10.75%。
本发明选用了酶用量、温度、时间和pH值四个因素进行单因素对比试验，通过实验得到了每个单因素单独适用的最优条件，然后进一步通过四因素三水平交互响应面试验，得出四因素的最佳配比，从最佳配比结果可知，温度、时间与pH值与单因素实验得到的结果差别不大，而α-淀粉酶的酶添加量与单因素试验的最适酶添加量有差别，这是因为pH值、温度、时间对α-淀粉酶产生交互作用影响，而且α-淀粉酶本身也有一定的颜色，故本发明以响应面交互试验的四因素交叉的最佳条件为准。
实施例5
称取适量紫甘薯粉，置于酸性乙醇溶液中60℃恒温水浴提取1h，以3000r/min离心15min，取上清液稀释后，用紫外-可见分光光度计在200～600nm范围内进行扫描，确定其最大吸收波长。
实验结果如图6所示，由图6可看出，紫甘薯花色苷的最大吸收波长λmax为530nm。
合成苋菜红色素与紫甘薯花色苷在530nm处均有最大吸收光度值，因此以合成苋菜红色素作为参照物，做标准曲线。
精确称取25.0mg苋菜红标准样品于50mL烧杯中，加入10mLpH为3的缓冲溶液溶解，溶解后转移至50mL容量瓶中，烧杯用10mLpH为3的缓冲溶液洗涤三次，洗涤液转移至容量瓶中，然后用pH为3的缓冲溶液定容，即配置成500mg/L的苋菜红标准溶液。
用移液管分别移取1mL，2mL，3mL，4mL，5mL，6mL，7mL500mg/L苋菜红标准溶液于100mL容量瓶中，并用pH为3的缓冲溶液定容至100mL,即制备成5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L的苋菜红标准溶液以pH为3的缓冲溶液作为空白，在最大吸收波长下检测吸光度，并绘制标准曲线。
以蒸馏水作为空白，在波长530nm下检测，并绘制标准曲线，图为在波长530nm下，觅菜红的吸光度随浓度变化的曲线。由图可知，曲线的回归方程为：y=45.137x+0.9197
式中：y——苋菜红浓度，μg/g;
x——吸光度
结合所得花色苷溶液的吸光度和标准曲线回归方程即可求得紫甘薯花色苷溶液中花色苷含量为738.53mg/100g。
实施例6
首先配制质量比为3%柠檬酸水溶液1L，取紫甘薯全粉50g，加入3%柠檬酸溶液500mL进行混匀处理，形成紫甘薯乳。每mL紫甘薯乳中添加酶活力为200U的α-淀粉酶，搅拌均匀，置于55℃恒温中酶解2.5h。将酶解完的紫甘薯乳以3000r/min进行离心15min处理，取上清液备用。取经预处理（新的AB-8大孔树脂预处理方法：95%乙醇浸泡过夜，装柱后水洗至无醇味；旧的AB-8处理方法：5%盐酸浸泡3h，用蒸馏水洗至中性，用30g/LNaOH浸泡3h，用蒸馏水洗至中性）的AB-8的大孔吸附树脂200mL装入柱子中，进行吸附处理，然后用500mL70%的乙醇溶液解析，速度为3mL/min，旋转蒸发浓缩至体积小于50mL时，采用冷冻干燥得到样品，共计3.57g，提取率为71.4mg/g，通过分光光度法测得样品色价为
实施例7
首先配制3%柠檬酸溶液550L，取紫甘薯全粉50kg，加入3%柠檬液500L进行混匀处理，形成紫甘薯乳。每mL紫甘薯乳中添加酶活力为200U的α-淀粉酶，搅拌均匀，置于55℃恒温中酶解2.5h。将酶解完的紫甘薯乳以3000r/min进行离心15min处理，取上清液备用。取经预处理的AB-8的大孔吸附树脂180L装入罐中，进行吸附处理，然后用500L70%的乙醇溶液解析，速度为100L/h，真空蒸发浓缩至较粘稠状态时，采用冷冻干燥得到样品，共计3.23kg，提取率为64.6mg/g，通过分光光度法测得样品色价为
实施例8
首先配制3%柠檬酸溶液550L，取紫甘薯全粉50t，加入3%柠檬酸水溶液500L进行混匀处理，形成紫甘薯乳。每mL紫甘薯乳中添加酶活力为200U的α-淀粉酶，搅拌均匀，置于55℃恒温中酶解2.5h。将酶解完的紫甘薯乳以3000r/min进行离心15min处理，取上清液备用。取经预处理的AB-8的大孔吸附树脂180L装入罐中，进行吸附处理，然后用500L70%的乙醇溶液解析，为50L/h，真空蒸发浓缩至较粘稠状态时，采用冷冻干燥得到样品，共计3.11t，提取率为62.2mg/g，通过分光光度法测得样品色价为
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.一种紫甘薯中花色苷的提取纯化方法，其特征在于提取步骤如下：
（1）挑选紫甘薯，进行干燥、粉碎得紫甘薯全粉；
（2）选用pH为4-6.5、质量比为3%-5%的柠檬酸水溶液，以紫甘薯全粉与柠檬酸水溶液的m：v=1：9-1：11进行混匀处理，形成紫甘薯乳；
（3）向紫甘薯乳中添加α-淀粉酶，搅拌均匀，在水浴下酶解处理；α-淀粉酶酶解的条件为酶用量203.35U/mL、温度57.9℃、时间58.4min、pH6.3；
（4）将上述酶解处理的紫甘薯乳离心，取上清液；
（5）酶解离心后的上清液与树脂按照v：v=2.5：1-3.5：1的比例进行过柱，取经预处理的大孔吸附树脂装入柱子中，对色素进行洗脱；树脂为AB-8，色素洗脱液为60%-80%乙醇溶液，洗脱液流速为1.5-3mL/min；
（6）将洗脱下来的色素溶液稀释后测其吸光度；
（7）将解析后的色素溶液进行真空旋转蒸发浓缩至体积小于原有体积的10%时，采用冷冻干燥得到样品，产品在真空冷冻干燥时，升华解析温度为40℃，冷冻干燥温度为-35℃。
2.根据权利要求1所述的紫甘薯中花色苷的提取纯化方法，其特征在于：所述步骤（1）中紫甘薯的干燥粉碎是指把紫甘薯块茎切成厚0.2-0.5cm薄片后避光干燥至恒重，然后用粉碎机粉碎成100目颗粒。
3.根据权利要求1所述的紫甘薯中花色苷的提取纯化方法，其特征在于：所述步骤（6）中洗脱下来的色素溶液稀释后，在紫甘薯花色苷最大吸收波长λmax530nm波长下测其吸光度值。
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