CN101907532A

CN101907532A - 一种蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备方法和用于实施该方法的试剂盒

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Publication number: CN101907532A
Application number: CN2010101207519A
Authority: CN
Inventors: 刘爱林
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-03-10
Filing date: 2010-03-10
Publication date: 2010-12-08

Abstract

本发明公开了一种蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备方法，包括铺片步骤、细胞裂解步骤、解旋电泳步骤、中和步骤以及染色步骤，其中，所述铺片步骤包括：第一铺胶步骤：在一个载玻片上铺一个第一琼脂糖凝胶层；加缓冲液步骤：在所述第一琼脂糖凝胶层上加Honda buffer缓冲液；点样步骤：将一个蚕豆根尖的切面反复多次进入所述Honda buffer缓冲液液面；第二铺胶步骤：在所述Honda buffer缓冲液上铺一层琼脂糖胶体液，盖上盖玻片，固化后形成一个细胞胶体混合凝胶层。本发明方法获得的可分析细胞核较多、所获得的图像背景较佳。

Description

一种蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备方法和用于实施该方法的试剂盒

技术领域

本发明涉及细胞DNA损伤检测技术，特别涉及一种蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备方法和用于实施该方法的试剂盒。

背景技术

单细胞凝胶电泳图像分析(Si ngl e Cell Gel El ect r ophor esi s，SCGE)技术，又称彗星检测法(Comet Assay)，是一种80年代末发展起来的研究和定量检测单个细胞DNA损伤的简单、灵敏、快速的新技术。在有关因子诱发下，细胞的DNA若受到损伤，会引起其高级结构变化，致使其超螺旋结构松散。当细胞发生原位裂解、DNA解旋等现象时，损伤的DNA片段在电泳时会从核中移出，向阳极迁移并呈现尾形分布，而细胞无损部分仍保持球形。经荧光染料染色后，可用荧光显微镜观察到这些细胞形成彗星状图样；而且一定条件下，DNA的迁移距离(表现为彗星尾长度)和DNA的迁移含量(表现为荧光强度)的分布与DNA受损伤程度相关，此即为单细胞凝胶电泳图像分析技术研究和定量分析的基础。

目前世界上通用的方法是采用Si ngh NP等建立和改进的碱性单细胞凝胶电泳图像分析(Al kal i ne Si ngl e Cell Gel El ect r ophor esi s，ASCGE)技术，一方面在高pH值碱性条件下，细胞DNA中碱易变性部位和断链更易出现，还可促使RNA降解，所以检测的灵敏度较高；另一方面，利用碱性条件溶解细胞和电泳，提高了检测的敏感性；此外，能同时检测DNA双链断裂和单链断裂，并通过加入特定的DNA内切酶来确定DNA链上的易感位点，从而使该技术的应用范围极广泛。与其他DNA链断裂检测技术，如原位杂交技术、高效毛细管电泳技术、高效液相色谱、气相色谱-质谱法等相比较，单细胞凝胶电泳图像分析技术具有敏感、快速、简便、重复性好、低耗等特点。因而单细胞凝胶电泳图像分析迅速成为流行的DNA损害检测方法，广泛应用于遗传毒理学、职业与环境生物监测、辐射生物学、肿瘤学、老年学、环境生态学以及氧化应激和细胞凋亡有关的多种病理过程研究；并可进行药物对DNA损伤的抑制和修复检验、肿瘤放疗化疗疗效评估检验、辐射对细胞DNA的损伤检验、病毒对细胞的DNA损伤检验、疾病的定性定量诊断和疗效分析、以及公安法医毒物分析等。

植物蚕豆由于其根尖细胞的染色体大，数量少，DNA含量多，对诱变剂反应敏感，因此被常用于作为样品来进行单细胞凝胶电泳图像分析。蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备基本步骤包括：(1)样品凝胶玻片的铺片；(2)细胞裂解；(3)解旋与电泳；(4)中和洗涤；(5)荧光染色。不同的样品制备方法最大区别在于铺片步骤。铺片步骤实质上是将单个的细胞和/或细胞核固定包埋在凝胶里。固定包埋的好坏决定是否有足够数量的完整的细胞核用于结果分析，决定荧光染色后图像背景是否干净便于显微分析，固定包埋过程时间的长短决定损伤DNA被恢复的程度，时间越短，恢复的程度越小，结果越客观。总之，铺片步骤的操作直接决定实验结果的质量，是整个蚕豆根尖细胞彗星试验技术的关键环节，是已往报道技术的主要差别所在。已往报道的蚕豆根尖细胞彗星试验技术在铺片步骤大体有以下几种做法：

(1)酶法：取3-5个蚕豆根尖，在缓冲液中切碎，加纤维酶和果胶酶分解约3小时，取细胞核上清液铺片。此方法最大优点在于可获得大量细胞核，最大缺点在于耗时，操作不便且微损伤DNA被恢复的可能性大，因而实际应用不多。

(2)机械法：取3-5个蚕豆根尖，在缓冲液中切碎，经分样筛或尼龙纱过滤，离心(有些技术不离心)，取细胞和/或细胞核铺片。此方法较酶法简便，但最大缺点在于获得的细胞核很少，如缓冲液不合适，甚至不能获得用于结果分析的足够数量的细胞核。此外，该方法获得的图像背景差(因组织碎片等杂质多)，不便显微分析。此方法因相对简便，是目前应用的主要技术。

分离数量适当的、完整的单个细胞和/或细胞核来铺片是决定蚕豆根尖细胞彗星试验成败的关键因素，不同技术的分离方法需要的器材(如离心机、过滤材料)不同，时间不同，效果也有很大差异。已报道的蚕豆根尖细胞彗星试验技术所用的细胞和/或细胞核分离方法均采用机械法或酶法，以机械法偏多，而且不同技术用机械法分离单个细胞和/或细胞核时采用的分离缓冲液差别很大(有：Sor ensenbuffer、PBS、Tris-HCl、MBS、Hbnda buf fer等)。多个研究报道表明缓冲液的选择对分离效果继而对实验成败影响很大，因而不同技术的实际效果有很大差异。此外，上述技术在铺片时有采用三层胶，也有采用二层胶的，胶的浓度也略有不同；铺片时用的玻璃片有磨砂的，也有普通的。

现有蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备方法存在一个缺点，细胞铺片步骤无论采用机械法或酶法，都操作复杂、时间较长，且获得的图像背景较差或可分析细胞核较少。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种简便快速的、获得的可分析细胞核较多、图像背景较佳的蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种用于实施上述方法的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备方法，包括铺片步骤、细胞裂解步骤、解旋电泳步骤、中和步骤以及染色步骤，其中，所述铺片步骤包括：第一铺胶步骤：在一个预处理的载玻片上铺一个第一琼脂糖凝胶层；加缓冲液步骤：在所述第一琼脂糖凝胶层上加Honda buffer缓冲液；点样步骤：将一个蚕豆根尖的切面反复多次进入所述Honda buffer缓冲液液面；第二铺胶步骤：在所述Honda buffer缓冲液上铺一层琼脂糖胶体液，盖上盖玻片，固化后形成一个细胞胶体混合凝胶层。

在本发明的一个实施方式中，所述铺片步骤进一步包括：第三铺胶步骤：移走所述盖玻片，在所述细胞胶体混合凝胶层上铺一个第二琼脂糖凝胶层。

在本发明的一个实施方式中，所述第一铺胶步骤中，所述琼脂糖胶体液为0.5％正常熔点琼脂糖胶体液。

在本发明的一个实施方式中，所述Honda buffer缓冲液包括0.44M的sucrose、体积分数为2.5％的Ficoll(type 400)，体积分数为5％的Dextran T-40、25mM且pH为8.5的Tris-HCl、10mM的MgCl₂、10mM的β-mercaptoethanol、以及体积分数为2.5％的Triton X-100。

在本发明的一个实施方式中，所述Honda buffer缓冲液的剂量为10μl。

在本发明的一个实施方式中，所述点样步骤中，所述蚕豆根尖为被切去远端根尖后所剩的近端根尖。

在本发明的一个实施方式中，所述第二铺胶步骤中，所述琼脂糖胶体液为0.5％低熔点琼脂糖胶体液。

在本发明的一个实施方式中，所述第二铺胶步骤中，所述琼脂糖胶体液的剂量为80μl、温度为40℃。

在本发明的一个实施方式中，所述第二铺胶步骤中，所述固化的方位是放置在4℃环境下10分钟。

在本发明的一个实施方式中，所述第三铺胶步骤包括在所述细胞胶体混合凝胶层上加剂量为80μl的、0.5％低熔点的琼脂糖胶体液，盖上新盖玻片，放置在4℃环境下10分钟。

在本发明的一个实施方式中，所述细胞裂解步骤包括将经过所述铺片步骤处理的载玻片放在染色缸中，加100ml裂解液，放置在4℃环境下2小时，其中，所述裂解液包括2.5M的NaCl、100mM的Na₂EDTA、10mM的Tris base、以及体积分数1％的Triton X-100，pH 10。

在本发明的一个实施方式中，解旋电泳步骤包括将经过细胞裂解步骤处理的载玻片放在一个电泳槽里，向所述电泳槽里加入碱性电泳缓冲液，使液面高于所述载玻片凝胶面2mm，静置20分钟后，在设定电压25V、电流300mA，环境温度4℃的条件下电泳20分钟，其中碱性电泳缓冲液包括0.3M的NaOH和1mM的Na₂EDTA，pH＞13。

在本发明的一个实施方式中，所述中和步骤包括将经过所述解旋电泳步骤处理的载玻片放入中和缓冲液中和5分钟，更换中和缓冲液，再中和两次，其中，中和缓冲液包括0.4M Tris-HCl，pH 7.5。

在本发明的一个实施方式中，所述染色步骤包括将经过中和步骤处理的载玻片滴加2μg/ml的EB进行荧光显微镜观察，或者在无水乙醇中脱水10分钟，可干燥保存至少一周。

一种用于实施上述的方法的试剂盒，包括第一至第六试剂、载玻片以及盖玻片，所述第一试剂是0.5％正常熔点琼脂糖胶体液，所述第二试剂是由0.44M的sucrose、体积分数为2.5％的Ficoll(type 400)，体积分数为5％的Dextran T-40、25mM且pH为8.5的Tris-HCl、10mM的MgCl₂、10mM的β-mercaptoethanol、以及体积分数为2.5％的Triton X-100构成的Honda buffer缓冲液，所述第三试剂是0.5％低熔点琼脂糖胶体液，所述第四试剂是由2.5M的NaCl、100mM的Na₂EDTA、10mM的Tris base和1％的Triton X-100，pH 10构成的裂解液，第五试剂是由0.3MNaOH和1mMNa₂EDTA构成的，且pH＞13的碱性电泳缓冲液，第六试剂是由0.4M、pH 7.5的Tris-HCl构成的中和缓冲液。

和现有技术相比，本发明蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备方法具有以下优点：

(1)仅需一个蚕豆根尖就可获得足够分析用的细胞核，不需要离心和过滤，不但减少实验设备和材料要求，而且操作极其简单，荧光图像背景干净。

(2)细胞铺片时间极大缩短，减缓DNA损伤修复可能，试验结果更客观。

附图说明

图1是本发明蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备方法的流程图。

具体实施方式

请参照图1，图1是本发明蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备方法的流程图。该方法包括以下步骤：

步骤1、准备步骤；

准备一根新鲜的待测蚕豆根，在冰上放置2分钟，距根尖约2mm处用锋利刀片截断蚕豆根，弃去截下的远端根尖，保留近端根尖以备实验。

准备一张磨砂载玻片，垂直浸入在65℃恒温水槽里温浴备用的、用无Ca²⁺，Mg²⁺的磷酸盐缓冲液配制的1％正常熔点琼脂糖胶体液(NMP)中约2秒钟取出，垂直放置，待胶凝固后刮去，干燥保存备用。

步骤2、铺片步骤；包括：

第一铺胶步骤：在一个载玻片上铺一个第一琼脂糖凝胶层；

准备所述备用的磨砂载玻片，加80μl、在65℃恒温水槽里温浴备用的、0.5％正常熔点琼脂糖胶体液，盖上盖玻片，放4℃冰箱10分钟，固化后形成第一个琼脂糖凝胶层。

加缓冲液步骤：在该第一琼脂糖凝胶层上加Honda buffer缓冲液；

在凝固的第一琼脂糖凝胶层上加10μl预冷的Honda buffer缓冲液。该Hondabuffer缓冲液的成分包括0.44M的sucrose、体积分数为2.5％的Ficoll(type 400)，体积分数为5％的Dextran T-40、25mM且pH为8.5的Tris-HCl、10mM的MgCl₂、10mM的β-mercaptoethanol、以及体积分数为2.5％的Triton X-100。

点样步骤：将一个蚕豆根尖的切面反复多次进入该Honda buffer缓冲液液面；

用该待测蚕豆根的近端根尖的切面轻轻触及并略进入凝胶上的Honda buffer缓冲液液面约30次。然后，将该磨砂载玻片静置3分钟。

第二铺胶步骤：在该Honda buffer缓冲液上铺一层琼脂糖胶体液，盖上盖玻片，固化后形成一个细胞胶体混合凝胶层。

加80ul、在40℃恒温水槽里温浴备用的、0.5％低熔点琼脂糖胶体液(LMPA)覆盖该Honda buffer缓冲液，盖上盖玻片，放4℃冰箱10分钟，固化后形成一个细胞胶体混合凝胶层。

第三铺胶步骤：移走所述盖玻片，在所述细胞胶体混合凝胶层上铺一个第二琼脂糖凝胶层。

从冰箱取出该磨砂载玻片，用大拇指推动移走该盖玻片，加80μl、0.5％低熔点琼脂糖胶体液覆盖载玻片上的该细胞胶体混合凝胶层，盖上新盖玻片，放4℃冰箱10分钟，进行固化。

步骤3、细胞裂解步骤；

从冰箱取出该磨砂载玻片，移走盖玻片，放在染色缸中，加100ml裂解液，放4℃冰箱裂解1小时。该裂解液的成分包括2.5M的NaCl、100mM的Na₂EDTA、10mM Tris base、以及体积分数为1％的Triton X-100，pH 10。

步骤4、解旋电泳步骤；

从染色缸中将磨砂载玻片取出并放在一个电泳槽里，向所述电泳槽里加入碱性电泳缓冲液，使液面高于所述载玻片凝胶面2mm，静置20分钟后，在设定电压25V、电流300mA，环境温度4℃的条件下电泳20分钟，其中碱性电泳缓冲液包括0.3M的NaOH和1mM Na₂EDTA，pH＞13。

步骤5、中和步骤；

将经过所述解旋电泳步骤处理的载玻片放入中和缓冲液中和5分钟，更换中和缓冲液，再中和两次，其中，中和缓冲液包括0.4M的Tris-HCl，pH 7.5。

步骤6、染色步骤；

中和完毕的磨砂载玻片可立即滴加2μg/ml的溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)进行荧光显微镜观察，亦可在无水乙醇中脱水10分钟，可干燥保存至少一周。

用于该方法的试剂盒包括第一至第六试剂、载玻片以及盖玻片，所述第一试剂是0.5％正常熔点琼脂糖胶体液，所述第二试剂是由0.44M的sucrose、体积分数为2.5％的Ficoll(type 400)，体积分数为5％的Dextran T-40、25mM且pH为8.5的Tris-HCl、10mM的MgCl₂、10mM的β-mercaptoethanol、以及体积分数为2.5％的Triton X-100构成的Honda buffer缓冲液，所述第三试剂是0.5％低熔点琼脂糖胶体液，所述第四试剂是由2.5M NaCl、100mM Na₂EDTA、10mM Tris base和1％的Triton X-100，pH 10构成的裂解液，第五试剂是由0.3M NaOH和1mM的Na₂EDTA构成的且pH＞13的碱性电泳缓冲液，第六试剂是由04M、pH为7.5的Tris-HCl构成的中和缓冲液。

虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当以权利要求所界定的为准。

Claims

1.一种蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备方法，包括铺片步骤、细胞裂解步骤、解旋电泳步骤、中和步骤以及染色步骤，其特征在于，所述铺片步骤包括：

第一铺胶步骤：在一个预处理的载玻片上铺一个第一琼脂糖凝胶层；

加缓冲液步骤：在所述第一琼脂糖凝胶层上加Honda buffer缓冲液；

点样步骤：将一个蚕豆根尖的切面反复多次进入所述Honda buffer缓冲液液面；

第二铺胶步骤：在所述Honda buffer缓冲液上铺一层琼脂糖胶体液，盖上盖玻片，固化后形成一个细胞胶体混合凝胶层。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铺片步骤进一步包括：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一铺胶步骤中，所述琼脂糖胶体液为0.5％正常熔点琼脂糖胶体液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Honda buffer缓冲液包括0.44M的sucrose、体积分数为2.5％的Ficoll(type 400)，体积分数为5％的DextranT-40、25mM且pH为8.5的Tris-HCl、10mM的MgCl₂、10mM的β-mercaptoethanol、以及体积分数为2.5％的Triton X-100。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加缓冲液步骤中，所述Hondabuffer缓冲液的剂量为10μl。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述点样步骤中，所述蚕豆根尖为被切去远端根尖后所剩的近端根尖。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二铺胶步骤中，所述琼脂糖胶体液为0.5％低熔点琼脂糖胶体液。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第三铺胶步骤包括在所述细胞胶体混合凝胶层上加剂量为80μl的、0.5％低熔点的琼脂糖胶体液，盖上新盖玻片，放置在4℃环境下10分钟。

9.根据权利要求1至10中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞裂解步骤包括将经过所述铺片步骤处理的载玻片放在染色缸中，加100ml裂解液，放置在4℃环境下2小时，其中，所述裂解液包括2.5M的NaCl、100mM的Na₂EDTA、10mM的Tris base、以及体积分数1％的Triton X-100，pH 10。

10.一种用于实施根据权利要求1至10中任意一项所述的方法的试剂盒，其特征在于：包括第一至第六试剂、载玻片以及盖玻片，所述第一试剂是0.5％正常熔点琼脂糖胶体液，所述第二试剂是由0.44M的sucrose、体积分数为2.5％的Ficoll(type 400)，体积分数为5％的Dextran T-40、25mM且pH为8.5的Tris-HCl、10mM的MgCl₂、10mM的β-mercaptoethanol、以及体积分数为2.5％的TritonX-100构成的Honda buffer缓冲液，所述第三试剂是0.5％低熔点琼脂糖胶体液，所述第四试剂是由2.5M的NaCl、100mM的Na₂EDTA、10mM的Tris base和1％Triton的X-100构成的裂解液，第五试剂是由0.3M的NaOH和1mM的Na₂EDTA构成的且pH＞13的碱性电泳缓冲液，第六试剂是由0.4M、pH 7.5的Tris-HCl构成的中和缓冲液。