CN107576540A - 一种简易的彗星实验方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种简易彗星实验方法，该方法包括简易再胶片的制作以及细胞液体的配置，只是需要铺一层胶就可以进行彗星实验，简单，准确率高，而且效率高。

Description

一种简易的彗星实验方法

技术领域

本发明属于细胞检测领域,特别的,属于利用彗星电泳技术检测细胞损伤的方法。

背景技术

单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresisAssay，SCGE)也称彗星实验(Comet Assay)，1984年由Ostlingn发明，是一种检测真核细胞DNA损伤的技术，目前，在遗传毒性试验、环境污染检测和分子流行病学、生态病理学以及DNA损伤修复的基础研究领域有关广泛的应用。其原理是：把包埋于琼脂糖中的细胞裂解，然后把DNA解旋和电泳。如果细胞DNA断裂成碎片，染色后会在显微镜下看到彗星样的结构。主要实验步骤包括：制备单细胞悬液、制胶与铺胶、裂解、解旋、电泳、中和、染色、镜检以及结果分析等。

在彗星实验中，凝胶的载体-载胶片至关重要，决定着实验的成败。铺胶后，载胶片要经过：细胞裂解液浸泡溶解细胞、强洗脱力的强碱性溶液(pH13)的浸泡解旋、在强碱性(pH13)电泳液中电泳，中和液中浸泡和超纯水中洗涤等五个步骤，在这些浸泡过程中，凝胶极易从载胶片上漂移、断裂、脱落。当采用多层凝胶方案时，凝胶厚度往往不易控制，凝胶的厚度差可造成荧光显微镜拍照时不清晰。另外，荧光显微镜观察时，要求载胶片的长、宽和厚度必须与普通的载玻片一样才能放入显微镜载物台，并拍出满意的图片。

国内文献中记载的载胶片，常见的有磨砂载玻片，如张静等(2012)年采用磨砂载玻片检测铅对小鼠淋巴细胞的DNA损伤，在该方法中使用双层胶法，第一层胶即底胶是0.8％的正常熔点琼脂，取100μL于45℃平铺于磨砂载玻片上，用盖玻片推匀后并压在胶上，4℃凝固15分钟，然后取下盖玻片。再取100μL的37℃的0.4％混合胶(0.8％低熔点琼脂糖与细胞悬液按等体积混合)，平铺于第一层胶上，并用盖玻片覆盖，4℃凝固15分钟。这种方法需要两次铺胶，步骤较多，铺胶容易失败，特别是两次把盖玻片从很薄的胶上取下时，容易造成胶破裂和松动，对操作人员的要求较高。更重要的是后续的裂解、解旋、电泳、中和与洗涤的浸泡的过程中，胶体容易从胶板上胶落。而且两层胶的厚度无法控制，难以形成均匀的胶，不利于后继的显微镜观察。此法最主要的缺点是荧光显微照像时，激发光无法穿过磨砂载玻片，激发荧光，而只能从顶部入射激发，这样激发的荧光的信号很弱，导致照片很不清晰，几乎不能显示正常的彗尾。

第二种常见载胶片是普通载玻片，如杨春玲等(2014)，取100μL正常溶点胶平铺在普通的载玻片上，加盖盖玻片，4℃下放置lO分钟，待第一层胶凝固后轻轻去除盖玻片，吸取100μL混合胶平铺于第一层胶上，4℃下放置lO分钟。这种方法的缺点是制胶步骤多，易失败，凝胶厚度不均匀，去除盖玻片时造成胶松动，浸泡时易脱落。

第三种常见载胶片是自制电泳槽，如杨国强等(2015)，用双层胶法，按常规方法把两层胶均铺于自制的胶板上，其缺点是步骤多，凝胶厚和不易成像等。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不足，本发明提供一种本实验发明的彗星实验载胶片及彗星实验方法，该方法很好的解决了上述制胶步骤多、易脱胶、成像不清楚等问题，简化了实验步骤，提高了荧光显微镜的拍摄效果。

一方面，本发明提供一种简易彗星实验方法

该方法包括如下步骤：

(1)制作载胶片：提供材料：普通载玻片(长宽为25.4mm×75.6mm，厚度为1mm-1.2mm)、家装玻璃胶、玻璃刀；沿载玻片短边，用玻璃刀栽切成3-4mm长的细长条；用玻璃胶把玻璃长条沿载玻片长轴方向粘牢，每载玻片粘4条，相互间隔均匀且分布在载玻片正中间，从而获得三个胶槽；室内避光晾干7天；干燥后用小刀刮除残留玻璃胶；

(2)制备生物体的细胞悬浮液，并保持在37℃；

(3)化胶：根据实验需要，提供低熔点琼脂糖若干，加入PBS溶液150倍(质量体积比)，在微波炉上加热熔化胶，冷却胶液并保持在37℃；

(4)制胶：取37℃的细胞悬液与37℃胶按体积比1∶3的比例混匀后，立即铺在步骤(2)制备好的载玻片的胶槽中；胶铺好后室温下冷却15min；

(5)裂解：冷却结束后，将带有胶片的载玻片浸入裂解液中，置于4℃暗室2h；2h后取出胶板，用4℃蒸馏水浸泡冲洗2次，每次5分钟；

(6)解旋：将带有胶片的载玻片浸入4℃解旋液中，黑暗条件下保持20min；

(7)电泳：将带有胶片的载玻片从解旋液取出，重新浸没在新鲜的4℃解旋液中进行电泳，电泳条件为：0.7v/cm，20min；

(8)中和：电泳结束后，带有胶片的载玻片在中和液中浸泡15min；

(9)染色：每个胶片上滴加2ug/ml EB液覆盖胶上，避光1-5分钟后；清除胶板上多余的EB液；

(10)镜检：荧光显微镜下，先明场下确认是细胞DNA，后再G模式下放大倍数为400倍或200倍，带标尺，拍照，tiff格式保存。

在一些优选的方式中，所述的PBS(1000ml)配方：

在一些优选的方式中，所述的细胞裂解液(1000ml)

6)NaCl 146.3g

7)Na2-EDTA2H₂O 40.824g

8)Tris-HCl 1.586g

9)pH 10.0

10)临用前加入1％TritonX-100和10％DMSO，用前冷藏30～60min；

在一些优选的方式中，所述的解旋液(1000ml)

4)NaOH 12.0g

5)Na₂-EDTA2H₂O 0.4082g

6)pH 13.0

在一些优选的方式中，所述的中和液(200ml)常温贮藏

14.Tris－HCl中和液 12.6g(原始pH＝4,加NaOH调节pH)

15.pH 7.5

在一些优选的方式中，制备动物细胞悬浮液：先提取动物的血液、淋巴液、剪碎的组织液，或胰蛋白酶消化的组织液，再通过离心法得到纯化的细胞悬浮液。

在一些优选的方式中，制备植物细胞(核)悬液：用纤维素酶和果胶酶溶解植物组织，或洗脱植物组织得到植物细胞核悬浮液。细胞悬浮液的制备方法因物种而异，也可以用其它方法获得。

在一些优选的方式中，细胞悬浮液在与胶混合前要保持在37℃。

另一方面，本发明提供一种检测蚯蚓体腔细胞DNA损伤的彗星实验方法

该方法包括：

1、提供一种蚯蚓彗星实验载胶片的制备方法。

提供普通载玻片(长宽为25.4mm×75.6mm，厚度为1mm-1.2mm)和玻璃条(长为3-4mm，宽为1-2mm)及胶水。在每个载玻片上，沿长轴方向粘牢4个玻璃条，玻璃条间隔相等且分布在载玻片正中间，玻璃条之间的空间即为胶槽，从而得到用于彗星实验的载胶片。其中，所述的4个玻璃条是从所述载玻片的沿短边切割下来的。

在一些优选的方式中，该方法还包括：2.提供一种蚯蚓体腔细胞的制备方法，该方法包括：

(1)每处理取蚯蚓2条，用超纯水清洗体表至无脱落物，用吸水纸除去蚯蚓体表水膜。(2)每个2ml离心管放入1只蚯蚓，再加1ml体腔细胞提取液，室温静置5min弃死蚓，得到蚯蚓体腔细胞的粗提液。(3)对粗提液进行三次离心纯化蚯蚓体腔细胞，前两次离心条件为：转速均为2000RPM，时间为达到所需转速时间。第三次离心条件为：4℃3000r/min离心6min。(4)弃上清液，得到沉淀的细胞，每管加入PBS并均匀悬浮分散体腔细胞，置于37℃保温。

在一些优选的方式中，该方法还包括：3.提供一种蚯蚓彗星实验凝胶的制备方法，该方法包括：

天平称取所需低熔点琼脂糖若干，加入PBS溶液150倍(质量体积比)，在微波炉上加热熔化胶，冷却胶液并保持在60℃,混胶前冷却至37℃。

在一些优选的方式中，该方法还包括：4.提供一种蚯蚓彗星实验铺胶方法：

取37℃的细胞悬液与37℃胶按体积比1∶3的比例混匀后，立即铺在步骤1制备好的载胶片的胶槽中；胶铺好后室温下冷却15min；

在一些优选的方式中，该方法还包括：5.提供一种蚯蚓彗星实验细胞裂解方法：

(1)冷却结束后，将胶片浸入裂解液工作液中，置于4℃暗室2h；

(2)2h后取出胶板，用4℃蒸馏水浸泡两次。

在一些优选的方式中，该方法还包括：6.提供一种蚯蚓彗星实验DNA解旋方法

(1)将胶片浸入4℃解旋液中，黑暗条件下保持20min。

在一些优选的方式中，该方法还包括：7.提供一种蚯蚓彗星实验电泳方法

(1)将胶片浸没在新鲜的4℃解旋液中，0.7v/cm电泳20min。

在一些优选的方式中，该方法还包括：8.提供一种蚯蚓彗星实验DNA中和方法

(1)中和液应常温储存。

(2)电泳结束后胶片在中和液中浸泡15min。

在一些优选的方式中，还包括：9.DNA染色

每个胶片上滴加2ug/ml EB液覆盖胶上，避光1-5分钟后；清除胶板上多余的EB液；

在一些优选的方式中，还包括：10.荧光显微拍照

荧光显微镜下，先明场下确认是细胞DNA，后再G模式下放大倍数为400倍，带标尺，并拍照。tiff格式保存照片。

在本方法中，涉及的溶液配方如下：

在一些优选的方式中，所述的1000ml PBS配方：

1)NaCl 8.0g；

2)KCl 0.2g；

3)Na₂HPO₄ 1.44g；

4)KH₂PO₄ 0.24g；

5)H₂O 900mL

6)用HCl调节pH至7.3后，定容至1000mL；灭菌后4℃保存。

在一些优选的方式中，所述的100ml蚯蚓体腔细胞提取液配方：

1)NaCl 0.413g

2)Na₂-EDTA2H₂O 0.204g

3)愈创木酚甘油醚 0.998g

4)pH 7.5

5)用超纯水80ml,调节pH 7.5，定容至100ml.

在一些优选的方式中，所述的1000ml细胞裂解液配方：

1)NaCl 146.3g

2)Na2-EDTA2H₂O 40.824g

3)Tris-HCl 1.586g

4)H₂O 1000mL

5)pH 10.0

在一些优选的方式中，所述的1000ml解旋液配方：

7)NaOH 12.0g

8)Na₂-EDTA2H₂O 0.4082g

9)H₂O 1000mL

10)pH 13.0

在一些优选的方式中，所述的200ml中和液配方：

16.Tris－HCl 12.6g

17.H₂O 200mL

18.pH 7.5

说明书附图

图1是本发明制作的载胶片照片。

图2是烯啶虫胺对蚯蚓体腔细胞DNA损伤的彗星图像(400×)，第一列是用本法制备的蚯蚓体腔细胞标本照片，第二列和第三列均是用本发明制作的载胶片进行彗星试验后的照片。

具体实施方式：

实施例子一：本发明的用于彗星实验的载胶片的制作

一、载胶片的制作材料

1.普通载玻片(帆船牌载玻片，江苏飞舟玻塑有限公司产品，规格与型号：长宽为25.4mm×75.6mm，厚度为1mm-1.2mm)。

2.家装玻璃胶(道康宁牌，深圳市震坤化工有限公司产品，产品型号DC-7091)

3.玻璃刀(阳江十八子作牌，阳江十八子集团有限公司产品)。

二、载胶片的制作方法

1.沿载玻片短边，用玻璃刀栽切成3-4mm长的细长条，

2.用玻璃胶把玻璃长条沿载玻片长轴方向粘牢，要求每载玻片粘4条，相互间隔均匀且分布在载玻片正中间。

3.室内避光晾干7天。

4.干燥后用小刀刮去多余残留玻璃胶。

5.得到本方法制作的载胶片，见图1

利用实施例子1所制作的载玻片可以用于任何植物或者动物的细胞损伤的彗星实验。

实施例子二：载胶片和检测蚯蚓体腔细胞DNA损伤的彗星实验方法应用实例

蚯蚓是常见的土壤环节动物，能改善土壤的结构，提高土壤的肥力，因而对土壤生态系统非常重要(Lavelle,2001；Bartlett,2010)。其约占土壤动物生物总量的60％-80％(Ouellet,2008；Jouquet,2010)。因其体表缺少保护层，对土壤化学污染物特别敏感(Lanno,2004；Nahmani,2007)，OECD、ISO、EEC等国际组织推荐蚯蚓作为土壤环境的指示生物(Darling,2005；Rich,2015)。有关蚯蚓的毒性研究大多集中在重金属，多氯联苯、常规农药如有机氯、有机磷和氨基甲酸酯类等(Diercxsens,1985；Kamitani,2007；Reinecke,2007；Hackenberger,2008)。而新烟碱类杀虫剂对蚯蚓毒性研究则较少。

烯啶虫胺(Nitenpyram)是一种新烟碱类(烟酞亚胺类)杀虫剂，由日本武田公司1989年开发,用于水稻、果树、蔬菜和茶叶等的害虫防治，1995年在日本上市登记(张一宾，1997)。2005我国开始原药登记(刘刚，2009)，2011年出现制剂登记热潮(刘刚，2012)。随着烯啶虫胺产品在农产品产地源头的大量投放，它的环境毒性效应开始受到关注，毒理学研究逐渐增多。如用滤纸法和人工土壤法测定了95％烯啶虫胺原药(江苏南通农化有限公司产品)对蚯蚓(Eiseniafetida)的致死中浓度，分别为0.22mg·cm^-2和3.91mg·kg^-1(14d)属于极毒类(Wang等，2012)。95％烯啶虫胺原药(山东某农药公司产品)在人工土壤中2.5mg·kg-1时引起蚯蚓氧化胁迫和体腔细胞的DNA损伤(王广驰，2015)。94％烯啶虫胺原药(连云港立本农药化学有限公司产品)在人工土壤中3mg·kg^-1时,造成表皮细胞粗糙,细胞间空泡增多,细胞形状不规则的损伤效应(王凯，2015)。

采用彗星实验测定了土壤中低浓度(0.1mg·kg^-1)烯啶虫胺对蚯蚓体腔细胞的DNA损伤效应，为进一步研究烯啶虫胺对蚯蚓的毒性毒理提供数据。

1材料与方法

1.1实验蚯蚓

赤子爱胜蚯蚓(Eiseniafoetide)取自浙江大学动物科学学院蚯蚓养殖场。引入后在温度为18.0℃～22.0℃，相对湿度为70％～90％，黑暗条件下培养，适时适量喂食磨碎的燕麦片。取体重为0.350g-0.600g的具蚓带个体进行试验。

1.2主要仪器设备

电子天平(感量0.001g，PL203-IC型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；小型离心机(Heraeus Fresco17型，美国Thermo Scientific公司)；核酸电泳仪(Elite 200型，美国Wealtec有限公司)；水平电泳槽(DYCP-31CN型，北京六一仪器厂)；超纯水仪(ThermoFisherGenPure UV/UF型，美国Thermo Scientific公司)；笔式pH计(SX-620型，上海三信仪表厂)；移液枪(2～20μL型，10～100μL型，100～1 000μL型，德国Eppendorf公司)；荧光显微镜(CKX41型，日本Olympus公司)

1.3主要试剂

烯啶虫胺(97％，连云港立本农药化工有限公司)；丙酮(分析纯，永华化学科技(江苏)有限公司)；盐酸(37.5％，杭州化学试剂有限公司)；乙醇(分析纯，杭州双林化工试剂厂)；氢氧化钠(分析纯，兰溪市屹达化工试剂有限公司)；愈创木酚甘油醚(≥98％)；低熔点琼脂糖(分子生物学级)；Triton X-100(分子生物学级)；溴化乙锭(分子生物学级)；三羟甲基氨基甲烷(分析纯)；台酚蓝(分子生物学级)；Na₂-EDTA(优级纯)；氯化钠(优级纯)；氯化钾(优级纯)；磷酸氢二钠(优级纯)；磷酸二氢钾(优级纯)，以上未注明厂家的试剂，均为美国Aladdin Industrial Corporation产品。

1.4实验方法

1.4.1蚯蚓的暴露处理

用丙酮溶解烯啶虫胺配成母液，取1ml母液或丙酮与10g沙搅匀，待丙酮完全挥发后，再与1kg人工土壤(OECD,1984)搅匀，加300g自来水搅匀，放入成年蚯蚓至少36条，用带孔透明塑料薄膜封口，置温度为20±1℃，相对湿度为80％-85％，400–800lx光照下培养。分别于1d,2d,3d,4d和14d，每处理取3条蚯蚓，先台酚蓝染色体腔细胞，后镜检，再进行彗星试验(Comet assay)。

1.4.2彗星试验

1.制胶与准备工作

(1)开启加热器80℃(旧胶)/60℃(新胶)和37℃，并在60℃放置2个2ml离心管。

(2)标记胶板为CK1，CK2，N1，N2。

(3)标记离心管，CK1，CK2，CK3，CK4，N1，N2，N3，N4

(4)配裂解液：0.3ml tritonX-100(母液1％)+3ml DMSO(母液10％)+26.7ml细胞裂解液，重复一次，4℃保存。

(5)称取0.030g-0.050g低熔点琼脂糖，加PBS溶液150倍即4.5mL-7.5mL，在微波炉上加热熔化胶，在60℃下保存胶。

2.制备蚯蚓体腔细胞

(1)每处理取蚯蚓2只，置于标记容器中，用超纯水清洗干净，用吸水纸除去蚯蚓体表水膜。

(2)每处理每管1只蚯蚓放入已标记离心管，每管加1ml体腔细胞提取液，室温5min弃死蚓。

(3)对离心管中剩余的粗提液，第一次离心，转速达2000RPM即停。

(4)每处理两管各取600μL，转入已标记的新离心管中，第二次离心，转速达2000RPM即停。

(5)每处理(即每管)各取1000μL，转入标记的新离心管中，第三次离心，4℃3000r/min离心6min。

(6)弃上清液，每管加入400μL的PBS(可根据细胞浓度调整PSB的量),吹打120次后，37℃保存。

3.胶冷却

把胶从80℃(旧胶)/60℃(新胶)冷却到37℃。

4.混合与铺胶

(1)每处理取37℃体腔细胞悬液100ul与37℃胶300ul混匀后立即铺胶，每处理铺两个胶板(实施例子1中制备的胶板)，而且是一次完成，只是铺一层。

(2)胶铺好后室温下冷却15min。

5.细胞裂解

(1)冷却结束后，将胶片浸入裂解液工作液中，置于4℃暗室2h。

(2)2h后取出胶板，用4℃蒸馏水浸泡两次。

6.DNA解旋

(1)将胶片浸入4℃解旋液中，黑暗条件下保持20min。

7.电泳

(1)将胶片浸没在新鲜的4℃解旋液中，0.7v/cm电泳20min。

8.DNA中和

(1)电泳结束后，把胶片浸泡在常温储存的中和液中15min。

9.DNA染色

(1)中和后，每个胶片上滴加2ug/ml EB液覆盖胶上，避光5分钟。

(2)先把胶板上的EB液倒入废液缸，用1ml的枪吸取超纯水冲洗胶板背部与显微镜接触部位，然后用吸水纸擦干。

10.荧光显微拍照

(1)荧光显微镜下，先明场下确认是细胞DNA，后再G模式下放大倍数为400倍，带标尺，并拍照。tiff格式保存照片。

1.4.3数据统计与分析

用Casp软件分析单细胞的彗星图像，获得尾长、尾部DNA百分含量和Olive尾矩等DNA损伤指标。每个处理(包括丙酮对照)统计30个细胞的这三项指标，每项随机挑选5个细胞数据计算一个算术平均值，得每个处理每项指标有6次重复用于显著性分析。

采用DPS数据处理系统(V9.50)(Tang等，2013)对实验数据进行方差分析。调用完全随机设计单因素试验Duncan新复极差法分析烯啶虫胺不同时间暴露组间及与空白对照组之间的差异，P＝0.05表示差异显著。

2结果

2.1低浓度烯啶虫胺对蚯蚓体腔细胞DNA损伤动态特征

本试验测试了一个烯啶虫胺浓度0.10mg·kg^-1，观察14d内未见蚯蚓死亡，同时丙酮对照也未见死亡。在处理后1、2、3、4、14d提取蚯蚓体腔细胞后立即台酚蓝染色，然后显微镜检查，99％的细胞未被染色(图2第一列)，接着进行彗星试验，获得了大量CK对照(丙酮)(图2第二列CK)与烯啶虫胺处理的蚯蚓体腔细胞彗星试验图片(图2第三列N)。观察到：处理后1天，蚯蚓体腔细胞出现了彗尾，2、3、4d也观察到彗尾，但是到第14d，未见彗尾。2.2低浓度烯啶虫胺对蚯蚓体腔细胞DNA损伤参数特征

采用彗星试验分析软件CASP，将蚯蚓体腔细胞DNA的彗星试验图像转化为数字量化指标，可获得彗星头部面积、尾部面积、头部DNA含量、尾部DNA含量、头部DNA百分占比、尾部DNA百分占比、头部半径、尾长、彗星全长、头部均值(Head mean X)、尾部均值(Tail meanX)、尾距(Tail moment)和Olive尾距(Olive tail moment)等13项损伤指标。选取最具代表性的三个指标尾长、尾部DNA百分占比和Olive尾矩来进行损伤的参数评价。14d内5次采样，发现除了第14d，其余的丙酮对照与烯啶虫胺处理(0.10mg·kg^-1)的这三个指标境均有显著差异。烯啶虫胺处理组间，除了第14d和第1d的Olive尾矩，其余均无显著差异(表1)。这些指标间的显著差异，暗示低浓度烯啶虫胺对蚯蚓体腔细胞DNA存在损伤效应。

表1烯啶虫胺对蚯蚓体腔细胞DNA损伤的彗星指标

实施实施例子三：常规的传统的彗星实验与本发明的彗星实验方法的比较

采用常见载胶片是细胞培养板板盖，如王春光等(2006)；蒋玫等(2015)，均采用细胞培养板的板盖制作载胶板，先把板盖切割成所需尺寸，利用培养板的规则自然凹陷来承载胶，取25μL受检细胞与8％的75μL低熔点琼脂糖混合，铺于细胞培养板板盖的小圆凹槽中。本发明的发明人按照这种单层胶法进行实验，进行了上百次，无一成功，主要问题是脱胶，进行百次实验，有98次在实验过程中脱胶，了导致无法完成实验，偶尔未脱胶，在显微镜下也无法得到清晰照片，因为这种高分子树脂载胶片的透光性很差，而且是凹槽，不利于显微镜的观察，另外，观察的结果也是不准确的。特备的，同样进行实施例子2的实验，因为脱胶次数多，造成实验结果不准确，另外就算不脱胶，也不能观察到有效的实验结果。

同样采用本发明的方法进行平行实验，进行了102次实验，其中只有1次有脱胶，而且很容易在显微镜下进行实验结果的观察。

3讨论

彗星试验也叫单细胞凝胶电泳(Single Cell Gel Electrophoresis,SCGE)，原理简单，但是操作步骤繁琐，不易获得完美的彗星图象。本实验对所参考的方法进行了三点改进，一是自制载胶片，本实验证明用本发明的载胶片可成功进行彗星实验。二是把三层胶法或双层胶法修改为单层胶法，简化了步骤，同时缩短了DNA在细胞离体后降解时间，提高了实验的可靠度。三是除了镜检步骤，全程操作都在4℃下进行，可有效阻止DNA降解和防止脱胶，保证了本实验能够获得足够数量的用于统计分析的彗星图象。

烯啶虫胺对蚯蚓的人工土壤急性毒性7d和14d的LC₅₀分别为：4.42mg·kg-1和3.91mg·kg-1(wang 2012)，在此浓度下，蚯蚓可能出现死亡或局部细胞死亡现象，用死亡细胞进行彗星试验，也会得到彗星图象，但这并不是测试物造成的DNA损伤，而是已经死亡细胞的DNA自然降解所致，为了避免这种情况，要求试验细胞从一开始就应该是活细胞。

本实验室前期的急性毒性试验表明，烯啶虫胺对蚯蚓的人工土壤急性毒性14d的LC₅₀为：5.0mg·kg-1(结果待发表)，以此浓度的五十分之一作为试验浓度，可有效避免蚯蚓死亡和其它不良反应，保证用蚯蚓活细胞做试验，台酚蓝染色鉴定表明，蚯蚓细胞达到试验的有效性要求(见图1第1列)。本实验还发现，蚯蚓的体腔细胞按大小和形状可分为三种类型，即大而圆的细胞，不规则细胞和小且圆的细胞(见图1第1列)，作者认为依据细胞大小来判断，彗星应该是主要是第一种细胞的图象，它的生理功能还不明确，因而造成的毒性效应需要进一步探索。

烯啶虫胺对蚯蚓的土壤彗星试验可检索资料并不多，王广驰测定啶虫胺在浓度0.5，1.0和2.5mg·kg-1时均造成蚯蚓体腔细胞，在14d实验期间未修复的DNA损伤。本实验在更低浓度0.1mg·kg-1也观察到了DNA的损伤效应，在暴露后1天就有损伤，直到第4天也能观察到，但是到14时已经修复。表明烯啶虫胺对蚯蚓在低浓度时有遗传毒性，而且是可修复的，这种修复可能不是原样修复，因而可能加速蚯蚓种群变异与进化。这种损伤是烯啶虫胺与DNA的直接接触损伤，还是间接损伤，需要进一步实验验证。

本实施例子或者本发明所用的试剂的配方也可以是如下：

1000ml PBS配方：

100ml体腔细胞提取液配方：

1)NaCl 0.413g

2)Na₂-EDTA2H₂O 0.204g

3)愈创木酚甘油醚 0.998g

4)pH 7.5

5)用超纯水80ml,调节pH 7.5，定容至100ml.1000ml细胞裂解液配方：

1000ml解旋液配方：

1)NaOH 12.0g

2)Na₂-EDTA2H₂O 0.4082g

3)H₂O 1000mL

4)pH 13.0

200ml中和液配方：

1)Tris－HCl 12.6g

2)H₂O 200mL

pH 7.5。

Claims (7)

1.一种简易彗星实验方法，该方法包括如下步骤：

(1)、制作载胶片：提供材料：普通载玻片(长宽为25.4mm×75.6mm，厚度为1mm-1.2mm)、家装玻璃胶、玻璃刀；沿载玻片短边，用玻璃刀栽切成3-4mm长的细长条；用玻璃胶把玻璃长条沿载玻片长轴方向粘牢，每载玻片粘4条，相互间隔均匀且分布在载玻片正中间，从而获得三个胶槽；室内避光晾干7天；干燥后用小刀刮除残留玻璃胶；

(2)、制备生物体的细胞悬浮液，并保持在37℃；

(3)、化胶：根据实验需要，提供低熔点琼脂糖若干，加入PBS溶液150倍(质量体积比)，在微波炉上加热熔化胶，冷却胶液并保持在37℃；

(4)、制胶：取37℃的细胞悬液与37℃胶按体积比1∶3的比例混匀后，立即铺在步骤(2)制备好的载玻片的胶槽中；胶铺好后室温下冷却15min；

(5)、裂解：冷却结束后，将带有胶片的载玻片浸入裂解液中，置于4℃暗室2h；2h后取出胶板，用4℃蒸馏水浸泡冲洗2次，每次5分钟；

(6)、解旋：将带有胶片的载玻片浸入4℃解旋液中，黑暗条件下保持20min；

(7)、电泳：将带有胶片的载玻片从解旋液取出，重新浸没在新鲜的4℃解旋液中进行电泳，电泳条件为：0.7v/cm，20min；

(8)、中和：电泳结束后，带有胶片的载玻片在中和液中浸泡15min；

(9)、染色：每个胶片上滴加2ug/ml EB液覆盖胶上，避光1-5分钟后；清除胶板上多余的EB液；

(10)、镜检：荧光显微镜下，先明场下确认是细胞DNA，后再G模式下放大倍数为400倍或200倍，带标尺，拍照，tiff格式保存。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的PBS(1000ml)配方：

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的细胞裂解液(1000ml)配方如下：

1)NaCl 146.3g

2)Na2-EDTA2H₂O 40.824g

3)Tris-HCl 1.586g

4)pH 10.0。

5)临用前加入1％TritonX-100和10％DMSO，用前冷藏30～60min。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的解旋液(1000ml)配方如下：

1)NaOH 12.0g

2)Na₂-EDTA2H₂O 0.4082g

3)pH 13.0。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的中和液(200ml)常温贮藏，配方如下：

1)Tris－HCl中和液 12.6g(原始pH＝4,加NaOH调节pH)

2)pH 7.5。。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，制备动物细胞悬浮液：先提取动物的血液、淋巴液、剪碎的组织液，或胰蛋白酶消化的组织液，再通过离心法得到纯化的细胞悬浮液。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，制备植物细胞(核)悬液：用纤维素酶和果胶酶溶解植物组织，或洗脱植物组织得到植物细胞核悬浮液。细胞悬浮液的制备方法因物种而异，也可以用其它方法获得。