CN204142680U - 采用单细胞凝胶电泳检测dna链断裂的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种采用单细胞凝胶电泳检测DNA链断裂的试剂盒，包括盒体、盒盖和设置在盒体内的衬垫，所述衬垫上设有小孔，装有DAPI荧光染料的试剂管、装有裂解液的试剂管、装有碱性电泳缓冲液的试剂管、装有Tris缓冲液的试剂管、装有正常熔点琼脂糖NMA的试剂管、装有低熔点琼脂糖LMA的试剂管被放置在所述小孔内。本实用新型可更加灵敏、快捷、简便、安全、有效、直观的检测DNA链断裂。

Description

采用单细胞凝胶电泳检测DNA链断裂的试剂盒

技术领域

本发明属于分子细胞生物学领域，涉及一种采用单细胞凝胶电泳检测DNA链断裂的试剂盒。

背景技术

经典的DNA链断裂检测技术包括密度梯度沉降法、羟基磷灰石柱层析分析法、荧光快速测定法、脉冲电场凝胶电泳法、荧光原位杂交法(FISH)以及放射自显影法等。其中蔗糖密度梯度离心法的缺点为敏感性差，不能用于差异较小的实验条件，操作步骤繁琐、处理时间较长、误差较大，定性的实验意义大于定量的实验意义，实验条件要求较高，便利性不够。脉冲电场凝胶电泳法的缺点为实验持续时间长，实验操作复杂，耗用多种实验材料，设备、试剂昂贵，需要交变电场、酵母体系、各种分子实验体系、凝胶电泳体系等等，实验具有局限性，比较适用于由于电离辐射所致的DNA链的断裂检测，具有一定的危险性，因为所采用的荧光染料是由有一定毒性的溴化乙锭。

实用新型内容

为了解决上述技术问题，本实用新型的目的在于提供一种用于采用单细胞凝胶电泳检测DNA链断裂的试剂盒，可以更加灵敏、快捷、简便、安全、有效、直观的检测DNA链断裂。

为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案是：一种用于采用单细胞凝胶电泳检测DNA链断裂的试剂盒，包括盒体(1)、盒盖(3)和设置在盒体内的衬垫(2)，所述衬垫上设有小孔，装有DAPI荧光染料的试剂管(4)、装有裂解液的试剂管(5)、装有碱性电泳缓冲液的试剂管(6)、装有Tris缓冲液的试剂管(7)、装有正常熔点琼脂糖NMA的试剂管(8)、装有低熔点琼脂糖LMA的试剂管(9)被放置在所述小孔内。

其中，裂解液为由2.5M NaCl、100mM EDTA、10mM Tris与1％肌氨酸钠混合而成，用前加入1％TritonX-100、10％二甲基亚砜，最终PH为10。

其中，碱性电泳缓冲液为由1mM EDTA与300mM NaOH混合而成且PH>13。

其中，所述衬垫(2)上设有6个小孔，所述小孔在所述衬垫(3)上分成2排平行排列。

通过以上技术方案，本实用新型的有益效果如下：

(1)适用性比较广，能够用于再生障碍性贫血、范可尼贫血、血小板减少、三系降低、两系降低等所有可能存在DNA链断裂的各种疾病的临床辅助诊断中；

(2)标本需求量少；

(3)能够的清晰的分离并且得到单个有核细胞的损伤情况，结果直观；

(4)实验过程简单、效果明显，更加灵敏、快速；

(5)节约成本，具有一定的经济效益；

(6)采用低毒的荧光染料，无需放射性标记，更加安全。

附图说明

图1为本实用新型的结构示意图；

图中，1-盒体，3-盒盖，2-衬垫，4-装有DAPI荧光染料的试剂管、5-装有裂解液的试剂管、6-装有碱性电泳缓冲液的试剂管、7-装有Tris缓冲液的试剂管、8-装有正常熔点琼脂糖NMA的试剂管、9-装有低熔点琼脂糖LMA的试剂管。

具体实施方式

下面结合实施例对本实用新型的具体实施方式作进一步描述，本实用新型的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本实用新型的范围构成任何限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如图1所示，本实用新型提供了一种用于采用单细胞凝胶电泳检测DNA链断裂的试剂盒，其包括盒体(1)、盒盖(3)和设置在盒体内的衬垫(2)，所述衬垫2上设有小孔，装有DAPI荧光染料的试剂管(4)、装有裂解液的试剂管(5)、装有碱性电泳缓冲液的试剂管(6)、装有Tris缓冲液的试剂管(7)、装有正常熔点琼脂糖NMA的试剂管(8)、装有低熔点琼脂糖LMA的试剂管(9)被放置在所述小孔内。

其中，所述衬垫(2)上设有6个小孔，所述小孔在所述衬垫(2)上分成2排平行排列。

彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。

实验仪器及试剂：

全磨砂载玻片需要依次经过清水冲洗、蒸馏水冲洗、100％乙醇冲洗浸泡，然后烘箱烘干；

裂解液：2.5M NaCl、100mM EDTA、10mM Tris与1％肌氨酸钠混合而成，用前加入1％TritonX-100、10％二甲基亚砜，最终PH为10

碱性电泳缓冲液：1mM EDTA、300mM NaOH且PH>13

Tris缓冲液：0.4M、PH7.5

乙醇梯度洗涤液：50％、70％、80％、90％、100％乙醇溶液

1640培养基：添加10％胎牛血清的RPMI1640培养基

正常熔点琼脂糖NMA

低熔点琼脂糖LMA

DAPI荧光染料

其中，裂解液、碱性电泳缓冲液、Tris缓冲液、正常熔点琼脂糖NMA、低熔点琼脂糖LMA、DAPI荧光染料位于试剂盒中的试剂管(4)-(9)。

检测步骤如下：

配置0.8％正常熔点琼脂糖，将50～55℃全磨砂载玻片，依次浸入热的琼脂糖中，保湿盒中平放保存，37℃培养箱中过夜处理，作为第一层胶备用；

取10～30ul外周血或骨髓血与1ml RPMI1640培养基(添加有10％胎牛血清)混匀，2000rpm离心5min，沉淀用20～40μl RPMI1640(添加有10％胎牛血清)重悬，样品制备完成；

配置0.5～0.6％低熔点琼脂糖，待温度降至42℃时，将低熔点琼脂糖与样品按照3:1～2:1的比例配置第二层胶100μl；

将第二层胶均匀地铺到第一层胶上，加盖盖玻片，4℃下处理10min,使第二层胶凝结；

移除盖玻片，然后将整个载玻片水平浸入4℃裂解液中，4℃处理3-15h，使所有细胞的膜结构被破坏，使得RNA以及蛋白分子释放出来。

采用4℃双蒸水清洗三次，每次5min，终止裂解液的作用。

将载玻片置于水平电泳槽中，倒入4℃碱性电泳缓冲液(1mMEDTA,300mMNaOH,PH>13)，没过胶面0.25cm,解旋15min左右，使得DNA双链解旋成单链。

在25v的电压与300mA的电流下低温避光，电泳10min左右，在电压存在的情况下，损伤的DNA分子会向正极移动，从而出现彗星图像。

取出载玻片，用蒸馏水冲洗之后，0.4MTris(PH7.5)中和2～3次，使得碱性电泳缓冲液失去作用。

依次采用50％、70％、80％、90％、100％乙醇在常温下脱水各一次，每次5min，使得琼脂糖胶脱水，得到更加清晰的图像。

采用8μl DAPI染色后，加盖盖玻片。

在常温以及4℃下分别处理后，荧光显微镜镜检，使得荧光染料彻底浸入细胞中，染色更加均匀、清晰。

上面已经举例说明了本实用新型的实施例，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本实用新型的精神和范围下可以对本实用新型技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本实用新型的保护范围内。

Claims (2)

1.一种采用单细胞凝胶电泳检测DNA链断裂的试剂盒，其特征在于包括盒体(1)、盒盖(3)和设置在盒体内的衬垫(2)，所述衬垫上设有小孔，装有DAPI荧光染料的试剂管(4)、装有裂解液的试剂管(5)、装有碱性电泳缓冲液的试剂管(6)、装有Tris缓冲液的试剂管(7)、装有正常熔点琼脂糖NMA的试剂管(8)、装有低熔点琼脂糖LMA的试剂管(9)被放置在所述小孔内。 

2.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述衬垫(2)上设有6个小孔，所述小孔在所述衬垫(2)上分成2排平行排列。