WO2019206150A1 - 一种实现生物组织快速染色的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
一种实现生物组织快速染色的装置，包括染色箱，染色箱内部具有1-100个电泳腔放置槽（3）；电泳腔放置槽（3）具有电泳腔（15）、温度传感器、离子浓度传感器、pH传感器、电流传感器和流速传感器。该装置能够有效提高染色的效率，大幅够减少染色的时间，显著提高染色的质量，易于组装且成本低。
Description
本发明涉及生物装置领域，具体涉及一种实现生物组织快速染色的方法和装置。
近年来组织透明化技术的发展和逐步成熟使获得完整生物组织的高分辨率三维结构成为可能。然而，将组织透明化技术应用于研究完整组织或器官的三维高分辨率结构时，对生物组织进行染色所需时间通常很长。
例如，对透明化小鼠全脑的单次免疫荧光染色往往需要数周的时间。染色时间过长的瓶颈极大的限制了组织透明化技术应用于研究不同生理状态下的组织三维结构。
染色耗时过长的主要原因是标记组织特别是抗体用的分子探针以被动扩散的方式从完整组织的表面到达组织内部需要很长的时间。
综上，本领域亟需开发一种使用方便、结构简单，能够实现生物组织快速染色的装置及方法。
发明内容
本发明的目的在于开发一种使用方便、结构简单，能够实现生物组织快速染色的装置及方法。
本发明第一方面提供一种实现生物组织快速染色的装置，所述的装置包括染色箱；
其中，所述的染色箱内部具有1-100个电泳腔放置槽；
所述的电泳腔放置槽具有电泳腔、温度传感器、离子浓度传感器、pH传感器、电流传感器、流速传感器；
所述电泳腔放置槽的槽口外侧具有正负电极接口；
所述的电泳腔具有正极电极、负极电极、样品腔固定架以及样品腔。
在另一优选例中，所述的装置具有控制系统，所述的控制系统包括控制面板、 温控模块、液控模块、电流模块、电源开关、时间控制模块、pH控制模块；
其中，所述的温控模块、液控模块、电流模块位于装置中电泳腔放置槽的下方；
所述的温控模块与温度传感器连接；
所述的液控模块与流速传感器、离子浓度传感器、以及pH传感器连接；
所述的电流模块与电源开关以及电流传感器连接。
在另一优选例中，所述温控模块包括加热模块和制冷模块。
在另一优选例中，所述的正极电极距离腔壁0.01-0.5cm、所述的负极电极距离腔壁0.01-0.5cm。
在另一优选例中，所述的正极电极包括电极材料以及固定电极材料：
所述的固定电极的材料为绝缘材料，所述的固定电极材料选自下组：玻璃板、塑料板、陶瓷板或其组合；
所述的电极材料为导电材料，所述的电极材料选自下组：铂、金、银、导电玻璃、碳、石墨烯或其组合；
在另一优选例中，所述电极的材料是金属铂。
在另一优选例中，所述的负极电极包括电极材料以及固定电极的材料；
所述的固定电极材料为绝缘材料，所述的固定电极材料选自下组：玻璃板、塑料板、陶瓷板或其组合；
所述的电极材料为导电材料，所述的电极材料选自下组：铂、金、银、导电玻璃、碳、石墨烯或其组合。
在另一优选例中，所述电极的材料是金属铂。
在另一优选例中，所述的控制面板具有温度调节面板、离子浓度调节面板、pH调节面板、电流调节面板、时间调节面板以及流速控制面板。
在另一优选例中，所述的样品腔包括：顶盖、内环、底盖、第一透析膜以及第二透析膜；
其中，所述的内环包括：上部琼脂糖中空柱、样品、下部琼脂糖中空柱
其中，所述的样品腔从一端到另一端依次包括：顶盖、第一透析膜、内环、底盖、第二透析膜。
在另一优选例中，所述第一透析膜的截留分子量为6-500kDa，所述第二透析 膜的截留分子量为6-500kDa。
本发明第二方面提供一种本发明第一方面所述装置的方法，所述的方法包括步骤：
(I)将含有缓冲液的电泳腔放置于电泳腔放置槽，将样品腔放置在样品腔固定架，调节正极电极与负极电极之间的电流；其中，缓冲液离子浓度为0.1-10M、pH为1-13、电流强度为0-300mA；
(II)染色，染色时间为30min-48hours。
在另一优选例中，所述缓冲液离子浓度为0.1-5M，较佳地，0.1-2M，更佳地，0.1-1M，最佳地，0.1-0.5M。
在另一优选例中，所述缓冲液pH为3-11，较佳地，4-10，更佳地，5-9，最佳地，5.5-8.6。
在另一优选例中，所述的缓冲液中加入去垢剂Triton X-100,浓度为0.1-5％，较佳地，1-5％，更佳地，0.5-1％，最佳地，0.1-0.5％。
在另一优选例中，所述电流强度为5-200mA，较佳地，10-100mA，更佳地，20-50mA，最佳地，20-30mA。
在另一优选例中，所述染色时间为30min-36h，较佳地，45min-24h，更佳地，50min-12h，最佳地，1-6h。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：洗脱，其中，在步骤洗脱中，缓冲液离子浓度为0.1-10M、pH为1-13、电流强度为0-500mA，洗脱时间为30min-24hours。
在另一优选例中，所述的电流的范围为0.1-300mA，且所述电流的方向是交替变化的。
在另一优选例中，所述缓冲液中还包括表面活性剂。
在另一优选例中，所述表面活性剂的浓度为0.05％-0.5％，较佳地，0.05-0.2％，以所述缓冲液总体积计。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
图1是装置示意图。
图2是控制系统与各模块的关系示意图。
图3是装置俯视图。
图4是电泳腔内部示意图。
图5是样品腔示意图。
图6是实施例1的成像结果。
图7是实施例2的成像结果。
图8是实施例3的成像结果。
图9是实施例4的染色过程中的电泳液温度变化曲线。
图10A为样品染色前后的照片，图10B是样品染色前后激光扫描共聚焦显微镜图像。
图11是实施例6的成像结果。
图中，各标识如下：
1：控制面板；
2：电源开关；
3：电泳腔放置槽；
4：正负电极接口；
5：液控模块；
6：温控模块；
11：样品腔；
12：正极电极；
15：电泳腔；
16：负极电极；
111：顶盖；
112：内环；
113：底盖；
114：样品；
115：上部琼脂糖中空圆柱；
116：下部琼脂糖中空圆柱；
117：第二透析膜；
118：第一透析膜。
本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现采用电场方向是交替变化的小电流能够加速分子探针进入组织内部、且避免产生大量焦耳热对组织样品的破坏、有利于大幅减少染色的时间，显著提高染色的质量，在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“实现生物组织快速染色的装置”、“生物组织快速染色的装置”或“装置”可互换使用，指本发明第一方面所述实现生物组织快速染色的装置。
一种实现生物组织快速染色的装置
一种实现生物组织快速染色的装置包括：染色箱。
其中，所述的染色箱内部具有1-100个电泳腔放置槽3；
所述的电泳腔放置槽具有电泳腔15、温度传感器、离子浓度传感器、pH传感器、电流传感器、流速传感器。
所述电泳腔放置槽的槽口外侧具有正负电极接口4。
所述的电泳腔具有正极电极12、负极电极16、样品腔固定架以及样品腔11。
在另一优选例中，所述的正极电极距离腔壁0.01-0.5cm、所述的负极电极距离腔壁0.01-0.5cm。
在另一优选例中，所述的正极电极包括电极材料以及固定电极材料：
所述的固定电极的材料为绝缘材料，所述的固定电极材料选自下组：玻璃板、塑料板、陶瓷板或其组合。
所述的电极材料为导电材料，所述的电极材料选自下组：铂、金、银、导电玻璃、碳、石墨烯或其组合。
在另一优选例中，所述电极的材料是金属铂。
在另一优选例中，所述的负极电极包括电极材料以及固定电极材料。
所述的固定电极材料为绝缘材料，所述的固定电极材料选自下组：玻璃板、塑料板、陶瓷板或其组合。
所述的电极材料为导电材料，所述的电极材料选自下组：铂、金、银、导电玻璃、碳、石墨烯或其组合。
在另一优选例中，所述电极的材料是金属铂。
该装置具有控制系统，所述的控制系统包括控制面板、温控模块、液控模块、电流模块、电源开关、时间控制模块、pH控制模块；
其中，所述的温控模块、液控模块、电流模块位于装置中电泳腔放置槽的下方；
所述的温控模块与温度传感器连接；
所述的液控模块与流速传感器、离子浓度传感器、以及pH传感器连接；
所述的电流模块与电源开关以及电流传感器连接。
在另一优选例中，所述的控制面板具有温度调节面板、离子浓度调节面板、pH调节面板、电流调节面板、时间调节面板以及流速控制面板。
该生物组织快速染色的装置电泳腔的样品腔包括：顶盖111、内环112、底盖113、上部琼脂糖中空柱115、下部琼脂糖中空柱116、第二透析膜117以及第一透析膜118，其中，所述第一透析膜的截留分子量6-500kDa，所述第二透析膜的截留分子量为6-500kDa。
其中，内环内部包括：上部琼脂糖中空圆柱、样品、下部琼脂糖中空圆柱
其中，所述的样品腔从一端到另一端依次包括：顶盖、第一透析膜、内环、底盖、第二透析膜。
使用装置的方法
一种使用装置的方法包括步骤：
(I)将含有缓冲液的电泳腔放置于电泳腔放置槽，将样品腔放置在样品腔固定 架，调节正极电极与负极电极之间的电流；其中，缓冲液离子浓度为0.1-10M、pH为1-13、电流强度为0-300mA；
(II)染色，染色时间为30min-48hours。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：洗脱，在洗脱步骤中，缓冲液离子浓度为0.1-10M、pH为1-13、电流强度为0-500mA，洗脱时间为30min-24hours。
在另一优选例中，所述电流的电场方向是交替变化的。
发明优点：
1、有利于分子探针，例如：抗体分子、核酸探针在组织中的快速扩散，能够大幅减少探针穿透进入组织内部的时间，实现对组织的快速染色(如1mm组织染色时间可缩短至数小时，比常规免疫染色时间缩短20倍以上)。
2、采用小电流既能实现分子探针快速进入组织内部，又能避免大量产生的焦耳热和外加电场力对样品的破坏。
3、小电流电场方向的方式交替变化，显著减少分子探针在组织表面的大量聚集和被困在致密组织中的概率，提高染色的效率和质量，且可大幅减少抗体用量(常规免疫染色的十分之一以下)。
4、染色样品的两侧都加注分子探针溶液，染色过程中，分子探针能从两侧进入组织，能构减少染色的时间，提高染色的质量。
5、电场洗脱，可以将非特异性粘附的探针分子通过电场力的作用完全洗脱，从而大幅减少背景信号，提高染色，进而成像的质量。
6、该装置简单、易于组装、且成本低。
实施例1
用IgG抗体对本发明的装置进行测试
(a)组装样品腔
按照样品腔从一端到另一端依次包括：顶盖、第一透析膜、内环、底盖和第二透析膜的顺序组装样品腔，其中，内部包括上部琼脂糖中空圆柱、样品、下部中空圆柱，且第一透析膜以及第二透析膜需要用去离子水去除表面附着的保护甘油。
其中，样品为厚度为1mm的成年小鼠(C57BL/6)的透明化(用被动CLARITY方 法透明化处理)脑片。
组装样品腔具体包括步骤：
(a-1)下部琼脂糖中空圆柱的中空部分加入抗体；
(a-2)样品放置于下部琼脂糖中空圆柱的中空部分中，并在样品周围注射8％琼脂糖；
(a-3)琼脂糖凝固后安装好上部琼脂糖中空圆柱，并在上部琼脂糖圆柱的中空部分填满抗体溶液。
(b)染色,染色包括步骤：
(b-1)用电泳液(0.1mol/L硼酸缓冲液，pH 8.6，0.1％Triton X-100)按照1：200的比例配制抗体Anti-GFP-Alexa555(Thermo Fisher,A31851)溶液；
(b-2)组装好样品腔后，将样品腔放入电泳腔，并用蓝丁胶固定，加入电泳液并没过样品腔。
(b-3)打开电源，将电流设置为25mA后，染色15min后，交换电流方向，正反各两次，共染色1h。
(c)荧光成像检测标记效果
切断电源，打开顶盖和底盖，将样品从内环中取出，切去多余琼脂糖，剥下样品后用激光扫描共聚焦显微镜(A1Si，Nikon)成像，成像倍数为10X。
成像结果
成像结果如图6，从图中可以看出，1mm厚透明脑片组织中充满抗体，并且分布的十分均匀，证明该装置可以实现快速的抗体进入组织并弥散分布的目标。
实施例2：
用Anti-Histone3抗体对透明化脑组织染色
(a)组装样品腔
按照样品腔从一端到另一端依次包括：顶盖、第一透析膜、内环、底盖、第二透析膜的顺序组装样品腔，其中，内环内部包括上部琼脂糖中空圆柱、样品、下部琼脂糖中空圆柱，且第一透析膜以及第二透析膜需要用去离子水去除表面附着的保护甘油。
其中，样品为厚度为1mm的成年小鼠(C57BL/6)的透明化(用被动CLARITY方法透明化处理)脑片。
组装样品腔具体包括步骤：
(a-1)下部琼脂糖中空圆柱的中空部分加入抗体；
(a-2)样品放置于下部琼脂糖中空圆柱的中空部分中，并在样品周围注射8％琼脂糖；
(a-3)琼脂糖凝固后安装好上部琼脂糖中空圆柱，并在圆柱的中空部分填满抗体溶液。
(b)染色,染色包括步骤：
(b-1)用电泳液(0.1mol/L硼酸缓冲液，pH 8.6，0.1％Triton X-100)配制3％的BSA封闭溶液后，按照1：200的比例配制Histone3抗体(Histone H3XP Rabbit mAB,Alexa-647Conjugate，12230S,Cell Signaling Technology)；
(b-2)安装好样品后，将样品腔放入电泳腔，并用样品腔固定架固定，加入电泳液并没过样品腔；
(b-3)打开电源，将电流设置为25mA后，染色1h；然后，交换电流方向，再设置电流为25mA，染色1h，共2h；
(b-4)切断电源，孵育30min后即染色完成。
(c)抗体洗脱，其中，抗体洗脱包括步骤
(c-1)打开顶盖和底盖，使用新的缓冲液；
(c-2)在25mA电流条件下洗脱30min，将未能与抗原(即Histone3蛋白)有效结合的多余抗体分子去除掉。
(d)荧光成像检测标记效果
洗脱结束后将样品从内环中取出，切去多余琼脂糖，剥下样品后用激光扫描共聚焦显微镜(A1Si，Nikon)成像，成像倍数为10X。
成像结果如图7所示，为了减少成像时对荧光的淬灭，对这1mm的实验组样品的成像是每隔一段距离才成一张像。从A图和B图中可以看出，实验组的抗体全部进入样品之中，并且分布的较为均匀。从C图中可以看出，电泳去除多余抗体的作用非常好，样品结构部分的信号清晰，背景干净。从D图、E图和F图中可以看出，对照组自由扩散染色相同时间后，抗体只能进入到组织内部非常薄的一层，难以将整个样品进行染色。由此说明，快速染色装置对于厚组织非常有效。
A：实验组样品在1mm尺度上的三维图像的z轴分布；B：实验组样品在1mm 尺度上的三维图像的xy方向的分布；C：实验组样品在不同深度下的显微图像；D：对照组样品在不同深度下的显微图像；E：对照组样品在1mm尺度上的三维图像的z轴分布；F：对照组样品在1mm尺度上的三维图像的xy方向的分布。
实施例3
小鼠脑组织中星形胶质细胞的快速免疫染色(包括一抗和二抗染色)
(a).组装样品腔
按照样品腔从一端到另一端依次包括：顶盖、第一透析膜、内环、底盖和第二透析膜的顺序组装样品腔，其中，所述的内环内部包括上部琼脂糖中空圆柱、样品、下部琼脂糖中空圆柱，且第一透析膜以及第二透析膜需要用去离子水去除表面附着的保护甘油。
其中，样品为厚度为1mm的成年小鼠(C57BL/6)的透明化(用被动CLARITY方法透明化处理)脑片。
组装样品腔具体包括步骤：
(a-1)下部琼脂糖中空圆柱的中空部分加入抗体；
(a-2)样品放置于下部琼脂糖中空圆柱的中空部分中，并在样品周围注射8％琼脂糖；
(a-3)琼脂糖凝固后安装好上部琼脂糖中空圆柱，并在中空部分填满抗体溶液。
(b)一抗和二抗染色，染色包括步骤：
(b-1)按照1：200的比例用3％的BSA溶液配制GFAP一抗和二抗溶液；
(b-2)按照与实施例2相同的方法，进行GFAP一抗染色；
(b-3)在一抗染色完成后，打开模具的顶盖和底盖，将一抗溶液吸出；
(b-4)仅将内环和里面用琼脂糖安装的样品放入电泳腔，并用蓝丁胶固定，加入新的电泳液；
(b-5)将电流设置为25mA后，染色40min后取出内环；
(b-6)吸去内环中多余溶液后，分别在上下的琼脂糖圆柱的中空部分中加入二抗溶液；
(b-7)在放上第一透析膜后，用顶盖盖紧；最后，将整个样品腔盖紧，并检漏；
(b-8)再按照一抗染色时的电泳条件进行染色；
(b-9)打开顶盖和底盖，将剩余的二抗溶液吸出；
(b-10)在25mA的电泳条件下洗脱45min，去除多余二抗分子。其中，在每次染色和洗脱的交替中，都要更换电泳液。结束后将样品从内环中取出，切去多余琼脂糖，剥下样品后用激光扫描共聚焦显微镜(A1Si，Nikon)成像，成像倍数为10X。
成像结果如图8所示，为了减少成像时对荧光的淬灭，对这1mm的实验组样品的成像是每隔一段距离才成一张像。从A图和B图中可以看出，实验组的抗体全部进入样品之中，并且分布的较为均匀。从C图中可以看出，电泳去除多余抗体的作用非常好，样品结构部分的信号清晰，背景干净。从D图、E图和F图中可以看出，对照组自由扩散染色相同时间时，抗体只能进入到表面，难以将整个样品进行染色。由此说明，快速染色装置对于厚组织来说非常有效。
A：实验组样品在1mm尺度上的三维图像的z轴分布；B：实验组样品在1mm尺度上的三维图像的xy方向的分布；C：实验组样品在不同深度下的显微图像；D：对照组样品在不同深度下的显微图像；E：对照组样品在1mm尺度上的三维图像的z轴分布；F：对照组样品在1mm尺度上的三维图像的xy方向的分布。
实施例4染色过程中电泳液温度的变化
(a)组装样品腔
按照样品腔从一端到另一端依次包括：顶盖、第一透析膜、内环、底盖、第二透析膜的顺序组装样品腔，其中，内环内部包括上部琼脂糖中空圆柱、样品、下部琼脂糖中空圆柱，且第一透析膜以及第二透析膜需要用去离子水去除表面附着的保护甘油。
其中，样品为厚度为1mm的成年小鼠(C57BL/6)的透明化(用被动CLARITY方法透明化处理)脑片。
组装样品腔具体包括步骤：
(a-1)下部琼脂糖中空圆柱的中空部分加入抗体；
(a-2)样品放置于下部琼脂糖中空圆柱的中空部分中，并在样品周围注射8％琼脂糖；
(a-3)琼脂糖凝固后安装好上部琼脂糖中空圆柱，并在圆柱的中空部分填满抗体溶液。
(b)染色,染色包括步骤：
(b-1)用电泳液(0.1mol/L硼酸缓冲液，pH 8.6，0.1％Triton X-100)配制3％的BSA封闭溶液后，按照1：200的比例配制(ThermoFisher,A31851)抗体；
(b-2)安装好样品后，将样品腔放入电泳腔，并用样品腔固定架固定，加入电泳液并没过样品腔；
(b-3)打开电源，将电流设置为25mA后，每隔15分钟，电场方向反向一次，共染色60min。
(b-4)用电子温度计实时显示电泳腔中电泳液的温度，并每隔1分钟记录温度的数值。
本实施例中样品腔温度变化曲线如图9所示，可以看出本发明的装置在抗体标记过程中1h内温度变化在3℃以内，染色过程中电流很小，产生的焦耳热非常少，电泳腔内液体温度变化小，不会对组织造成严重热破坏。
实施例5小鼠脑组织神经元结构染色前后的变化
(a).组装样品腔
按照样品腔从一端到另一端依次包括：顶盖、第一透析膜、内环、底盖和第二透析膜的顺序组装样品腔，其中，所述的内环内部包括上部琼脂糖中空圆柱、样品、下部琼脂糖中空圆柱，且第一透析膜以及第二透析膜需要用去离子水去除表面附着的保护甘油。
其中，样品为厚度为2mm的成年转基因小鼠Thy1-GFP-的透明化(用被动CLARITY方法透明化处理)脑片。
组装样品腔具体包括步骤：
(a-1)下部琼脂糖中空圆柱的中空部分加入缓冲液(0.1mol/L硼酸缓冲液，pH 8.6，0.1％Triton X-100)；
(a-2)样品放置于下部琼脂糖中空圆柱的中空部分中，并在样品周围注射8％琼脂糖；
(a-3)琼脂糖凝固后安装好上部琼脂糖中空圆柱，并在中空部分填满缓冲液。
(b)染色，染色包括步骤：
(b-1)安装好样品后，将样品腔放入电泳腔，并用样品腔固定架固定，加入电泳液(0.1mol/L硼酸缓冲液，pH 8.6，0.1％Triton X-100)并没过样品腔；
(b-2)将电流设置为25mA，电场方向在染色1.5,3,3.5h时反向，共4h。
(b-3)结束后将样品从内环中取出，切去多余琼脂糖，剥下样品后用激光扫描共聚焦显微镜(SP8，Leica)成像，成像倍数为10X。
成像结果如图10A和图10B所示，从图10A可以看出，染色前后样品宏观结构保持完好，从图10B可以看出，样品中神经元的结构保持完好，说明使用本发明的装置进行染色不会对组织的宏观结构和微观结构造成破化，可保证成像的质量。
实施例6
小鼠脑组织中星形胶质细胞的快速免疫染色(包括一抗和二抗染色)
(a).组装样品腔
按照样品腔从一端到另一端依次包括：顶盖、第一透析膜、内环、底盖和第二透析膜的顺序组装样品腔，其中，所述的内环内部包括上部琼脂糖中空圆柱、样品、下部琼脂糖中空圆柱，且第一透析膜以及第二透析膜需要用去离子水去除表面附着的保护甘油。
其中，样品为厚度为2mm的成年小鼠(C57BL/6)的透明化(用被动CLARITY方法透明化处理)脑片。
组装样品腔具体包括步骤：
(a-1)下部琼脂糖中空圆柱的中空部分加入抗体；
(a-2)样品放置于下部琼脂糖中空圆柱的中空部分中，并在样品周围注射8％琼脂糖；
(a-3)琼脂糖凝固后安装好上部琼脂糖中空圆柱，并在中空部分填满抗体溶液。
(b)一抗和二抗染色，染色包括步骤：
(b-1)按照1：200的比例用5％BSA溶液配制GFAP一抗和二抗溶液；
(b-2)组装好样品腔后，将样品腔放入电泳腔，并用蓝丁胶固定，加入电泳液(0.1mol/L硼酸缓冲液，pH 8.6，0.1％Triton X-100)并没过样品腔；
(b-3)打开电源，将电流设置为25mA后，染色3h，隔1.5h，电场方向反向一次；
(b-4)完成后，关闭电源，等待30mins，让抗原和抗体充分的孵育和结合；
(b-3)孵育完成后，打开模具的顶盖和底盖，将一抗溶液吸出；
(b-4)重新组织样品腔，并用蓝丁胶固定，加入新的电泳液，；
(b-5)在30mA的电流条件下洗脱80min，电场方向每隔20分钟反向一次，然后后取出内环；
(b-6)吸去内环中多余溶液后，分别在上下的琼脂糖圆柱的中空部分中加入二抗溶液；
(b-7)在放上第一透析膜后，用顶盖盖紧；最后，将整个样品腔盖紧，并检漏；
(b-8)再按照一抗染色时的电泳条件进行染色；
(b-9)打开顶盖和底盖，将剩余的二抗溶液吸出；
(b-10)在30mA的电流条件下洗脱90min，电场方向在25mins,50mins,and70mins反向一次，去除多余二抗分子。其中，在每次染色和洗脱的交替中，都要更换电泳液。结束后将样品从内环中取出，切去多余琼脂糖，剥下样品后用激光扫描共聚焦显微镜(SP8DIVE，Leica)成像，成像倍数为25X。
成像结果如图11所示，A：样品在2mm尺度上的三维图像的xy方向的分布；B：样品在不同z轴深度下的显微图像；C：样品在2mm尺度上的三维图像。
从A、B和C可以看出，抗体完全进入样品之中，并且分布均匀，染色质量很好，成像效果清晰，背景干净。且本实施例的抗体的用量与常规免疫标记方法相比降低了一个数量级，只需1/10以下，进一步说明本发明的装置具有优异的染色效率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
- 一种实现生物组织快速染色的装置，其特征在于，所述的装置包括染色箱；其中，所述的染色箱内部具有1-100个电泳腔放置槽；所述的电泳腔放置槽具有电泳腔、温度传感器、离子浓度传感器、pH传感器、电流传感器、流速传感器；所述电泳腔放置槽的槽口外侧具有正负电极接口；所述的电泳腔具有正极电极、负极电极、样品腔固定架以及样品腔。
- 如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的装置具有控制系统，所述的控制系统包括控制面板、温控模块、液控模块、电流模块、电源开关、时间控制模块、pH控制模块；其中，所述的温控模块、液控模块、电流模块位于装置中电泳腔放置槽的下方；所述的温控模块与温度传感器连接；所述的液控模块与流速传感器、离子浓度传感器、以及pH传感器连接；所述的电流模块与电源开关以及电流传感器连接。
- 如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的负极电极包括电极材料以及固定电极材料；所述固定电极材料为绝缘材料，且所述的固定电极材料选自下组：玻璃板、塑料板、陶瓷板或其组合；所述的电极材料为导电材料，且所述的电极材料选自下组：铂、金、银、导电玻璃、碳、石墨烯或其组合。
- 如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的正极电极包括电极材料以及固定电极材料：所述固定电极材料为绝缘材料，且所述的固定电极材料选自下组：玻璃板、塑料板、陶瓷板或其组合；所述的电极材料为导电材料，且所述的电极材料选自下组：铂、金、银、导电玻璃、碳、石墨烯或其组合。
- 如权利要求2所述的装置，其特征在于，所述的控制面板具有温度调节面 板、离子浓度调节面板、pH调节面板、电流调节面板、时间调节面板以及流速控制面板。
- 如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的样品腔包括：顶盖、第一透析膜、内环、底盖、以及第二透析膜；其中，所述的内环内部包括：上部琼脂糖中空柱，样品，下部琼脂糖中空柱；其中，所述的样品腔从一端到另一端依次包括：顶盖、第一透析膜、内环、底盖、第二透析膜。
- 如权利要求6所述的装置，其特征在于，所述第一透析膜的截留分子量为6-500kDa，所述第二透析膜的截留分子量为6-500kDa。
- 一种使用如权利要求1所述装置的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：(I)将含有缓冲液的电泳腔放置于电泳腔放置槽，将样品腔放置在样品腔固定架，调节正极电极与负极电极之间的电流；其中，缓冲液离子浓度为0.1-10M、pH为1-13、电流强度为0.1-300mA；(II)染色，染色时间为30min-48hours。
- 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤：洗脱，在洗脱步骤中，缓冲液离子浓度为0.1-10M、pH为1-13、电流强度为0-500mA，洗脱时间为30min-24hours。
- 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的电流的范围为0.1-300mA，且所述电流的方向是交替变化的。
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