WO2017047617A1 - 観察標本作製用細胞保持基材ホルダー及びそれを含むキット並びに観察標本の作製方法 - Google Patents

観察標本作製用細胞保持基材ホルダー及びそれを含むキット並びに観察標本の作製方法 Download PDF

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賢一 向所
隆則 服部
卓哉 岩佐
川部　雅章
熊谷　聡士
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国立大学法人滋賀医科大学
日本バイリーン株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a cell holding substrate holder that can be used for the preparation of an observation specimen prepared for the purpose of observing with a microscope (optical, fluorescence) by various staining of cells, a kit including the same, and a preparation method of the observation specimen
  • cytodiagnosis pathological stains performed in cytodiagnosis
  • preparation of observation specimens subjected to wet fixation and subsequent staining using a staining tank (Papanicolaou staining, PAS staining, Alcian blue staining, etc.) Regarding the method.
  • This field is mainly used for the diagnosis of cancer, making observation specimens from cells collected from patients, and microscopic examination by qualified persons such as cytologists, cytodiagnosis specialists, pathologists, etc.
  • the procedure is to detect cells (atypical cells).
  • this field is mainly implemented in medical institutions such as hospitals, and it is necessary to prepare and inspect a large amount of specimens (observation specimens and microscopic specimens) every day.
  • Cytology is categorized according to the method of cell collection, exfoliated cytology (eg sputum, urine, pleural effusion, ascites, pericardial effusion, cerebrospinal fluid, bile, etc.), and brushes and cotton swabs.
  • Scraping cytology cervical / body, bronchial, bile duct, pancreatic duct, etc.
  • puncture aspiration cell that collects cells by aspiration with a fine needle inserted into the lesion site
  • There are medical examinations (mammary gland, thyroid gland, lymph node, liver, etc.), and these collected cells are smeared on an observation substrate (slide glass) to prepare an observation specimen.
  • the slide glass is smeared in a state where cells are dispersed in a liquid. If the collected state is not a liquid such as a body fluid, it may be smeared after being dispersed in a fixed liquid (liquefied specimen cells). Diagnosis).
  • Cell staining has various fields other than the field concerned.
  • the staining method, reagents, instruments, and equipment are completely different depending on the purpose (completeness) of the prepared observation specimen.
  • the purpose of staining is, for example, to divide tissues according to cell types and clarify their localization (eg, immunohistochemical staining), and the number of target cells based on some markers or morphological characteristics of the cells.
  • That can be detected with a device eg, high-content screening, flow cytometry
  • those that are observed with the human eye for the above-mentioned purposes eg, cell counting with a hemocytometer
  • targets inside and outside the cell Observe the substance in detail by observing its location by staining the substance (eg, fluorescence microscopy), observing the shape and color of the organelle (eg: cytodiagnosis), and even the internal structure of the organelle (For example, observation with an electron microscope), but in this field, an observation magnification (approximately 200 to 40) that allows observation of an organelle by observation with an optical microscope. At times), the acquisition of the observation image organelle shapes and dyeing color and shading can be determined is determined.
  • a method of directly applying to a slide glass such as a drawing glass method, a laminating method, and a centrifugal direct smearing method
  • a method of collecting cells with a filter and then transferring them to a slide glass filter method.
  • the former pulling glass method and the rubbing method are simple, but it is difficult to smear in a narrow area, and cells adhere to the glass side used for rubbing, so the cell density is reduced, and during the observation operation There was a problem that a wide range had to be observed.
  • the latter filter method has a problem that all the collected cells cannot be transferred to a slide glass, so that the cells are lost, and the cell shape is denatured by the pressure during the transfer operation.
  • the cells immediately after smearing are easily peeled off from the slide glass, and when immersed in a fixative, many cells are detached from the slide glass. If the cells had a massive stacking property, it was more difficult to keep them on a glass slide.
  • a slide glass provided with a cell peeling prevention coat such as a silane coat
  • a cell peeling prevention coat such as a silane coat
  • a method of coding a cell and a slide glass by spraying or dropping a fixative having moisture retention has been devised. However, even when the fixative is sprayed, cell detachment occurs, and moisturizing ingredients (such as PEG) coat the cells, changing the staining of the cells and affecting the diagnosis. Has occurred.
  • Staining (including solvent replacement, fractionation, and color drawing) It is carried out by setting several slide glasses that have been smeared and wet fixed vertically in a staining basket, and putting them in a staining tank containing a reagent such as a staining solution or a pad filled with tap water, leaving it still, or letting it appear.
  • a staining tank containing a reagent such as a staining solution or a pad filled with tap water, leaving it still, or letting it appear.
  • the dyeing process is long and complicated. For example, in the Papanicolaou dyeing technique, triple dyeing is performed, and although there are some differences depending on the executing agency, about 20 to 25 steps are required for the whole process.
  • the time of each staining step and the number of appearances in the reagent are preferably determined, and the staining stability / reproducibility is improved in staining in this field in which a target such as an organelle is dyed. It is important to get. In this way, in the staining in this field, it is necessary to process a large amount of patient specimens quickly and uniformly and stably and reproducibly. It is useful to use.
  • the dyeing basket can hold a plurality of slide glasses without damaging the smeared surface, operations such as movement between the dyeing tanks and infestation are facilitated.
  • cleaning liquid separation liquid
  • Dehydration / Transmission It is carried out by gradually transferring from a low-concentration alcohol tank to a pure alcohol tank, dehydrating, and finally immersing in a xylene tank. By this operation, the tissue becomes transparent and becomes a specimen suitable for microscopic examination. Since a solvent with strong dissolving power is used for clearing, if the cells on the polycarbonate membrane used mainly in the filter method are passed through as they are, the membrane dissolves and becomes cloudy. It was necessary to transfer the collected cells to a slide glass.
  • An encapsulating agent (resin dissolved in a solvent) is introduced into the encapsulating smear surface, and the cells are sandwiched between a cover glass and a slide glass. Sealing the stained cells with an encapsulant prevents physical impact on the smear surface during microscopic operation, deterioration due to microscope illumination, and further fading over time, enabling long-term storage.
  • the preparation of conventionally known observation specimens in the field has been performed by smearing on a slide glass.
  • the slide glass has good observability, and since the cells are distributed so as to stick to the glass surface in a slightly spread state, the inside of the cells is easy to observe, and since it is flat, there is an advantage that the sealing operation is easy.
  • due to its planar structure cells cannot be retained in the preparation process of the observation specimen, and peeling occurs.
  • the moisture retention is poor and cell degeneration due to drying is likely to occur.
  • the cells have an elongated shape, there is a problem that it is difficult to detect the three-dimensional irregularities of the cell shape and the cell nucleus, which are characteristic of cancer cells.
  • a method for preparing an observation specimen capable of sufficiently observing cell organelles with an optical microscope while simultaneously solving the three problems of cell detachment, drying, and loss of stericity has not been devised.
  • Patent Document 1 is a method for omitting mistakes and skilled techniques during encapsulation, and does not disclose the structure and type of the filter.
  • Patent Documents 2 to 5 do not disclose a method for preparing an observation specimen using a staining tank.
  • the encapsulation process is not carried out, it is not encapsulated with an encapsulant that matches the refractive index, and irregular reflection occurs due to the curved fiber surface, so that a clear observation that can distinguish organelles with an optical microscope I can't get a statue.
  • Patent Document 2 merely observes the presence or absence of a cell having a specific cell surface marker by fluorescence observation, and the Example of Patent Document 3 uses a low-magnification unclear image, In this way, when observing the cells collected on the fibers, the method that does not carry out the encapsulation step is necessary in the field. It is not possible to obtain an observation sample of the degree
  • the encapsulation operation should be carried out in an oily form mainly composed of glycerin or liquid paraffin, or in a solvent.
  • the filter is adhered to the frame (resin frame) with an adhesive so as to retain the filter shape during cell collection.
  • the collected filter is sealed between the glass and the frame, not only does the air bubbles easily remain at the step between the filter and the frame, but the volume of the encapsulant decreases with drying, creating a gap between the upper and lower glass. As a result, bubbles are generated and the observability deteriorates.
  • the observation specimen itself becomes thick, and it becomes impossible to perform a microscopic examination at a high magnification. Therefore, it is necessary to take out only the filter from the frame. In that case, the filter cannot be taken out unless a complicated operation such as cutting the filter is performed, and the filter is distorted during this cutting operation, and the cells adhering to the filter are removed. There is a risk of peeling.
  • an object of the present invention is to provide a cell holding substrate holder and kit for preparing a cell observation specimen in which a cell holding substrate such as a filter can be easily attached and detached, and cell detachment, drying, and loss of three-dimensionality.
  • An object of the present invention is to provide a method for preparing an observation specimen capable of sufficiently observing a cell organelle with an optical microscope while simultaneously solving these problems.
  • a support plate having a cell holding substrate arrangement portion having a water-permeable window portion (2) Preparation of an observation specimen that includes a window portion that allows water to flow, and includes a clamping plate that can be clamped and fixed to the cell holding substrate arrangement portion in cooperation with the support plate and that can be removed.
  • Cell holding substrate holder [2] The cell holding substrate holder for preparing an observation specimen according to [1], wherein the support plate has a cell holding substrate arrangement portion and a frame portion, [3]
  • the support plate is a cover plate having dents (preferably through holes) on both sides of the window, and the clamping plate is a cover plate having claws that can be fitted in both the dents (preferably through holes).
  • the clamping plate is a flange plate having a flange portion capable of contacting the frame portion of the support plate, and further includes a clip capable of clamping and fixing the frame portion of the support plate and the flange portion of the flange plate.
  • the cell holding substrate holder [5] The cell-holding substrate holder according to [4], wherein the flange plate has a cup part capable of introducing a specimen and communicated with a window part of the flange part.
  • the cell holding substrate holder of [1] of the present invention the cell holding substrate can be clamped and fixed between the support plate and the holding plate, and the cell holding substrate can be easily detached from the support plate.
  • the cell holding substrate can be moved to perform a stable enclosing operation, and the entire observation specimen can be made thin.
  • the support plate has a frame portion, and a fitting recess for detachably fixing the holding plate to the frame portion, a cell holding base.
  • Various functions can be added by providing a dent into which the tip of the tweezers can be inserted when collecting the material, a storage dent for storing the protruding portion of the clamping plate, and the like.
  • the cell holding substrate holder of [3] of the present invention can be fixed to the support plate by the claw of the cover plate, so that no shear force is applied to the cell holding substrate. Therefore, even if an inorganic cell holding substrate such as glass (for example, an inorganic fiber sheet) is used, there is no fear of breakage, and the cell holding substrate can be easily attached and detached.
  • an inorganic cell holding substrate such as glass (for example, an inorganic fiber sheet) is used, there is no fear of breakage, and the cell holding substrate can be easily attached and detached.
  • it has a cover plate and can be used in a staining process using a staining basket while maintaining the cell holding substrate sandwiched and fixed in the cell holding substrate arrangement portion in cooperation with the support plate. Excellent in properties.
  • the cell holding substrate holder of [4] of the present invention since the cell holding substrate can be fixed to the support plate with a clip, no shear force is applied to the cell holding substrate. Therefore, even if an inorganic cell holding substrate such as glass (for example, an inorganic fiber sheet) is used, there is no fear of breakage, and the cell holding substrate can be easily attached and detached.
  • an inorganic cell holding substrate such as glass (for example, an inorganic fiber sheet) is used, there is no fear of breakage, and the cell holding substrate can be easily attached and detached.
  • the cell holding substrate holder of [5] of the present invention when the cell holding substrate is used as a filter, even a large amount of liquid specimen can be collected by filtration.
  • the cup part can be separated, the volume of the kit can be reduced.
  • the cell holding substrate holder of [7] of the present invention in a staining step using a staining basket while the cell holding substrate is sandwiched and fixed in the cell holding substrate arrangement portion in cooperation with the support plate. Since it can be utilized, it is excellent in workability, and since the shearing force is not applied to the cell holding substrate, the cell holding substrate can be detached without damaging the cell holding substrate.
  • the cell-holding group can be formed by water pressure by operations such as cell filtration and staining.
  • the material is hard to tear.
  • the support plate can be stored in the staining basket, it can be applied to staining baskets and automatic staining apparatuses conventionally used for staining slide glass smear cells. Is possible.
  • the cell holding substrate holder of [10] of the present invention since the cell holding substrate can be attached and detached using tweezers, workability is good, and the cell holding substrate may be damaged by the tweezers. Decrease.
  • the cell holding substrate holder of [11] of the present invention since it is composed of an organic resin, it is easy to dispose after using the cell holding substrate holder.
  • the cell holding substrate holder of [12] of the present invention since the cell holding substrate can be fixed to the support plate by fitting, clamping, or pivoting of the cover plate, the cell holding substrate is sheared. Power is not applied. Therefore, even if an inorganic cell holding substrate such as glass (for example, an inorganic fiber sheet) is used, there is no fear of breakage, and the cell holding substrate can be easily attached and detached.
  • the cover plate and the support plate can be used in a staining process using a staining basket while the cell holding substrate is sandwiched and fixed in the cell holding substrate arrangement portion, thus improving workability. Are better.
  • the cover plate has a force point portion to which a force can be applied, and is clamped by the cover plate and the support plate by applying a force to the force point portion. Since the fixing action can be released, it can be easily detached without damaging the cell holding substrate.
  • the force point is a protrusion that can hook a finger or a notch that can insert a finger
  • force is applied to the protrusion or notch to release the clamping and fixing action of the cover plate and the support plate.
  • it can be easily detached without damaging the cell holding substrate.
  • the cell holding substrate holder of [14] of the present invention since the cell holding substrate arrangement part and / or the cover plate have a liquid-permeable structure, the cell holding substrate cover plate and cells that are likely to occur during staining are used. It is possible to promote the cleaning and removal of the remaining staining liquid in the portion sandwiched and fixed by the holding base material arrangement portion. For this reason, since the residual staining solution is difficult to diffuse and stain spots are not generated, the observation property with a microscope is excellent.
  • the cell holding substrate can be clamped and fixed between the support plate and the holding plate, and the cell holding substrate can be easily detached from the support plate.
  • the cell-holding substrate is made of a porous sheet, it does not require expensive equipment or special procedures, and it concentrates floating cells in one step of cell filtration by gravity and simulates solidification on the cell-holding substrate.
  • a cell observation specimen can be prepared.
  • the cell-holding substrate is composed of an inorganic fiber sheet, and the cells can be fixed in the internal voids of the cell-holding substrate. Soaking operation is possible. Moreover, since the porosity is 90% or more, not only the cells are easily fixed in the internal voids of the cell holding substrate, but also the water permeability is excellent.
  • the cell-holding substrate can be stored in the staining basket in a state mounted on the cell-holding substrate holder, staining conventionally used for staining slide glass smeared cells It can be applied to a basket or an automatic staining apparatus to stain cells with good operability.
  • the observation specimen preparation method of [18] of the present invention since cells are stably held in the internal voids of the inorganic fiber assembly having excellent rigidity, cell detachment and loss of stericity can be prevented. . It is also useful for holding cell clusters having multi-layered properties.
  • inorganic fibers are hydrophilic and inorganic fiber aggregates have a certain level of water retention, even if they are left for several minutes, the cells do not dry and stable wet fixation becomes possible. Therefore, it is useful for simultaneous production of a large amount of specimens and application to instruments.
  • the three-dimensionality of the cells is maintained, it is also useful for observing cell clusters having three-dimensional irregularities and stratification of cells and nuclei.
  • the inorganic fiber aggregates are resistant to solvents (ethanol, methanol, xylene) contained in the reagents used for cytodiagnosis, they can be used as an observation base material after being collected and enclosed. Therefore, the transfer operation performed by the conventional filter method using a membrane filter is unnecessary. For this reason, there is no concern about cell shape degradation due to transcription pressure, and no cell loss occurs at that time.
  • sealing is performed with an encapsulant whose refractive index matches that of the fiber, irregular reflection caused by the curved fiber surface can be suppressed, and a clear observation image can be obtained so that an organelle can be identified even in an optical microscope.
  • FIG. 4 is a photograph replacing a drawing showing a state before use (a state before holding a filter) of one form of the filter holder (support plate and cover plate) of the present invention included in the filter kit of the present invention shown in FIG. 1.
  • FIG. 3 is a photograph replacing a drawing showing a state in which the filter is held by sandwiching the filter between the support plate and the cover plate shown in FIG. 2. It is the photograph which replaces drawing which shows the state which assembled the flange plate (a flange part and a cup part are integrated) and packing contained in another one aspect
  • a filter holder for observation specimen preparation for floating cells when the cell holding base material acts as a filter hereinafter, And a filter kit (hereinafter also referred to as the present invention kit) which is one of the observation specimen preparation kits of the present invention including the filter holder.
  • the method for producing the observation specimen of the present invention will be described.
  • the filter kit of the present invention includes a filter for collecting cells and the filter holder of the present invention.
  • the kit of the present invention will be described, but the description can be applied to the filter holder of the present invention as it is except that the kit of the present invention includes a filter.
  • 1 includes a support plate 1; a cover plate 2; a flange portion 31 and a cup portion 32 that can constitute the flange plate 3; two clips 4a and 4b; a packing 5; a filter. It consists of nine.
  • the support plate 1 has a filter arrangement part 12 having a window part 11 through which water can flow, and can further have a frame part 13.
  • a support member 14 that can support the filter 9 can be provided in the window portion 11.
  • the window portion 11 shown in FIG. 1 is provided with an X-shaped support member 14, but in the kit of the present invention, in addition to the X-shape, for example, * -shape, triangle shape, I-shape, Y-shape Support members such as a letter shape, a two-letter shape, a lattice shape, and a mesh shape can be provided.
  • fitting recesses 15 a and 15 b for detachably fixing the cover plate 2 on both sides of the window portion 11; for disposing the flange portion 31 at a predetermined position with respect to the support plate 1.
  • a recess 17 into which the tip of the tweezers can be inserted also serves as a storage recess 18.
  • the fitting recesses 15a and 15b, the recess 17 or the storage recess 18 are preferably through-holes as shown in FIG. Further, the depression 17 into which the tip of the tweezers can be inserted can be provided in a clamping plate, for example, the cover plate 2 or the flange plate 3.
  • the depression 17 into which the tip of the tweezers can be inserted is preferably provided adjacent to the filter placement portion 12 so that the filter 9 can be taken out.
  • the filter 9 is sandwiched with the support plate 1 when the sandwiching plate is removed. The filter 9 can be taken out without being damaged regardless of whether it is attached to any of the plates.
  • the protrusion 24 of the cover plate 2 can be stored in the storage recess 18 and no protrusion is formed on the filter holder, it is easy to store and use it in a dyeing basket as usual.
  • the filter placement portion 12 has the same rectangular shape as that of the filter 9, and is composed of a concave portion having an outer shape with substantially the same area. Therefore, the filter 9 can be stored in close contact with the filter placement portion 12, and displacement of the filter 9 can be prevented.
  • positioning part is the same perfect circle shape as a filter, and is comprised from the recessed part which consists of the external shape of the substantially the same area. Therefore, the filter can be stored in close contact with the filter placement portion, and the displacement of the filter can be prevented.
  • the filter arrangement part is comprised from the recessed part which consists of the same shape as a filter, and the external shape of substantially the same area.
  • the filter arrangement portion may be a recess having a shape different from that of the filter or having a larger area than the filter to such an extent that the filter is not displaced.
  • a spatial margin is generated between the filter arrangement part and the filter, and tweezers can be interposed between the filter arrangement part and the filter, so that the filter can be arranged without damaging the filter. It is easy to install in the part, and it is easy to remove the filter from the filter installation part.
  • the filter placement portion can be composed of rectangular recesses having a longitudinal length and a transverse length that are equal to or longer than the filter diameter, and the filter placement Since the tweezers can be interposed in the space formed between the portion and the filter, the filter can be attached and detached without damaging the filter.
  • the filter placement part is a concave part having a different shape from the filter or having a larger area than the filter, there is a possibility that the filter may be displaced.
  • the filter placement portion preferably has a convex portion at a position where it can come into contact with the outer edge of the filter.
  • the filter arrangement part 12 has a through-hole 19 as a liquid passage structure.
  • the through hole By having the through hole in this way, the liquid permeability is improved through the through hole, and in the cleaning step after the dyeing step, the cleaning solution reaches the filter 9 and easily drains after cleaning, so that it remains. This is because it is easy to wash and remove the staining solution. That is, if the staining liquid remains in the portion sandwiched between the filter cover plate 2 and the filter arrangement portion 12, the staining liquid diffuses to produce staining spots, and the observability with a microscope decreases. Since the liquid passing structure (through hole 19) is easy to wash and remove the remaining staining liquid, the effect of excellent observation with a microscope is achieved.
  • the through-hole 19 is the through-hole 19, but does not have to be a through-hole, and the outer edge of the filter placement portion 12 (the fitting recesses 15 a and 15 b and the recess 17 are provided on the surface in contact with the filter).
  • a groove leading to (including) may be used. Even when the liquid passage structure is a groove, the liquid permeability is improved through the groove, so that the same effect as in the case of the through-hole is obtained, and the effect of excellent observability with a microscope is achieved.
  • the liquid passing structure (through hole 19, groove, etc.) is located more than the position where the packing 5 is in contact so that floating cells do not leak out during cell filtration. It is preferably located outside.
  • the cover plate 2 has a window portion 21 through which water can pass, and the window portion 21 can be provided with a support member 22 that can support the filter 9.
  • a support member 22 that can support the filter 9.
  • Examples of the shape of the support member 22 include an X shape, a * shape, a triangular shape, an I shape, a Y shape, a second shape, a lattice shape, and a mesh shape.
  • the support member 22 of the cover plate 2 does not need to have the same shape as the support member 14 of the support plate 1.
  • the cover plate 2 can be provided with fitting claws 23a and 23b that can be fitted into both fitting recesses 15a and 15b of the support plate 1.
  • the cover plate 2 can clamp and fix the filter 9 to the filter placement portion 12 of the support plate 1 in cooperation with the support plate 1. That is, after the filter 9 is arranged on the filter arrangement portion 12 of the support plate 1, the fitting claws 23 a and 23 b of the cover plate 2 are fitted with the fitting depressions 15 a and 15 b, and the support plate 1 and the cover plate 2
  • the filter 9 can be fixed by sandwiching with. Therefore, no shearing force is applied to the filter, and there is no fear of breakage even when an inorganic filter such as glass (for example, an inorganic fiber sheet) is used.
  • the cover plate 2 in FIG. 1 has a protrusion 24 that can be hooked with a finger, the cover plate 2 can be easily detached from the support plate 1 by hooking the finger on the protrusion 24 and pulling it upward.
  • the filter 9 can be taken out without being damaged.
  • the cover plate 2 has a protrusion 24 that can be hooked by a finger, and the length of one of the fitting claws (23 a in FIG. 1) in the cover plate 2 is the length for the other fitting. It is shorter than the nail (23b in FIG. 1), and the fitting state of one of the fitting nails 23a with the fitting depression 15a is shallow, so that by placing a finger on the protruding portion 24 and pulling upward, The cover plate 2 can be easily removed and the filter 9 can be taken out without being damaged.
  • the protrusion 24 of the cover plate 2 is smaller than the storage recess 18 of the support plate 1, and a gap is generated between the protrusion 24 and the storage recess 18 when the cover plate 2 is mounted on the support plate 1.
  • the protruding portion 24 in the cover plate 2 is a power point portion protruding in the surface direction of the cover plate 2, but the protruding portion may protrude in the thickness direction instead of the surface direction of the cover plate 2.
  • the force point portion is picked up by a finger and pulled to release the pinch by the cover plate 2 and the support plate 1 and take out the filter 9 without damage. Can do.
  • FIG. 1 shows an aspect in which the force point portion of the cover plate 2 is a protruding portion 24 that can hook a finger.
  • the cover plate 2 is a force point portion that is formed by a notch portion into which a finger can be inserted.
  • the aspect which has this may be sufficient.
  • the finger is inserted into the notch, the finger is placed on the cover plate 2 and pulled upward to release the pinch between the cover plate 2 and the support plate 1 without damaging the filter 9. It can be taken out.
  • the notch preferably extends from the outer edge of the cover plate 2 toward the window 21.
  • the notch part may be completely notched (namely, through-hole) in the thickness direction of a cover plate, and may be partially notched (namely, hollow).
  • the support member 22 of the cover plate 2 supports the filter 9 against the water pressure from both directions of the filter surface generated in the subsequent dyeing process, so that the load applied to the filter 9 can be dispersed. It is preferable that the support plate 1 is arranged so as not to overlap the support member 14.
  • the cover plate 2 has a recess 27 into which the tip of the tweezers can be inserted between the fitting claws 23 b and close to the window portion 21. Even when the filter 9 is attached to the cover plate 2 when 2 is removed from the support plate 1, the filter 9 can be taken out without being damaged.
  • the outer shape of the cover plate 2 corresponds to the outer shape of the filter placement portion 12 of the support plate 1, and the cover plate 2 can be stored in the filter placement portion 12. Therefore, the filter 9 can be sandwiched and fixed by the filter placement portion 12 and the cover plate 2, and displacement of the filter 9 can be prevented.
  • the outer shape of the cover plate 2 corresponds to the outer shape of the filter placement portion, and the cover plate 2 can be stored in the filter placement portion 12.
  • the cover plate 2 has a concave portion at a corresponding position and can accommodate the convex portion. Since it can be stored in this manner, the thickness of the filter placement portion 12 when the cover plate 2 is mounted can be made approximately the same as that of the frame portion 13, so that it can be easily stored and used in a dyeing basket as before.
  • the cover plate 2 also has a through hole 29 as a liquid-permeable structure. This is because the filter arrangement portion 12 of the support plate 1 acts in the same manner as when it has a through hole, and has the effect of being excellent in observability with a microscope.
  • the liquid passage structure of the cover plate 2 in FIG. 6 is the through hole 29, but it is not necessary to be a through hole, and may be a groove provided on the surface in contact with the filter and leading to the outer edge of the cover plate. Even in the case of such a groove, since the liquid permeability is improved through this groove, the same effect as in the case of the through-hole is obtained, and the effect of excellent observability with a microscope is obtained.
  • the filter arrangement portion 12 of the support plate 1 has a liquid passage structure
  • liquid leakage is prevented between the window portion 35 of the flange plate 3 and the window portion 21 of the cover plate 3 as described later.
  • the liquid passing structure (the through hole 29, the groove, etc.) is located more than the position where the packing 5 is in contact so that floating cells do not leak during cell filtration. It is preferable to have it outside.
  • positioning part of the support plate 1 and the liquid passage structure in the cover plate 2 may be the same, and may differ.
  • the shape, size, position, through hole or groove of the liquid passing structure may be the same or different.
  • positioning part of the support plate 1 or only the cover plate 2 may have a liquid-permeable structure, the direction which has a liquid-permeable structure in both is excellent in the above-mentioned effect.
  • the support plate 1 sandwiches the window 11 and opposes in the longitudinal direction, and has both fitting recesses 15a and 15b, and the fitting claws 23a and 23b of the cover plate 2 are fitted.
  • the filter 9 can be clamped and fixed, but the fitting position does not need to be opposed to the window plate 11 of the support plate 1 in the longitudinal direction.
  • the support plate 1 may be opposed in the short direction across the window portion 11, and the angle formed by the adjacent fitting positions with respect to the center of the window portion 11 is 60 °, 72 °, 90 °. , 120 °, etc., may be arranged at a constant angle.
  • the support plate 1 has four fitting recesses that are involved in the fitting, and the cover plate has four fitting claws corresponding to the fitting depressions, but it is necessary to have four fitting nails. No, it only needs to be fitted at two or more locations. It is preferable that the filter 9 can be fitted at three to six positions so that the filter 9 can be stably clamped and fixed.
  • the filter holder in FIG. 1 can clamp and fix the filter 9 by fitting the fitting claws 23a and 23b of the cover plate 2 into the fitting depressions 15a and 15b of the support plate 1. It is not necessary that the cover plate 2 is attached to the support plate 1 by fitting and the filter 9 can be clamped and fixed.
  • a cover plate having a water-permeable window portion and a support plate having a filter placement portion having a water-permeable window portion the cover plate is disposed in the filter placement portion, and a support plate similar to that described later. It may be an aspect that can be clamped by a thin clip that can clamp the cover plate.
  • a cover plate having a water-permeable window, a pivot shaft at one end, and a convex portion (protrusion, etc.) or a concave portion (through hole, depression, etc.) at the other end, It has a filter arrangement part having a window part through which water can pass, a bearing at one end of the filter arrangement part, and a concave part (through hole, depression, etc.) or convex part (protrusion etc.) at the other end part.
  • the support plate includes a support plate, and at one end, the cover plate pivot shaft can be inserted into the bearing of the support plate and pivoted, and at the other end, the convex portion and the concave portion can be fitted. May be. Even in these modes, since the elastic force does not act on the filter 9, it can be attached and detached without damaging the filter.
  • the cover plate can be hooked with a finger so that the filter can be easily taken out without being damaged.
  • a power point part such as a protruding part, a protruding part that can be picked up by a finger, or a notch part in which a finger can be inserted.
  • the shape and size of the support plate 1 is preferably a rectangle that can be stored in a staining basket so that a conventionally known staining basket and staining tank can be used. That is, it is preferable that the shape and size conform to a conventionally known slide glass for preparing an observation specimen. More specifically, it is preferably about 76 mm in length, about 26 mm in width, and about 1 mm in thickness.
  • the cover plate preferably has a shape and size that does not protrude from the support plate so that a conventionally known dyeing basket and dyeing tank can be used.
  • the flange plate 3 includes a flange portion 31 and a cup portion 32 that can be loaded with a specimen and can communicate with the window portion 35 of the flange portion 31. As shown in FIG. 1, the flange portion 31 and the cup portion 32 are connected to each other. It can be designed to be separable, or can be integrally molded as shown in FIG.
  • the flange portion 31 shown in FIG. 1 has a window portion 35 through which water can be passed, and a flange 33 that can come into contact with the frame portion 13 of the support plate 1, the inside of the cup portion 32, and the flange portion 31. It consists of the connection part 34 which can connect the said window part 35 so that communication is possible.
  • the flange 33 can be provided with a connection protrusion 36 at a position corresponding to the connection hole 16 of the support plate 1.
  • the support plate 1 (preferably, the support plate 1 in which the filter 9 is fixed by the cover plate 2) and the flange plate 3 in a state where the filter 9 is held by the filter placement portion 12 is shown in FIG.
  • the frame portion 13 of the support plate 1 and the flange 33 of the flange portion 31 of the flange plate 3 can be clamped and fixed by sliding the U-shaped clips 4a and 4b.
  • the flange plate 3 cooperates and can be clamped and fixed to the filter placement portion 12 without damaging the filter 9.
  • the clip 9 can be removed without damaging the filter 9 because the filter 9 can be released and the flange plate 3 can be removed by sliding the clips 4a and 4b.
  • the filter 9 can be clamped and fixed without being damaged, and the filter 9 can be taken out without being damaged.
  • the flange plate 3 may have a mode in which the flange plate and the support plate can be fitted or pivoted in addition to a mode in which the flange plate 3 can be clamped by a clip as shown in FIG.
  • the flange plate 3 of the kit 10 of FIGS. 1 and 5 has a cup portion 32, a liquid specimen containing cells can be put in a large amount into the cup portion 32 to carry out the solidification process.
  • the flange plate 3 without the cup portion 32 can also be used.
  • the connecting portion 34 of the flange plate 3 can perform the same operation as the cup portion 32. That is, the connecting part 34 can temporarily store the liquid specimen without causing a lateral leakage of the liquid specimen, supply the liquid specimen to the window 35 of the flange plate 3, and solidify the cells.
  • the flange plate 3 shown in FIG. 1 includes the flange portion 31 having the flange 33 and the connecting portion 34 and the cup portion 32, but the flange plate 3 may be constituted only by the flange 33. . That is, the connecting part 34 and the cup part 32 may not be provided. In this case, if the flange plate 3 has a sufficient thickness that can temporarily store the liquid sample, the window 35 does not cause side leakage of the liquid sample, and the liquid sample is stored while temporarily storing the liquid sample. The specimen can be filtered to solidify the cells.
  • the kit of the present invention can include both the cover plate 2 and the flange plate 3 as a clamping plate, or can include only one of them.
  • the cover plate 2 mainly functions as a sandwiching plate, with the flange plate 3 being auxiliary.
  • any of the plates functions as a clamping plate.
  • the flange plate 3 when only the flange plate 3 is used, as with the cover plate 2, a recess into which the tip of the tweezers can be inserted is adjacent to a portion corresponding to the filter placement portion 12 of the support plate 1.
  • the filter 9 can be taken out without being damaged.
  • the flange plate 3 when the filter placement portion 12 has a convex portion, like the cover plate 2, the flange plate 3 preferably has a concave portion at a corresponding position so that the convex portion can be accommodated. .
  • the support plate 1 in the filter holder of FIG. 1 has a filter arrangement part 12 and a frame part 13, and this frame part is for fitting to fix the clamping plate (cover plate 2, flange plate 3) detachably.
  • the support plate 1 does not need to have a frame portion.
  • a clamping plate cover plate 2, flange plate 3 that can be fitted, clamped or pivotally attached to the filter placement portion 12
  • the filter 9 protrudes from the filter placement portion 12, it is for clamping
  • the plate the cover plate 2 or the flange plate 3
  • the support plate 1 does not need to have a frame portion.
  • the filter 9 included in the kit of the present invention is not particularly limited as long as it can collect cells by filtration operation and can carry out the subsequent staining process, encapsulation process, and the like.
  • the sheet is preferable because it can fix the cells in the internal space of the filter and can be immersed in a reagent.
  • an inorganic fiber sheet having a porosity of 90% or more is preferable because it not only facilitates fixing of cells to the internal voids of the filter but also has excellent water permeability.
  • an inorganic fiber sheet having a porosity of 90% or more for example, an inorganic fiber nonwoven fabric described in JP 2010-185164 A can be used.
  • Examples of the material of the constituent fiber of the inorganic fiber nonwoven fabric include SiO 2 , Al 2 O 3 , B 2 O 3 , TiO 2 , ZrO 2 , CeO 2 , FeO, Fe 3 O 4 , Fe 2 O 3 , and VO 2. , V 2 O 5 , SnO 2 , CdO, LiO 2 , WO 3 , Nb 2 O 5 , Ta 2 O 5 , In 2 O 3 , GeO 2 , PbTi 4 O 9 , LiNbO 3 , BaTiO 3 , PbZrO 3 , KTaO 3 , Li 2 B 4 O 7 , NiFe 2 O 4 , SrTiO 3, and the like. These may be composed of one component oxide, or may be composed of two or more component oxides. . For example, it can be composed of two components of SiO 2 —Al 2 O 3 .
  • the porosity of the inorganic fiber nonwoven fabric is preferably 91% or more, more preferably 92% or more, still more preferably 93% or more, and still more preferably 94% or more.
  • the upper limit of the porosity is not particularly limited, but is preferably 99.9% or less so as to be excellent in form stability.
  • the inorganic fiber nonwoven fabric is preferably not less than 0.2 MPa in tensile strength, more preferably not less than 0.2 MPa so that it is not easily damaged by water pressure at the stage of cell filtration, dyeing, etc., and is excellent in handleability. It is 3 MPa or more, more preferably 0.4 MPa or more, further preferably 0.5 MPa or more, and further preferably 0.55 MPa or more.
  • This tensile breaking strength is a quotient obtained by dividing the cutting load by the cross-sectional area of the inorganic fiber nonwoven fabric.
  • the cutting load is a value measured under the following conditions, and the cross-sectional area is a value obtained from the product of the width and thickness of the test piece at the time of measurement.
  • Product name Small tensile tester Model: TSM-01-cre Search Co., Ltd. Test size: 5 mm width x 40 mm length Chuck spacing: 20 mm Tensile speed: 20 mm / min. Initial load: 50mg / 1d
  • the average fiber diameter of the fibers constituting the inorganic fiber nonwoven fabric is not particularly limited, but is preferably 3 ⁇ m or less so that the fibers can easily form pores having a size that can easily hold cells. Is more preferably 1 ⁇ m or less, and further preferably 0.8 ⁇ m or less.
  • the lower limit of the average fiber diameter is not particularly limited, but is preferably 0.01 ⁇ m or more.
  • Average fiber diameter in the present invention refers to an arithmetic average value of fiber diameters at 50 points, and “fiber diameter” is measured based on an electron micrograph taken of an inorganic fiber nonwoven fabric in a field of view of 10 or more fibers. Refers to the thickness of the fiber.
  • the average basis weight of the inorganic fiber nonwoven fabric is not particularly limited, but if the basis weight is higher than necessary, the drainage property will deteriorate in the cell collection process or the dyeing process, and it will take time to collect, Since it tends to be a cause, it is preferably 20 g / m 2 or less, more preferably 15 g / m 2 or less, and still more preferably 10 g / m 2 or less.
  • the minimum of an average fabric weight is not specifically limited, It is preferable that it is 1 g / m ⁇ 2 > or more.
  • Average basis weight in the present invention refers to an arithmetic average value of basis weights of 18 samples (inorganic fiber nonwoven fabrics), and “weight per unit area” measures the area and mass of the widest surface, and the area and mass To the value converted to mass per 1 m 2 area.
  • the average thickness of the inorganic fiber nonwoven fabric is not particularly limited, but if it is thicker than necessary, the possibility of bubbles being generated in the observation specimen increases due to the volume reduction accompanying the drying of the encapsulant. Is preferably 300 ⁇ m or less, and more preferably 200 ⁇ m or less. The lower limit of the average thickness is not particularly limited, but is preferably 20 ⁇ m or more.
  • the “average thickness” in the present invention refers to the arithmetic average value at 54 locations of the thickness of the sample (inorganic fiber nonwoven fabric). The value measured by the method [load: 0.5 N (measurement area: diameter 14.3 mm)].
  • the average pore diameter of the inorganic fiber nonwoven fabric is not particularly limited, but is preferably 2 to 40 ⁇ m, more preferably 4 to 20 ⁇ m so that general cells having a diameter of about 20 ⁇ m can be easily retained.
  • the thickness is preferably 6 to 10 ⁇ m.
  • the average pore diameter refers to the value of the average flow pore diameter obtained by the method prescribed in ASTM-F316. For example, the average pore diameter is measured by a mean flow point method using a porometer [Polometer, manufactured by Coulter, Inc.]. be able to.
  • the constituent fibers of the inorganic fiber nonwoven fabric are preferably continuous fibers. This is because when the constituent fiber is a short fiber, the inorganic fiber nonwoven fabric is distorted during the dyeing process or when the cells held in the pores of the inorganic fiber nonwoven fabric move, This is because there is a possibility of damaging cells, but there is no such fear when it is a continuous fiber. “Continuous fiber” means that the end of the constituent fiber cannot be confirmed when a 5,000-fold electron micrograph of the inorganic fiber nonwoven fabric is taken.
  • the inorganic fiber nonwoven fabric is bonded with an inorganic adhesive. This is because the shape stability is excellent, the pores for holding the cells are easily maintained, and the filter is prevented from being damaged in each step. In particular, if the whole of the inorganic fiber nonwoven fabric, including the inside, is bonded with an adhesive without forming a film between the fibers, the drainage is good in the cell collection process and the staining process, and the filtration time is shortened. And dyeing unevenness can be suppressed.
  • the inorganic fiber nonwoven fabric that can be used in the method of the present invention is a known electrospinning method, preferably an electrospinning method in which a sol-gel method and a neutralization spinning method are combined, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-185164. It can be manufactured by the described manufacturing method.
  • JP 2010-185164 A The production method described in JP 2010-185164 A is (1) a step of spinning an inorganic gel fiber by an electrospinning method from an inorganic sol solution for spinning containing a compound mainly composed of an inorganic component; (2) A step of irradiating and accumulating ions having a polarity opposite to that of the inorganic gel fiber to form a gel fiber web; (3) a step of firing the gel-like fiber web to form an inorganic fiber web; (4) An adhesive inorganic sol solution containing a compound mainly composed of an inorganic component is applied to the whole including the inside of the inorganic fiber web, and the excess inorganic sol solution for bonding is removed by aeration to bond.
  • Forming an inorganic fiber web containing an inorganic sol solution (5) It includes a step of heat-treating the inorganic fiber web containing the inorganic sol solution for bonding and forming an inorganic fiber nonwoven fabric bonded with an inorganic adhesive in the whole including the inside.
  • the shape of the filter 9 of the present invention is not particularly limited, and can be, for example, a square shape such as a quadrangle as shown in FIG. 1 or a round shape such as a perfect circle as shown in FIG. .
  • Materials of members other than the filter included in the kit of the present invention are particularly limited as long as floating cells can be collected.
  • organic resins for example, polyamide, polybutylene phthalate, polycarbonate, polyethylene, polyethylene phthalate, acrylic, polyacetal, polypropylene, polyphenylene oxide, polyphenylene sulfide, polystyrene, polyvinyl chloride, ABS resin, AS resin, chlorotrile
  • Fluoroethylene, vinylidene fluoride, perfluoroalkoxy fluororesin, etc. are made of organic resin. Preference is.
  • the kit of the present invention is prepared by putting a suspended cell dispersion to be prepared for observation into a cup 32 and filtering it by gravity or by suction if desired.
  • 9 can collect cells.
  • the filter 9 that has collected the cells can remain in a state of being fixed between the support plate 1 and the cover plate 2 and can proceed to a cell fixing process or a staining process using a staining basket and a staining tank. Thereafter, the filter 9 can be removed from the support plate 1 and moved onto the slide glass to proceed to the enclosing step.
  • the cell holding substrate when the shape and size when the cell holding substrate is mounted on the cell holding substrate holder is a rectangle that can be stored in the staining basket, the cell holding substrate is mounted on the cell holding substrate holder. Therefore, the cells can be stained with good workability by carrying out a cell fixing step and a staining step using a staining basket and a staining tank.
  • the above is a filter holder for preparing an observation specimen for floating cells, which is one of the cell holding substrate holders for preparing an observation specimen of the present invention, and a filter that is one of the kit for preparing an observation specimen of the present invention including the same.
  • the description of the kit that is, the description in the case where the cell holding base material acts as a filter, is the cell holding base material holder for observation specimen preparation and the kit for observation specimen preparation of the present invention, When it does not act as a filter, it can be used even when it is a cell culture substrate or a cell adsorption substrate, for example.
  • the solidification step of the cells on the cell holding substrate was performed using a cell holding substrate such as a cell culture substrate or a cell adsorption substrate without using the filter holder of the present invention as described above. Thereafter, the cell holding substrate holding the cells can be advanced to a cell fixing step or a staining step using a staining basket or a staining tank in a state where the cell holding substrate is sandwiched between a support plate and a clamping plate (particularly a cover plate).
  • a substrate having a thickness suitable for an observation specimen performed with a microscope can be used.
  • a glass substrate, a membrane, an inorganic fiber sheet, or the like can be used.
  • the solidification step for solidifying the cells on the cell holding substrate includes, for example, a step of culturing and adhering adhesive cells on the cell culture substrate; a porous state such as the inorganic fiber sheet used as the filter described above. Placing the cell adsorption substrate on the bottom of the culture vessel, and then pouring the cell dispersion liquid and allowing it to stand to allow the cells to naturally settle and adsorb; or using the charge of the cell surface and the cell adsorption substrate It can be carried out by a step of electrically adsorbing.
  • the cell holding substrate holder for preparing an observation specimen and the kit for preparing an observation specimen of the present invention can be used in the method for preparing an observation specimen of the present invention.
  • the observation specimen preparation method of the present invention includes a cell collection process using an inorganic fiber aggregate, a wet fixation process, a staining process, a penetration process, and an encapsulation process. it can.
  • cells are collected using an inorganic fiber aggregate.
  • the collection method is not particularly limited as long as cells in the specimen can be collected in an inorganic fiber aggregate in a sufficient amount for cytodiagnosis.
  • an inorganic fiber aggregate of an appropriate size on the surface of at least one (preferably one) substrate having a window in the center so as to completely cover the window. It can be carried out by preparing a cell collection plate in which a filter part is formed and passing (filtering) the specimen through the filter part.
  • two substrates having a window in the central part are prepared, and the filter part is formed in the central part of the substrate by pasting the substrates together with an inorganic fiber aggregate of an appropriate size sandwiched therebetween.
  • the size and thickness of the substrate are not particularly limited, but considering the use of a conventional staining basket, it is preferable to follow the slide glass for preparing the observation specimen.
  • a liquid specimen in the case of a liquid specimen, it is dropped as it is or after being diluted with an appropriate liquid (for example, physiological saline, cell fixing solution, etc.), and dropped on the upper surface of the filter portion made of an inorganic fiber aggregate.
  • Cells can be collected by filtration by gravity, or by suction if desired. In particular, a gravity filtration method is preferred because it is difficult to damage cells or denature cells.
  • the liquid storage means for example, a cylinder having a hollow portion that penetrates
  • the liquid specimen can be centrifuged in advance to remove excess liquid, and then the filtration operation can be performed.
  • the collection operation can be carried out after being dispersed in an appropriate liquid (for example, physiological saline, cell fixing solution, etc.).
  • the inorganic fiber aggregate used in the method of the present invention is preferably an inorganic fiber sheet that can collect cells by filtration and can be flat and thin.
  • an inorganic fiber non-woven fabric can be mentioned, which is suitable because the cells can be fixed in the internal space of the filter and immersed in a reagent.
  • an inorganic fiber nonwoven fabric having a porosity of 90% or more is preferable because it not only facilitates fixing of cells to the internal voids of the filter but also has excellent water permeability.
  • the above description regarding the inorganic fiber nonwoven fabric that can be used in the kit of the present invention can be directly applied to the inorganic fiber nonwoven fabric that can be used in the method of the present invention.
  • the inorganic fiber aggregates collected with the cells are immersed and fixed in a reagent (fixing solution, for example, 95% ethanol) so that the cells collected in the inorganic fiber aggregates are not denatured.
  • a reagent for example, 95% ethanol
  • the cells smeared on the slide glass are easily dried, and thus it was required to perform wet fixation within a few seconds. Since it has water retention, even if it is allowed to stand for several minutes (eg, 3 to 10 minutes), the cells are not dried, and stable wet fixation can be performed.
  • the dyeing step in the method of the present invention is a step of dyeing the cells collected in the inorganic fiber aggregate, which has been wet-fixed, by an appropriately selectable dyeing method according to the purpose of use (inspection purpose). It can be carried out according to the staining operation in the conventionally known ordinary observation specimen preparation method used.
  • it is not essential to use a dyeing basket and a dyeing tank, but it is preferable to use a dyeing basket and a dyeing tank in that a large amount of inorganic fiber aggregates can be treated in a lump.
  • staining method examples include Papanicolaou staining, PAS staining, and Alcian blue staining.
  • the see-through step in the method of the present invention is a step of clarifying the cells by immersing them in xylene or the like after dehydrating the cells collected in the inorganic fiber aggregate after staining. It can be carried out according to the penetration operation in a conventionally known ordinary observation specimen preparation method using a slide glass.
  • the encapsulating step in the method of the present invention is a step of sealing the inorganic fiber aggregate carrying the stained cells with an encapsulating agent under the cover glass.
  • an encapsulant having a refractive index equivalent to the refractive index of the constituent fibers of the inorganic fiber aggregate is used.
  • the equivalent means that the refractive index is within a range of ⁇ 0.05.
  • Examples of the encapsulant that can be used in the method of the present invention include Neo-Mount (registered trademark) (Merck # 109016, refractive index: 1.46), Softmount (registered trademark) (Wako Pure Chemicals # 192-16301, Refractive index: 1.50), Encapsulant New MX (Matsunami Glass Industry # FX00100, Refractive Index: 1.545), Encapsulant MGK-S (Matsunami Glass Industry # FK00100, Refractive Index: 1.545), Multi Mount 480 (Matsunami Glass Industry # FM48001, Refractive Index: 1.49), Multi Mount 220 (Matsunami Glass Industry # FM22001, Refractive Index: 1.49), Marinol (Mudo Chemical # 20009, Refractive Index: 1.572), etc. Can be used.
  • the method for preparing an observation specimen of the present invention can be carried out using the cell holding substrate holder for preparing an observation specimen and a kit for preparing an observation specimen of the present invention.
  • the cells were collected or smeared and fixed under the conditions shown in Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2 below. Subsequently, Papanicolaou staining was performed using Papanicolaou hematoxylin staining solution (Wako Pure Chemical # 168-18941), Papanicolaou EA100 staining solution (164-18921), and Papanicolaou OG100 staining solution (# 161-18931). Used according to the instructions in the attached instructions, using a dyeing basket and a dyeing tank. The translucency after dyeing was also performed using a xylene bath according to the procedure in the same manual. Thereafter, the sample was sealed with a commercially available mounting agent (Soft Mount (registered trademark), Wako Pure Chemicals, # 192-16301, refractive index: 1.50) to prepare an observation specimen.
  • Soft Mount registered trademark
  • Wako Pure Chemicals # 192-16301, refractive index: 1.50
  • Example 1 Silica sol solution was applied to the whole including the inside of the inorganic fiber web obtained by combining the sol-gel method and the neutral spinning method, and the product was manufactured by heat treatment.
  • Silica continuous fiber aggregate bonded with an adhesive (average basis weight: 7.42 g / m 2 , average thickness: 142 ⁇ m, average pore diameter: 7 ⁇ m, average fiber diameter: 0.73 ⁇ m, porosity: 95%, per unit basis weight Cutting load: 0.57 MPa, refractive index of fiber material: 1.46) is cut into a rectangle of 30 mm in width and 26 mm in length, and a hole in an aluminum plate with a width of 76 mm and a length of 26 mm with a hole with a diameter of 20 mm is a continuous silica fiber.
  • the filter was covered with an aggregate and adhered with an epoxy resin adhesive to produce a filter (filter surface: diameter 20 mm, area about 3.1 cm 2 ).
  • a cylinder having a diameter of 20 mm was fixed with a clip through an O-ring (packing) so that the hole of the filter communicated with the hollow portion of the cylinder.
  • 10 mL of a physiological saline dispersion (5 ⁇ 10 4 cells / mL) of HepG2 cells (human hepatoma-derived cell line) assumed to be a liquid specimen was placed in the hollow part of the tube, and filtered by gravity. After collecting the cells with the silica continuous fiber aggregate of the filter, the cells were immediately immersed in a 95% ethanol bath and fixed.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, the cells were collected with a continuous silica fiber aggregate, allowed to stand at room temperature for 3 minutes, and then immersed in a 95% ethanol bath for fixation.
  • Comparative Example 1 Physiological saline containing HepG2 cells 5 ⁇ 10 5 cells was centrifuged to remove the supernatant, and a cell sediment was prepared. This was smeared by a drawing glass method over a range of about 9.3 cm 2 of a slide glass (Muto Kagaku, # 511617) treated with a cell peeling prevention coating. Immediately after smearing, it was immersed in a 95% ethanol bath and fixed.
  • Comparative Example 2 As in Comparative Example 1, cells were smeared on a slide glass. After leaving at room temperature for 3 minutes, it was immersed in a 95% ethanol bath and fixed.
  • FIG. 1 magnification: 100 times
  • FIG. 2 magnification: 400 times
  • FIG. 3 show cell images obtained by observing the observation specimen of Example 2 (after cell collection, after being left at room temperature for 3 minutes and then fixed) with an optical microscope.
  • FIG. 5 magnification: 100 times
  • FIG. 6 magnification: 400 times
  • FIGS. 1 to 8 The cell images obtained by observing the observation sample of Comparative Example 2 (after cell smearing, after being allowed to stand at room temperature for 3 minutes and then fixed) with an optical microscope are shown in FIG. 7 (magnification: 100 times) and FIG. (Magnification: 400 times).
  • FIGS. 1 to 8 cells that appear dark gray are actually stained blue. Further, in FIG. 8, cells that appear dark gray to black are actually stained from amber to brown as a result of cell swelling.
  • Example 1 Using a cell-retaining optical microscope (Olympus Inverted Microscope IX73PI-22FL / PH), 100 points of observation were taken randomly at 5 points on the collection surface of the observation sample of Example 1 and 5 points on the smear surface of the observation sample of Comparative Example 1 did. In Example 1, at least 1000 cells or more were uniformly observed in all visual fields (FIG. 1), whereas in Comparative Example 1, there were two visual fields in which about 500 cells were observed. However, almost 50 or less cells were not observed, and there were three fields of view in which cell detachment occurred. FIG. 5 is a photomicrograph in which about 500 cells were observed.
  • Example 3 Observability (intracellular) In Example 1, an observation image capable of sufficiently discriminating organelles was obtained even in observation at a high magnification (400 times) (FIG. 2). On the other hand, in Comparative Example 1, the cells spread slightly and it was easy to observe the organelle.
  • Example 4 Observability (stericity) In Example 1, the three-dimensionality of individual cells and the three-dimensional positional relationship between the cells were maintained (FIG. 2). On the other hand, in Comparative Example 1, since all the cells spread slightly so as to stick to the slide glass, the original three-dimensional structure of the cells was lost (FIG. 6).
  • Cell holding substrate holder and cell holding substrate kit for preparing observation specimen of the present invention and preparation method of observation specimen, pathological diagnosis such as cytology and field of research using cells of medicine, pharmacy, life science, etc. Can be used.
  • pathological diagnosis such as cytology and field of research using cells of medicine, pharmacy, life science, etc.
  • 10 ... Filter kit for preparing observation specimens for floating cells; 1 ... support plate; 2 ... cover plate; 3 ... flange plate; 4a, 4b ... clip; 5 ... packing; 9 ... filter; 11 ... window; 12 ... Filter arrangement part; 13 ... Frame part; 14 ... support member; 15a, b ... depression for fitting; 16 ... Connection hole; 17 ... Depression; 18 ... Storage depression; 19 ... through-hole (liquid flow structure); 21 ... window; 22 ... support member; 23a, b ... fitting nail; 24 ... protrusion; 27 ... depression; 29 ... Through hole (liquid passage structure); 31 ... Flange part; 32 ... Cup part; 33 ... Flange; 34 ... Connection part; 35 ... Window; 36 ... Connection projection.

Abstract

細胞保持基材の着脱が簡便に行える観察標本の作製用細胞保持基材ホルダー及び細胞保持基材キットを提供し、細胞剥離、乾燥、立体性の消失という３つの問題を同時に解決しながら、光学顕微鏡にて細胞小器官を十分に観察できる観察標本の作製方法を提供する。前記細胞保持基材ホルダーは、（１）通水可能な窓部を有する細胞保持基材配置部１２を有する支持プレート１、（２）通水可能な窓部を有するとともに、前記支持プレート１と協働して細胞保持基材配置部１２に細胞保持基材９を挟持固定可能、かつ取り外し可能な挟持用プレート２，３を含む。前記細胞保持基材キット１０は、前記細胞保持基材ホルダーと、細胞保持基材９とを含む。前記方法では、無機繊維集合体で細胞を捕集し、そのまま湿固定、染色、及び無機繊維の屈折率と同等の封入剤による封入を実施する。

Description

観察標本作製用細胞保持基材ホルダー及びそれを含むキット並びに観察標本の作製方法
　本発明は、細胞に種々の染色を施し、顕微鏡（光学、蛍光）で観察する目的で作製される観察標本の作製に使用できる細胞保持基材ホルダー及びそれを含むキット、並びに観察標本の作製方法、より詳細には、細胞診（細胞診断）において実施される病理染色の内、湿固定とそれに続く染色槽を用いる染色（パパニコロウ染色、ＰＡＳ染色、アルシアン青染色等）を施した観察標本の作製方法に関する。
　当該分野は、主にがんの診断のために使用され、患者から採取した細胞から観察標本を作製し、細胞診断士、細胞診断専門医、病理専門医等の資格をもつ者が検鏡し、異常細胞（異型細胞）を検出するという手順で実施される。また、当該分野は、主に病院等の医療機関で実施され、日々大量の検体（観察標本、検鏡標本）を作製、検査する必要を要する。
　細胞診は細胞の採取方法によって分類され、剥離した細胞が混入した体液を採取する剥離細胞診（喀痰、尿、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液、胆汁など）、ブラシや綿棒などを体内に挿入し病変部を擦過して細胞を採取する擦過細胞診（子宮頸部・体部、気管支、胆管、膵管など）、細い針を病変部に刺し、吸引して細胞を採取する穿刺吸引細胞診（乳腺、甲状腺、リンパ節、肝臓など）などがあり、これらの採取した細胞を観察用基板（スライドガラス）に塗沫して観察標本を作製する。スライドガラスへの塗沫は、細胞を液体に分散した状態で行うことが多く、採取した状態が体液などの液状でない場合は、固定液体に分散してから塗抹する場合がある（液状化検体細胞診）。
　“細胞染色”は、当該分野以外にも様々な分野が存在する。作製された観察標本の使用目的（完成度）によって、染色方法、試薬、器具、機器は全く異なる。染色の目的は、例えば、組織を細胞種によって染め分けてそれぞれの局在を明らかにするもの（例：免疫組織染色）、細胞のもつ何らかのマーカーや形態学的な特徴を元に目的の細胞の数や染色強度を装置で検出できればよいだけのもの（例：ハイコンテントスクリーニング、フローサイトメトリー）、前述の目的において人の目で観察するもの（例：血球計算板による細胞カウント）、細胞内外の標的物質を染色して局在を観察するもの（例：蛍光顕微鏡観察）、細胞小器官の形状や色を観察するもの（例：細胞診）、さらには細胞小器官内部の構造まで詳細に観察するもの（例：電子顕微鏡観察）が挙げられるが、当該分野においては、光学顕微鏡観察によって観察が行われ、細胞小器官が十分観察できる観察倍率（およそ２００～４００倍）にて、細胞小器官の形状や染色の色および濃淡が判別できる観察像の取得が求められる。
　また、当該分野でのこれまでの通常の観察標本の作製工程には、提供される細胞試料の状態、使用する試薬の性質、必要とする標本の完成度の理由から、他の染色分野では行われない、次のような独特の作業工程が必要である。
塗抹
　提供された細胞試料を観察用基板（スライドガラス）に塗りつける操作のことである。スライドガラスに直接塗りつける方法（引きガラス法、すり合わせ法、遠心直接塗抹法など）や、フィルタで細胞を捕集した後、スライドガラスに転写する方法がある（フィルタ法）。前者の引きガラス法、すり合わせ法は簡便ではあるが、狭い範囲に塗抹することが難しく、すり合わせに使用したガラス側にも細胞が付着してしまうため、細胞密度が薄くなり、観察操作の際に広い範囲を観察しなければならないという問題があった。また、後者のフィルタ法は、捕集したすべての細胞をスライドガラスに転写することはできないため細胞にロスが生じ、また、転写操作時の圧力により細胞形状が変性するという問題があった。
湿固定
　塗抹した細胞が変性しないように試薬（固定液）に浸して固定する操作である。当該分野では湿固定が重要であり、細胞が乾燥して変性すると染色性が変化して、診断に影響を及ぼす。一般的にスライドガラスに塗抹した細胞は数秒以内に湿固定しなければならないとされている。そのため、大量の検体を同時に塗抹することは難しい。また、塗抹に機器を用いる遠心直接塗抹法、フィルタ法は、機器やスライドガラスフォルダから取り外す間、さらにフィルタ法では転写操作の間、乾燥に曝されるという問題があった。加えて、塗抹直後の細胞はスライドガラスから剥がれやすく、固定液に浸すと、多くの細胞がスライドガラスから剥離してしまうという問題もある。細胞が塊状の重積性を有する場合は、これらをスライドガラス上に保持することは更に困難であった。この剥離の問題を解決するために、細胞剥離防止コート（シランコート等）が施されたスライドガラスも考案されているが、実際には十分な効果が得られるものではなかった。また、剥離、乾燥の問題を同時に解決するために、保湿性を有する固定液をスプレーまたは滴下し、細胞とスライドガラスをコーディングする方法が考案されている。しかし、固定液をスプレーした瞬間にも細胞の剥離が起き、また、保湿成分（ＰＥＧ等）が細胞をコーティングしてしまうため、細胞の染色性を変化させ、診断に影響を与えるという新たな問題が生じていた。
染色（溶媒置換、分別、色だしを含む）
　塗抹及び湿固定の終わったスライドガラス数枚を染色かごに垂直にセットし、染色液等の試薬が入った染色槽や水道水を張ったパッドに投入、静置、または出没させることによって実施される。染色工程は長く複雑で、例えば、パパニコロウ染色の手法では、３重染色が行われ、実施機関によって多少の差異があるものの、全工程で２０～２５ステップ程度が必要である。これは、染色だけではなく、染色試薬に合わせて溶媒の置換を行う工程、余分な染色液を洗い流す洗浄工程（分別）、及び色だしを行うために溶液中に浸す工程などが含まれるためである。また、各染色ステップの時間や試薬への出没回数は厳密に定めた状態で実施することが好ましく、細胞小器官などの標的を染め分ける当該分野の染色においては、染色の安定性・再現性を得るためには重要である。このように、当該分野の染色では、大量の患者検体に対して、ムラなく迅速に処理して安定性・再現性のある染色を行わなければならないが、その際に、染色かご及び染色槽を用いることは有用である。染色かごは、塗抹面を傷つけずに複数のスライドガラスを保持できるため、染色槽間の移動や出没といった操作が容易になる。また、染色ムラや脱染ムラが生じないように、塗抹面を迅速に大容量の染色液、分別液（洗浄液）に浸す必要があるが、染色かごごと染色槽による投入、出没するという操作で、このようなムラを回避することができる。このように、染色工程において、何ステップにもわたって、試薬との接触が行なわれるため、湿固定工程と同様に、スライドに塗抹された細胞の剥離が起きてしまうという問題があった。
脱水・透徹
　低濃度のアルコール槽から段階的に純アルコールの槽に移して脱水し、最終的にキシレン槽に浸すことによって実施される。この操作により組織は透明になり、検鏡に適した標本となる。透徹には溶解力の強い溶剤が使用されることから、フィルタ法で主に用いられているポリカーボネート製メンブレン上の細胞をそのまま透徹すると、メンブレンの溶解、白濁が起きるため、メンブレンを観察用基材として用いることはできず、スライドガラスへ捕集した細胞を転写する必要があった。
封入
　塗抹面に封入剤（樹脂が溶剤に溶解したもの）を投入し、カバーガラスとスライドガラスとで、細胞を挟むことで実施される。染色した細胞を封入剤で密封することで、検鏡操作時の塗抹面への物理的な衝撃、顕微鏡照明による劣化、さらに経時的な褪色を防ぎ、長期保存が可能になる。
観察
　光学顕微鏡によって実施される。例えば、パパニコロウ染色では核内クロマチン構造の観察、ＰＡＳ染色では顆粒の色を観察する必要があるため、最低でも２００～４００倍の鮮明な観察像を得る必要がある。
　当該分野におけるこれまでの通常の観察標本の作製は、上記のような工程によって実施される。このような、染色かご、染色槽を用いた染色工程は、人の手によって、あるいは、自動染色装置によって実施される。
　また、当該分野の従来公知の観察標本の作製は、スライドガラスに塗抹されることで実施されてきた。スライドガラスは観察性が良好で、細胞がガラス表面にやや広がった状態で張り付くように分布するため、細胞内部が観察しやすく、また、平らであるため封入操作がしやすいというメリットがある。一方で、その平面的な構造のため、観察標本の作製工程で細胞を保持できず剥離が起きる。また、保湿性に乏しく、乾燥による細胞の変性が起きやすい。さらに、細胞が伸びた形状になるため、がん細胞の特徴である細胞形状や細胞核の立体的な不整を検出しづらいという問題があった。このように、細胞剥離、乾燥、立体性の消失という３つの問題を同時に解決しながら、光学顕微鏡にて細胞小器官を十分に観察できる観察標本の作製方法はこれまで考案されていなかった。
　なお、フィルタを用いて細胞を捕集し、分析や診断用の標本を作製するという方法が、以下に示すように既に考案されているが、前記課題を解決できるものではない。
　特許文献１は、封入時のミスや熟練した技術を省略する方法であって、フィルタの構造・種類について開示するものではない。
　特許文献２～５は、染色槽を用いる観察標本の作製方法を開示するものではない。また、封入工程が実施されておらず、屈折率の整合する封入剤で封入しておらず、曲面状の繊維表面により乱反射が生じるため、光学顕微鏡において細胞小器官が判別できるほどの鮮明な観察像を得ることはできない。実際に、特許文献２の実施例は蛍光観察により特定の細胞表面マーカーをもつ細胞の有無を観察しているだけであり、また、特許文献３の実施例は低倍率の不鮮明な画像から、細胞の外形や染色の有無から細胞数をカウントしているだけであり、このように、繊維上に捕集された細胞を観察する場合において、封入工程を実施しない方法では、当該分野において必要な完成度の観察標本を得ることはできない。
　一方で、細胞を捕集したフィルタを顕微鏡ステージで観察する場合、ろ過装置などからフィルタのみを取り出し、スライドガラスなどの薄い基板上に設置して観察標本を完成させることが好ましい。その理由としては、封入操作を行わなければならないこと、また、高倍率で観察する場合には対物レンズと観察対象の距離が短くなるため、観察標本全体を薄く仕上げる必要があるためである。なお、封入操作は、顕微鏡操作時の細胞固化面への物理的ダメージ、顕微鏡照明によるダメージ、経時的な褪色を防ぐために、グリセリンや流動パラフィンを主成分とするオイル状のもの、または、溶剤に溶解した樹脂からなる封入剤とよばれる試薬で密封することによって実施される。封入時に気泡などが混入すると観察性が低下するため、封入面に気泡が付着、残留しにくいように、平らな２枚のガラス（スライドガラス、カバーガラス）を利用し、そこに細胞を挟み、隙間を封入剤で密封する。
　特許文献４に開示の標本ホルダでは、細胞を捕集できる窓を取り出せることを記載しているが、細胞捕集時の窓の固定方法、取り出し方法、また、その機構については具体的な記載がない。このように、フィルタのみを容易に着脱できないフィルタホルダでは、当該分野において必要な完成度の観察標本を得ることはできない。
　また、特許文献５に開示の濾過モジュールでは、フィルタが細胞捕集時にフィルタ形状を保持するためにフレーム（樹脂製の枠）に接着剤で接着されており、容易に着脱できず、細胞を捕集したフィルタをフレームごとガラスに挟んで封入を行うと、フィルタとフレームの段差部分に気泡が残留しやすくなるだけではなく、封入剤は乾燥とともに体積減少を起こすため、上下のガラス間に隙間生じて気泡が発生し、観察性が悪化してしまう。しかも観察標本自体も厚みのあるものになり、高倍率での検鏡が不可能になる。そのため、フィルタのみをフレームから取り出す必要があるが、その場合、フィルタを切断するなどの煩雑な操作を行わないと取り出せず、この切断操作の際にフィルタが歪んでしまい、フィルタに固着した細胞が剥離する恐れがある。
特開平４－１６５３２１号公報 特開２０１２－７５３８３号公報 特開２００４－２９８１５８号公報 特表平１１－５０７７２４号公報 特表２００８－５３７４８５号公報
　従って、本発明の課題は、フィルタなどの細胞保持基材の着脱が簡便に行える細胞観察標本の作製用の細胞保持基材ホルダー及びキットを提供し、細胞剥離、乾燥、立体性の消失という３つの問題を同時に解決しながら、光学顕微鏡にて細胞小器官を十分に観察できる観察標本の作製方法を提供することにある。
　前記課題は、本発明による、
［１］（１）通水可能な窓部を有する細胞保持基材配置部を有する支持プレート、
（２）通水可能な窓部を有するとともに、前記支持プレートと協働して細胞保持基材配置部に細胞保持基材を挟持固定可能、かつ取り外し可能な挟持用プレート
を含む、観察標本作製用細胞保持基材ホルダー、
［２］支持プレートが細胞保持基材配置部とフレーム部とを有する、［１］の観察標本作製用細胞保持基材ホルダー、
［３］支持プレートが窓部を挟んで両側に窪み（好ましくは貫通口）を有し、挟持用プレートが、前記両窪み（好ましくは貫通口）に嵌着可能な爪を有するカバープレートである、［１］又は［２］の細胞保持基材ホルダー、
［４］挟持用プレートが、支持プレートのフレーム部と当接可能なフランジ部を有するフランジプレートであり、支持プレートのフレーム部とフランジプレートのフランジ部とを挟持固定可能なクリップを更に含む、［２］の細胞保持基材ホルダー、
［５］フランジプレートが、検体を投入可能、かつフランジ部の窓部と連通可能なカップ部を有する、［４］の細胞保持基材ホルダー、
［６］カップ部が分離可能である、［５］の細胞保持基材ホルダー、
［７］カバープレートとフランジプレートとクリップとを含む、［３］～［６］のいずれかの細胞保持基材ホルダー、
［８］支持プレートの窓部に細胞保持基材を支持できる支持部材を有する、［１］～［７］のいずれかの細胞保持基材ホルダー、
［９］支持プレートの形状及び大きさが染色かごに収納可能な長方形である、［１］～［８］のいずれかの細胞保持基材ホルダー、
［１０］支持プレート及び／又は挟持用プレートに、ピンセット先端を挿入可能な窪み（好ましくは貫通口）を有する、［１］～［９］のいずれかの細胞保持基材ホルダー、
［１１］いずれの材料も有機樹脂から構成されている、［１］～［１０］のいずれかの細胞保持基材ホルダー、
［１２］挟持用プレートが、支持プレートに嵌着可能、挟着可能、又は枢着可能なカバープレートである、［１］又は［２］の細胞保持基材ホルダー、
［１３］カバープレートは力を作用させることのできる力点部を有する、［３］、［７］～［１２］のいずれかの細胞保持基材ホルダー、
［１４］支持プレートの細胞保持基材配置部及び／又はカバープレートが通液構造を有する、［３］、［７］～［１３］のいずれかの細胞保持基材ホルダー、
［１５］［１］～［１４］のいずれかの細胞保持基材ホルダーと、細胞保持基材とを含む、観察標本作製用キット、
［１６］細胞保持基材が空隙率９０％以上の無機繊維シートである、［１５］のキット、
［１７］細胞保持基材を細胞保持基材ホルダーに装着した際の形状及び大きさが、染色かごに収納可能な長方形である、［１５］又は［１６］の、観察標本作製用キット、
［１８］無機繊維集合体で細胞を捕集し、そのまま湿固定、染色、及び無機繊維の屈折率と同等の封入剤による封入を実施する、観察標本の作製方法
により解決することができる。
　本発明の［１］の細胞保持基材ホルダーによれば、支持プレートと挟持用プレートで細胞保持基材を挟持固定でき、また、細胞保持基材を支持プレートから容易に取り外せるため、スライドガラス上に細胞保持基材だけを移動させ、安定した封入操作が可能であり、観察標本全体を薄く仕上げることができる。
　本発明の［２］の細胞保持基材ホルダーによれば、支持プレートがフレーム部を有しており、このフレーム部に、挟持用プレートを着脱可能に固定するための嵌め込み用窪み、細胞保持基材を回収する際にピンセットの先端を挿入可能な窪み、挟持用プレートの突出部を収納できる収納窪みなどを設け、様々な機能を付加できる。
　本発明の［３］の細胞保持基材ホルダーによれば、支持プレートへの細胞保持基材の固定をカバープレートの爪により行なえるため、細胞保持基材にせん断力がかからない。そのため、ガラス等の無機の細胞保持基材（例えば、無機繊維シート）を使用しても破損する恐れがないし、細胞保持基材の着脱も容易である。また、カバープレートを有し、支持プレートと協働して細胞保持基材配置部に細胞保持基材を挟持固定した状態のまま、染色かごを利用する染色工程に利用することができるため、作業性に優れている。
　本発明の［４］の細胞保持基材ホルダーによれば、支持プレートへの細胞保持基材の固定をクリップにより行なえるため、細胞保持基材にせん断力がかからない。そのため、ガラス等の無機の細胞保持基材（例えば、無機繊維シート）を使用しても破損する恐れがないし、細胞保持基材の着脱も容易である。
　本発明の［５］の細胞保持基材ホルダーによれば、細胞保持基材をフィルタとして用いた場合、多量の液状検体であっても濾過によって細胞の捕集をすることができる。
　本発明の［６］の細胞保持基材ホルダーによれば、カップ部が分離可能であるため、キットの容積を小さくすることができる。
　本発明の［７］の細胞保持基材ホルダーによれば、支持プレートと協働して細胞保持基材配置部に細胞保持基材を挟持固定した状態のまま、染色かごを利用する染色工程に利用することができるため、作業性に優れているとともに、細胞保持基材にせん断力がかからないため、細胞保持基材を破損することなく、細胞保持基材を脱着できる。
　本発明の［８］の細胞保持基材ホルダーによれば、支持プレートの窓部に細胞保持基材を支持できる支持部材を有するため、細胞濾別、染色等の操作による水圧によって、細胞保持基材が破れにくい。
　本発明の［９］の細胞保持基材ホルダーによれば、支持プレートが染色かごに収納可能であるため、従来からスライドガラス塗抹細胞の染色に用いられている染色かごや自動染色装置への適用が可能である。
　本発明の［１０］の細胞保持基材ホルダーによれば、ピンセットを用いて細胞保持基材の着脱を行うことができるため、作業性がよく、また、ピンセット先で細胞保持基材を傷つける恐れが減少する。
　本発明の［１１］の細胞保持基材ホルダーによれば、有機樹脂から構成されているため、細胞保持基材ホルダー使用後に廃棄しやすい。
　本発明の［１２］の細胞保持基材ホルダーによれば、支持プレートへの細胞保持基材の固定をカバープレートの嵌着、挟着、又は枢着により行なえるため、細胞保持基材にせん断力がかからない。そのため、ガラス等の無機の細胞保持基材（例えば、無機繊維シート）を使用しても破損する恐れがないし、細胞保持基材の着脱も容易である。また、カバープレートと支持プレートが協働して、細胞保持基材配置部に細胞保持基材を挟持固定した状態のまま、染色かごを利用する染色工程に利用することができるため、作業性に優れている。
　本発明の［１３］の細胞保持基材ホルダーによれば、カバープレートは力を作用させることのできる力点部を有し、この力点部に力を作用させることにより、カバープレートと支持プレートによる挟持固定作用を解除することができるため、細胞保持基材を損傷することなく、容易に着脱できる。例えば、力点部が指を引っ掛けることのできる突出部、又は指を挿入できる切欠部であれば、その突出部又は切欠部に力を作用させることにより、カバープレートと支持プレートによる挟持固定作用を解除し、細胞保持基材を損傷することなく、容易に着脱できる。
　本発明の［１４］の細胞保持基材ホルダーによれば、細胞保持基材配置部及び／又はカバープレートが通液構造を有するため、染色時に発生しやすい、細胞保持基材のカバープレートと細胞保持基材配置部によって挟持固定されている部分の残留染色液の洗浄除去を促すことができる。そのため、残留染色液が拡散して染色斑を生じにくいため、顕微鏡での観察性に優れている。
　本発明の［１５］のキットによれば、支持プレートと挟持用プレートで細胞保持基材を挟持固定でき、また、細胞保持基材を支持プレートから容易に取り外せるため、スライドガラス上に細胞保持基材だけを移動させ、安定した封入操作が可能であり、観察標本全体を薄く仕上げることができる。また、細胞保持基材が多孔シートからなる場合、高額な機器、特殊な手技を必要とせず、重力による細胞濾別というワンステップで浮遊細胞の濃縮、細胞保持基材上への擬似的な固化をして、細胞観察標本を作製することができる。
　本発明の［１６］のキットによれば、細胞保持基材が無機繊維シートからなり、細胞を細胞保持基材の内部空隙に固定することができるため、接着状態の細胞と同様に、試薬に浸すといった操作が可能である。また、空隙率が９０％以上であるため、細胞を細胞保持基材の内部空隙に固定しやすいばかりでなく、通水性に優れている。
　本発明の［１７］のキットによれば、細胞保持基材を細胞保持基材ホルダーに装着した状態で染色かごに収納可能であるため、従来からスライドガラス塗抹細胞の染色に用いられている染色かごや自動染色装置に適用して、操作性良く、細胞を染色することができる。
　本発明の［１８］の観察標本の作製方法によれば、剛性に優れた無機繊維集合体の内部空隙に、安定して細胞が保持されるため、細胞の剥離及び立体性の消失を防止できる。また、重層性を有する細胞塊の保持にも有用である。
　また、無機繊維は親水性で、無機繊維集合体はある程度の保水力を有するため、数分間に及んで放置しても細胞が乾燥せず、安定した湿固定が可能になる。そのため、大量検体の同時作製や機器への適用に有用である。
　更に、細胞の立体性が保持されるため、細胞や核の立体的な不整、重層性を有する細胞塊の観察にも有用である。
　更に、無機繊維集合体は細胞診に使用する試薬に含まれる溶剤（エタノール、メタノール、キシレン）に対して耐薬性を示すため、細胞捕集後、そのまま観察用基材として用い、封入することができることから、メンブレンフィルタを用いた従来のフィルタ法で行われている転写操作が不要である。そのため、転写の圧力による細胞形状の変性の心配がなく、また、その際に発生する細胞のロスが起きない。また、繊維と屈折率が整合する封入剤で封入を行うため、曲面状の繊維表面により生じる乱反射を抑え、光学顕微鏡においても細胞小器官が判別できるほどの鮮明な観察像を得ることができる。
本発明のフィルタキットの一形態を模式的に示す斜視図である。 図１に示す本発明のフィルタキットに含まれる本発明のフィルタホルダー（支持プレート及びカバープレート）の一形態の使用前の状態（フィルタを保持する前の状態）を示す、図面に代わる写真である。 図２に示す支持プレート及びカバープレートでフィルタを挟み込むことにより、フィルタを保持した状態を示す、図面に代わる写真である。 本発明のフィルタキットの別の一態様に含まれるフランジプレート（フランジ部とカップ部とが一体化）とパッキンを組み立てた状態を示す、図面に代わる写真である。 図１に示す本発明のフィルタキット（但し、フランジプレートとして、図４に示すものを使用）を組み立てた状態を示す、図面に代わる写真である。 本発明のフィルタキット（支持プレート、カバープレート及びフィルタ）の別形態の使用前の状態（フィルタを保持する前の状態）を示す、図面に代わる写真である。 実施例１の観察標本を光学顕微鏡（倍率：１００倍）で観察することにより得られた細胞像を示す顕微鏡写真である。 実施例１の観察標本を光学顕微鏡（倍率：４００倍）で観察することにより得られた細胞像を示す顕微鏡写真である。 実施例２の観察標本を光学顕微鏡（倍率：１００倍）で観察することにより得られた細胞像を示す顕微鏡写真である。 実施例２の観察標本を光学顕微鏡（倍率：４００倍）で観察することにより得られた細胞像を示す顕微鏡写真である。 比較例１の観察標本を光学顕微鏡（倍率：１００倍）で観察することにより得られた細胞像を示す顕微鏡写真である。 比較例１の観察標本を光学顕微鏡（倍率：４００倍）で観察することにより得られた細胞像を示す顕微鏡写真である。 比較例２の観察標本を光学顕微鏡（倍率：１００倍）で観察することにより得られた細胞像を示す顕微鏡写真である。 比較例２の観察標本を光学顕微鏡（倍率：４００倍）で観察することにより得られた細胞像を示す顕微鏡写真である。
　以下、図面を参照して、本発明の観察標本作製用細胞保持基材ホルダーの１つである、細胞保持基材がフィルタの作用を奏する場合の浮遊細胞用観察標本作製用フィルタホルダー（以下、本発明のフィルタホルダーと称することがある）、及び、それを含む本発明の観察標本作製用キットの１つであるフィルタキット（以下、本発明キットと称することがある）について説明し、続いて、本発明の観察標本の作製方法について説明する。
　本発明のフィルタキットは、細胞を捕集するためのフィルタと、本発明のフィルタホルダーとを含む。以下、本発明キットについて説明するが、本発明キットがフィルタを含むこと以外は、当該説明は、そのまま、本発明のフィルタホルダーに適用できる。
　図１に示す本発明キット１０の一態様は、支持プレート１；カバープレート２；フランジプレート３を構成することのできるフランジ部３１とカップ部３２；２個のクリップ４ａ、４ｂ；パッキン５；フィルタ９からなる。
　支持プレート１は、通水可能な窓部１１を有するフィルタ配置部１２を有し、更にフレーム部１３を有することができる。窓部１１には、フィルタ９を支持できる支持部材１４を設けることができる。図１に示す窓部１１には、Ｘ字状の支持部材１４が設けられているが、本発明キットにおいては、Ｘ字状以外に、例えば、＊字状、三角形状、Ｉ字状、Ｙ字状、二の字状、格子状、網目状などの支持部材を設けることができる。
　フレーム部１３には、窓部１１を挟んだ両側に、カバープレート２を着脱可能に固定するための嵌め込み用窪み１５ａ、１５ｂ；支持プレート１に対して所定の位置にフランジ部３１を配置するための接続用穴１６；フィルタ９を回収する際に、ピンセットの先端を挿入可能な窪み１７、後述のカバープレート２の突出部２４を収納できる収納窪み１８、などを設けることができる。なお、図１では、ピンセットの先端を挿入可能な窪み１７が、収納窪み１８を兼ねている。前記嵌め込み用窪み１５ａ、１５ｂ、窪み１７、又は収納窪み１８は、図１に示すように、貫通口であることが好ましい。また、ピンセットの先端を挿入可能な前記窪み１７は、挟持用プレート、例えば、カバープレート２、フランジプレート３に設けることもできる。
　なお、ピンセットの先端を挿入可能な窪み１７はフィルタ９を取り出すことができるように、フィルタ配置部１２に隣接して設けるのが好ましい。このように、ピンセットの先端を挿入可能な前記窪み１７を支持プレート１と挟持用プレートのいずれにも設けられていると、挟持用プレートを取り外した際に、フィルタ９が支持プレート１と挟持用プレートのいずれに貼り付いていても、フィルタ９を損傷することなく、取り出すことができる。また、収納窪み１８にカバープレート２の突出部２４を収納でき、フィルタホルダーに突起が形成されないため、従来通り、染色かごに収納して使用しやすい。
　なお、図１において、フィルタ配置部１２はフィルタ９と同じ長方形状で、ほぼ同じ面積の外形からなる凹部から構成されている。そのため、フィルタ配置部１２にフィルタ９を密着して収納することができ、フィルタ９のズレを防止することができる。また、図６において、フィルタ配置部はフィルタと同じ真円形状で、ほぼ同じ面積の外形からなる凹部から構成されている。そのため、フィルタ配置部にフィルタを密着して収納することができ、フィルタのズレを防止することができる。このように、フィルタ配置部はフィルタと同じ形状、かつほぼ同じ面積の外形からなる凹部から構成されているのが好ましい。
　しかしながら、フィルタ配置部はフィルタのズレが生じない程度に、フィルタと形状が異なる、又はフィルタよりも面積の広い凹部であることもできる。この場合、フィルタ配フィルタ配置部とフィルタとの間に空間的な余裕が生じ、フィルタ配置部とフィルタとの間にピンセットを介在させることができるため、フィルタを損傷することなく、フィルタをフィルタ配置部に設置しやすく、また、フィルタ設置部からフィルタを取り外しやすい。例えば、真円形状のフィルタの場合、フィルタ配置部は、フィルタの直径と同じかそれよりも長い縦方向長さと横方向長さを有する長方形状の凹部から構成されていることができ、フィルタ配置部とフィルタとの間に形成される空間にピンセットを介在させることができるため、フィルタを損傷することなく、フィルタを着脱できる。
　なお、フィルタ配置部がフィルタと形状が異なる、又はフィルタよりも面積の広い凹部であることによって、フィルタにズレが生じる恐れがある場合には、フィルタの外縁と部分的に接触して、フィルタのズレを防止することができるように、フィルタ配置部はフィルタの外縁と接触できる位置に凸部を有するのが好ましい。
　更に、図６に示すように、フィルタ配置部１２は通液構造として、貫通孔１９を有するのが好ましい。このように貫通孔を有することによって、この貫通孔を介して通液性が向上し、染色工程後の洗浄工程において、洗浄液がフィルタ９に到達し、洗浄した後に排液しやすいため、残存する染色液を洗浄除去しやすいためである。つまり、フィルタのカバープレート２とフィルタ配置部１２によって挟持されている部分に染色液が残存していると、染色液が拡散して染色斑を生じ、顕微鏡での観察性が低下してしまうが、前記通液構造（貫通孔１９）を有することによって、残存する染色液を洗浄除去しやすいため、顕微鏡での観察性に優れるという効果を奏する。
　また、図６における通液構造は貫通孔１９であるが、貫通孔である必要はなく、フィルタと接する面に設けられた、フィルタ配置部１２の外縁（嵌め込み用窪み１５ａ、１５ｂ、窪み１７を含む）に通じる溝であっても良い。通液構造が溝である場合も、この溝を介して通液性が向上するため、貫通孔の場合と同様の作用を奏し、顕微鏡での観察性に優れるという効果を奏する。
　なお、後述のように、フランジプレート３の窓部３５と、支持プレート１の窓部１１（カバープレート２を用いる場合には、カバープレート２の窓部２１）との間に、液漏れを防ぐことのできるパッキン５を設ける場合、前記通液構造（貫通孔１９、溝など）は、細胞濾別時に、浮遊状態の細胞が漏出することがないように、パッキン５が接している位置よりも外側に位置しているのが好ましい。
　カバープレート２は、通水可能な窓部２１を有し、窓部２１には、フィルタ９を支持できる支持部材２２を設けることができる。支持部材２２の形状としては、例えば、Ｘ字状、＊字状、三角形状、Ｉ字状、Ｙ字状、二の字状、格子状、網目状などを挙げることができる。なお、カバープレート２の支持部材２２は、支持プレート１の支持部材１４と同形状である必要はない。
　また、カバープレート２には、支持プレート１の両嵌め込み用窪み１５ａ、１５ｂに嵌着可能な嵌め込み用爪２３ａ、２３ｂを設けることができる。カバープレート２は、図３に示すように、支持プレート１と協働して、支持プレート１のフィルタ配置部１２にフィルタ９を挟持固定することができる。すなわち、支持プレート１のフィルタ配置部１２上にフィルタ９を配置した後、カバープレート２の嵌め込み用爪２３ａ、２３ｂを前記嵌め込み用窪み１５ａ、１５ｂと嵌着させ、支持プレート１とカバープレート２とで挟持することにより、フィルタ９を固定することができる。そのため、フィルタにせん断力がかからず、ガラス等の無機フィルタ（例えば、無機繊維シート）を使用しても破損する恐れがない。
　更に、図１におけるカバープレート２は指を引っ掛けることのできる突出部２４を有するため、突出部２４に指を掛け、上方向へ引っ張ることによって、カバープレート２を支持プレート１から容易に取り外すことができ、フィルタ９を損傷することなく取り出すことができる。特に、図１においては、カバープレート２は指を引っ掛けることのできる突出部２４を有するとともに、カバープレート２における一方の嵌め込み用爪（図１においては、２３ａ）の長さは、他方の嵌め込み用爪（図１においては、２３ｂ）よりも短く、一方の嵌め込み用爪２３ａの前記嵌め込み用窪み１５ａとの嵌着状態が浅いため、前記突出部２４に指を掛け、上方向へ引っ張ることによって、カバープレート２を容易に取り外すことができ、フィルタ９を損傷することなく取り出すことができる。
　更に、カバープレート２の突出部２４は支持プレート１の収納窪み１８よりも小さく、カバープレート２を支持プレート１に装着した状態において、突出部２４と収納窪み１８との間に隙間が生じるため、この隙間に指を挿入し、突出部２４に指を掛けて、上方向へ引っ張り、カバープレート２を支持プレート１から容易に取り外すことができ、フィルタ９を損傷することなく取り出すことができる。
　この図１におけるカバープレート２における突出部２４は、カバープレート２の面方向において突出した力点部であるが、突出部はカバープレート２の面方向ではなく、厚さ方向に突出していても良い。このような厚さ方向に突出した力点部である場合には、力点部を指で摘まんで引張ることにより、カバープレート２と支持プレート１による挟持から開放し、フィルタ９を損傷することなく取り出すことができる。
　また、図１は、カバープレート２の力点部が指を引っ掛けることのできる突出部２４である態様であるが、突出部２４に替えて、カバープレート２は指を挿入できる切欠部からなる力点部を有する態様であっても良い。切欠部を有する場合、この切欠部に指を挿入し、カバープレート２に指を掛けて、上方向へ引っ張ることによりカバープレート２と支持プレート１による挟持から開放し、フィルタ９を損傷することなく取り出すことができる。なお、この切欠部はカバープレート２の外縁から窓部２１方向に向かって延びているのが好ましい。また、切欠部はカバープレートの厚さ方向において、完全に切り欠かれていても良い（つまり、貫通口）し、部分的に切り欠かれていても良い（つまり、窪み）。
　なお、カバープレート２の支持部材２２は、後の染色工程の際に生じるフィルタ面両方向からの水圧に対してフィルタ９を支持しながらも、フィルタ９にかかる負荷を分散することができるように、支持プレート１の支持部材１４と重ならないように配置しているのが好ましい。
　更に、図１、図２に示すように、カバープレート２はピンセットの先端を挿入可能な窪み２７を、嵌め込み用爪２３ｂ間であり、窓部２１に近接して有しているため、カバープレート２を支持プレート１から取り外した際に、フィルタ９がカバープレート２に貼り付いたとしても、損傷することなく、フィルタ９を取り出すことができる。
　なお、図１、図６において、カバープレート２の外形は支持プレート１のフィルタ配置部１２の外形に相当し、カバープレート２はフィルタ配置部１２に収納できる状態にある。そのため、フィルタ配置部１２とカバープレート２によって、フィルタ９を挟持して固定し、フィルタ９のズレを防止することができる。このように、カバープレート２の外形はフィルタ配置部の外形に相当し、カバープレート２はフィルタ配置部１２に収納できるのが好ましい。
　また、前述の通り、フィルタ配置部１２が凸部を有する場合、カバープレート２は対応する位置が凹部となっており、前記凸部を収納できるのが好ましい。このように収納できることによって、カバープレート２装着時におけるフィルタ配置部１２の厚さをフレーム部１３と同程度とすることができるため、従来通り、染色かごに収納して使用しやすいためである。
　更に、図６に示すように、カバープレート２も通液構造として、貫通孔２９を有しているのが好ましい。支持プレート１のフィルタ配置部１２が貫通孔を有する場合と同様に作用し、顕微鏡での観察性に優れるという効果を奏するためである。
　更に、図６におけるカバープレート２の通液構造は貫通孔２９であるが、貫通孔である必要はなく、フィルタと接する面に設けられた、カバープレート外縁部に通じる溝であっても良い。このような溝である場合も、この溝を介して通液性が向上するため、貫通孔の場合と同様の作用を奏し、顕微鏡での観察性に優れるという効果を奏する。
　また、支持プレート１のフィルタ配置部１２に通液構造を有する場合と同様に、後述のように、フランジプレート３の窓部３５とカバープレート３の窓部２１との間に、液漏れを防ぐことのできるパッキン５を設ける場合、前記通液構造（貫通孔２９、溝など）は、細胞濾別時に、浮遊状態の細胞が漏出することがないように、パッキン５が接している位置よりも外側に有するのが好ましい。
　なお、支持プレート１のフィルタ配置部における通液構造とカバープレート２における通液構造は同じであっても良いし、異なっていても良い。例えば、通液構造の形状、大きさ、位置、貫通孔か溝か、などは同じであっても良いし、異なっていても良い。しかしながら、図６のように、支持プレート１のフィルタ配置部における通液構造とカバープレート２における通液構造とを対向する位置に有するのが好ましい。このように対向する位置に有することによって、洗浄液がフィルタに到達し、洗浄した後に排液しやすいため、染色液が残存するのを防止しやすく、顕微鏡での観察性に優れているためである。また、支持プレート１のフィルタ配置部のみ、又はカバープレート２のみに通液構造を有していても良いが、両方に通液構造を有する方が前述の作用効果に優れている。
　図１におけるフィルタホルダーは、支持プレート１は窓部１１を挟み、長手方向において対向して、両嵌め込み用窪み１５ａ、１５ｂを有し、カバープレート２の嵌め込み用爪２３ａ、２３ｂを嵌着することによって、フィルタ９を挟持固定できるものであるが、嵌着位置は支持プレート１の窓部１１を挟み、長手方向において対向している必要はない。例えば、支持プレート１の窓部１１を挟んだ短手方向において対向していても良いし、窓部１１の中心を基準として、隣接する嵌着位置の成す角度が６０°、７２°、９０°、１２０°など、一定角度で配置していても良い。
　また、図１においては、支持プレート１が嵌着に関与する嵌め込み用窪みを４箇所有するとともに、それに対応して、カバープレートが嵌め込み用爪を４つ有する態様であるが、４箇所である必要はなく、２箇所以上で嵌着できれば良い。安定してフィルタ９を挟持固定できるように、３～６箇所で嵌着できるのが好ましい。
　更に、図１におけるフィルタホルダーは、カバープレート２の嵌め込み用爪２３ａ、２３ｂを、支持プレート１の両嵌め込み用窪み１５ａ、１５ｂに嵌着することによって、フィルタ９を挟持固定できるものであるが、嵌着によってカバープレート２を支持プレート１に装着し、フィルタ９を挟持固定できる態様である必要はない。例えば、通水可能な窓部を有するカバープレートと、通水可能な窓部を有するフィルタ配置部を有する支持プレートからなり、カバープレートをフィルタ配置部に配置するとともに、後述と同様の支持プレートとカバープレートとを挟持できる薄肉クリップによって挟着できる態様であっても良い。或いは、通水可能な窓部を有するとともに、一方の端部に枢着軸を有し、他方の端部に凸部（突起など）又は凹部（貫通孔、窪みなど）を有するカバープレートと、通水可能な窓部を有するフィルタ配置部を有するとともに、フィルタ配置部の一方の端部に軸受を有し、他方の端部に凹部（貫通孔、窪みなど）又は凸部（突起など）を有する支持プレートからなり、一方の端部で、カバープレートの枢着軸を支持プレートの軸受に挿入して枢着できるとともに、他方の端部で、凸部と凹部とを嵌着できる態様であっても良い。これらの態様であっても、フィルタ９にせん弾力が作用しないため、フィルタを損傷することなく着脱できる。
　なお、支持プレート１に対して、挟着可能なカバープレート又は枢着可能なカバープレートを有する場合であっても、フィルタを損傷することなく取り出しやすいように、カバープレートは指を引っ掛けることのできる突出部、指で摘まむことのできる突出部、指を挿入できる切欠部などの力点部を有するのが好ましい。
　支持プレート１の形状及び大きさは、従来公知の染色かご及び染色槽が使用できるように、染色かごに収納可能な長方形であるのが好ましい。つまり、従来公知の観察標本作製用スライドガラスに準ずる形状及び大きさであることが好ましく、より具体的には、縦７６ｍｍ程度、横２６ｍｍ程度、厚さ１ｍｍ程度であるのが好ましい。また、カバープレートは従来公知の染色かご及び染色槽が使用できるように、支持プレートからはみ出ない形状及び大きさであるのが好ましい。
　フランジプレート３は、フランジ部３１と、検体を投入可能、かつフランジ部３１の窓部３５と連通可能なカップ部３２とからなり、図１に示すように、フランジ部３１とカップ部３２とが分離可能となるように設計することもできるし、図４に示すように、一体成形とすることもできる。
　図１に示すフランジ部３１は、通水可能な窓部３５を中央部に有し、且つ支持プレート１のフレーム部１３と当接可能なフランジ３３と、カップ部３２の内部とフランジ部３１の前記窓部３５とを連通可能に連結することができる連結部３４とからなる。フランジ３３には、支持プレート１に対して所定の位置にフランジ部３１を配置するため、支持プレート１の接続用穴１６に対応する位置に、接続用突起３６を設けることができる。
　本発明キット１０は、フィルタ９をフィルタ配置部１２に保持した状態の支持プレート１（好ましくは、フィルタ９をカバープレート２で固定した状態の支持プレート１）と、フランジプレート３とを、図５に示すように、支持プレート１のフレーム部１３と、フランジプレート３のフランジ部３１のフランジ３３とを、断面コ字状のクリップ４ａ，４ｂをスライドさせることにより挟持固定できるため、支持プレート１とフランジプレート３が協働して、フィルタ９を損傷することなく、フィルタ配置部１２に挟持固定することができる。また、クリップ４ａ，４ｂをスライドさせることによりフィルタ９の挟持固定状態を解除し、フランジプレート３を取り外すことができるため、フィルタ９を損傷することなく、取り出すことができる。この際、フランジプレート３の窓部３５と、支持プレート１の窓部１１（カバープレート３を用いる場合には、カバープレート３の窓部２１）との間に、液漏れを防ぐことのできるパッキン５を設けると、細胞濾別時に、浮遊状態の細胞の漏出を防止しやすい。なお、クリップ４ａ，４ｂとして、図５とは異なり、バネで付勢できるクリップであっても、フィルタ９を損傷することなく挟持固定することができ、また、フィルタ９を損傷することなく取り出すことができる。また、フランジプレート３は図５のようにクリップによって挟着できる態様の他に、フランジプレートと支持プレートとが嵌着又は枢着できる態様であっても良い。
　なお、図１、図５のキット１０のフランジプレート３はカップ部３２を有するため、細胞を含む液状検体をカップ部３２に、大量に投入して固化工程を実施することができるが、ピペットで液状検体を投入する場合のように、少量の液状検体を用いて固化工程を実施する場合には、カップ部３２のないフランジプレート３を使用することもできる。この場合、フランジプレート３の連結部３４がカップ部３２と同様の作用を奏することができる。つまり、連結部３４が液状検体の横漏れを生じることなく、液状検体を一時的に貯留し、フランジプレート３の窓部３５に液状検体を供給し、細胞を固化することができる。
　また、図１に示すフランジプレート３は、フランジ３３と連結部３４とを有するフランジ部３１と、カップ部３２とを有するものであるが、フランジプレート３はフランジ３３のみから構成されていても良い。つまり、連結部３４とカップ部３２がなくても良い。この場合、フランジプレート３が液状検体を一時的に貯留できる充分な厚さを有していれば、窓部３５が液状検体の横漏れを生じることなく、液状検体を一時的に貯留しながら液状検体を濾過し、細胞を固化することができる。
　なお、本発明キットは、挟持用プレートとして、図１に示すように、カバープレート２とフランジプレート３の両方を含むこともできるし、あるいは、いずれか一方のみを含むこともできる。カバープレート２とフランジプレート３の両方を同時に使用する場合には、カバープレート２が主として、フランジプレート３が補助的に、挟持用プレートとして機能する。カバープレート２又はフランジプレート３のいずれか一方のみを使用する場合には、いずれのプレートの場合も、挟持用プレートとして機能する。なお、挟持用プレートとしてフランジプレート３のみを使用する場合には、フランジプレート３のフランジ部３１の窓部３５に、カバープレート２と同様のフィルタを支持できる支持部材を設けることが好ましい。
　また、フランジプレート３のみを使用する場合には、カバープレート２と同様に、ピンセットの先端を挿入可能な窪みを、支持プレート１のフィルタ配置部１２に相当する箇所に隣接して有していると、フランジプレート３を支持プレート１から取り外した際に、フィルタ９がフランジプレート３に貼り付いていても、フィルタ９を損傷することなく、取り出すことができる。更に、前述の通り、フィルタ配置部１２が凸部を有する場合、カバープレート２と同様に、フランジプレート３は対応する位置が凹部となっており、前記凸部を収納できる状態にあるのが好ましい。
　図１のフィルタホルダーにおける支持プレート１はフィルタ配置部１２とフレーム部１３とを有し、このフレーム部は、挟持用プレート（カバープレート２、フランジプレート３）を着脱可能に固定するための嵌め込み用窪み１５ａ、１５ｂ、フィルタ９を回収する際にピンセットの先端を挿入可能な窪み１７、２７、挟持用プレート（カバープレート２、フランジプレート３）の突出部２４を収納できる収納窪み１８を有し、また、フランジプレート３を挟持固定する際の、クリップ４ａ，４ｂによる挟持固定部位としても利用できるため、フィルタ９の挟持固定性、着脱性、及び／又は染色性に優れるものであるが、支持プレート１はフレーム部を有している必要はない。例えば、フィルタ配置部１２に嵌着可能、挟着可能、又は枢着可能な挟持用プレート（カバープレート２、フランジプレート３）を使用する場合、フィルタ配置部１２からフィルタ９がはみ出る場合、挟持用プレート（カバープレート２、フランジプレート３）が力点部として切欠部を有する場合、及び／又はフランジプレート３を使用しないような場合、支持プレート１はフレーム部を有している必要はない。
　本発明キットに含まれるフィルタ９は、濾過操作により細胞を捕集することができ、その後の染色工程、封入工程等を実施することができれば、特に限定されるものではないが、例えば、無機繊維シートは細胞をフィルタの内部空隙に固定することができ、試薬に浸すといった操作が可能であるため好適である。特に、空隙率が９０％以上の無機繊維シートは細胞をフィルタの内部空隙に固定しやすいばかりでなく、通水性に優れているため好適である。このような空隙率が９０％以上の無機繊維シートとして、例えば、特開２０１０－１８５１６４号公報に記載の無機系繊維不織布を用いることができる。
　無機系繊維不織布の構成繊維の材料としては、例えば、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、Ｂ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＺｒＯ２、ＣｅＯ２、ＦｅＯ、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＶＯ２、Ｖ２Ｏ５、ＳｎＯ２、ＣｄＯ、ＬｉＯ２、ＷＯ３、Ｎｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５、Ｉｎ２Ｏ３、ＧｅＯ２、ＰｂＴｉ４Ｏ９、ＬｉＮｂＯ３、 ＢａＴｉＯ３、ＰｂＺｒＯ３、ＫＴａＯ３、Ｌｉ２Ｂ４Ｏ７、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＳｒＴｉＯ３などを挙げることができ、これらの一成分の酸化物から構成されていても、二成分以上の酸化物から構成されていても良い。例えば、ＳｉＯ２－Ａｌ２Ｏ３の二成分から構成することができる。
　無機系繊維不織布の空隙率は９１％以上であるのが好ましく、より好ましくは９２％以上、更に好ましくは９３％以上、更に好ましくは９４％以上である。一方で、空隙率の上限は特に限定するものではないが、形態安定性に優れるように、９９．９％以下であるのが好ましい。
　また、無機系繊維不織布は細胞濾別、染色等の段階による水圧によって破損しにくく、取り扱い性に優れているように、引張破断強度が０．２ＭＰａ以上であるのが好ましく、より好ましくは０．３ＭＰａ以上であり、更に好ましくは０．４ＭＰａ以上であり、更に好ましくは０．５ＭＰａ以上であり、更に好ましくは０．５５ＭＰａ以上である。この引張破断強度は切断荷重を無機系繊維不織布の断面積で除した商である。なお、切断荷重は次の条件で測定した値であり、断面積は測定時の試験片の幅と厚さの積から得られる値である。
　製品名：小型引張試験機
　型式：ＴＳＭ－０１－ｃｒｅ　サーチ株式会社製
　試験サイズ：５ｍｍ幅×４０ｍｍ長
　チャック間間隔：２０ｍｍ
　引張速度：２０ｍｍ／ｍｉｎ．
　初荷重：５０ｍｇ／１ｄ
　無機系繊維不織布を構成する繊維の平均繊維径は、特に限定するものではないが、繊維が細胞を保持しやすい大きさの孔を形成しやすいように、３μｍ以下であるのが好ましく、２μｍ以下であるのがより好ましく、１μｍ以下であるのが更に好ましく、０．８μｍ以下であるのが更に好ましい。なお、平均繊維径の下限は特に限定するものではないが、０．０１μｍ以上であるのが好ましい。本発明における「平均繊維径」は５０点における繊維径の算術平均値をいい、「繊維径」は１０本以上の繊維が写る視野で無機系繊維不織布を撮影した電子顕微鏡写真をもとに測定した繊維の太さをいう。
　無機系繊維不織布の平均目付は、特に限定するものではないが、必要以上に目付けが高いと細胞捕集工程や染色工程において水抜け性が悪くなり、捕集に時間が掛かったり、染色ムラの原因となりやすいため、２０ｇ／ｍ２以下であるのが好ましく、１５ｇ／ｍ２以下であるのがより好ましく、１０ｇ／ｍ２以下であるのが更に好ましい。なお、平均目付の下限は特に限定するものではないが、１ｇ／ｍ２以上であるのが好ましい。本発明における「平均目付」は、１８個の試料（無機系繊維不織布）の目付の算術平均値をいい、「目付」は、最も面積の広い面の面積及び質量を測定し、この面積と質量から、面積１ｍ２当たりの質量に換算した値をいう。
　無機系繊維不織布の平均厚さは、特に限定するものではないが、必要以上に厚いと、封入剤の乾燥に伴う体積減少により、観察標本内に気泡が生じる可能性が高まることから、４００μｍ以下であるのが好ましく、３００μｍ以下であるのがより好ましく、２００μｍ以下であるのが更に好ましい。なお、平均厚さの下限は特に限定するものではないが、２０μｍ以上であるのが好ましい。本発明における「平均厚さ」は、試料（無機系繊維不織布）の厚さの５４箇所における算術平均値をいい、「厚さ」は、最も面積の広い面と面の長さを、マイクロメーター法［荷重：０．５Ｎ（測定面積：直径１４．３ｍｍ）］で測定した値をいう。
　無機系繊維不織布の平均孔径は、特に限定するものではないが、直径約２０μｍ前後の一般的な細胞を保持しやすいように、２～４０μｍであるのが好ましく、４～２０μｍであるのがより好ましく、６～１０μｍであるのが更に好ましい。なお、平均孔径は、ＡＳＴＭ－Ｆ３１６に規定されている方法により得られる平均流量孔径の値をいい、例えば、ポロメータ［Ｐｏｌｏｍｅｔｅｒ、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）社製］を用いて、ミーンフローポイント法により測定することができる。
　無機系繊維不織布の構成繊維は連続繊維であるのが好ましい。これは、構成繊維が短繊維であると、染色工程中などに無機系繊維不織布が歪んだり、無機系繊維不織布の孔内に保持された細胞が移動した場合に、無機系繊維の端部が細胞を傷つける恐れがあるが、連続繊維であると、このような恐れがないためである。なお、「連続繊維」とは、無機系繊維不織布の５，０００倍の電子顕微鏡写真を撮影した場合に、構成繊維の端部を確認できないことを意味する。
　無機系繊維不織布は無機系接着剤で接着されているのが好ましい。形態安定性に優れ、細胞を保持するための孔を維持しやすく、また、各工程においてフィルタが破損するのを防ぐ効果があるためである。特に、無機系繊維不織布の内部を含む全体において、繊維同士間に被膜を形成することなく接着剤で接着していると、細胞捕集工程や染色工程において水抜け性が良く、濾過時間の短縮や染色ムラを抑制できるため好適である。
　本発明方法で用いることのできる無機系繊維不織布は、公知の静電紡糸法、好ましくは、ゾルゲル法と中和紡糸法とを組み合わせた静電紡糸法、例えば、特開２０１０－１８５１６４号公報に記載の製造方法により製造することができる。特開２０１０－１８５１６４号公報に記載の製造方法は、
（１）無機成分を主体とする化合物を含む紡糸用無機系ゾル溶液から、静電紡糸法により無機系ゲル状繊維を紡糸する工程、
（２）前記無機系ゲル状繊維とは反対極性のイオンを照射し、集積させ、ゲル状繊維ウエブを形成する工程、
（３）前記ゲル状繊維ウエブを焼成して無機系繊維ウエブを形成する工程、
（４）前記無機系繊維ウエブの内部を含む全体に、無機成分を主体とする化合物を含む接着用無機系ゾル溶液を付与し、余剰の接着用無機系ゾル溶液を通気により除去し、接着用無機系ゾル溶液含有無機系繊維ウエブを形成する工程、
（５）前記接着用無機系ゾル溶液含有無機系繊維ウエブを熱処理し、内部を含む全体において、無機系接着剤で接着した無機系繊維不織布を形成する工程
を含む。
　本発明のフィルタ９の形状は特に限定するものではなく、例えば、図１に示すように、四角形などの角型形状、図６に示すような、真円などの丸型形状であることができる。
　本発明キットに含まれるフィルタ以外の部材の材料、つまり、支持プレート１、カバープレート２、フランジプレート３、クリップ４ａ、４ｂ、パッキン５としては、浮遊細胞を捕集できる限り、特に限定されるものではないが、例えば、有機樹脂（例えば、ポリアミド、ポリブチレンフタレート、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンフタレート、アクリル、ポリアセタール、ポリプロピレン、ポリフェニレンオキサイド、ポリフェニレンサルファイド、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、クロロトリフルオロエチレン、フッ化ビニリデン、ペルフルオロアルコキシフッ素樹脂など）を挙げることができ、キット使用後の廃棄性の点から、フィルタ以外の部材の材料はいずれも有機樹脂から構成されているのが好ましい。
　本発明キットは、図５に示すように、組み立てた後、観察標本を作製しようとする浮遊細胞分散液をカップ部３２に投入し、重力により、あるいは、所望により吸引により濾過することにより、フィルタ９に細胞を捕集することができる。細胞を捕集したフィルタ９は、例えば、支持プレート１とカバープレート２との間に固定した状態のままで、染色かご及び染色槽を使用する細胞固定工程や染色工程に進むことができ、染色後、支持プレート１からフィルタ９を外して、スライドガラス上に移動させ、封入工程に進むことができる。このように、細胞保持基材を細胞保持基材ホルダーに装着した際の形状及び大きさが、染色かごに収納可能な長方形であると、細胞保持基材を細胞保持基材ホルダーに装着した状態で染色かごに収納可能であるため、染色かご及び染色槽を使用する細胞固定工程や染色工程を実施して、作業性良く、細胞を染色することができる。
　以上は、本発明の観察標本作製用細胞保持基材ホルダーの１つである、浮遊細胞用観察標本作製用フィルタホルダー、及び、それを含む本発明の観察標本作製用キットの１つであるフィルタキットの説明、つまり、細胞保持基材がフィルタとしての作用を奏する場合の説明であるが、本発明の観察標本作製用細胞保持基材ホルダー、及び観察標本作製用キットは、細胞保持基材がフィルタとして作用しない場合、例えば、細胞培養基材または細胞吸着基材である場合であっても使用することができる。例えば、細胞保持基材への細胞の固化工程を、上述のような本発明のフィルタホルダーを使用することなく、細胞培養基材または細胞吸着基材のような細胞保持基材を用いて行なった後に、細胞を保持した細胞保持基材を支持プレートと挟持用プレート（特にはカバープレート）とで挟持した状態で、染色かごや染色槽を使用する細胞固定工程や染色工程へと進むことができる。この場合、細胞保持基材は顕微鏡で行う観察標本に適した厚さを有するものを使用することができ、例えば、ガラス基板、メンブレン、又は無機繊維シートなどを使用することができる。なお、細胞保持基材に細胞を固化する固化工程は、例えば、接着性細胞を細胞培養基材上で培養して接着させる工程；上述のフィルタとして使用する無機繊維シートのような、多孔質状の細胞吸着基材を培養容器底面に配置した後、細胞分散液を注いで静置することにより細胞を自然沈降させて吸着させる工程；又は細胞表面と細胞吸着基材の電荷を利用して静電的に吸着させる工程、により実施することができる。
　本発明の観察標本作製用細胞保持基材ホルダー及び観察標本作製用キットは、本発明の観察標本の作製方法に用いることができる。
　本発明の観察標本の作製方法（以下、本発明方法と称することがある）は、無機繊維集合体を用いる細胞捕集工程、湿固定工程、染色工程、透徹工程、及び封入工程を含むことができる。
　本発明方法における細胞捕集工程では、無機繊維集合体を用いて細胞を捕集する。捕集方法は、検体中の細胞が無機繊維集合体に、細胞診に充分な量で捕集できる方法であれば、特に限定されるものではない。
　例えば、中央部に窓を設けた基板の少なくとも一方（好ましくは一方）の表面に、前記窓を完全に覆うように、適当な大きさの無機繊維集合体を貼り付けることにより、基板中央部にフィルタ部を形成させた細胞捕集板を作製し、検体を前記フィルタ部を通過（濾過）させることにより実施することができる。あるいは、中央部に窓を設けた基板を２枚用意し、その間に適当な大きさの無機繊維集合体を挟み込んだ状態で基板同士を貼り付けることにより、基板中央部にフィルタ部を形成させた細胞捕集板を作製し、検体を前記フィルタ部を通過（濾過）させることにより実施することができる。基板の大きさ・厚さは、特に限定されるものではないが、従来の染色かごを使用することを考慮すると、観察標本作製用のスライドガラスに準ずることが好ましい。
　より具体的には、液体検体の場合には、そのまま、あるいは、適当な液体（例えば、生理食塩水、細胞固定液など）で希釈した後、無機繊維集合体からなるフィルタ部の上面に滴下し、重力、あるいは、所望により吸引により濾過することにより、細胞を捕集することができる。特に、重力による濾過方法であると、細胞を傷つけたり、細胞を変性させにくいため好適である。液体検体の量が多い場合には、フィルタ部上に貯液手段（例えば、貫通した中空部を有する筒）を配置した状態で液体検体の濾過操作をおこなうことにより、十分な量の細胞を捕集することができる。また、液体検体をあらかじめ遠心処理して余分な液体を除いておいてから、濾過操作をおこなうこともできる。
　検体が液状でない場合には、適当な液体（例えば、生理食塩水、細胞固定液など）に分散した後、前記捕集操作を実施することができる。
　本発明方法で用いる無機繊維集合体としては、濾過操作により細胞を捕集することができ、しかも平らで薄いものであることのできる無機繊維シートであるのが好ましい。この無機繊維シートとして、例えば、無機系繊維不織布を挙げることができ、細胞をフィルタの内部空隙に固定することができ、試薬に浸すといった操作が可能であるため好適である。特に、空隙率が９０％以上の無機繊維不織布は細胞をフィルタの内部空隙に固定しやすいばかりでなく、通水性に優れているため好適である。本発明キットに用いることのできる無機系繊維不織布に関する先述の説明は、本発明方法で用いることのできる無機系繊維不織布にそのまま適用することができる。
　本発明方法における湿固定工程は、無機繊維集合体に捕集した細胞が変性しないように、細胞を捕集した無機繊維集合体を試薬（固定液、例えば、９５％エタノール）に浸して固定する工程であり、スライドガラスを用いる従来公知の通常の観察標本作製方法における湿固定操作に準じて、実施することができる。従来公知の観察標本作製方法における湿固定操作では、スライドガラスに塗抹した細胞が乾燥しやすいため、数秒以内に湿固定を行うことが要求されていたが、本発明方法では、無機繊維集合体が保水性を有するため、数分間（例えば、３分間～１０分間）にわたって放置しても細胞が乾燥することがなく、安定した湿固定を行うことができる。
　本発明方法における染色工程は、湿固定が完了した、無機繊維集合体に捕集された細胞を、使用目的（検査目的）に従って、適宜選択可能な染色方法により染色する工程であり、スライドガラスを用いる従来公知の通常の観察標本作製方法における染色操作に準じて、実施することができる。本発明方法における染色工程では、染色かご及び染色槽の使用は必須ではないが、大量の無機繊維集合体を一括して処理できる点で、染色かご及び染色槽を使用することが好ましい。
　本発明方法における染色工程で使用可能な染色方法としては、例えば、パパニコロウ染色、ＰＡＳ染色、アルシアン青染色を挙げることができる。
　本発明方法における透徹工程は、染色が完了した、無機繊維集合体に捕集された細胞を脱水した後、キシレン等に浸すことにより細胞を透明化する工程である。スライドガラスを用いる従来公知の通常の観察標本作製方法における透徹操作に準じて、実施することができる。
　本発明方法における封入工程は、染色した細胞を担持する無機繊維集合体を、カバーガラスの下に、封入剤で密封する工程である。本発明方法では、無機繊維集合体の構成繊維の屈折率と同等の屈折率を有する封入剤を使用する。ここで、同等とは、その屈折率の±０．０５の範囲内であることを意味する。本発明方法で用いることのできる封入剤としては、例えば、Ｎｅｏ－Ｍｏｕｎｔ（登録商標）（メルク＃１０９０１６、屈折率：１．４６）、ソフトマウント（登録商標）（和光純薬＃１９２－１６３０１、屈折率：１．５０）、封入剤Ｎｅｗ　Ｍ・Ｘ（松浪硝子工業＃ＦＸ００１００、屈折率：１．５４５）、封入剤ＭＧＫ－Ｓ（松浪硝子工業＃ＦＫ００１００、屈折率：１．５４５）、マルチマウント４８０（松浪硝子工業＃ＦＭ４８００１、屈折率：１．４９）、マルチマウント２２０（松浪硝子工業＃ＦＭ２２００１、屈折率：１．４９）、マリノール（武藤化学＃２００９１、屈折率：１．５７２）などを用いることができる。
　本発明の観察標本の作製方法は、本発明の観察標本作製用細胞保持基材ホルダー及び観察標本作製用キットを用いて実施することができる。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
　以下の実施例１及び２、並びに比較例１及び２に示す条件にて、細胞を捕集あるいは塗抹後、固定した。続いて、パパニコロウ染色を、パパニコロウ・ヘマトキシリン染色液（和光純薬＃１６８－１８９４１）、パパニコロウ　ＥＡ１００染色液（同＃１６４－１８９２１）、パパニコロウ　ＯＧ１００染色液（同＃１６１－１８９３１）の各染色試薬を使用し、添付の説明書の手順に従い、染色かご及び染色槽を使用して実施した。染色後の透徹においても同説明書の手順に従い、キシレン槽を使用して実施した。その後、市販封入剤（ソフトマウント（登録商標）、和光純薬、＃１９２－１６３０１、屈折率：１．５０）にて封入し、観察標本を作製した。
《実施例１》
　ゾルゲル法と中和紡糸法を組み合わせて得た無機系繊維ウエブの内部を含む全体に、シリカゾル溶液を付与し、熱処理をして製造した、内部を含む全体において、被膜を形成することなく、シリカ接着剤で接着したシリカ連続繊維集合体（平均目付：７．４２ｇ／ｍ２、平均厚さ：１４２μｍ、平均孔径：７μｍ、平均繊維径：０．７３μｍ、空隙率：９５％、単位目付あたりの切断荷重：０．５７ＭＰａ、繊維材質の屈折率：１．４６）を横３０ｍｍ、縦２６ｍｍの長方形にカットし、直径２０ｍｍの穴の開いた横７６ｍｍ、縦２６ｍｍのアルミ板の穴をシリカ連続繊維集合体で覆うとともに、エポキシ樹脂接着剤で接着して、フィルタ（フィルタ面：直径２０ｍｍ、面積約３．１ｃｍ２）を作製した。次いで、直径２０ｍｍの筒を、Ｏ－リング（パッキン）を介して、フィルタの穴と筒の中空部が連通するように、クリップで固定した。
　続いて、筒の中空部に、液体検体に見立てたＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝がん由来細胞株）の生理食塩水分散液（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）１０ｍＬを投入し、重力により濾過した。フィルタのシリカ連続繊維集合体で細胞を捕集した後、直ちに９５％エタノール槽に浸漬し、固定を行った。
《実施例２》
　実施例１と同様に細胞をシリカ連続繊維集合体にて捕集し、室温にて３分間放置した後、９５％エタノール槽に浸漬し、固定を行った。
《比較例１》
　ＨｅｐＧ２細胞５×１０５ｃｅｌｌｓを含む生理食塩水を遠心して上清を除去し、細胞沈渣を調製した。これを細胞剥離防止コート処理がされたスライドガラス（武藤化学、＃５１１６１７）の約９．３ｃｍ２の範囲に引きガラス法にて塗抹した。塗抹後、直ちに９５％エタノール槽に浸漬し、固定を行った。
《比較例２》
　比較例１と同様にスライドガラスに細胞を塗抹した。室温にて３分間放置した後、９５％エタノール槽に浸漬し、固定を行った。
《比較結果》
　実施例１の観察標本（細胞捕集後、直ちに固定したもの）を光学顕微鏡で観察することにより得られた細胞像を図１（倍率：１００倍）及び図２（倍率：４００倍）に示す。
　実施例２の観察標本（細胞捕集後、室温にて３分間放置した後、固定したもの）を光学顕微鏡で観察することにより得られた細胞像を図３（倍率：１００倍）及び図４（倍率：４００倍）に示す。
　比較例１の観察標本（細胞塗抹後、直ちに固定したもの）を光学顕微鏡で観察することにより得られた細胞像を図５（倍率：１００倍）及び図６（倍率：４００倍）に示す。
　比較例２の観察標本（細胞塗抹後、室温にて３分間放置した後、固定したもの）を光学顕微鏡で観察することにより得られた細胞像を図７（倍率：１００倍）及び図８（倍率：４００倍）に示す。
　なお、図１～図８において、濃淡の灰色に見える細胞は、実際には青色に染色されている。また、図８において、濃い灰色から黒色に見える細胞は、細胞の膨化の結果、実際には緋色から茶色に染色されている。
１．細胞保持性
　光学顕微鏡（オリンパス倒立顕微鏡ＩＸ７３ＰＩ－２２ＦＬ／ＰＨ）を用い、１００倍観察にて実施例１の観察標本の捕集面５箇所、比較例１の観察標本の塗抹面５箇所をランダム撮影した。実施例１では、全ての視野で少なくとも１０００個以上の細胞が均一に観察された（図１）のに対し、比較例１では、５００個程度の細胞数が観察された視野が２つあったが、５０個以下のほとんど細胞が観察されず、細胞剥離が起きたと見られる視野が３つあった。なお、図５は５００個程度の細胞が観察された顕微鏡写真である。
２．乾燥耐性
　実施例２では、３分間の室温放置でも染色性に変化が起きなかった（図４）のに対し、比較例２では、細胞の膨化が起き、染色性が変化した（図８）。
３．観察性（細胞内）
　実施例１では、高倍率（４００倍）の観察においても、細胞小器官を十分に判別できる観察像を得られた（図２）。一方、比較例１では、細胞がやや広がり細胞小器官を観察しやすかった。
４．観察性（立体性）
　実施例１では、個々の細胞の立体性および細胞間の立体的な位置関係が維持されていた（図２）。一方、比較例１では、全て細胞はスライドガラスに張り付くようにやや広がっているため、細胞本来の立体構造は消失していた（図６）。
　これらの結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の観察標本作製用の細胞保持基材ホルダー及び細胞保持基材キット、並びに観察標本の作製方法は、細胞診等の病理診断および医学、薬学、生命科学系等の細胞を用いる研究の分野に利用することができる。
　以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変法や改良は本発明の範囲に含まれる。
１０・・・浮遊細胞用観察標本作製用フィルタキット；
１・・・支持プレート；２・・・カバープレート；
３・・・フランジプレート；４ａ，４ｂ・・・クリップ；
５・・・パッキン；９・・・フィルタ；１１・・・窓部；
１２・・・フィルタ配置部；１３・・・フレーム部；
１４・・・支持部材；１５ａ，ｂ・・・嵌め込み用窪み；
１６・・・接続用穴；１７・・・窪み；１８・・・収納窪み；
１９・・・貫通孔（通液構造）；２１・・・窓部；２２・・・支持部材；
２３ａ，ｂ・・・嵌め込み用爪；２４・・・突出部；２７・・・窪み；
２９・・・貫通孔（通液構造）；３１・・・フランジ部；
３２・・・カップ部；３３・・・フランジ；３４・・・連結部；
３５・・・窓部；３６・・・接続用突起。

Claims (18)

  1. （１）通水可能な窓部を有する細胞保持基材配置部を有する支持プレート、
    （２）通水可能な窓部を有するとともに、前記支持プレートと協働して細胞保持基材配置部に細胞保持基材を挟持固定可能、かつ取り外し可能な挟持用プレート
    を含む、観察標本作製用細胞保持基材ホルダー。
  2. 　支持プレートが細胞保持基材配置部とフレーム部とを有する、請求項１に記載の観察標本作製用細胞保持基材ホルダー。
  3. 　支持プレートが窓部を挟んで両側に窪みを有し、挟持用プレートが、前記両窪みに嵌着可能な爪を有するカバープレートである、請求項１又は２に記載の細胞保持基材ホルダー。
  4. 　挟持用プレートが、支持プレートのフレーム部と当接可能なフランジ部を有するフランジプレートであり、支持プレートのフレーム部とフランジプレートのフランジ部とを挟持固定可能なクリップを更に含む、請求項２に記載の細胞保持基材ホルダー。
  5. 　フランジプレートが、検体を投入可能、かつフランジ部の窓部と連通可能なカップ部を有する、請求項４に記載の細胞保持基材ホルダー。
  6. 　カップ部が分離可能である、請求項５に記載の細胞保持基材ホルダー。
  7. 　カバープレートとフランジプレートとクリップとを含む、請求項３～６のいずれか一項に記載の細胞保持基材ホルダー。
  8. 　支持プレートの窓部に細胞保持基材を支持できる支持部材を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞保持基材ホルダー。
  9. 　支持プレートの形状及び大きさが染色かごに収納可能な長方形である、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞保持基材ホルダー。
  10. 　支持プレート及び／又は挟持用プレートに、ピンセット先端を挿入可能な窪みを有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞保持基材ホルダー。
  11. 　いずれの材料も有機樹脂から構成されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞保持基材ホルダー。
  12. 　挟持用プレートが、支持プレートに嵌着可能、挟着可能、又は枢着可能なカバープレートである、請求項１又は２に記載の細胞保持基材ホルダー。
  13. 　カバープレートは力を作用させることのできる力点部を有する、請求項３又は請求項７～１２のいずれか一項に記載の細胞保持基材ホルダー。
  14. 　支持プレートの細胞保持基材配置部及び／又はカバープレートが通液構造を有する、請求項３又は請求項７～１３のいずれか一項に記載の細胞保持基材ホルダー。
  15. 　請求項１～１４のいずれか一項に記載の細胞保持基材ホルダーと、細胞保持基材とを含む、観察標本作製用キット。
  16. 　細胞保持基材が空隙率９０％以上の無機繊維シートである、請求項１５に記載のキット。
  17. 　細胞保持基材を細胞保持基材ホルダーに装着した際の形状及び大きさが、染色かごに収納可能な長方形である、請求項１５又は１６に記載のキット。
  18. 　無機繊維集合体で細胞を捕集し、そのまま湿固定、染色、及び無機繊維の屈折率と同等の封入剤による封入を実施する、観察標本の作製方法。
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